مقالة منهجية

عزل وتحديد الخلايا الزلية الأولية الشبيهة بالخلايا الليفية من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي

530 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70116

⸱

فبراير 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة عزل وتحديد الخلايا الزلية الشبيهة بالخلايا الليفية الأولية عالية النقاء (FLS) من الأنسجة الزللية لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي لنمذجة الأمراض الموثوقة وفحص الأدوية.

الملخص

التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن مناعي ذاتي يتميز بتمدد التنسج الزليلي وتدمير المفاصل التدريجي كسمة مرضية أساسية. تعرف الخلايا الزلية الشبيهة بالخلايا الليفية (FLS) كمكونات خلوية محورية في مسببات أمراض الروماتويد، وتتميز بسلوكها العدواني الشبيه بالورم، الذي يتوسط تدمير الغضاريف والعظام. يعد عزل وتنقية الخلايا الزلية الشبيهة بالتهاب المفاصل الروماتويدي الرومية الرومية (RA-FLS) أداة حيوية لدراسة آليات المرض وتقييم الأدوية العلاجية المحتملة. هنا، نقدم بروتوكولا شاملا لعزل وزراعة والتحقق الوظيفي من متلازمة الروماتويديا المزمنة البشرية الأولية من عينات الأنسجة الزليلي المستأصلة التي تم الحصول عليها أثناء جراحة استبدال الركبة لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي. تستخدم هذه الطريقة الأنسجة الزليلي الطازجة وتستخدم عملية هضم إنزيمية متسلسلة باستخدام التربسين والكولاجناز من النوع الثاني لتعظيم عزل RA-FLS من مصفوفة الأنسجة. أخيرا، يتم تحديد هوية الخلايا من خلال فلورية المناعة الفيمنتين وقياس تدفق الخلايا الخلية، مع تقييم وظيفي للتكاثر الناتج عن TNF-α. يتيح هذا البروتوكول اقتناء زراعة RA-FLS عالية النقاء ذات خصائص ظاهرية محددة واستجابة التهابية، مما يوفر للباحثين طريقة موثوقة للحصول على RA-FLS مزروعة قصيرة الأمد ومشتقة من المرضى مناسبة لفحص الأدوية، والدراسات الميكانيكية، وتطبيقات هندسة الأنسجة.

المقدمة

التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن يتميز بالتهاب متعدد المفاصل المتماثل في المفاصل الطرفية، ويقدر انتشار الانتشار العالمي بين 0.5٪-1٪ ولديه إمكانية التسبب في مضاعفات جهازية وخارج مفصليةمتنوعة 1,2,3,4,5. الميزة المرضية الأساسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي هي التهاب العلب الزليلي المزمن الذي تتوسطه الاستجابات المناعية الذاتية، مما يؤدي أيضا إلى تكوين نسيج بانوس غازي يؤدي إلى تآكل الغضروف المفصليوالعظم تحت الغضروف 6,7. من بين هذه الخصائص، يمثل التهاب الغشاء الزليلي أقدم وأهم سمة مرضية مميزة لالتهاب المفاصل الروماتويدي. الخلايا الزلية الشبيهة بالخلايا الليفية (FLS)، التي تعيش كالخلايا المقيمة الرئيسية في السيلفي، هي دور محوري في تنظيم كل من الالتهاب الزليلي وتدمير العظام 8,9. خلال الاستجابة الالتهابية الزلالية في التهاب المفاصل الروماتويدي الروماتويد، تفقد الخلايا الزلية الشبيهة بالخلايا الليفية (RA-FLS) نمطيها الظاهري "التنظيمي" الطبيعي وتظهر بدلا من ذلك ملف "مضاد للالتهاب"10. يؤدي هذا التحول إلى إنتاج هائل للسيتوكينات الالتهابية، التي قد تنشط مسارات الطاقة الأيضية ذات الصلة، مما يؤدي إلى زيادة تكاثر الخلايا وتضخيم سلسلة الالتهاب الزليلي 11,12,13. في الوقت نفسه، يتفاعل RA-FLS مع خلايا مناعية أخرى (مثل الخلايا البلعمية، الخلايا التائية، وخلايا B) للحفاظ على حالة التهابية مزمنة مستمرة 14,15. علاوة على ذلك، يظهر متلازمة الروماتويد-فل الروماتويدي خصائص شبيهة بالسرطان، بما في ذلك زيادة القدرة على الهجرة، والتوغل، والتكاثر غير المنضبط عليه، ومقاومة الاستماتة المبرمجة، ويشارك بنشاط في عمليات تآكل الغضاريف والعظم16.

في السنوات الأخيرة، تم استخدام FLS على نطاق واسع كنماذج في المختبر لدراسة أمراض التهاب المفاصل مثل التهاب المفاصل الروماتويدي، وهو اتجاه مدفوع جزئيا بقيود العلاجات الدوائية الخط الأولالحالية 17,18,19. تستخدم في الزراعة ثنائية الأبعاد، والنماذج ثلاثية الأبعاد، وأنظمة الأعضاء على شريحة لدراسة آليات الأمراض، والتحقق من الأهداف العلاجية، وإجراء فحص الأدوية20، 21، 22، 23. علاوة على ذلك، يعمل RAFLS كأساس للتطبيقات المتقدمة، بما في ذلك العضويات الزلزية المشتقة من المرضى للتنبؤ باستجابة DMARDs؛ التحرير الجيني عبر CRISPR/Cas9 لدراسة وظيفة الجينات في تقدم التهاب المفاصل الروماتويدية؛ وكمصدر خلوي لهندسة زراعة الأنسجة الزليلي الوظيفية24،25،26.

يعد الحصول على RA-FLS المزروع مؤقتا الأمد من الأنسجة الزللية لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي الخطوة الأولى للعديد من التجارب. مقارنة بخطوط الخلايا السريرية المبكرة، تحتفظ الخلايا الريماتيدية المزمنة المختصة من المريض المزروعة قصيرة الأمد بالتباين بين المرضى وخصائص خاصة بالمرض، مما يتيح تمثيلا أكثر أصالة للعوامل النسخية المرتبطة بالأمراض والاختلافات التنظيمية في المسارات. وبالتالي، قد تتأثر إنتاجية الخلية ومعدل النمو والأداء الوظيفي بعوامل خاصة بالمريض مثل العمر، مدة المرض، تاريخ الأدوية، ونشاط المرض، مما يؤدي إلى درجة معينة من التغير بين الدفعات. لذا يجب على الباحثين تقييم الخلفية السريرية لمصدر النسيج قبل الاستخدام وإجراء تجارب ضمن الممرات المبكرة (P3-P7) للحفاظ على الاستقرار الظاهري للخلايا.

توضح هذه الدراسة بروتوكولا مبسطا لاستخراج وتحديد متلازمة RA-FLS من نسيج الركبة الزليلي. تستخدم الطريقة الهضم الإنزيمي المتسلسل (التريبسين يليه كولاجناز النوع الثاني) مع تفكك ميكانيكي لطيف. تشير الأدلة إلى أن هذه الاستراتيجيات الإنزيمية المحسنة متعددة الخطوات تتفوق عادة على العلاجات ذات الإنزيم الواحد أو غير المتسلسلة ذات الإنزيمات المختلطة، مما قد يؤثر على بقاء الخلايا والنمطالظاهري 27,28,29,30. بالمقارنة، يتيح البروتوكول المعروض عزلا أكثر كفاءة ولطفا لحمض الرياستويوم السليم عالي الحيوية، وعالي النقاء، مما يقلل من تلف الخلايا وفقدان الظاهرة لضمان ملاءمة الاختبارات الوظيفية اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جمعت هذه الدراسة الأنسجة الزليلي من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي الذين خضعوا لجراحة استبدال المفصل في مستشفى الصداقة الصيني الياباني. قدم جميع المرضى موافقة كتابية مستنيرة قبل الجراحة. تم التعامل مع المعلومات المجمعة والعينات البيولوجية بإجراءات صارمة لضمان خصوصية المرضى وأمن بياناتهم. تم التخلص من أي عينات متبقية من الأنسجة الزلالية وفقا للوائح السلامة البيولوجية. تمت الموافقة على استخدام نسيج مفصل الركبة الزليلي لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي في هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى الصداقة الصيني-الياباني (رقم الموافقة: 2025-KY-223). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. اكتساب وتحضير الأنسجة الزليلي

ملاحظة: ضع الأنسجة الزليلي التي تم الحصول عليها أثناء الجراحة في حاوية معقمة مملوءة بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪ أو PBS لمنع التلوث أثناء النقل من غرفة العمليات إلى خزانة السلامة البيولوجية. استخدم الغمر بالإيثانول ثم غسله بمحلول البنسلين-ستربتوميسين كخطوات حاسمة لمنع التلوث البكتيري أو الفطري، لضمان نجاح التجارب اللاحقة.

  1. اغمر الأنسجة الزلزية الطازجة في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل يحتوي على PBS وانقله إلى خزانة السلامة البيولوجية.
  2. انقل النسيج الزليلي إلى طبق بتري يحتوي على 75٪ إيثانول واغمره لمدة 30 ثانية للتعقيم.
  3. قم بإزالة الدهون والأنسجة العظمية من الأنسجة الزليلي باستخدام مقص جراحي معقم وملاقط، ثم نقل الأنسجة المتبقية إلى طبق زراعة جديد.
  4. غسل النسيج الزليلي المستلم 3 مرات باستخدام PBS يحتوي على 10٪ بنسلين/ستربتومايسين.

2. هضم النسيج الزيلي

ملاحظة: استخدم التريبسين لتعطيل وصلات الخلايا والمصفوفة خارج الخلية داخل النسيج الزليلي للعزل اللاحق. تطبيق الكولاجناز من النوع الثاني لتحليل بنية المصفوفة خارج الخلية بشكل انتقائي، مما يسهل تفكك الخلايا عن المصفوفة. قم بتعقيم جميع المقصات الجراحية، الملقط، والمصافات اللازمة لتشريح الأنسجة الزليلي عن طريق التعقيم قبل الاستخدام. بعد الهضم، يجب أن تبدو شظايا الأنسجة مرتخية، مع حواف مهترئة، وقد يصبح الوسط عكرة قليلا. ستظل الأنسجة غير المهضومة مضغوطة وعتامة.

  1. قم بتقطيع النسيج مرارا وتكرارا بالمقص إلى أجزاء 1 مم × 1 مم.
  2. أضف 0.25٪ تريبسين إلى النسيج وهضم عند 37 درجة مئوية في هزاز ثابت الحرارة (عند 100-150 دورة في الدقيقة) أو في حاضنة الخلايا لمدة 30 دقيقة.
  3. حضر محلول مصل أبقار جنيني بنسبة 10٪ باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  4. انقل النسيج إلى أنابيب طرد مركزي بحجم 15 مل أو 50 مل حسب كمية الأنسجة، وقم بتحييده وهضمه باستخدام PBS الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS).
  5. الطرد المركزي (4 درجات مئوية، 500 × جم، 5 دقائق)، ثم تخلص من المادة الفائقة واحتفظ بالكريات.
  6. أعد تعليق الرصاصة في PBS.
  7. الطرد المركزي (4 درجات مئوية، 500 × جم، 5 دقائق)، ثم تخلص من المادة الفائقة واحتفظ بالرصاصة.
  8. أضف 100 ملغ من الكولاجناز من النوع الثاني إلى 50 مل من وسط DMEM لتحضير محلول كولاجناز من النوع الثاني بسعة 2 ملغ/مل.
  9. قم بترشيح محلول الكولاجناز من النوع الثاني المحضر عبر غشاء بحجم 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
  10. أضف 2 ملغ/مل كولاجناز من النوع الثاني وهضم في جهاز هز بدرجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية (عند 100-150 دورة في الدقيقة) أو حاضنة خلية لمدة 4 ساعات.

3. عزل وزراعة الخلايا الزلية الشبيهة بالخلايا الليفية

ملاحظة: قم بجميع إجراءات زراعة الخلايا على خزانة السلامة البيولوجية في ظروف معقمة وارتد قفازات معقمة لمنع التلوث.

  1. جهز وسط DMEM كامل عن طريق إضافة وسط DMEM الأساسي بنسبة 10٪ مصل البقري الجنني، و100 وحدة U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين.
  2. ضع مصفاة خلية مكونة من 100 شبكة على طبق بتري معقم وصب الأنسجة الزلية المهضومة والسائل على المصفاة.
  3. انقل مصفاة الخلية مع الأنسجة المتبقية إلى طبق بترى معقم آخر.
  4. طحن الأنسجة المتبقية على المصفاة باستخدام نهاية قضيب مكبس حقنة معقمة بحجم 20 مل حتى تبقى بقايا بيضاء ليفية فقط، ولا يمكن التعبير عن تعليق خلوي إضافي.
  5. اشطف المصفاة بكمية مناسبة من وسط DMEM كامل.
  6. اجمع جميع الترشيحات والطرد المركزي (4 درجات مئوية، 500 × جم، 5 دقائق)، وتخلص من السوبرناتان.
  7. أعد تعليق الحبيبة في PBS، وجهاز الطرد المركزي (4 درجات مئوية، 500 × جم، 5 دقائق)، وتخلص من السوبرناتان.
  8. أعد تعليق الخلايا في وسط DMEM كامل.
  9. قم بعد الخلايا وانقل الخلايا إلى قارورة زراعة.
  10. حضن القارورة في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون).
  11. استبدل الوسط بعد 48 ساعة.
  12. هضم الخلايا التي تحتوي على التريبسين والمرور بنسبة 1:3 عندما تصل إلى التقاء كامل.

4. تحديد متلازمة الريباتيك الفلورية الريباتينية باستخدام تلوين الفيمنتين المناعي الفلوري

ملاحظة: قم بتسخين محلول PBS المستخدم لغسل الخلايا مسبقا في حمام ماء على درجة حرارة 37 درجة مئوية. جميع أحجام الكواشف المحددة في هذا القسم موحدة لصيغة صفيحة ذات 48 بئر. يجب تعديل الأحجام بشكل متناسب بناء على مساحة النمو عند استخدام ألواح بصيغة مختلفة.

  1. هضم الخلايا باستخدام التربسين، وأعد تعليق الخلايا المستخرجة، وتخفيف إلى 1 ×10 4 خلايا/لتر باستخدام وسط DMEM كامل.
  2. زرع RA-FLS في صفيحة ب 48 بئر بسرعة 200 ميكرولتر لكل بئر.
  3. وضعها في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية، 5٪ CO₂) واحتضن لمدة 24 ساعة.
  4. تخلص من الوسط واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المسخن مسبقا.
  5. أضف 4٪ بارافورمالديهايد لتثبيت الخلايا لمدة 10 دقائق، تخلص من المثبت، واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS.
  6. جهز 150 ميكرولتر من محلول ترايتون X-100 بنسبة 0.1٪ في PBS لكل بئر. تأكد من الخلط الكامل عن طريق الدوامة أو الانقلاب اللطيف قبل الاستخدام.
  7. أضف محلول Triton X-100 بنسبة 0.1٪ إلى الآبار وحضن لمدة 10 دقائق لتمكين الخلايا.
  8. تخلص من محلول Triton X-100 بنسبة 0.1٪، واغسل ثلاث مرات باستخدام PBS.
  9. أضف 150 ميكرولتر من محلول الانسداد الخالي من الحيوانات لكل بئر، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
  10. تخلص من محلول الحظر. أضف 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية الفيمنتين (مخفف بنسبة 1:200 في مخفف الأجسام المضادة) إلى كل بئر.
  11. حضن الجسم المضاد الأولي عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  12. تخلص من الجسم المضاد الأساسي واغسل الخلايا خمس مرات باستخدام متلازمة PBS.
  13. أضف 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية IgG المضادة للأرانب من Alexa Fluor 488 (مخفف بنسبة 1:50 في مخفف الأجسام المضادة الشاملة) لكل بئر، وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة محمية من الضوء.
  14. تخلص من الجسم المضاد الثانوي واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.
  15. أضف قطرة واحدة من وسط تركيب مضاد التلاشي يحتوي على DAPI لكل بئر، وجففه لمدة 10 دقائق في الظلام.
  16. راقب والتقاط الصور باستخدام مجهر فلوري مقلوب مزود بمجموعات مرشح موضوعية بحجم 20× ومناسبة ل DAPI وFITC/GFP.
    ملاحظة: غسل الخلايا ب PBS بملء الآبار بالكامل ب PBS، ثم حضنها لمدة 5 دقائق، ثم إزالة PBS. تشكل هذه العملية دورة غسيل واحدة.

5. قياس كمية RA-FLS وتقييم النقاء باستخدام قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: استخدم فيمنتين وCD90 كمؤشرات إيجابية لتحديد RA-FLS، مع تطبيق CD68 وCD14 وCD11b كعوامل تحكم سلبية لاستبعاد تلوث الخلايا المناعية. يعمل الفيمنتين كبروتين خيط وسيط خاص داخل الخلية، ويتمركز بشكل رئيسي في السيتوبلازم لحمض RA-FLS. يعمل CD90 كعلامة سطحية حرجة تعبر عنها بشكل كبير في RA-FLS، مما يمكن من تمييزها عن الخلايا المناعية. بينما تعبر CD68 وCD14 وCD11b تحديدا في البلاعميات والخلايا الأحادية والخلايا النخاعية، إلا أنها تستخدم كعلامات سلبية لاستبعاد تلوث الخلايا المناعية. خصص الفلوروكروم لعلامات سطح الخلية بناء على خصوصية ارتباطها، وضمان عدم وجود تداخل في قنوات الفلورة. على سبيل المثال، في هذه التجربة، تشترك CD90 وCD68 في نفس الفلوروكروم؛ لذلك، لا تضيفها إلى نفس أنبوب الطرد المركزي. قبل الحضانة بالأجسام المضادة للفيمنتين، أضف عوامل تثبيت ونفاذية لتعطيل غشاء الخلية. إذا كان مقياس التدفق يحتوي على قنوات فلورية كافية، يمكن تعيين علامات مثل CD90 وCD68 لقنوات مختلفة لتحليل متزامن متعدد الألوان لتحسين كفاءة الكشف ومحتوى المعلومات.

  1. استيعج الجيل الثالث من RA-FLS باستخدام التربسين الخالي من EDTA.
  2. أنهي الهضم بوسط DMEM كامل، وجهاز طرد مركزي (4 درجات مئوية، 500 × جرام، 5 دقائق)، وتخلص من السوبرناتانت.
  3. أعد تعليق الحبيبات في PBS، وقم بعد الخلايا، وضبط تركيز الخلية إلى 1 × 10⁶ خلايا/مل باستخدام PBS.
  4. وزع الخلايا إلى ثلاثة أنابيب طرد مركزي، مع إضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل أنبوب.
  5. أضف الجسم المضاد CD11b (مخفف بنسبة 1:100 في مخفف الأجسام المضادة الشاملة) عند حجم نهائي 100 ميكرولتر إلى الأنبوب 1. دوامة لخلطها.
    1. بعد 15 دقيقة من الحضانة، أضف عامل تثبيت/نفاذية بسعة 1 مل إلى الأنبوب 1، والدوامة للخلط، وحضن لمدة 30 دقيقة محميا من الضوء.
    2. أضف 1 مل من مخزن التثبيت/نفاذية إلى الأنبوب 1 لإنهاء النفاذية، ثم دوامة للخلط، وطرد مركزي (4 درجات مئوية، 500 × جم، 5 دقائق)، وتخلص من السوبرناتانت.
    3. حضر 100 ميكرولتر من الفيمنتين وكوكتيل الأجسام المضادة CD68 (كل منهما مخفف بنسبة 1:100 في مخفف الأجسام المضادة الشاملة)، أضف إلى الأنبوب 1، ثم خلط الدوامة، وحضن الغلاف المحمي من الضوء لمدة 30 دقيقة.
    4. أضف 1 مل من مخزن التثبيت/النفاذية إلى الأنبوب 1، ثم الدوامة للخلط، والطرد المركزي (4 درجات مئوية، 500 × جم، 5 دقائق)، وتخلص من السوبرناتانت.
    5. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي IgG مضاد للأرانب أليكسا فلور 488 (مخفف بنسبة 1:50 في مخفف الأجسام المضادة الشاملة) إلى الأنبوب 1. دوامة للخلط والحضانة، محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة.
    6. أضف 1 مل من المخزن إلى الأنبوب 1، والدوامة للخلط، والطرد المركزي (4 درجات مئوية، 500 × جم، 5 دقائق)، وتخلص من السوبرناتان.
    7. أضف 300 ميكرولتر من المخزن إلى الأنبوب 1، ودوامة لخلط عينة التحميل.
  6. أضف الأجسام المضادة CD90 وCD14 (كل منهما مخفف بنسبة 1:100 في مخفف الأجسام المضادة الشاملة) إلى الأنبوب 2 إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. اترك أنبوب 3 بدون أجسام مضادة كعامل تحكم سلبي.
    1. بعد 15 دقيقة من الحضانة، أضف 1 مل PBS إلى الأنبوبين 2 و3.
    2. أنابيب الطرد المركزي 2 و3 (4 درجات مئوية، 500 × جم، 5 دقائق)، تتخلص من السوبرناتانت، تضيف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت ودوامة للخلط لتحضير عينة التحميل.
  7. إجراء جمع التدفق الخلوي للعينات المحضرة.
  8. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي وإجراء الإحصاءات باستخدام برامج متوافقة.

6. قياس انتشار RA-FLS الناتج عن TNF-α باستخدام اختبار MTS

  1. استيعج الجيل الثالث من RA-FLS باستخدام التربسين الخالي من EDTA.
  2. أنهي الهضم بوسط DMEM كامل، وجهاز طرد مركزي (4 درجات مئوية، 500 × جرام، 5 دقائق)، وتخلص من السوبرناتانت.
  3. أعد تعليق الحبيبة في وسط DMEM كامل، وقم بعد الخلايا، وتخفيف الحبيبة إلى 1 × 10⁵ خلايا/لتر.
  4. زرع الخلايا المعلقة في صفيحة بسعة 96 بئر بقدرة 100 ميكرولتر لكل بئر.
  5. حضن الصفيحة في حاضنة زراعة الخلايا حتى يحدث التصاق الخلية، ثم قسموا إلى مجموعات ضابطة فارغة وتدخل.
  6. أضف 10 نانوغرام/مل TNF-α إلى مجموعة التدخل وحجم متساو من PBS إلى مجموعة الضابط الفارغة.
  7. بعد 24 ساعة من التدخل، أضف 10 ميكرولتر من مادة MTS إلى كل بئر واستمر في الحضانة في حضانة زراعة الخلايا.
  8. بعد ساعة من الحضانة، قس الامتصاص (OD) عند 490 نانومتر باستخدام قارئ الميكرولوب.
  9. احسب قابلية تكاثر الخلايا بناء على قيمة التوزيع الزائد لكل بئر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام البروتوكول، نجحنا في عزل RA-FLS المزروعة قصيرة الأمد والمشتق من المرضى. يتم توفير مخطط تخطيطي لسير العمل الإجرائي (الشكل 1). تحت المجهر الضوئي، أظهر RA-FLS نمطا ظاهريا مورفولوجيا سائدا لخلايا متعددة الأضلاع على شكل مغزل وغير منتظمة. أظهرت الخلايا انتشارا سيتوبلازميا واسعا مع عمليات ممدودة. ظهرت حدود الخلايا غير واضحة قليلا في مناطق التلامس أو التداخل بين الخلية. غالبية الخلايا قدمت سيتوبلازم شفافا نسبيا مع امتداد مستقطب. كانت النوى في الغالب بيضاوية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يؤسس هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لعزل وزراعة متلازمة الروماتويد-فلوريد قصيرة الأمد من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي، ويظهر نجاحه من خلال القدرة العالية على العيش في الخلايا، والنمط الظاهري المميز، والتعبير المحدد، والاستجابة الوظيفية للمحفزات الالتهابية.

خطوات حرجة واعتبارات تقنية
تعتمد موثوقية هذه الطريقة على عدة خطوات حاسمة. أولا، يجب إخضاع الأنسجة الزليلي الطازجة للهضم الإنزيمي بسرعة خلال 4-6 ساعات من الاكتساب. بينما يمكن تخزين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يبلغ المؤلفون عن عدم وجود تضارب في المصالح في هذا العمل ويؤكدون أن استخدام Figdraw لإنشاء الشكل 1 يلتزم بشروط ترخيص المنصة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (الرقمين 82074223 8207141673) والمشروع الرئيسي على مستوى الحكومة المركزية: إنشاء استخدام مستدام لموارد الطب الصيني القيمة (رقم 2060302).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أليكسا فلور 488-متزامن مضاد للأرانب IgGشركة تشونغشان جينغتشياو للتكنولوجيا الحيويةZF-0511
0.25٪ تريبسين-إيدتا (1X)جيبكو25200-072
4٪ بارافورمالديهيدسولاربيولوجياP1110
أليكسا فلور674 ضد البشر CD68بيوليجند562111
حل الحجب الخالي من الحيواناتتقنية الإشارة الخلوية15019
ناقلة جنود مدرعة مضادة للبشر CD90بيوليجند559869
برنامج BD FACSDiva 8.0.2بكالوريوس العلوم الحيوية657925
بي دي إل إس آر فورتيسابكالوريوس العلوم الحيوية647177
BV605 CD11b المضاد للإنسانبيدجند563015
اختبار CellTiter 96 لتحليل تكاثر خلية المحلول الواحد (MTS)بروميغاG358A
كولاجناز IIسولاربيولوجياC8150
وسط تركيب فلوري يحتوي على DAPIشركة تشونغشان جينغتشياو للتكنولوجيا الحيويةZLI-9556
وسط تركيب فلوري يحتوي على DAPIشركة تشونغشان جينغتشياو للتكنولوجيا الحيويةZLI-9556
وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM)، عالي الجلوكوزهايكلونSH30022.01
مصل البقر الجيني - فائق الحساسية (FBS)شركة شنغهاي تشونغتشياو شيندان للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.ZQ0500
القرص المضغوط 14 لمكافحة البشر في FITCبيوليجند325604
PBS، 1×؛ (درجة الحموضة 7.4) محلول ملحي مخزن بالفوسفاتسيرفيسبيوG4202
محلول خليط البنسلين-ستربتوميسين (مضادات حيوية مزدوجة) 100 مرة؛شركة شنغهاي تشونغتشياو شيندان للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.CSP006
حجب البروتين العالمي ومخزن تخفيف الأجسام المضادة من QuickBlockبيوتايمP0270-500 مل
TNF & alpha البشري المؤتلف؛بيبروتيك300-01A
بوف بتلوين عامل النسخالعلوم الحيوية الإلكترونية00-5523-00
ترايتون X-100سولاربيولوجياT8200
محلول التربسين (خال من EDTA)شركة بكين لابجيك للتكنولوجيا، المحدودة.BL526A

المراجع

  1. Di Matteo, A., Bathon, J. M., Emery, P. Rheumatoid arthritis. Lancet. 402 (10416), 2019-2033 (2023).
  2. Uke, P., Maharaj, A., Adebajo, A. A review on the epidemiology of rheumatoid arthritis: An update and trends from current literature. Best Pract Res Clin Rheumatol. 39 (1), 9(2025).
  3. Wu, D., et al. Systemic complications of rheumatoid arthritis: Focus on pathogenesis and treatment. Front Immunol. 13, 13(2022).
  4. Chen, G., Yan, Z., Wang, Y., Tao, Q. Rheumatoid arthritis and fibromyalgia syndrome: A bibliometric and bioinformatics perspective on comorbidity research. J Multidiscip Healthc. 18, 6811-6827 (2025).
  5. Zhao, Y., Chen, G. Y., Fang, M. Research trends of rheumatoid arthritis and depression from 2019 to 2023: A bibliometric analysis. J Multidiscip Healthc. 17, 4465-4474 (2024).
  6. Komatsu, N., Takayanagi, H. Mechanisms of joint destruction in rheumatoid arthritis - immune cell-fibroblast-bone interactions. Nat Rev Rheumatol. 18 (7), 415-429 (2022).
  7. Zhang, Y. Y., Gao, Z. J., Chao, S. S., Lu, W. J., Zhang, P. P. Transdermal delivery of inflammatory factor-regulated drugs for rheumatoid arthritis. Drug Deliv. 29 (1), 1934-1950 (2022).
  8. Bottini, N., Firestein, G. S. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: Passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 9 (1), 24-33 (2013).
  9. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 4, 23(2018).
  10. Liu, Y., et al. Regulatory fibroblast-like synoviocytes cell membrane-coated nanoparticles: A novel targeted therapy for rheumatoid arthritis. Adv Sci. 10 (4), 15(2023).
  11. Li, C. L., et al. A transformable nanoplatform precisely positions fibroblast-like synoviocytes via FAP-α for improved rheumatoid arthritis therapy. Adv Healthc Mater. 15 (2), e03277(2026).
  12. Meng, Q. L., Wei, K., Shan, Y. E3 ubiquitin ligase gene BIRC3 modulates TNF-induced cell death pathways and promotes aberrant proliferation in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Front Immunol. 15, 10(2024).
  13. Chen, L., et al. AMPK signaling in osteoarthritis: From mechanisms to targeted therapeutics. Front Pharmacol. 16, 1681610(2025).
  14. Bakinowska, E., et al. The role of mesenchymal stromal cells in the treatment of rheumatoid arthritis. Cells. 13 (11), 17(2024).
  15. Filer, A. The fibroblast as a therapeutic target in rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 413-419 (2013).
  16. Promila, L., et al. Mitochondrial calcium uniporter regulates human fibroblast-like synoviocytes invasion via altering mitochondrial dynamics and dictates rheumatoid arthritis pathogenesis. Free Radic Biol Med. 234, 55-71 (2025).
  17. Wang, X. C., He, J. X., Zhang, Q., He, J., Wang, Q. W. Constructing a 3D co-culture in vitro synovial tissue model for rheumatoid arthritis research. Mater Today Bio. 31, 16(2025).
  18. Shi, R. Y., et al. Monocyte membrane-coated drug nanocrystals for enhanced targeted therapy of rheumatoid arthritis. J Control Release. 384, 14(2025).
  19. Smolen, J. S., et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2019 update. Ann Rheum Dis. 79 (6), 685-699 (2020).
  20. Chen, G. Y., et al. Mechanisms of total glucosides of paeony in alleviating methotrexate-induced liver injury. Drug Des Devel Ther. 19, 3407-3423 (2025).
  21. Philippon, E. M. L., et al. A novel 3D spheroid model of rheumatoid arthritis synovial tissue incorporating fibroblasts, endothelial cells, and macrophages. Front Immunol. 14, 11(2023).
  22. Lin, X., et al. Sesamol serves as a p53 stabilizer to relieve rheumatoid arthritis progression and inhibits the growth of synovial organoids. Phytomedicine. 121, 14(2023).
  23. Lee, M. S., Kim, S., Lee, J. H., Bae, Y. S., Lee, S. K. Synovium-on-a-chip reveals fibroblast-macrophage crosstalk underpinning joint homeostasis and evaluation of gout therapies. Adv Healthc Mater. 14 (18), 16(2025).
  24. Kim, D., et al. 3D in vitro synovial hyperplasia model on polycaprolactone-micropatterned nanofibrous microwells for screening disease-modifying anti-rheumatic drugs. Mater Today Bio. 26, 10(2024).
  25. Murakami, A., et al. Human CD4(+) T cells regulate peripheral immune responses in rheumatoid arthritis via insulin-like growth factor-like family member 2. Sci Immunol. 10 (110), eadr3838(2025).
  26. Yue, S., et al. Unveiling the therapeutic potential: Targeting fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Expert Rev Mol Med. 27, e18(2025).
  27. Clister, T., et al. Optimization of tissue digestion methods for characterization of photoaged skin by single-cell RNA sequencing reveals preferential enrichment of T cell subsets. Cells. 13 (3), (2024).
  28. Hu, Z., et al. Novel strategy for primary epithelial cell isolation: Combination of hyaluronidase and collagenase I. Cell Prolif. 56 (1), e13320(2023).
  29. Sueters, J., Schipperheijn, R., Huirne, J., Smit, T., Guler, Z. Reproducibility and consistency of isolation protocols for fibroblasts, smooth muscle cells, and epithelial cells from the human vagina. Cells. 14 (2), 76(2025).
  30. Jiang, D. X., et al. Primary isolation, culture, and phenotypic verification of rat knee articular chondrocytes. J Vis Exp. (225), e69509(2025).
  31. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Res Ther. 20 (1), 139(2018).
  32. Zhang, F., et al. Deconstruction of rheumatoid arthritis synovium defines inflammatory subtypes. Nature. 623 (7987), 616(2023).
  33. Li, P. F., et al. Comparative proteomic analysis of polarized human THP-1 and mouse RAW264.7 macrophages. Front Immunol. 12, 13(2021).
  34. Zhu, E. B., et al. Biomimetic cell stimulation with a graphene oxide antigen-presenting platform for developing T cell-based therapies. Nat Nanotechnol. 19 (12), 1914-1922 (2024).
  35. Sato, N., Bamford, R. N., Bryant, B. R., Tagaya, Y., Waldmann, T. A. Accessory cells precondition naive T cells and regulatory T cells for cytokine-mediated proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), 13(2023).
  36. Krishnaswamy, J. K., Alsén, S., Yrlid, U., Eisenbarth, S. C., Williams, A. Determination of T follicular helper cell fate by dendritic cells. Front Immunol. 9, 16(2018).
  37. Ndeupen, S., et al. Langerhans cells and cDC1s play redundant roles in mRNA-LNP-induced protective anti-influenza and anti-SARS-CoV-2 immune responses. PLoS Pathog. 18 (1), 18(2022).
  38. Walsh, M. C., et al. Osteoimmunology: Interplay between the immune system and bone metabolism. Annu Rev Immunol. 24, 33-63 (2006).
  39. Koenderman, L., Tesselaar, K., Vrisekoop, N. Human neutrophil kinetics: A call to revisit old evidence. Trends Immunol. 43 (11), 868-876 (2022).
  40. Montero, R. B., et al. bFGF-containing electrospun gelatin scaffolds with controlled nano-architectural features for directed angiogenesis. Acta Biomater. 8 (5), 1778-1791 (2012).
  41. Yang, C. Y., Yuan, W. W., Liao, G. X., Yu, Q. Q., Wang, L. G. Construction of bFGF/heparin and Fe3O4 nanoparticles functionalized scaffolds aiming at vascular repair and magnetic resonance imaging monitoring. Int J Biol Macromol. 286, 15(2025).
  42. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of induced-pluripotent stem cells using fibroblast-like synoviocytes isolated from joints of rheumatoid arthritis patients. J Vis Exp. (116), e54072(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة