تقدم هذه الدراسة طريقة غير جراحية في الجسم الحي باستخدام مجهر التوليد الثنائي والثاني لمراقبة شكل ساق الشعر، وديناميكيات الميلانين، وكثافة الكولاجين الجلدي طوال دورة بصيلات الشعر في الفئران، مما يوفر إطارا منهجيا قويا لأبحاث علاج تساقط الشعر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
* These authors contributed equally
† These authors contributed equally
تقدم هذه الدراسة طريقة غير جراحية في الجسم الحي باستخدام مجهر التوليد الثنائي والثاني لمراقبة شكل ساق الشعر، وديناميكيات الميلانين، وكثافة الكولاجين الجلدي طوال دورة بصيلات الشعر في الفئران، مما يوفر إطارا منهجيا قويا لأبحاث علاج تساقط الشعر.
تعتمد التقييمات التقليدية لدورة بصيلات الشعر على طرق نسيجية غازية، مما يحد من المراقبة الطولية المستمرة. تم افتراض أن التصوير البصري غير الجراحي، وخاصة الفلورة المثارة بفوتونتين (TPEF) والتوليد التوافقي الثاني (SHG)، يمكنه تتبع وقياس التغيرات الديناميكية في الجسم الحي في أعمدة الشعر والميلانين والكولاجين عبر دورات متعددة من بصيلات الشعر. تمت مراقبة أعمدة شعر فئران C57BL/6 في الجسم الحي خلال مراحل الأناجين، والكاتاجين، والتيلوجين باستخدام التنظير الجلدي، والتصوير الفوتوغرافي، والمجهر الإلكتروني. على وجه التحديد، تم استخدام TPEF تحت 800 نانومتر من الإثارة والتصوير لقياس ديناميكيات الميلانين، بينما استخدم SHG تحت 950 نانومتر لمراقبة تغيرات الكولاجين بين الجريبات. لضمان الدقة، تم التحقق من صحة القياسات البصرية في الجسم الحي : تم تأكيد ديناميكيات الميلانين عبر تصوير الجلد لمظهر الأنسجة بشكل عام وتلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE) لتعبير بصيلات الشعر، بينما تم التحقق من تغيرات الكولاجين من خلال تقييم كثافة الألياف واتجاهها باستخدام نظام تصوير مستقطب للبلورات السائلة على الأقسام المصبوغة باللون الأحمر من سيريوس. أظهرت الملاحظات أن قطر ساق الشعر وإنتاج الميلانين زاد تدريجيا خلال مرحلة الأناجين، مصحوبا بانخفاض كبير في كثافة الكولاجين بين الجريبات. خلال مرحلتي الكاتاجين والتيلوجين، انخفضت مستويات الميلانين تدريجيا، وتعافت كثافة الكولاجين تدريجيا إلى المستويات الأساسية. يؤسس هذا المشروع منهجية موثقة وغير جراحية في الجسم الحي لتقييم الديناميكيات الشاملة لبصيلات الشعر، مما يوفر إطارا تجريبيا قويا للتقييم قبل السريري للعوامل الفعالة لعلاجات تساقط الشعر.
تظهر بصيلات الشعر في فئران C57BL/6 تزامن وانتظاما، مما يوفر راحة تجريبية ويجعلها نموذجا حيوانيا شائعا لدراسة أمراض الجلد 1,2. تدخل بصيلات الشعر المرحلة الثانية من التيلوجين في الأسبوع السابع بعد ولادة فأر C57BL/63. في غياب التدخل الصناعي، ستستمر هذه المرحلة التيليوجينية حتى الأسبوع الثاني عشر بعد الولادة4. هذه الفترة الطويلة من التيلوجين هي نقطة زمنية شائعة تستخدم في الأبحاث لمزامنة دورة نمو بصيلات الشعر5. بعد إزالة الشعر الاصطناعية للفئران، تبدأ بصيلات الشعر فورا في الدخول في المرحلةالسادسة من العناء.
بعد دخول مرحلة النمو، تتكاثر الخلايا الجذعية في منطقة الانتفاخ وتتمايز إلى غلاف الجذر الخارجي، وتنمو لأسفل لزيادة طول الجريبات7. قاعدة ساق الشعر تمتد للأعلى مع تعمق الجريبات8. الخلايا الجذعية في البصلة تتمايز باستمرار إلى ساق الشعر وغلاف الجذر الداخلي9. كما يتغير إفراز الكولاجين والميلانين في الجلد بسرعة خلال المرحلة10 من الأناغين، ويلعب دورا مهما في تطور بصيلات الشعر11,12. في الدراسات المتعلقة بتساقط الشعر، يتم تقييم إفراز الميلانين عادة من خلال لون البشرة، مما لا يسمح بقياس دقيق13. حتى الآن، ركزت الأبحاث حول الكولاجين بشكل أساسي على التطور والشيخوخة بدلا من الديناميكيات الدورية للقياس الكميمي.
حاليا، هناك قيود رئيسية في تقييم دورات بصيلات الشعر والعلاجات التجديدية هي الاعتماد على نقاط نهائية نسيجية مدمرة، مما يستلزم القتل الرحيم لمجموعات مختلفة من الحيواناتفي نقاط زمنية محددة. وهذا يمنع التتبع المستمر والطولي لنفس البيئة الدقيقة الجريبية عبر عدة دورات. علاوة على ذلك، تفتقر التقنيات التقليدية غير الجراحية مثل تنظير الجلد إلى اختراق الأنسجة الكافية لرؤية تغيرات الجريبات العميقة15، كما أن الملاحظة الكبيرة تفشل في تحديد الميلانين بدقة، مما يجعل من الصعب اكتشاف جذر شعر النادي الناقص للميلانين خلال مراحل الانحدار المتأخرة ومراحل الراحة16،17. بينما طورت تقنيات بصرية مختلفة الرصد الطولي في الجسم الحي 18،19، مثل الاستقطاب السائل البلوريتي لتقييم ألياف الكولاجين20،21، المجهر الكونفوكلي الجلدي لمراقبة التصبغ22،24، والتصوير المقطعي البصري المتماسك لقياس سمك الجلد25،26،27، يقدم المجهر متعدد الفوتون حلا فريدا وجذابا. يوفر الاستخدام المشترك لتألق الإثارة ذو الفوتونين (TPEF) والتوليد التوافقي الثاني (SHG) مزايا واضحة: فهو يتيح تقسيما بصريا عالي الدقة وخالي من العلامات عميقا داخل الجلد، مما يسمح بقياس الفلورة الذاتية للميلانين وبنية ألياف الكولاجين في الوقت نفسه دون وجود أصباغ خارجية28,29. في هذه الدراسة، يفترض المؤلفون أن التصوير غير الغازي ل TPEF/SHG يمكنه قياس هذه التغيرات الهيكلية بدقة ديناميكية ودقة مماثلة لمعايير الذهب النسيجي الغازي. من خلال معالجة هذه المشكلة العلمية الرئيسية، تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء إطار تصوير قوي وطولي لدعم التقييم غير الجراحي للعوامل العلاجية للثعلبة30.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
جميع الطرق التي تتضمن استخدام الفقاريات تم تنفيذها وفقا للإرشادات المؤسسية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مركز البحوث التجريبية التابع لأكاديمية الصين للعلوم الطبية الصينية (رمز البروتوكول: ERCCACMS11-2210-03). جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.
تحضير الحيوانات والمراقبة الماكروسكوبية
تم الحصول على فئران ذكور C57BL/6، تتراوح أعمارهم بين 6 و7 أسابيع ووزنها 20 ± 2 جرام، من مورد تجاري. تم تقسيم الفئران إلى مجموعة تحليل نسيجية (n = 39) ومجموعة تصوير مستمرة في الجسم الحي (n = 3). تم إزالة الشعر الظهري لجميع الفئران لتزامنة دورة بصيلات الشعر. تم فحص حالة نمو الشعر كل يومين من اليوم الثاني حتى اليوم 26 بعد إزالة الشعر. تم تصوير ظهور الفئران في مجموعة التصوير كل يومين حتى اليوم السادس والعشرين باستخدام الكاميرا. تم الحفاظ على مسافة بؤرية ثابتة تبلغ 15 سم، وتم ضمان ظروف إضاءة مختبرية محيطة موحدة وموحدة لتوثيق التغيرات الماكروسكوبية بدقة.
في الجسم الحي تصوير TPEF وSHG
أجريت جلسات التصوير في الأيام 2، 4، 6، 8، 10، 12، 14، 16، 18، 20، 22، 24، و26 بعد إزالة الشعر. تم تخدير الفئران باستخدام الإيزوفلوران. تم ضمان فقدان الوعي الكامل من خلال مراقبة معدل التنفس واختبار رد فعل القدم بقرص خفيف على إصبع القدم. تم تثبيت الفأر المخدر على مسرح مجهر ذو فوتونين. لتصوير TPEF للميلانين، تم تزويد المجهر بهدف غمر مائي بمقدار 25x (الفتحة الرقمية = 1.05)، وتم ضبط طول موجة الإثارة على 800 نانومتر. تم إجراء مسح z-stack لتألق الميلانين الذاتي، وبلغ عمق المسح الإجمالي 45 ميكرومتر. تم تعيين حجم الخطوة إلى 2 ميكرومتر، ودقة الصورة إلى 1,024 × 1,024 بكسل، وسرعة الاكتساب إلى 4 ميكروثانية/بكسل. في تصوير ألياف الكولاجين بتقنية SHG، تم ضبط طول موجة الإثارة إلى 950 نانومتر باستخدام نفس هدف الغمر في الماء بمقدار 25 مرة. تم بدء مسح z-stack من السطح العلوي للأدمة إلى عمق مسح إجمالي يبلغ 45 ميكرومتر، مع الحفاظ على حجم خطوة 2 ميكرومتر، ودقة صورة 1024 × 1024 بكسل، وسرعة اكتساب 4 ميكروثانية/بكسل. بعد جلسة التصوير، تم إخراج الفأر بعناية من مرحلة المجهر، وتوقف استخدام الإيزوفلوران، ووضع الفأر على وسادة تدفئة حتى استعاد وعيه بالكامل قبل إعادته إلى القفص المنزلي.
جمع الأنسجة والمعالجة النسيجية
تم إعدام مجموعة منفصلة ومنفصلة من ثلاثة فئران من المجموعة الأنسجة كل يومين من اليوم الثاني حتى اليوم السادس والعشرين، وفقا للإرشادات المؤسسية، لضمان عدم إعادة استخدام أي فأر لأخذ عينات نسيجية طولية. تم استئصال عينة نسيج جلد ظهري كامل السماكة بحجم 2 سم × 2 سم مركزة بدقة عند تقاطع الخطين الأفقي والعمودي في ظهر كل فأر. تم وضع نسيج الجلد المستخرج بشكل مسطح على بطاقة صلبة لمنع انحناء الحواف وغمره فورا في أنبوب اختبار يحتوي على 4٪ بارافورمالديهايد. تم تجفيف الأنسجة المثبتة ودمها لتحضير مقاطع بارافين بسماكة 6 ميكرومتر. قبل إزالة الشمع، كانت أقسام البرافين تسخن على سخان منزلق لمدة 120 دقيقة. تم صبغ الأقسام بالهيماتوكسيلين والإيوسين (HE) وSirius Red باستخدام مجموعات التلوين القياسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تركيب الأقسام بطبقة علكة محايدة وتمت مراقبتها باستخدام مجهر مقلوب. للتصوير المستقطب بالبلورات السائلة، تم تصوير الأقسام التي تم إزالة الشمع ومصبوغة باللون الأحمر من سيريوس تحت مجهر ضوئي مستقطب. تم إنشاء زاوية مستقطبة موحدة عن طريق عبور المستقطب والمحلل عند 90° بالضبط لتحقيق خلفية مظلمة للغاية (حالة الانقراض)، وكانت هذه الزاوية المحددة تقفل باستمرار لجميع الصور اللاحقة.
تنظير الجلد في الجسم الحي والمجهر الإلكتروني لجذور الشعر
قبل القطف، تم تقييم منطقة نمو الشعر الظهري في الجسم الحي باستخدام منظار جلدي سريري بتكبير 20 مرة. تم قياس تجديد الشعر باستخدام نظام تقييم قياسي من 0 إلى 3 يعتمد على ظهور وكثافة ساق الشعر (0 = عدم ظهور الشعر المرئي؛ 1 = بروز الشعر المتناثر؛ 2 = كثافة شعر متوسطة؛ 3 = كثافة كاملة للشعر). لضمان أخذ عينات غير متحيزة، تم تقسيم المنطقة الظهرية الخالية من الشعر لكل فأر بصريا إلى أربعة أرباع متساوية. تم استخدام مولد أرقام عشوائية لاختيار ربعين لكل فأرة، وتم نزع خمسة أعمدة شعر جديدة من كل ربع مختار باستخدام ملقط معقم. تم غمر أعمدة الشعر المقتزعة فورا وتثبيتها في 2.5٪ جلوتارالديهيد في محلول فوسفات بعمق 0.1 متر (pH 7.4) لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية للحفاظ على البنية الفائقة. تم غسل أعمدة الشعر الثابتة ثلاث مرات في مخزن فوسفات بقطر 0.1 متر، ثم جففت بشكل متسلسل عبر سلسلة إيثانول متدرجة (50٪، 70٪، 80٪، 90٪، و100٪) لمدة 15 دقيقة عند كل تركيز، تلتها تجفيف نقاط حرجة باستخدام ثاني أكسيد الكربونالسائل 2. تم تثبيت أعمدة الشعر المجففة أفقيا على شريط كربوني موصل مزدوج الجانب مثبت على قطع الألمنيوم. تم طلاء العينات بطبقة ذهبية عيار 10 نانومتر باستخدام طبقة تفريغ لمدة 60 ثانية لمنع شحن الإلكترونات. تم إدخال العينات المطلية في مجهر إلكتروني ماسح، وتمت ملاحظة أعمدة الشعر باستخدام جهد متسارع 5.0 كيلوفولت. تم تقييم التغيرات الشكلية فوق المجهرية بشكل منهجي من خلال التقاط صور بتكبير 500x و1,000x، مع توثيق قطر ساق الشعر وسلامة وترتيب القشور الجلدية بشكل منهجي.
البيانات والتحليل الإحصائي
تم قياس وقياس معلمات الصورة باستخدام برنامج تحليل صور عام. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية والتمثيلات الرسومية باستخدام برامج تحليل إحصائي قياسية. بالنسبة لبيانات المراقبة المستمرة في الجسم الحي التي تم الحصول عليها من نفس الحيوانات عبر عدة نقاط زمنية، تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين بمقاييس متكررة (RM-ANOVA) تلاه اختبار بونفيروني بعد الاختبار . بالنسبة للبيانات الأنسجة التي تشمل عينات حيوانية مستقلة، تم استخدام تحليل أنوفي أحادي الاتجاه عادي يتبعه اختبار توكي بعد التحليل لتقييم الفروق الإحصائية. تم التعبير عن جميع النتائج كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم اعتبار الفروق ذات دلالة إحصائية عند *p < 0.05، وp < 0.01، و***p < 0.001.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ملاحظة شعر الفأر
تعرض الملاحظات الفوتوغرافية لنمو شعر الفئران في الشكل 1A. بدأ ظهور الشعر عبر سطح الجلد في اليوم العاشر، مع استمرار النمو بين اليوم الثاني عشر واليوم السادس عشر (الصفحة < 0.05). استقرت تغطية الشعر بعد ذلك من اليوم الثامن عشر حتى اليوم 26 (ص> 0.05) (الشكل 1B). علاوة على ذلك، سهل التنظير الجلدي المراقبة غير الجراحية لديناميكيات نمو الشعر في الجسم الحي . في اليوم الثاني...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم اختيار نموذج الفأر C57BL/6 لأن مرحلة التيلوجين الثانية تستمر بشكل مستقر من الأسبوع السابع حتى الأسبوع الثاني عشر. نظرا لأن نافذة الملاحظة التي تبلغ 26 يوما تقع بالكامل ضمن هذه المرحلة الثابتة، فإن التغيرات الديناميكية العميقة التي تلاحظ تدفعها تطور الدورة الناتجة عن إزالة الشعر صراحة من خلال تطور الدورة الناتجة عن إزالة الشعر، مستثنية تماما التقلبات الطبيعية المرتبطة بالعمر. عندما يتم إزالة الشعر خلال مرحلة التيلوجين، تدخل بصيلات الشعر فورا مرحلة الأناجين. حسب علم المؤلف، تقدم هذه الد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يصرح المؤلفون بعدم وجود مصالح مالية متنافسة أو علاقات شخصية معروفة قد أثرت على العمل المذكور في هذه الورقة. يتوفر نسخة أولية من هذا المقال في مستودع BioRxiv العام في المرجعالتالي 42.
وقد دعم هذا العمل صندوق الابتكار في الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (المعرف: CI2025C001)، ومشروع الابتكار العلمي والتكنولوجي التابع لأكاديمية الصين للعلوم الطبية الصينية (منحة رقم). NLTS2025004)، وصناديق البحث الأساسية لمعاهد البحوث المركزية للرعاية العامة (المنحة رقم JJPY2025002).
مساهمات المؤلفين: التصور، جاييينغ هي ويي وانغ؛ التحقيق، منغهوا ليو، شياويو وانغ، وفنغلونغ وانغ؛ منغهوا ليو في تنسيق البيانات؛ الكتابة — إعداد المسودة الأصلية، منغهوا ليو؛ الاستحواذ على التمويل، يي وانغ. جميع المؤلفين قرأوا ووافقوا على النسخة المنشورة من المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فئران C57BL/6 | بكين فيتال ريفر لابوراتوري أنيمل تكنولوجي | SCXK (Jing) 2021-0006 | يستخدم لنماذج الحيوان |
| كاميرا DSLR رقمية | Canon | EOS 80D | يستخدم لالتقاط صور الجزء الخلفي من الفئران |
| مجموعة تلوين H&E | LtdSolarbio Science & Technology Co. | G1120 | يستخدم لتلوين شرائح الأنسجة |
| مجهر مقلوب | Olympus | BX51 | يستخدم لالتقاط الصور |
| الآيزوفلورين | RWD Life Science Co. | R510-22-16 | يستخدم لتخدير الحيوانات |
| Mai Tai DeepSee | SpectraPhysics | Mai Tai HP | يستخدم لتصوير TPEF وSHG داخل الجسم |
| منظار الجلد الإلكتروني الطبي | China Chuanghong Medical Technology Co. | CH-DSIS-2000 | يستخدم لتصوير لون البشرة داخل الجسم |
| مجهر الضوء المستقطب | Olympus | BX51-P | يستخدم لتصوير تلوين Sirius Red |
| مجهر إلكتروني ماسح | Hitachi High-Tech Corporation | SU8010 | لمراقبة بنية شعر الحيوانات الصغيرة |
| مجموعة تلوين Sirius Red | Solarbio | G1472 | لتلوين ألياف الكولاجين |
| آلة تخدير الحيوانات الصغيرة | RWD Life Science Co. | R500 | يستخدم لتخدير الحيوانات |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.