مقالة منهجية

تأسيس نموذج تثبيط المناعة الناتج عن تعفن الدم للفئران عن طريق إدخال البكتيريا عبر الأنف

119 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70150

⸱

يونيو 12, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Burns and Combined Injury, Army Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Daping Hospital, Army Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج تثبيط المناعة لتعفن الدم في الفأر عبر التلقيح الأنفي لكلبسييلا الرئوية وأكدنا النموذج من خلال مؤشرات متنوعة.

الملخص

تعفن الدم هو فشل في الأعضاء يهدد الحياة ناتج عن استجابة المضيف غير المناسبة للعدوى. الالتهاب الرئوي هو السبب الرئيسي لتعفن الدم. نماذج الحيوانات أدوات مهمة لدراسة سبب مرض الإنتان وتقييم استراتيجيات العلاج الجديدة. كانت النماذج الحيوانية السابقة للإستان تفتقر إلى مسارات العدوى الطبيعية، مما جعل من الصعب عكس عملية العدوى السريرية بدقة.

قدمت هذه الدراسة نموذج تثبيط المناعة لتعفن الدم للفأر تم تأسيسه عن طريق الغرس الأنفي لمرض كليبسييلا الرئة (KP) لمحاكاة مسار العدوى التنفسية الطبيعي. بعد النمذجة بتركيزات مختلفة من KP، تم تقييم التهاب النموذج عند 12 ساعة لمستويات الإنترلوكين-6 (IL-6) في السيتوكين، وتقييم تلف الأعضاء عند 24 ساعة لمستويات إنزيم ألينين أمينوترانسفيراز (ALT)، وإنزيم الأسبارتات أمينوترانسفيراز (AST)، وكرياتين كيناز (CK)، ونيتروجين اليوريا في الدم (BUN). تم تحليل معدل بقاء النموذج بعد 7 أيام. تمت ملاحظة نسبة الخلايا اللمفاوية وخلايا الدم البيضاء، ونسبة تعبير معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الثانية (MHC-II) في الخلايا الأحادية، ومتوسط شدة التألق (MFI) لIL-10 وTGF-β1 في خلايا CD4+ التائية لتقييم كبت المناعة لدى الفئران. بعد 7 أيام من النمذجة، تم إجراء عدوى ثانوية عن طريق الزرع الأنفي لمرض كاذبة الهواء (PA). تم تقييم الحمل البكتيري في سائل غسل الشعب الهوائية (BALF) بعد 24 ساعة من العدوى الثانوية ومعدل الوفيات خلال 14 يوما لتقييم تثبيط المناعة في النموذج بشكل أعمق.

يمكن أن يؤدي الغرس الأنفي لكلبسيلا الرئوي عالي التركيز إلى تثبيط المناعة بشكل فعال. الغرض منه هو محاكاة تعفن الدم الناتج عن مسار عدوى تنفسية طبيعية وتوفير نموذج معياري لأبحاث الإنتان في الحيوانات.

المقدمة

تعفن الدم هو فشل عضو مهدد للحياة ناتج عن استجابة المضيف غير المناسبة للعدوى 1,2,3. يعد من الأسباب الرئيسية للوفاة في وحدات العناية المركزة. على مستوى العالم، هناك 48.9 مليون حالة تعفن الدم سنويا، مع 11 مليون حالة وفاة مرتبطة4. على الرغم من التقدم الأخير في العلاج المضاد للعدوى وتقنيات دعم الأعضاء، لا يزال سبب مرض الإنتان غير مفهوم بشكل كامل، كما أن خيارات العلاج المحددة مفقودة. وبالتالي، أصبح الإنتان محورا وتحديا رئيسيا في البحث الطبي السريري4.

تلعب نماذج الحيوانات دورا لا يمكن استبداله في البحث الطبي الأساسي والترجمي، حيث تعد أدوات أساسية للتحقيق في مسببات مرض الإنتان وتقييم استراتيجيات علاجية جديدة. من خلال محاكاة العمليات الفسيولوجية المرضية لتعفن الدم البشري، لا تسهل هذه النماذج فقط استكشاف آليات رئيسية مثل اضطرابات المناعة وضعف الأعضاء، بل توفر أيضا منصة تجريبية لفحص الأدوية وتطوير استراتيجيات التدخل. من بين نماذج الحيوانات المختلفة، تعد الفئران الأكثر استخداما في أبحاث الإنتان بسبب خلفيتها الجينية المحددة جيدا، والبحث المكثف على جهازها المناعي، وسهولة التلاعب بها.

حاليا، تتوفر عدة نماذج حيوانية لتعفن الدم تعتمد على نماذج مختلفة، بما في ذلك نماذج السموم الداخلية، نماذج التسريب البكتيري، نماذج الربط والثقب الدماغي (CLP)، ونماذج التهاب الصفاق الدعائي للقولون (CASP)5. ومع ذلك، تفتقر هذه النماذج إلى مسارات العدوى الطبيعية، مما يجعل من الصعب عكس عملية العدوى السريرية بشكل حقيقي. أفادت الدراسات أن الالتهاب الرئوي هو السبب الرئيسي لتعفن الدمفي الولايات المتحدة. لذلك، فإن إنشاء نموذج تعفن الدم للفأر يحاكي مسارات العدوى الطبيعية، ويظهر خصائص مثبطة للمناعة، وسهل التشغيل مع قابلية تكرار عالية، يعد ذا أهمية كبيرة للبحث المتعمق في آليات المناعة لتعفن الدم ولتقييم استراتيجيات التدخل المحتملة.

تمثل كلبسييلا الالتهاب الرئوي (KP) نسبة تتراوح بين 3٪ إلى 8٪ من جميع العدوى البكتيرية المكتسبة في المستشفيات 7,8,9. يمكن لهذه البكتيريا دخول الجسم عبر بوابات مختلفة، بما في ذلك الجهاز التنفسي والجهاز الهضمي والمسالك البولية، بالإضافة إلى الجلد، والعدوى الناتجة عن التهاب البكتيريا لها توقعات ضعيفة، خاصةلدى المرضى ذوي المناعة الضعيفة. نظرا لأن الالتهاب الرئوي هو السبب الرئيسي للتسمم وKP هو ممرض تنفسي شائع مرتبط بنتائج سيئة، فإن KP مرشح مثالي لوضع نموذج تعفن الدم ذو صلة سريرية.

على الرغم من أن مجموعة متنوعة من نماذج الحيوانات لعدوى KP، بما في ذلك الطريقة الأنفية، قد تم تأسيسها سابقا11، إلا أن بعض الدراسات ركزت على تحسين النموذج لتحفيز تثبيط المناعة المرتبط بالإنتان أو تحديد التركيز الأمثل ل KP لتأسيس النموذج. تحد هذه الفجوة من فائدة نماذج KP الحالية لدراسة خلل المناعة الناتج عن الإنتان.

لتلبية هذه الحاجة، أنشأنا نموذج تثبيط المناعة الناتج عن الإنتان في الفئران عبر الحقن الأنفي ل KP. مقارنة بالنماذج الحالية، يحاكي هذا النموذج المسارات الطبيعية للعدوى التنفسية. تم التحقق من صحة النموذج لتوفير طريقة للبحث اللاحق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الموضحة في هذا المقال من قبل لجنة رعاية الحيوانات والأخلاقيات المختبرية في الجامعة الطبية العسكرية الثالثة (SCXK(PLA)20120031).

1. الحيوانات التجريبية

  1. استخدم فئران C57BL/6، ذكر، عمرها 8–10 أسابيع، وزنها 23–28 جرام (رقم رخصة الحيوان: SCXK (شيانغ) 2019-0004). ضع الفئران في بيئة خالية من مسببات الأمراض (SPF) مع وصول مجاني إلى الطعام والماء. حافظ على ظروف السكن كما يلي: درجة حرارة الغرفة (24 ± 2ºc)، رطوبة بين 50٪–55٪، ودورة 12 ساعة لكل 12 ساعة من الإضاءة إلى الظلام.

2. تحضير البكتيريا

  1. استخدم سلالة مناسبة. هنا، استخدم سلالة كليبسييلا الرئوية الأمريكية من مجموعة الزراعة النوعية الأمريكية (ATCC) رقم 43816.
  2. حضر وسيطا مناسبا للزراعة (مرق لوريا-بيرتاني [LB]).
  3. جهز البكتيريا للغرس.
    1. اختر مستعمرة واحدة وقم بتطعينها ب 5 مل من مرق LB، ثم حضن طوال الليل (12 ساعة) في شاكر عند 37 درجة مئوية و220 دورة في الدقيقة.
    2. نقل الزراعة البكتيرية الليلية إلى مرق LB طازج وزراعة لمدة 3–4 ساعات حتى تصل إلى مرحلة النمو عالية الكثافة (كثافة بصرية عند 600 نانومتر [OD600] ≈ 0.8).
    3. بعد تخفيف المحلول البكتيري، خذ 100 ميكرولتر وأضفه إلى قاع طبق الزراعة الذي يحتوي على وسط زراعة صلب. ضعه في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة، وعد عدد المستعمرات، واحصل على تركيز KP عند 2 × 109 وحدة CFU/mL، أي OD600 ≈ 0.8.
    4. اضبط تركيز البكتيريا باستخدام محلول NaCl بنسبة 0.9٪. جهز ثلاث تعليقات بكتيرية بتركيزات 1 × 108 CFU/mL، 1 × 106 CFU/mL، و1 × 104 CFU/mL للاستخدام لاحقا.

3. عدوى الغرس عبر الأنف (الشكل 1)

  1. تخدير الفأر عن طريق حقن 2٪ من الصوديوم بنتوباربيتال داخل الصفاق بجرعة 2 ميكرولتر/جم (الشكل 1A,B).
  2. عندما يظهر الفأر وعيه منخفضا لكنه يحتفظ بانعكاس البلع، استنشق 50 ميكرولتر من التعليق البكتيري (أو محلول NaCl بنسبة 0.9٪ كضابط) باستخدام ميكروبيبت.
  3. أمسك عنق الفأر برفق مع وضع الإبهام على مقدمة الرقبة، وامسك جسد الفأر برفق ببقية الأصابع. قم بإمالة رأس الفأر للخلف (الشكل 1C).
  4. قم بإدخال التعليق البكتيري تدريجيا في فتحتي أنف الفأر باستخدام ماصة (حوالي 5–10 ميكرولتر لكل قطرة). ازرع قطرة واحدة في فتحة أنف واحدة في كل مرة (الشكل 1D).
  5. بعد ملاحظة أن الفأر قد استنشق التعليق، ارفع الفأر بسرعة للأعلى ثم خفضه ببطء لتعزيز استنشاق التعليق إلى القصبات الهوائية (الشكل 1E,F).
  6. كرر الخطوات السابقة، مع التناوب بين الحقن في فتحة الأنف الأخرى حتى يستنشق الفأر تعليق البكتيريا بسعة 50 ميكرولتر بالكامل.
  7. إذا سعل الفأر أو تنهد أو لم يستطع استنشاق المحلول البكتيري أثناء العملية، دع الفأر يرتاح ويراقب. بعد استقرار الوضع، استمر في خطوة الاستنشاق لضمان استنشاق الفأر لكل محلول البكتيريا (أو 0.9٪ NaCl).
  8. ثبت الفأرة في وضعية الاستلقاء على لوحة الفأرة مائلة بزاوية 60°. إذا كانت درجة حرارة الغرفة منخفضة، استخدم مدفأة لمساعدة الفأر على التعافي. راقب الفأر حتى يتعافى تماما من التخدير، ثم أعده إلى قفصه مع ظروف حرارة مثالية، وماء كاف، وطعام.

4. تقييم النموذج

ملاحظة: تم تأسيس أربع مجموعات من نماذج الفئران عبر طريقة التلقيح داخل الأنف المذكورة أعلاه، وهي مجموعة التحكم (المجموعة أ، مزروعة ب PBS)، مجموعة تركيز 1 ×10 4 كيلو بي (المجموعة ب)، مجموعة تركيز 1 ×10 6 كيلو بير (المجموعة ج)، ومجموعة تركيز 1 × 108 كيلومتر (المجموعة د). تم تقييم النموذج باستخدام الطرق التالية:

  1. قيم مؤشرات الالتهاب لمدة 12 ساعة.
    1. بعد 12 ساعة من التلقيح الأنفي ل KP، اجمع الدم (≥ 300 ميكرولتر) عن طريق البزل القلبي (n = 5 لكل مجموعة). افصل المصل عن طريق الطرد المركزي (1000 × ج، 10 دقائق) واستخدامه للكشف عن الإنترلوكين السيتوكيني-6 (IL-6).
  2. تقييم تلف الأعضاء على مدار 24 ساعة
    1. بعد 24 ساعة من حقن الكين بالأنف، استخدم المصل للكشف عن المؤشرات الكيميائية الحيوية (n = 5 لكل مجموعة). من بين هذه المؤشرات، استخدم ألانين أمينوترانسفراز (ALT) وإزيزيف الأسبارتات أمينوترانسفيراز (AST) لتقييم تلف الكبد، وإنزيم الكرياتين كيناز (CK) لتلف العضلات، ونيتروجين اليوريا في الدم (BUN) لتلف الكلى.
  3. تقييم الأعراض
    1. راقب وزن جسم الفأر يوميا، وراقب حالة الشعر، ومستوى نشاطه، ومعايير أخرى.
  4. السيتوكينات والخلايا المناعية لمدة 7 أيام
    1. بعد 7 أيام من النمذجة (n = 10 [A/B]، n = 15 [C]، n = 40 [D])، يجمع الدم المحيطي عبر ثقب القلب لتحليل تدفق الخلايا الخلوية لتقييم نسب الخلايا اللمفاوية، ونسبة تعبير مركب التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الثانية (MHC-II) في الخلايا الأحادية، وهو متوسط شدة التألق MFI) ل IL-10 وTGF-β1 في خلايا T CD4+ .
    2. معالجة الأنسجة
      1. اخلط عينات الدم (100 ميكرولتر) مع محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (300 ميكرولتر) بنسبة حجم 1:3. بعد 15 دقيقة من تحليل كريات الدم الحمر في درجة حرارة الغرفة، قم بطرد المركزي بالخليط عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من السوبرناتانت.
      2. أعد تعليق الحبيبة في 200 ميكرولتر من مخزن تحلل كريات الدم الحمراء (نسبة الحجم = 1:2) وحضن القرص لمدة 10 دقائق للتحلل الثانوي.
      3. بعد عملية طرد مركزية أخرى عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق، قم بإزالة الفائق الحيوي، وأعد تعليق الحبيبة في 100 ميكرولتر من مخزن صبغة الخلية.
      4. أضف 1 ميكرولتر من كل جسم مضاد لقياس خلوية التدفق إلى العينات. باختصار، أضف CD45 لتلوين اللمفاويات؛ CD45، CD116، Ly6G، Ly6C، وMHC-II للكشف عن MHC-II؛ CD45، CD3، CD4، CD8، وCD25 لقياس IL-10 وTGF-β1. نسبة التخفيف لكل جسم مضاد مذكور أعلاه هي 1:100.
      5. حضن جميع العينات على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد ذلك، أضف 1 مل من مخزن صبغة الخلية، ثم استخدم الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق؛ تخلص من السوبرناتانت.
      6. لاكتشاف الخلايا اللمفاوية وMHC-II، أعد تعليق 400 ميكرولتر من حاجز بقع الخلية قبل تحليل قياس تدفق السيلتومتر.
      7. بعد ذلك، نفذ إجراءات للكشف عن IL-10 وTGF-β1 وفقا للخطوات 4.4.2.8–4.4.2.12:
      8. أضف 1 مل من حاجز التثبيت وحضن العينات عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 60 دقيقة.
      9. بعد إضافة 1 مل من محلول التجويف، قم بعمل طرد مركزي على 400 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من السوبرناتان.
      10. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من المخزن الدائم، تليها إضافة 1 ميكرولتر لكل من الأجسام المضادة Foxp3 وIL-10 وTGF-β1. حضن العينات على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
      11. بعد ذلك، أضف 1 مل من المخزن الدائم، واستخدم الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق قبل إزالة السوبرناتانت.
      12. وأخيرا، أعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من حاجز بقع الخلية واكتشافها بواسطة قياس تدفق الخلية.
    3. استراتيجية البوابة
      1. لاكتشاف الخلايا اللمفاوية، استبعد الحطام والدوبلات في مخطط FSC-A/FSC-H. حدد إجمالي كريات الدم البيضاء كأحداث CD45⁺. تهيئة الخلايا اللمفاوية بناء على انخفاض FSC/SSC ضمن مجموعة CD45⁺.
      2. للكشف عن MHC-II، يجب أولا إجراء بوابة الكريات البيضاء على FSC-A/SSC-A لاستبعاد الحطام، ثم اختيار خلايا CD45⁺. حدد خلايا النخاع ك CD11b⁺، مع استبعاد العدلات بسبب سلبية Ly6G. عرف الخلايا الأحادية الكلاسيكية كخلايا Ly6G⁻ Ly6Chi، وقيم تعبير MHC-II داخل هذه المجموعة.
      3. لاكتشاف IL-10 وTGF-β1، استبعد الحطام والدوبلتات بواسطة FSC-A/SSC-A و FSC-A/FSC-H. حدد إجمالي الخلايا التائية كأحداث CD45⁺CD3⁺. داخل مجموعة CD4⁺CD8⁻، حدد Tregs كخلايا CD25⁺FOXP3⁺. قم بقياس خلايا TGF-β⁺ في مجموعة Treg، وتقييم تعبير IL-10 عبر جميع خلايا CD4⁺ التائية. قم بضبط جميع البوابات الإيجابية باستخدام أدوات التحكم في FMO.
  5. عدد البكتيريا في سائل غسل القصبات الهوائية (BALF) بعد 24 ساعة من العدوى الثانوية
    1. في اليوم السابع بعد تأسيس النموذج (n = 5 [A/B]، n = 10 [C]، n = 40 [D])، خضع الفأر لحقن داخل الأنف ل 50 ميكرولتر من Pseudomonas aeruginosa (PA) (بتركيز 6.8 × 1010 CFU/mL) باستخدام طريقة الغرز عبر الأنف المذكورة سابقا.
    2. بعد 24 ساعة من الإصابة الثانوية بالتهاب المفاجئ الدماغي، اجمع 1.5 مل من سائل غسل الشعب الهوائية (BALF). قم بتخفيف BALF بشكل تسلسلي، ثم وضعه على وسط سائل LB، وحضنه في حاضنة بدرجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل عد المستعمرة.
    3. اتبع هذه الخطوات لجمع BALF.
      1. قم بتخدير عميق (2.5 ميكرولتر/جم 2٪ صوديوم بنتوباربيتال) أو القتل الرحيم (7.5 ميكرولتر/جم 2٪ صوديوم بنتوباربيتال) بشكل إنساني وضعه في وضعية الاستلقاء على الظهر مع تمديد الرقبة بشكل مفرط.
      2. قم بعمل شق في منتصف خط الرقبة لكشف القصبة الهوائية. أدخل قسطرة 24G حادة في القصبة الهوائية حتى ما بعد الكارينا مباشرة وتثبيتها بخياطة.
      3. قم بإدخال وسحب PBS المعقم والبارد بلطف (0.5 مل لكل أليكوت) باستخدام حقنة بسعة 1 مل. كرر دورة الغسل هذه من 3 إلى 5 مرات. قم بتنفيذ هذه العملية ثلاث مرات، مما ينتج عنه حجم غسيل إجمالي يبلغ 1.5 مل.
  6. تحليل البقاء
    1. استخدم مجموعة منفصلة من الفئران لتحليل البقاء (n = 10 [A/B/C]، n = 40 [D]).
    2. سجل حالة بقاء الفئران خلال 7 أيام بعد الإصابة.
    3. بعد الإصابة الثانوية بالتهاب المفاجأة الزائدة، راقب معدل وفيات الفئران من اليوم السابع حتى اليوم الرابع عشر.
    4. بعد المراقبة، يتم تخدير الفئران بعمق باستخدام الإيزوفلوران (5٪) ثم يتم التخلص منها عن طريق الحقن البريتوني بجرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال (150 ملغ/كغ)، مع تأكيد الوفاة بسبب خلع عنق الرحم.
  7. التحليل الإحصائي
    1. إجراء اختبارات الطبيعية واختبارات تجانس التباين على البيانات الكمية.
    2. للمقارنات بين المجموعات، استخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) إذا كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي وتظهر تباين متجانس؛ وإلا، استخدم اختبارات غير معلمية.
    3. إجراء تحليل البقاء باستخدام طريقة كابلان-ماير. استخدم نماذج التأثيرات المختلطة لاختبار الفروق في تغيرات وزن الجسم بين المجموعات في نقاط زمنية مختلفة. اعتبر قيمة p ≤ 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد 12 ساعة من التلقيح عبر الأنف، ارتفع مستوى IL-6 في المصل في مجموعة 1 ×10 8 KP بشكل ملحوظ (p < 0.0001، n = 5) (الشكل 2A). بعد 24 ساعة من التلقيح الأنفي، كانت مستويات ALT (p < 0.01، n = 5) (الشكل 2B)، AST (p < 0.01، n = 5) (الشكل 2C)، CK (p < 0.01، n = 5) (الشكل 2D)، وBUN (p < 0.001، n = 5) (الشكل 2E) في مجموعة 1 × 108

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعفن الدم هو متلازمة سريرية معقدة، والحالة المثبطة للمناعة المميزة في مراحله المتأخرة هي عامل رئيسي يؤدي إلى وفاة المريض12,13. لذلك، فإن النماذج ما قبل السريرية التي تحاكي بدقة الفيزيولوجيا المرضية لتثبيط المناعة الناتج عن الإنتان ضرورية لاستكشاف آلياته بشكل معمق وتطوير علاجات جديدة. في هذه الدراسة، نجحنا في تأسيس والتحقق من نموذج تعفن الدم للفأر الناتج عن حقن KP عن طريق الأنف، مع ميزة جوهرية تتمثل في تكرار الحالة المثبطة للمناعة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد حظي هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82222038 و 81970259)، ومواهب الشباب المتميزة في تكنولوجيا الدفاع الوطني الحيوية (2023-JCJQ-ZQ-001 و01-SWKJYCJJ06)، وصندوق تشونغتشينغ للعلوم للعلماء الشباب المتميزين (CSTB2022NSCQ-JQX0017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Biochemical incubatorYSEISHH-150LBacterial incubation
C57BL/6J miceVital River Laboratories8-10 weeks, male
CD116bBioLegend101257Flow Antibodies (Anti-Mouse)
CD25BD bioscience740447Flow Antibodies (Anti-Mouse)
CD3BioLegend100203Flow Antibodies (Anti-Mouse)
CD4BioLegend100544Flow Antibodies (Anti-Mouse)
CD45BioLegend103116Flow Antibodies (Anti-Mouse)
CD8BioLegend100752Flow Antibodies (Anti-Mouse)
Cell stain buffer BioLegend420201
Constant temperature shakerHonourHNY-100BBacterial cultivation
Flow cytometerBeckman CoulterCytoFLEXFlow cytometry analysis
High-speed centrifugeBeckman CoulterAIIEGRA
IDEXX catalyst oneIDEXXCatalyst OneBiochemical analysis
IL-10BioLegend505026Flow Antibodies (Anti-Mouse)
Insulin cyringe WEGO1mLBlood collection
Klebsiella pneumoniae ATCC 43816biobw.orgbio-81659
LB Broth (powder)SolarbioL1010LB liquid culture medium
LB Broth (powder)SolarbioL1015LB agar plate
LY6CBioLegend128010Flow Antibodies (Anti-Mouse)
Ly6GBioLegend127606Flow Antibodies (Anti-Mouse)
MHC-IIBioLegend107622Flow Antibodies (Anti-Mouse)
MicropipetteEppendorfP100
Red blood cell lysis bufferSolarbioR1010
SpectrophotometerEppendorfEppendorf6131Optical density measurement
Statistical softwareGraphPad SoftwareGraphpad Prism10.0
Sterile and enzyme-free pipette tipsBiosharp200μL
TF diluent bufferBD Pharmingen51-90008101
TF fix/perm bufferBD Pharmingen51-90008100
TF perm/wash bufferBD Pharmingen51-90008102
TGF-β1BioLegend141406Flow Antibodies (Anti-Mouse)
Varioskan LUX multimodemicroplate readerThermo ScientificVarioskan LUX 

المراجع

  1. Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
  2. Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: for the third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
  3. Seymour, C. W., et al. Assessment of clinical criteria for sepsis: for the third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3). JAMA. 315 (8), 762-774 (2016).
  4. Meyer, N. J., Prescott, H. C. Sepsis and septic shock. N Engl J Med. 391 (22), 2133-2146 (2024).
  5. Kingsley, S. M., Bhat, B. V. Differential paradigms in animal models of sepsis. Curr Infect Dis Rep. 18 (9), 26(2016).
  6. Hansen, V., Oren, E., Dennis, L. K., Brown, H. E. Infectious disease mortality trends in the United States, 1980-2014. JAMA. 316 (20), 2149-2151 (2016).
  7. Ashurst, J. V., Dawson, A. Klebsiella pneumonia. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  8. Jondle, C. N., Gupta, K., Mishra, B. B., Sharma, J. Klebsiella pneumoniae infection of murine neutrophils impairs their efferocytic clearance by modulating cell death machinery. PLoS Pathog. 14 (10), e1007338(2018).
  9. Aghamohammad, S., et al. First report of extended-spectrum betalactamase-producing Klebsiella pneumoniae among fecal carriage in Iran: high diversity of clonal relatedness and virulence factor profiles. Microb Drug Resist. 26 (3), 261-269 (2020).
  10. Bengoechea, J. A., Sa Pessoa, J. Klebsiella pneumoniae infection biology: living to counteract host defenses. FEMS Microbiol Rev. 43 (2), 123-144 (2019).
  11. Assoni, L., et al. Animal models of Klebsiella pneumoniae mucosal infections. Front Microbiol. 15, 1367422(2024).
  12. Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nat Rev Immunol. 13 (12), 862-874 (2013).
  13. Van Der Poll, T., Van De Veerdonk, F. L., Scicluna, B. P., Netea, M. G. The immunopathology of sepsis and potential therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 17 (7), 407-420 (2017).
  14. Diboue Betote, P. H., et al. Sex-dependent vulnerability for Wistar rats model following intranasal instillation with Klebsiella pneumoniae ATCC 43816 causing lobar pneumonia. Pneumonia. 16 (1), 5(2024).
  15. Leus, I. V., Zgurskaya, H. I. No two are alike: on the role of Klebsiella pneumoniae permeability barriers in antibiotic susceptibility and persistence. Antimicrob Agents Chemother. 69 (8), e0008525(2025).
  16. Siempos, I. I., et al. Cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice. J Vis Exp. (84), e51066(2014).
  17. Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
  18. Prescott, H. C., Angus, D. C. Enhancing recovery from sepsis: a review. JAMA. 319 (1), 62-75 (2018).
  19. Barichello, T., Generoso, J. S., Singer, M., Dal-Pizzol, F. Biomarkers for sepsis: more than just fever and leukocytosis-a narrative review. Crit Care. 26 (1), 14(2022).
  20. Vulliamy, P. E., Perkins, Z. B., Brohi, K., Manson, J. Persistent lymphopenia is an independent predictor of mortality in critically ill emergency general surgical patients. Eur J Trauma Emerg Surg. 42 (6), 755-760 (2016).
  21. Pei, F., et al. Expert consensus on the monitoring and treatment of sepsis-induced immunosuppression. Mil Med Res. 9 (1), 74(2022).
  22. Lang, J. D., Matute-Bello, G. Lymphocytes, apoptosis and sepsis: making the jump from mice to humans. Crit Care. 13 (1), 109(2009).
  23. Wu, H., et al. Predictive value of the neutrophil-to-lymphocyte ratio in the prognosis and risk of death for adult sepsis patients: a meta-analysis. Front Immunol. 15, 1336456(2024).
  24. Siegler, B. H., et al. Postoperative abdominal sepsis induces selective and persistent changes in CTCF binding within the MHC-II region of human monocytes. PLoS One. 16 (5), e0250818(2021).
  25. Pachot, A., et al. Messenger RNA expression of major histocompatibility complex class II genes in whole blood from septic shock patients. Crit Care Med. 33 (1), 31-38 (2005).
  26. Padovani, C. M., Yin, K. Immunosuppression in sepsis: biomarkers and specialized pro-resolving mediators. Biomedicines. 12 (1), 175(2024).
  27. Misra, A. K., Levy, M. M., Ward, N. S. Biomarkers of immunosuppression. Crit Care Clin. 36 (1), 167-176 (2020).
  28. Monneret, G., et al. The anti-inflammatory response dominates after septic shock: association of low monocyte HLA-DR expression and high interleukin-10 concentration. Immunol Lett. 95 (2), 193-198 (2004).
  29. Bergmann, C. B., et al. Potential targets to mitigate trauma- or sepsis-induced immune suppression. Front Immunol. 12, 622601(2021).
  30. Van Vught, L. A., et al. Incidence, risk factors, and attributable mortality of secondary infections in the intensive care unit after admission for sepsis. JAMA. 315 (14), 1469-1479 (2016).
  31. Jones-Nelson, O., et al. The neutrophilic response to Pseudomonas damages the airway barrier, promoting infection by Klebsiella pneumoniae. Am J Respir Cell Mol Biol. 59 (6), 745-756 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MHC II
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة