التصوير عالي الدقة والإدارة المشتركة: بروتوكول للمجهر الكونفوكلي مع اكتشاف التعدد

Wei Yin; Guifeng Xiao; Sanhua Fang; Qianbing Zhao; Qiong Huang; Wei Wei; Xianzhu Zhang

doi:10.3791/70151

Method Article

التصوير عالي الدقة والإدارة المشتركة: بروتوكول للمجهر الكونفوكلي مع اكتشاف التعدد

DOI:

10.3791/70151

⸱

February 24th, 2026

Wei Yin¹ , Guifeng Xiao¹ , Sanhua Fang¹ , Qianbing Zhao¹ , Qiong Huang¹ , Wei Wei² , Xianzhu Zhang³

¹Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine, ²Department of Orthopedics, the Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, ³Department of Sports Medicine of the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول تطبيقات التصوير المتقدمة وإدارة الموارد المشتركة لنظام المجهر الكونفوكالي بالليزر المدمج مع كاشف مصفوفة متعدد الدقة للتصوير الخلوي وتحت الخلوي. يتيح سير العمل التصوير متعدد الوسائط من الدقة الكونفوكية إلى فائقة الدقة (~120 نانومتر) ضمن منصة واحدة، مما يجعل التصور على نطاق النانو أكثر سهولة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتغلب المجهر فائق الدقة (SRM) على حد الحيود في المجهر الضوئي التقليدي، مما يتيح التصور النانوي للهياكل تحت الخلية. ومع ذلك، فإن الاعتماد الواسع لتقنيات مثل المجهر الناتج عن استنزاف الانبعاث المحفز (STED)، والمجهر المعتمد على الموقع بالأشعة الضوئية (PALM) / المجهر البصري العشوائي (STORM)، والمجهر الإضاءة الهيكلية (SIM) يمكن أن يعيقه عوامل مثل السمية الضوئية العالية، أو تحضير العينة المتخصصة، أو العمليات المعقدة. هنا، نقدم بروتوكولا شاملا يستفيد من منصة كونفوكال بالمسح بالليزر مدمجة مع كاشف فائق الدقة متعدد الإرسال. يتيح هذا النظام، مع المعالجة الحاسوبية، انتقالا مباشرا بين التصوير الكونفوكلي والتصوير فائق الدقة ضمن نفس سير العمل. يوفر البروتوكول نهجا سهل الاستخدام للتصوير السريع والعالي الدقة ومنخفض السمية الضوئية. تشمل الطريقة التفصيلية قدرات التصوير متعدد الوسائط، بما في ذلك الفلورة متعددة الألوان، والتباين التفاضلي للتداخل (DIC)، وإعادة بناء المكدس Z ثلاثي الأبعاد، والتصوير الحي للخلايا الحية بالتايم لابس، والتبليط بمساحة كبيرة، وأنماط دقة فائقة متنوعة تقدمها كاشف المصفوفة متعددة الإرسال. تظهر المقارنات المنهجية أن أوضاع الدقة الفائقة تحقق دقة جانبية تقارب 120 نانومتر، مما يمثل تحسنا بحوالي مرتين عن حد الحيود في المجهر واسع المجال التقليدي، وتحسن كبير في كل من الدقة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء (4-8 أضعاف) مقارنة بالتشغيل الكونفوكلي القياسي على نفس المنصة. كما تغطي المناقشة النقاط الرئيسية لنموذج إدارة الموارد المشتركة الضروري لدعم التشغيل المستدام لهذه التقنية. يعد هذا الدليل المتكامل موردا قيما لكل من الباحثين الجدد وذوي الخبرة ومديري المنشآت الذين يسعون لتبني وتعظيم إمكانات هذا الشكل المتاح من التصوير المتقدم في أبحاث علوم الحياة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصور البنى الفرعية الديناميكية هو أساس لتقدم أبحاث علوم الحياة. ومع ذلك، فإن دقة المجهر البصري التقليدي محدودة بسبب الحيود إلى حوالي 200 نانومتر جانبيا، مما يحد من قدرته على تحليل العمليات تحت الخلوية الديناميكية. لتجاوز هذا الحاجز، تم تطوير تقنيات دقة فائقة مختلفة. ومع ذلك، غالبا ما تشكل تقنيات مثل المجهر STED، PALM/STORM، وSIM عوائق أمام الاعتماد الواسع في بيئات متعددة المستخدمين، بما في ذلك السمية الضوئية العالية، والحاجة إلى فلوروفورات متخصصة أو تحضير العينات، أو إجراءات محاذاة معقدة، أو معالجة حسابية مكثفة ^1,2,3.

في هذا السياق، تقدم أنظمة المجاهر الكونفوكالي المزودة بكاشف مصفوفة متعددة الإرسال بديلا مقنعا من خلال تمكين التصوير فائق الدقة من خلال الكشف متعدد البكسلات وإعادة التخصيص الحسابي، مما يقلل بشكل كبير من العتبة التقنية⁴. يستفيد هذا النهج من مصفوفة كاشف فوسفيد الجاليوم الأزرنيخي (GaAsP) المكونة من 32 عنصرا لجمع المزيد من الفوتونات من كل نقطة مسح. تعيد خوارزميات فك الالتفاف الذكية اللاحقة تعيين هذه المعلومات، مما يقلل فعليا من حجم الكشف. تحقق هذه العملية دقة مكانية تقارب 120 نانومتر جانبيا و350 نانومتر محوريا، مما يمثل تحسنا بحوالي 2 أضعاف عن حد الحيود في المجهر واسع المجال ويزيد بنسبة الإشارة إلى الضوضاء بمقدار 4-8 أضعاف مقارنة بالوضع الكونفوكالي القياسي على نفس الجهاز ^4,5,6. هذا المزيج الفريد من الدقة المحسنة، وجودة الإشارة المتفوقة، والتوافق مع العلامات والبروتوكولات الفلورية الشائعة يشكل ميزته الأساسية للتطبيقات الواسعة.

وبالتالي، وجد هذا النوع من المجهر فائق الدقة المتاح تطبيقا واسعا في أبحاث علوم الحياة، مما أتاح دراسات تفصيلية لشكل العضيات، وديناميكيات الهيكل الخلوي، وتفاعلات الفيروس-المضيف، والتمركز الجزيئي المشترك^{في كل من} الخلايا الثابتة والحية^. رقته النسبية تجعله مناسبا بشكل خاص للملاحظات الزمنية الممتدة للعينات الحية.

إن دمج هذه الأنظمة المتقدمة في المرافق الأساسية أمر بالغ الأهمية لديمقراطية الوصول، لكن تشغيلها المستدام والفعال يطرح تحديات واضحة. في المرافق الأساسية المؤسسية، مثل كلية الطب بجامعة تشجيانغ، يعتمد الأداء الأمثل والتأثير بشكل حاسم على ثلاثة أعمدة: (1) بروتوكولات تصوير موحدة وقابلة للتكرار، (2) صيانة روتينية صارمة، و(3) إطار إدارة فعال للوصول المشترك. بينما توجد موارد قيمة لجوانب محددة، مثل طرق التصوير للأنظمة⁹السابقة أو مبادئ إدارة المرافق العامة¹⁰^،¹¹، فإن دليلا شاملا يدمج بروتوكولات مفصلة وقابلة للتكرار لمنصات كاشف المصفوفة الحديثة متعددة الإرسال مع نموذج إدارة موارد مشتركة مثبت مفقود حاليا. تهدف هذه المقالة من البروتوكول إلى سد هذه الفجوة.

الهدف العام هو توفير دليل شامل خطوة بخطوة لتنفيذ واستخدام نظام كونفوكال مزود بكاشف مصفوفة متعدد الإرسال للتصوير فائق الدقة ضمن بيئة الموارد المشتركة. تم تصميمه لجمهورين رئيسيين: باحثون يحتاجون إلى دقة تتجاوز حدود الكونفوكات التقليدية (~250-300 نانومتر) لكنهم أيضا متوافقون مع الخلايا الحية، وسهولة الاستخدام، وسرعة النقل أمر بالغ الأهمية؛ ومديرو المرافق الذين يؤسسون أو يحسنون مثل هذه الخدمة. هنا، نفصل بشكل منهجي تكوين النظام، وبروتوكولات التصوير متعدد الوسائط (يشمل أنماط متعددة الألوان، ثلاثية الأبعاد، الخلايا الحية، التبليط، والدقة الفائقة)، ونموذج إدارة مشترك مثبت. يعمل هذا الدليل المتكامل كمورد لتعظيم الإمكانيات وسهولة الوصول إلى هذه الطريقة التصويرية القوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب التي شملت عينات بيولوجية وفقا للإرشادات واللوائح الخاصة بالمرافق الأساسية في كلية الطب بجامعة تشجيانغ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة السلامة الحيوية المؤسسية (شهادة الموافقة رقم) BSL20235710079).

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بزراعة الخلايا في ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ما لم يذكر خلاف ذلك. يفترض هذا البروتوكول تركيب نظام المجهر، ومعايرة قوى الليزر. المواصفات التفصيلية والموردين الموصى بهم للكواشف الرئيسية، والمستهلكات، والمعدات (مثل أطباق التصوير، زجاج التغطية، وسيط التثبيت) مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير العينة

ملاحظة: يبدأ التصوير فائق الدقة الناجح بتحضير العينة الأمثل. يعد استخدام أطباق تصوير زجاجية عالية الجودة بسماكة 1.5 (0.17 مم) ضرورية لمطابقة طوق التصحيح لأهداف الغمر الزيتي عالية الحمض النووي وتجنب الانحراف الكروي. يجب تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق ما لم يذكر ذلك.

تحضير عينات الخلايا الثابتة للتصوير متعدد الألوان فائق الدقة (مثل خلايا COS7)
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول التلوين المناعي للأنابيب الدقيقة (Alexa Fluor 568) والميتوكوندريا (Alexa Fluor 488)، باستخدام صبغة مضادة نووية 4',6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI)، كما هو موضح في الشكل 1.
1. زراعة خلايا COS7 في وسط إيجل المعدل (DMEM) من دولبيكو مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37°C في حاضنة ترطبة_{5٪ CO2} .
2. الخلايا الصفائحية على أطباق تصوير ذات قاع زجاجي بقطر 35 مم بكثافة 1.0 × 10⁵ خلايا لكل طبق. دع الخلايا تلتصق وتنمو حتى تصل إلى 60-70٪ (عادة 24 ساعة).
3. استنشق وسط الزراعة وغسل الخلايا مرة واحدة بلطف باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مسخن مسبقا (37°C). ثبت الخلايا بإضافة 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في PBS واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
4. استنشق محلول PFA (تعامل كنفايات خطرة). اغسل الخلايا ثلاث مرات بسعة 2 مل من PBS، مع احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق مع هز لطيف.
5. النفاذية والحصر: حضن الخلايا بمحلول نفاذ/حجب (0.1٪ v/v) Triton X-100، و1٪ (مع النفاذ/الوزن) ألبومين مصل البقري (BSA) في PBS) لمدة 30 دقيقة عند العلاج الطبيعي.
6. حضانة الأجسام المضادة الأولية: حضانة الخلايا التي تحتوي على مزيج من الأجسام المضادة الأولية ضد α-التوبولين (واحادي النسيلة الفأرية) وTOMM20 (متعدد النسيلة للأرنب) في مخزن تخفيف الأجسام المضادة (1٪ BSA في PBS) عند 4°C طوال الليل (أو 1-2 ساعة عند RT). استخدم 300 ميكرولتر لكل طبق لتغطية سطح الزجاج.
7. الغسيل: استنشق محلول الأجسام المضادة الأساسي بعناية. اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 2 مل من PBS يحتوي على 0.05٪ Tween-20 (PBST)، لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
8. تلوين الأجسام المضادة الثانوية والنووي: جهز مزيجا من الأجسام المضادة الفلورية الثانوية وDAPI في مخزن تخفيف الأجسام المضادة (1٪ BSA/PBS)، محمي من الضوء.
  1. استخدم IgG مضاد للفأر من الحمار المرتبط ب Alexa Fluor 568 (1:500) وIgG مضاد للأرنب مع Alexa Fluor 488 (1:500).
  2. تضمين DAPI بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل للتلوين النووي. ضع 300 ميكرولتر من هذا الخليط على الخلايا وحضانة لمدة ساعة واحدة عند RT في الظلام.
9. الغسل النهائي: استنشق محلول التلوين واغسل الخلايا ثلاث مرات بمحلول 2 مل من PBS، 5 دقائق لكل غسلة.
10. تطبيق وسط التثبيت: استنشق PBS بعناية من طبق التصوير، مع ترك العينة رطبة قليلا. ضع فورا قطرة صغيرة (~20 ميكرولتر) من وسط تثبيت مقاوم للتلاشي (مثل ProLong Gold) مباشرة على منطقة القاع الزجاجي.
11. التغطية والمعالجة: أنزل زجاج تغطية #1.5 عالي الدقة بلطف على القطرة، لتجنب الفقاعات. اترك التركيب يتجاف طوال الليل عند RT في الظلام، أو لمدة 2-4 ساعات عند 37°م إذا كان هناك حاجة للتصلب بشكل أسرع.
تحضير عينات الخلايا الحية للتصوير الزمني (مثل خلايا Hep3B التي تعبر عن علامة بروتين فلوري).
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تصوير خلايا Hep3B التي تعبر بشكل مستقر عن بروتين فلوري (مثل EGFP) موجه للميتوكوندريا.
1. زراعة خلايا Hep3B في وسط أساسي (MEM) مدعومة ب 10٪ FBS. الخلايا الصفائحية على أطباق تصوير زجاجية بقطر 35 مم (1.5 زجاج تغطية) بكثافة 0.8 × 10⁵خلايا لكل طبق. تسمح للخلايا بالنمو حتى تصل إلى حوالي 70-80٪ من التقاء الشمس لتحقيق صحة مثالية وكثافة تصوير (عادة 18-24 ساعة).
2. التحضير للتصوير: في يوم التصوير، استبدل وسط الزراعة القياسي بلطف بمقدار 2 مل من وسط تصوير مسبق التوازن (37°C، 5٪_CO2 لمدة لا تقل عن 30 دقيقة)، خال من الفينول الأحمر، منخفض الفلورة، مع دعم 10٪ FBS، وإذا لزم الأمر، 25 ملليمول HEPES لتثبيت الرقم الهيدروجيني خارج حاضنة ثاني أكسيد الكربون. يقلل هذا من التألق الخلفي ويحافظ على الرقم الهيدروجيني الفسيولوجي أثناء التصوير.
  ملاحظة: اترك الطبق يتكيف مع مرحلة المجهر المسخن مسبقا داخل غرفة البيئة لمدة لا تقل عن 30-45 دقيقة قبل بدء التقاط التايم لابس لضمان استقرار درجة الحرارة والتركيز وصحة الداخل.

2. بدء تشغيل نظام المجهر، التهيئة والمحاذاة الأساسية

الطاقة على وحدة المجهر الرئيسية، وحدة إطلاق الليزر (التي تحتوي على ليزرات الحالة الصلبة عند 405، 488، 561، و640 نانومتر)، ومصدر ضوء LED، وكمبيوتر التحكم.
1. اترك الليزر يسخن ويثبت لمدة لا تقل عن 15-20 دقيقة. وهذا أمر بالغ الأهمية لاستقرار طاقة الليزر، خاصة في التجارب الكمية أو التجارب الزمنية السريعة.
شغل برنامج تشغيل المجهر.
من الواجهة الرئيسية، اختر 'Microscope' > 'Initialize' أو اتبع معالج بدء التشغيل الخاص بالبرنامج.
في البرنامج، انتقل إلى لوحة 'الاستحواذ'. من قائمة العدسة المنسدلة للعدسة الموضوعية، اختر 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil ' أو الهدف المناسب لتجربتك.
ضع قطرة من زيت الغمر (معامل الانكسار = 1.518) مباشرة على العدسة الأمامية للجسم الموضوعي. تجنب إدخال الفقاعات.
بالنسبة للتصوير بالخلايا الحية، قم بتفعيل الحجرة البيئية ونظام تثبيت التركيز النشط (مثل 'التركيز المحدد' >) قبل التصوير بحوالي 45-60 دقيقة على الأقل. اضبط درجة الحرارة على 37°C، وثاني أكسيد الكربون_{على 5} ٪، والرطوبة على >60٪. دع النظام يستقر. تحقق من الاستقرار باستخدام حساسات الحجرة.
النظام الآن جاهز لتحميل العينات وإعداد معلمات التصوير.

3. تصوير فلورة متعدد الألوان

ضع العينة المحضرة على مرحلة المجهر. ارفع المسرح بحذر حتى يلامس زجاج الغطاء زيت الغمر.
في برنامج الاستحواذ، تنقل في تبويب 'الاستحواذ' واختر إنشاء تجربة جديدة.
أضف عدة مسارات تصوير (قنوات) تتوافق مع الفلوروفورات المستخدمة. للمثال في الشكل 1، قم بتكوين:
1. المسار 1 (DAPI): الإثارة 405 نانومتر، الكشف 410-480 نانومتر.
2. المسار 2 (أليكسا فلور 488): إثارة 488 نانومتر، الكشف 495-550 نانومتر.
3. المسار 3 (أليكسا فلور 568): الإثارة 561 نانومتر، الكشف 570-620 نانومتر.
لكل مسار، اضبط قطر الثقب الكونفوكال على وحدة هوائية واحدة (1 AU).
تحسين قدرة الليزر وكسب الكاشف لكل قناة باستخدام العملية التكرارية التالية:
1. اختر القناة الأولى (مثل DAPI). انتقل إلى وضع المسح المباشر.
2. اضبط قدرة الليزر الأولية على قيمة منخفضة (مثلا، 0.1-0.5٪). اضبط كسب الكاشف إلى مستوى متوسط ضمن نطاقه الخطي (مثلا، 700 فولت لجهاز PMT GaAsP).
3. قم بزيادة قوة الليزر تدريجيا حتى تصبح الهياكل المستهدفة مرئية بوضوح فوق الخلفية في الصورة الحية.
4. افتح عرض الهيستوغرام . تأكد من عدم وجود تشبع بكسل (المخطط التكراري غير مكدس على الحافة اليمنى). قلل من قوة الليزر إذا لزم الأمر.
5. اضبط كسب الكاشف للحصول على صورة ساطعة ومنخفضة الضوضاء. تجنب الزيادة في الجهد فوق 850 فولت لتجنب الضوضاء الزائدة.
6. كرر الخطوات 3.5.1-3.5.5 لجميع قنوات الفلورة المتبقية.
  ملاحظة: وازن بين طاقة الليزر والكسب ووقت البقاء في البكسل لتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء مع تقليل الضرر الضوئي. بالنسبة للخلايا الحية، أعط الأولوية لطاقة أقل وأوقات البقاء أقصر.
اضبط تنسيق الصورة (عدد البكسلات) ووقت التوقف عن البكسل.
1. اضبط حجم البكسل ليحقق معيار نيكويست: حجم البكسل ≤(الدقة / 2.3). للتصوير الكونفوكلي القياسي (الدقة الجانبية ~250 نانومتر)، اضبط حجم البكسل ≤108 نانومتر.
2. استخدم زر أخذ العينات 'Nyquist ' في البرنامج لحساب ذلك تلقائيا إذا كان متاحا.
3. اضبط وقت البكسل في البكسل. استخدم وقت استراحة أطول (مثل 1.0-2.0 ميكروثانية) لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، أو وقت توقف أقصر (مثل 0.5-1.0 ميكروثانية) للتصوير الأسرع.
تأكد من اختيار وضع 'المسح التسلسلي' بين المسارات لتقليل التفاعل المتقاطع.
انقر على 'ابدأ' للحصول على صورة واحدة. احفظ الصورة مع البيانات الوصفية ذات الصلة.

4. تصوير التباين التداخلي التفاضلي (DIC)

في تبويب 'الاستحواذ' في برنامج الاستحواذ، اختر 'إضافة قناة جديدة ' وقم بتعدها لاكتشاف الضوء المرسل.
اختر كاشف الضوء المناسب (وغالبا ما يسمى T-PMT (أنبوب مضاعف الضوء المنقول) أو ESID (كاشف واجهة النظام الخارجي) في البرنامج).
منشور DIC وتكوين المستقطب:
1. من لوحة التحكم في الأجهزة أو واجهة البرمجيات، اختر منشور DIC المطابق لهدفك (مثلا، 'DIC III' لهدف 63x).
2. أدخل المنشور المختار في مسار الضوء.
اضبط المستقطب وشريط DIC للحصول على أفضل تباين:
1. قم بتدوير المحلل (المستقطب) حتى تبدو الخلفية في الصورة 'الحية' داكنة أو باهتة جدا.
2. أثناء مراقبة الصورة الحية، قم بضبط وضع شريط DIC ببطء على دفعات صغيرة.
3. قم بتحسين التحسين حتى تظهر ميزات خلوية (مثل الأغشية والنوى) بظل بارز شبه ثلاثي الأبعاد على خلفية رمادية محايدة.
اضبط طول موجة الإضاءة ل DIC على قيمة في النطاق المرئي (مثل 488 نانومتر أو 546 نانومتر).
ضبط شدة الإرسال (طاقة الليزر أو المصباح) وكسب الكاشف لقناة الضوء المرسلة لتحقيق صورة واضحة دون تشبع.
احصل على صورة DIC.

5. اقتناء المكدس Z لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد

ملاحظة: قبل تعريف مكدس Z، قم بتكوين جميع معلمات التصوير (قوة الليزر، الكسب، الثقب، حجم البكسل) على مستوى بؤري واحد مثالي كما هو موضح في القسم 3. هذا يضمن إعدادات متسقة عبر جميع الأقسام البصرية.

في تبويب 'الاكتساب'، اختر وضع 'Z-stack'.
حدد حجم الاهتمام:
1. باستخدام مسح مباشر سريع السرعة، ركز على الهيكل الأعلى الذي يثير اهتمامك.
2. انقر على 'التعيين أولا' (أو 'الأعلى').
3. ركز بعناية إلى أدنى هيكل يثير اهتمامك.
4. انقر على 'تعيين الأخير' (أو 'الأسفل'). البرنامج سيعرض العمق الكلي.
اضبط حجم خطوة Z ليحقق معيار أخذ عينات نيكويست في الاتجاه المحوري. (عادة d_r/2.3، حيث d_r هو الدقة المحوري). لهدف زيت بقيمة 63x/1.4 NA، استخدم 0.3-0.4 ميكرومتر.
بدلا من ذلك، استخدم زر 'الأمثل' أو 'نايكويست' في البرنامج لحساب حجم الخطوة تلقائيا.
قم بتكوين معلمات التصوير (قوة الليزر، الكسب، الثقب = 1 وحدة فلكية) لكل قناة كما هو موضح في القسم 3. بالنسبة للإشارات الضعيفة، فكر في زيادة قوة الليزر أو الكسب قليلا مقارنة بصورة ثنائية الأبعاد واحدة.
ابدأ عملية الشراء لجمع كامل مجموعة الصور.
ملاحظة: إجمالي وقت الاستحواذ = (وقت الإطار من شريحة واحدة) × (عدد الشرائح)
خطط وفقا لذلك، خاصة للعينات الحية.
إعادة البناء والتصوير ثلاثي الأبعاد:
1. استخدم وحدة 'المعالجة' في البرنامج (مثل وظيفة العرض ثلاثي الأبعاد) أو افتح مكدس الصور في برامج مخصصة مثل ImageJ/Fiji.
2. توليد إسقاطات شدة قصوى (MIP) لعرض جميع الإشارات في التركيز في صورة ثنائية الأبعاد واحدة.
3. لتمثيل ثلاثي الأبعاد حقيقي، طبق عرض الصوت. قم بضبط السطوع والتعتيم والإضاءة حسب الحاجة.
4. توليد وجهات نظر متعامدة (مقاطع XZ و YZ) لفحص الامتداد المحوري والتسجيل.

6. تصوير الزمن الزمني للخلايا الحية

جهز الخلايا الحية كما هو موضح في القسم 1.2. وتركيب الطبق على مرحلة المجهر المسخن مسبقا داخل غرفة البيئة.
اترك العينة لتتأقلم لمدة لا تقل عن 45-60 دقيقة كما هو موضح في القسم 2.6 لضمان الاستقرار.
انتقل إلى مجال رؤية يحتوي على خلايا صحية ومتباعدة جيدا واحصل على لقطة واحدة عالية الجودة باستخدام معلمات محسنة حسب القسم 3.5.
شغل نظام تثبيت التركيز النشط (مثل التركيز المحدد أو ما شابه). هذا أمر غير قابل للنقاش في التجارب طويلة الأمد لتعويض الانجراف الحراري.
في تبويب 'الاكتساب'، اختر وضع 'السلسلة الزمنية'.
اختر وضع التصوير المناسب بناء على التوازن المطلوب بين السرعة والدقة والسمية الضوئية:
1. للحصول على أقصى دقة مكانية في عمليات أقل ديناميكية، اختر وضع 'SR' (فائقة الدقة).
2. للحصول على توازن مناسب للعديد من ديناميكا العضيات، اختر 'SR 2 Y ' أو 'SR 4 Y ' (أوضاع الدقة الفائقة المعجلة).
3. للتصوير عالي السرعة جدا بدون دقة فائقة، اختر وضع 'Confocal' أو 'Co 2 Y'.
حدد الجدول الزمني التجريبي: حدد المدة الكلية للتجربة والفارق الزمني (Δt) بين الإطارات المتتالية. (مثلا، 5-30 ثانية لحركة الميتوكوندريا)
تحسين معايير التصوير لتقليل تلف الضوء:
1. ابدأ بأقل قدرة ليزر تعطي إشارة قابلة للكشف.
2. اضبط كسب الكاشف ضمن نطاقه الخطي (600-850 فولت) لتحقيق مستوى إشارة قابل للعمل، مع تفضيل الكسب على زيادة طاقة الليزر.
3. استخدم أسرع سرعة مسح (أقصر وقت بسكوت بكسل) متوافقة مع متطلبات جودة الصورة.
ابدأ عملية الاستحواذ على التايم لابس. راقب الإطارات الأولى لاستقرار التركيز وصحة الخلايا.

7. تصوير البلاط بمساحة كبيرة

في تبويب 'الاستحواذ'، اختر وضع 'مسح البلاطات'.
حدد منطقة التبليغ باستخدام إحدى طريقتين:
1. يعتمد على التخطيط: حدد عدد البلاطات في اتجاهين X و Y (مثلا، 3 × 3).
2. يعتمد على العائد على الاستثمار: يرسم مستطيلا يدويا فوق صورة 'الحي' لتحديد منطقة الاهتمام. سيحسب البرنامج تلقائيا عدد البلاطات المطلوبة.
اضبط التداخل بين البلاطات المجاورة إلى 10-15٪.
ملاحظة: يوفر هذا التداخل معلومات كافية لخوارزمية الخياطة في البرنامج لإنشاء صورة مركبة سلسة.
قم بضبط معايير التصوير (قوة الليزر، الكسب، الدقة) لبلاطة واحدة كما تفعل مع صورة ثابتة.
ملاحظة: للمساحات الكبيرة جدا من البلاطات، فكر في استخدام وضع مسح أسرع (مثل 'Co 2 Y') للحفاظ على وقت الاكتساب الإجمالي عملي وتقليل التبييض الضوئي.
ابدأ عملية اقتناء التبليط. سيقوم البرنامج تلقائيا بجمع البلاطات وخياطتها.
بعد الاقتناء، افحص الصورة المخيطة بعناية، خاصة عند حدود البلاط، بحثا عن أي قطع أثرية. استخدم أدوات تعديل الخياطة اليدوية في البرنامج إذا لزم الأمر.

8. التصوير فائق الدقة باستخدام كاشف المصفوفة متعددة الإرسال

في تبويب 'الاستحواذ'، انتقل إلى محدد الأوضاع، انقر على 'إعداد ذكي' واختر وضع 'Airyscan'. ثم اختر 'الدقة الفائقة' كوضع تشغيل لكاشف المصفوفة المتعددة.
اختر وضع الاكتساب المحدد بناء على أولويات التجريب:
1. وضع 'SR': لأعلى دقة مكانية ممكنة (~120 نانومتر جانبيا). الاستخدام للعينات الثابتة.
2. وضع 'SR 2 Y': يوفر توازنا بين الدقة والسرعة.
3. وضع 'SR 4 Y': أسرع وضع دقة فائقة (حتى ~25 إطارا في الثانية، نظريا)، محسن للتصوير بالخلايا الحية لتقليل جرعة الضوء.
4. وضع 'Co 2 Y': يوفر سرعة تصوير شبيهة بالكونفوكال مع نسبة إشارة إلى ضوضاء محسنة، عندما لا تكون الدقة فائقة مطلوبة.
  ملاحظة: قيم الدقة (مثل 120 نانومتر) هي مواصفات النظام تحت الظروف المثالية¹². تعتمد الدقة الفعلية على تحضير العينة، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء، والمعالجة الصحيحة.
قم بضبط معلمات التصوير (طاقة الليزر، كسب الكاشف).
1. بالنسبة لتصوير الخلايا الحية، ابدأ بقوة ليزر أقل من الوضع الكونفوكلي لتقليل الضرر الضوئي.
2. بالنسبة للعينات الثابتة والخافتة، قد تكون هناك حاجة إلى قوة ليزر أعلى و/أو كسب أعلى لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية.
3. ابحث عن الحد الأدنى لطاقة الليزر التي تعطي صورة نظيفة وعالية التباين في وضع 'Live'.
اضبط حجم البكسل ووقت البقاء.
1. لالتقاط الدقة المحسنة، اضبط حجم البكسل لتلبية معيار نيكويست: حجم البكسل ≤(الدقة المطلوبة / 2.3). لوضع SR (الهدف 120 نانومتر)، اضبط حجم البكسل ≤~52 نانومتر.
2. استخدم زر 'الأمثل' أو 'Nyquist' في البرنامج لحساب ذلك تلقائيا إذا كان متاحا.
احصل على الصورة. تحتوي البيانات الخام على إشارات متعددة الإرسال ولم يتم حلها بشكل مفرط بعد.
معالجة البيانات المجمعة لتحقيق الدقة الفائقة:
1. انتقل إلى وحدة معالجة البرنامج.
2. اختر مجموعة البيانات واختر وظيفة 'معالجة الدقة الفائقة'.
3. ابدأ بإعدادات 'تلقائي'. بالنسبة لبيانات انخفاض نسبة الضوضاء (lowSNR)، قم بضبط 'القوة' و'مرشح الضوضاء' يدويا لتعزيز الحدة دون حدوث تشويش (arst).
4. (اختياري) للحصول على أعلى دقة، خاصة في المكدسات ثلاثية الأبعاد، قم بتطبيق خطوة فك الالتفاف الإضافية (jDCV).
5. نفذ المعالجة. قارن بين العروض المعالجة وغير المعالجة للتحقق من تحسين التفاصيل الحقيقية.
(اختياري) للمقارنة الكمية لنسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) عبر الأوضاع:
1. التقاط صور لنفس العينة في أوضاع مختلفة.
2. في برامج التحليل، حدد منطقة اهتمام (ROI) على بنية موحدة وقيس متوسط شدة الإشارة.
3. حدد عائد الاستثمار في الخلفية وقس الانحراف المعياري لشدة الخلفية.
4. احسب نسبة الضوضاء = (الإشارة المتوسطة) / (الانحراف المعياري للخلفية).
(اختياري) لقياس دقة النظام التجريبي باستخدام خرز فلوري:
1. جهز عينة من خرزات فلورية بقطر 100 نانومتر.
2. احصل على Zstack من خرزة معزولة في وضع SR باستخدام أخذ عينات Nyquist.
3. معالجة الحزمة باستخدام الدقة الفائقة و(اختياريا) jDCV.
4. استخدم أداة 'قياس PSF' في البرنامج لتركيب Gaussian ثلاثي الأبعاد وتسجيل العرض الكامل عند نصف القيم القصوى (FWHM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصوير الفلورة متعددة الألوان
تم إجراء تصوير فلوري متعدد الألوان لخلايا COS7 الثابتة كما هو موضح في القسم 3. تم استخدام الأجسام المضادة ضد α-التيبولين (الأنابيب الدقيقة) وTOMM20 (الميتوكوندريا) مع صبغة مضادة نووية من DAPI. كما هو موضح في الشكل 1، تم تحديد النوى (زرقاء)، والميتوكوندريا (خضراء، أليكسا فلور 488)، والأنابيب الدقيقة (الأحمر، أليكسا فلور 568) بوضوح مع تخصص عالي وأقل تداخل طيفي، مما يؤكد فعالية المسح التسلسلي وإعدادات الكشف المحس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول المتكامل المعروض هنا خارطة طريق شاملة لتنفيذ قدرات التصوير المتقدمة لنظام المجهر الكونفوكالي الحديث المزود بكاشف فائق الدقة متعدد المصفوف، ضمن إطار مستدام للموارد المشتركة. يجمع هذا القسم الجوانب الحرجة للطريقة، وتنفيذها العملي، وموقعها في مجال التصوير الحيوي. يعتمد التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول على عدة خطوات محورية. أولا، إعداد العينات بدقة هو الأساس؛ يعد استخدام ركائز عالية الدقة متوافقة (مثل زجاج التغطية #1.5) وبروتوكولات التلوين المناعي المحسنة ضروريا لتحقيق سلامة ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية أو غير مالية متنافسة. استخدم المؤلفون DeepSeek للمساعدة في تحسين اللغة وتنسيقها أثناء إعداد هذه المخطوطة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدعم الفني من المرافق الأساسية في كلية الطب بجامعة تشجيانغ ويشكرون ياو ياو تشونغ على توفير عينة Hep3B حية لسرطان الكبد البشري. وقد دعم هذا العمل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (LZ25H060002)، ومشروع التكنولوجيا التجريبية لجامعة تشجيانغ (SYBJS202321)، وإدارة التعليم في مقاطعة تشجيانغ (Y202351321)، ومشروع البحث المفتوح للمختبر الرئيسي لعلم فيروسات الحيوانات بوزارة الزراعة والشؤون الريفية (202201).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
خلايا COS7	ATCC (أو ما شابه)	CRL-1651	خط الخلايا الليفية الكلى الأفريقية للقرد الأخضر. يستخدم في تحضير عينات الخلايا الثابتة للتصوير متعدد الألوان فائق الدقة &nb;
IgG مضاد للفأر من الحمار، Alexa Fluor 568 مترافق	إنفيتروجين (أو ما شابه)	A10037	الجسم المضاد الثانوي لصبغ الأنابيب الدقيقة. يستخدم عند تخفيف 1:500
دولبيكو' S Modified Eagle medium (DMEM)، مرتفع الجلوكوز	Gibco (أو ما شابه)	11965092	وسط زراعة قياسي لخلايا COS7، مدعوم ب 10٪ FBS.
مصل البقر الجنيني (FBS)، معطل الحرارة	Gibco (أو ما شابه)	10082147	مكمل المصل المستخدم بنسبة 10٪ (v/v) في جميع وسائط زراعة الخلايا.
طبق تصوير قاع زجاجي (35 مم، &ميكرو-صحن، #1.5 غطاء بوليمر، سمك 0.17 مم)	إيبيدي (أو ما شابه)	81156	ركيزة لطلاء الخلايا والتصوير. ضروري للتوافق مع أهداف الغمر النفطي عالي الحمض الطبيعي.
معالجة الصور والعمل برامج التحليل (وحدات ZEN)	كارل زايس AG	ZEN 3.5 (أزرق)	يستخدم لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والمعالجة فائقة الدقة (مثل معالجة Airyscan)، وقياس PSF، وتحليل معدل الضوضاء الضوضاء (SNR).
ImageJ / فيجي	المصدر المفتوح	لا يوجد	يستخدم لإعادة بناء ثلاثية الأبعاد إضافية، وتوليد مشاهد متعامدة، وتحليل الصور بشكل عام.
زيت الغمر (معامل الانكسار = 1.518)	كارل زايس (أو ما شابه)	444960-0000-000	للاستخدام مع أهداف الغمر بالزيت (مثل 63x/1.4 NA).
نظام المجهر الكونفوكالي بالليزر مع كاشف مصفوفة متعددة الأبعاد (مثل ZEISS LSM 900 مع Airyscan 2)	كارل زايس AG	LSM 900 (Airyscan 2)	المنصة الرئيسية للتصوير المستخدمة لجميع أوضاع الدقة الكونفوكية والفائقة الموصوفة في البروتوكول.
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) مع إيرل س أملاح	Gibco (أو ما شابه)	11095080	وسط زراعة قياسي لخلايا Hep3B، مدعوم ب 10٪ FBS.
الجسم المضاد وحيد النسيلة المضاد للفأر والألفا (Clone DM1A)	سيغما-ألدريتش (أو ما شابه)	T6199	الجسم المضاد الأساسي لوضع علامات على الأنابيب الدقيقة. يستخدم عند تخفيف 1:500
بارافورمالديهايد (PFA)، 4٪ في PBS	Jinpan (أو ما شابه)	TBS5083	مثبت للخلايا. استخدمه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تعامل مع الأمر باتخاذ الاحتياطات المناسبة.
وسط تصوير خال من الفينول الأحمر	Gibco (أو ما شابه)	21063029	وسط تألق ذاتي منخفض يستخدم في تصوير الخلايا الحية. متوازن مسبقا مع 5٪ CO₂ عند 37&00; C قبل الاستخدام.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، 1X، pH 7.4	عالم الخلية (أو ما شابه)	C0162-311	يستخدم كمخزن للغسيل والتخفيف طوال البروتوكول.
تثبيت مضاد التلاشي الذهبي ProLong	إنفيتروجين (أو ما شابه)	P36930	وسط تثبيت مقوى للحفاظ على الفلورة في العينات الثابتة.
ترايتون X-100	سيغما-ألدريتش (أو ما شابه)	T8787	يستخدم عند 0.1٪ (v/v) لنفاذ الخلايا
توين-20	سيغما-ألدريتش (أو ما شابه)	P9416	استخدم عند 0.05٪ (v/v) في PBS (PBST) لخطوات الغسل بعد حضانة الأجسام المضادة.
ألبومين مصل البقر (BSA)، الجزء V	سيغما-ألدريتش (أو ما شابه)	A7906	يستخدم عند 1٪ (مع الوزن) في PBS للحجب وكمكون من مخزن تخفيف الأجسام المضادة.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	سيغما-ألدريتش (أو ما شابه)	D9542	الصبغة المضادة النووية. يستخدم بتركيز نهائي 1 وميكرو؛ g/mL.
IgG مضاد للأرانب من الحمار، أليكسا فلور 488 مرافق	إنفيتروجين (أو ما شابه)	A21206	الأجسام المضادة الثانوية لتلوين الميتوكوندريا. يستخدم عند تخفيف 1:500
الكرات الفلورية (الخرز)، قطرها 100 نانومتر	إنفيتروجين (مثل TetraSpeck™) أو ما شابه	T7279	يستخدم للقياس التجريبي للنظام' s دالة انتشار النقاط (PSF) والدقة.
خلايا Hep3B تعبر بشكل مستقر عن ميتوكوندريا EGFP	إيموسيل	IM-H367	تم تصميم خط خلايا الورم الكبدي البشرية للتعبير المستقر عن EGFP المستهدف إلى مصفوفة الميتوكوندريا. يستخدم لتصوير الخلايا الحية.
محلول مخزن HEPES، 1 M	Gibco (أو ما شابه)	15630080	يستخدم بتركيز نهائي 25 ملليمول في وسط تصوير لتثبيت الرقم الهيدروجيني أثناء التصوير الحي خارج حاضنة CO₂.
زجاج تغطية عالي الدقة (#1.5، 0.17 مم سمك)	مارينفيلد (أو ما شابه)	107052	تستخدم لتركيب عينات ثابتة.
برامج تشغيل المجهر (مثل إصدار ZEN الأزرق)	كارل زايس AG	ZEN 3.5 (أزرق)	يستخدم للتحكم في النظام، واكتساب الصور، والمعالجة الأساسية.
العدسة الموضوعية: Plan-apochromat 63x/1.40 NA Oil DIC	كارل زايس AG	421462-9900-000	الهدف الأساسي المستخدم للتصوير عالي الدقة.
الأجسام المضادة متعددة النسيلات من نوع Rabbit Anti-TOMM20	أبكام (أو ما شابه)	ab186735	الجسم المضاد الأساسي لوضع علامات على الميتوكوندريا. استخدم عند 1:1000 تخفيف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prakash, K., et al. Resolution in super-resolution microscopy - definition, trade-offs and perspectives. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 677-682 (2024).
Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21, 72-84 (2019).
Bond, C., et al. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82, 315-332 (2022).
Huff, J., et al. The new 2D super-resolution mode for ZEISS Airyscan. Nat Methods. 14, 1223(2017).
Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing Usage for Fast Gentle, Super-Resolution Imaging. Methods Mol Biol. 2304, 111-130 (2021).
Yin, W., Liu, S. S., Zhao, Q. B. Optimization strategy for fast super-resolution imaging parameters based on LSM 900. Chin J Cell Biol. 47, 1644-1655 (2025).
Moore, A. S., et al. Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis. Nature. 591, 659-664 (2021).
Ranjan, R., Chen, X. Super-resolution live cell imaging of subcellular structures. J Vis Exp. (167), e61563(2021).
Harmer, J., et al. Airyscan super resolution microscopy to study trypanosomatid cell biology. Methods Mol Biol. 2116, 449-461 (2020).
Lin, M. N., et al. Advanced functions and management of laser scanning confocal microscopy LSM880 with Airyscan. J Chin Electron Microsc Soc. 38, 271-275 (2019).
Li, H. J., et al. Comparative study on imaging characteristics and applications of LSCM880 with Airyscan and spinning disk confocal microscopy. Technol Innov Appl. 32, 4-8 (2020).
Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes. Nat Methods. 16, 1159-1163 (2019).
Chen, C. Y., et al. Depletion of Vasohibin 1 speeds contraction and relaxation in failing human cardiomyocytes. Circ Res. 127, 14-27 (2020).
Sandin, J. N., et al. Near simultaneous laser scanning confocal and atomic force microscopy (conpokal) on live cells. J Vis Exp. (162), e61433(2020).
Castagnini, D., Palma, K., Jara Wilde, J., et al. Super-resolution Imaging of Proteus mirabilis biofilm by expansion microscopy. J Vis Exp. (221), e67932(2025).
Wolf, D. M., et al. Method for live-cell super-resolution imaging of mitochondrial cristae and quantification of submitochondrial membrane potentials. Methods Cell Biol. 155, 545-555 (2020).
Wu, Z. H., et al. Near-infrared perylene carboximide fluorophores for live-cell super-resolution imaging. J Am Chem Soc. 146, 7135-7139 (2024).
Pfanzelter, J., Mostowy, S., Way, M. Septins suppress the release of vaccinia virus from infected cells. J Cell Biol. 217, 2911-2929 (2018).
Kolossov, V. L., et al. Airyscan super-resolution microscopy of mitochondrial morphology and dynamics in living tumor cells. Microsc Res Tech. 81, 115-128 (2018).
He, J., et al. Renal macrophages monitor and remove particles from urine to prevent tubule obstruction. Immunity. 57, 106-123 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

التصوير عالي الدقة والإدارة المشتركة: بروتوكول للمجهر الكونفوكلي مع اكتشاف التعدد

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles