مقالة منهجية

عزل وزراعة ونقل مؤقت لخلايا تائية بشرية أولية لتوليد خلايا تائية مستقبلات مستضدات كيميرية (CAR)

925 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70162

⸱

مارس 27, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Transfusion Medicine and Cell Therapy, Medical University of Vienna

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول الخطوات الأساسية لزراعة الخلايا التائية الأولية، بما في ذلك عزلها، وتفعيلها، وتمددها، ونقلها المؤقت بواسطة النسيج الكهربائي لل mRNA. بالإضافة إلى ذلك، يقترح وجود سير عمل ولوحة للأجسام المضادة لتحليل تدفق الخلايا للنمط الظاهري، وعلامات التفعيل، وقابلية البقاء، وتعبير مستقبلات المستضد الكيميرية (CAR).

الملخص

لتقييم فعالية وفعالية خلايا T المستقبلية المستضدة الكيميرية (CAR)، من الضروري عزل وتنشيط وتوسيع وتوصيف وهندسة الخلايا التائية البشرية الأولية وراثيا. مقارنة بخطوط الخلايا التائية الشائعة، يمكن للخلايا الأولية أن توفر نظام نموذجي أكثر واقعية، لأنها متغيرة للغاية، وقادرة على قتل الخلايا التائية، وقادرة على التمايز. هنا، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لجميع الخطوات الأساسية لزراعة الخلايا التائية الأولية، بما في ذلك عزلها عن منتجات الدم، والتفعيل، والتوسع في المختبر ، والانتقال العابر. نحن نصف الفروقات في حركية التمدد وتمايز الخلايا التائية الأولية عند التنشيط باستخدام كاشفين مختلفين، ونوفر لوحة أجسام مضادة لتحليل تدفق الخلايا الخلوية لنمط الخلايا التائية وحالة التنشيط الخاصة بها. نقدم تعليمات مفصلة لعملية الحفر الكهربائية لخلايا T البشرية باستخدام mRNA الذي يشفر CAR وتقييم حركية تعبيرات CAR مع مرور الوقت. يقدم هذا البروتوكول توصيات حول نقاط زمنية مثالية لاختبارات القوة والفعالية في مراحل لاحقة لخلايا CAR T وتأثير كميات مختلفة من mRNA على شدة الإشارة. نظرا للطبيعة المؤقتة لهذه الطريقة، فهي توفر إمكانية سريعة وسهلة التنفيذ لاختبار ومقارنة العديد من تراكيب CAR بالتوازي.

المقدمة

تمثل الخلايا التائية البشرية الأولية نموذجا فسيولوجيا ومتعدد الاستخدامات لدراسة بيولوجيا الخلايا التائية ولتطوير وتقييم علاجات الخلايا، بما في ذلك هندسة CAR. على عكس خطوط الخلايا الخالدة، تعكس الخلايا التائية المستخرجة من متبرعين أصحاء عن كثب التنوع الوظيفي، وحالات التنشيط، والتنوع الظاهري، وديناميكيات الإشارات في الخلايا التائية في الجسم الحي، مما يوفر تمثيلا أكثر دقة للاستجابات المناعية والأداء العلاجي 1,2. علاوة على ذلك، أبلغ عن أن خط خلايا جوركات تي الأكثر استخداما، والذي مشتق من لوكيميا لمفاوية، يظهر عدم استقرار جينومي بعد الزراعة الممتدة، وهو ظاهرة شائعة في خطوط الخلايا. 3 بينما يمكن أن تكون خطوط الخلايا التائية، بما في ذلك خطوط الخلايا المراسلة4، أدوات قيمة للفحص المبكر وتمكينها قراءة سريعة، فإن استخدام الخلايا التائية الأولية من المرضى يعكس التطبيق النهائي بشكل أوثق. ومع ذلك، فإن توفر الخلايا التائية المشتقة من المرضى وعدم الجودة غير المثالية غالبا ما يحد من قابليتها، خاصة في المراحل المبكرة من تطوير المنتجات ما قبل السريرية 5,6,7. استخدام الخلايا من متبرعين أصحاء يقلل من التباين الناتج عن التغيرات المناعية المرتبطة بالأمراض والعلاجات السابقة، ويسمح بتقييم قابل للتكرار لوظيفة الخلايا التائية، وتفعيلها، وتعبيرها المعدل عبر عدة متبرعين.

نظرا لتوفر خلايا تائية أولية، فإن بروتوكولات عزل وتنشيط وتوسع الخلايا التائية الأولية هي متطلبات أساسية لتعديلها الجيني واختباراتها الوظيفية. تستخدم استراتيجيات التنشيط الشائعة إما خرز مغناطيسي مغطاة بأجسام مضادة، أو كواشف بوليميرية تحتوي على محفزات الخلايا التائية، أو تركيبات أجسام مضادة قابلة للذوبان. عادة، تحاكي كواشف التنشيط تنشيط مستقبلات الخلايا التائية الفسيولوجية (TCR) من خلال مركب CD3 والإشارات التحفيزية المشتركة عبر CD28، والذي يشبه تنشيط أقوى من التنشيط الحصري فيCD3 8. يسمح التنشيط باستخدام خرزات CD3/28 بالتحكم الدقيق في قوة التنشيط ونسبة الخرزات إلى الخلية. بعد مرحلة التحفيز الأولية، يمكن إزالة الخرزات أو الاحتفاظ بها في الثقافة لتنشيطها المستمر. عادة ما تتوسع خلايا التائية بسرعة لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع قبل أن يتباطأ نمو الخلايا. على النقيض من ذلك، يحتوي TransAct على مصفوفة بوليمرية غروية، ويمكن إزالة الكاشف الزائد ببساطة عن طريق الطرد المركزي وتبادل المادة الفائقة. لذلك، يوفر بديلا يتيح تنشيط متجانس في الزراعة ويشبه تنشيط الخلايا التائية مع محفز أقل مقارنة بخرزات CD3/28. ومع ذلك، يتم تحفيز التكاثر لمدة تقارب الأسبوعين، ويتطلب الأمر إعادة التحفيز لفترات توسع أطول. بعد التنشيط الأولي لخلايا T باستخدام مادة تنشيط التشغيل، تزرع الخلايا التائية وتوسع في المختبر لمدة أسبوع إلى أربعة أسابيع قبل استخدامها في التجارب. ومن الجدير بالذكر أن نوع مادة التنشيط واختيار السيتوكينات9 و10 و11 وفترة التمدد تؤثر على الأعداد المطلقة للخلايا التائية، والنمط الظاهري وحالة التفعيل. عادة، يجب اختبار الظروف المثلى مثل تركيز الكاشف، كثافة الثقافات، مكملات السيتوكينات، ووقت التمدد في البداية وتحديد تجريبيا لتحقيق تكاثر قوي دون التسبب في موت الخلايا الناتج عن التنشيط أو استنزاف الخلايا التائية. هنا، نقدم مقارنة جنبا إلى جنب بين بروتوكوليكي تفعيل مختلفين وتأثيرهما على التمايز والتنشيط لخلايا T البشرية الأولية لدعم اتخاذ قرارات اختيار مادة التنشيط وتوقيت التجارب.

بالإضافة إلى ذلك، نقترح لوحة قياس تدفق خلوية مفيدة لتحليل التركيب الظاهري وحالة تنشيط الخلايا التائية، لدعم التخطيط التجريبي. بالنسبة للتعديل الوراثي لخلايا التائية الأولية، يمثل النقل العابر باستخدام التقميم الكهربائي لحمض الريبونوكلييك الرسول (mRNA) بديلا آمنا وفعالا ومرنا لنقل الفيروس12. بينما تمكن ناقلات الفيروسات العدسية التعبير المستقر وطويل الأمد للجينات المنقولة، إلا أنها تتطلب تدابير أمان حيوي معقدة، وتشمل الدمج في جينوم المضيف، ويمكن أن تؤدي إلى تعبير متغير حسب موقع الدمج. بالإضافة إلى ذلك، فإن إنتاج الفائقات الفيروسية العدسية، يليها نقل الخلايا التائية واختيار الخلايا المحولة، يستغرق وقتا طويلا. على النقيض من ذلك، يسمح التساقط الكهربائي لل mRNA بتعبير سريع ومؤقت للجينات المستهدفة دون دمج جينومي أو مكونات فيروسية، مما يقلل العبء التنظيمي ويتيح اختبارا سريعا وتكراريا للبنى. وهذا مفيد بشكل خاص في مراحل التطوير المبكرة، حيث يتم فحص وتقييم عدة مرشحين لبرنامج CAR. في المنشورات الحديثة، تم استكشاف النقل باستخدام mRNA كمنصة علاجية 13,14,15. نقترح أن النقل العابر باستخدام mRNA16 هو نهج سهل التنفيذ، خاصة للمختبرات التي لا تتوفر فيها إمكانية إجراء أعمال الفيروسات العدسية في بيئة السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2). مقارنة جنبا إلى جنب لأنظمة التنشيط المختلفة في نقل الفيروسات العدسية السابقة متاحة في مكان آخر17.

يصف هذا البروتوكول عزل وتنشيط وزراعة وتوسع ونقل الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام خرزات مضادة ل CD3/28 أو TransAct للتفعيل وتحليل كهربائي mRNA للتعبير العابر عن CAR. يتيح سير العمل الموضح توليد خلايا CAR T الوظيفية القابلة لإعادة الإنتاج المناسبة للتطبيقات اللاحقة مثل اختبارات السمية الخلوية، أو التوصيف الظاهري، أو النمذجة المخبرية لعلاجات الخلايا التائية التبني.

البروتوكول

يتبع هذا البروتوكول الإرشادات الأخلاقية لجامعة الطب في فيينا. تمت الموافقة على مقترحات الأخلاقيات من قبل لجنة الأخلاقيات في جامعة فيينا الطبية (1087/2025 و1198/2025).

1. عزل الخلايا التائية الأولية من منتجات الدم

ملاحظة: المادة الأولية يمكن أن تكون دم كامل، أو منتج الفصيلة أو غرف اختزال الكريات البيضاء (الكريات البيضاء الدقيقة). حافظ على العينة عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة وابدأ العزل في أقرب وقت ممكن، ولكن في أقرب وقت ممكن خلال 24 ساعة بعد جمع العينة. تتوفر استراتيجيات عزل مختلفة لعزل الخلايا التائية، بما في ذلك الانتقاء السلبي والإيجابي. تقدم القسمان 1.1 و1.2 بروتوكوليتين مختلفتين لتوفير خيارات لعزل الخلايا التائية. يجب إجراء التعامل مع منتجات الدم في خزانة أمان بيولوجية، مع الحفاظ على العينة في درجة حرارة الغرفة (RT) أثناء المعالجة.

  1. عزل الخلايا التائية عن طريق الانتقاء السلبي باستخدام الطرد المركزي بتدرج الكثافة
    1. وفقا لتعليمات الطقم، أضف الكمية المطلوبة من كوكتيل الأجسام المضادة لكل مل من العينة. حضن التمارين خلال الوقت المحدد في RT. بالنسبة لمجموعة إثراء الخلايا التائية البشرية المقترحة: استخدم 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لكل مل من العينة وحضن لمدة 20 دقيقة عند RT (مثلا، ل5 مل من العينة، أضف 250 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة).
      ملاحظة: لهذه المجموعة تحديدا، يجب أن يكون هناك حد أدنى من خلايا الدم الحمراء (RBCs) لعزل الخلايا التائية بنجاح (النسبة الدنيا الموصى بها هي 100 خلايا حمراء لكل خلية نووي). عادة ما يكون هذا هو الحال عندما تستخدم غرف اختزال الدم الكامل أو الكريات البيضاء كمادة بداية. بالنسبة لاستخدام حاصل الضرب، قد لا تكون استراتيجية العزل هذه ناجحة لأن نسبة الحمض الأحمر عادة ما تكون منخفضة جدا. لذلك، يوصى بعزل الخلايا أحادية النواة الطرفية (PBMCs) مسبقا تليها خطوة عزل الخلايا التائية كما هو موضح في القسم 1.2.
    2. جهز وسط كثافة (فيكول، بانكول أو ما شابه) في أنبوب مناسب. لأحجام العينات التي تقل عن 3 مل، استخدم 3 مل من وسط كثافة (في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل). لأحجام العينات التي تبلغ 4 مل وما فوق، استخدم 15 مل من وسط كثافة (في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل).
    3. في نهاية فترة الحضانة، يتم تخفيف العينة بحجم مماثل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) وامزجه عن طريق التوصيل بالماصات. وهذا يتوافق مع تخفيف بنسبة 1:2 (مثلا، تخفيف 3 مل من العينة مع 3 مل من PBS مع 2٪ FBS). قم بوضع العينة المخففة بعناية فوق وسط الكثافة باستخدام ماصة مصلية ومساعدة للعمل مع ضبط سرعة التوصيل إلى الحد الأدنى.
    4. ثبت الأنبوب بزاوية 45° لزيادة مساحة سطح وسط الكثافة ودعم الطبقات.
    5. قم بطرد مركزي للعينة عند 1,200 × جم، RT، لمدة 20 دقيقة. أطفئ فرامل الطرد المركزي أو ضبطه على الحد الأدنى. بعد الطرد المركزي، يجب أن تكون طبقة بيضاء مرئية بين واجهة وسط الكثافة والبلازما. تحتوي هذه الحلقة البيضاء المعبدة على الخلايا التائية المطلوبة.
    6. احصد خلايا T بجمع الطبقة بعناية باستخدام ماصة نقل معقمة أو ماصة مصلية بحجم 2 مل ونقلها إلى أنبوب جديد. تحرك الطبقات بأقل قدر ممكن لتجنب حمل وسط الكثافة أو البلازما.
    7. تابع القسم 1.3.
  2. عزل الخلايا التائية عن طريق الانتقاء الإيجابي باستخدام مجموعة تدفق الجاذبية
    1. قم بخطوة عزل تدرج الكثافة لاستخراج PBMCs من العينة: تحضير وسط كثافة وفقا للقسم 1.1.2. قم بتخفيف العينة بحجم متساوي من PBS مع 2٪ FBS. وهذا يعادل تخفيفا بنسبة 1:2 (مثلا، تخفيف 3 مل من العينة مع 3 مل من PBS + 2٪ FBS).
    2. قم بوضع العينة المخففة بعناية فوق وسط الكثافة باستخدام ماصة مصلية ومساعدة للعمل مع ضبط سرعة التوصيل إلى الحد الأدنى. ثبت الأنبوب بزاوية 45° لزيادة مساحة سطح وسط الكثافة ودعم الطبقات.
    3. الطرد المركزي عند 400 x g، RT، لمدة 30 دقيقة مع إيقاف الفاصل أو ضبطه على الحد الأدنى. بعد الطرد المركزي، يجب أن تكون طبقة بيضاء مرئية عند واجهة وسط الكثافة والبلازما. تحتوي هذه الحلقة البيضاء الغائمة على الميكروبات الخلفية الدقيقة، حيث أن كثافتها أقل من كثافة خلايا الدم الحمراء.
    4. اجمع أنابيب PBMC بجمع الطبقة البيضاء المعكرة بعناية ونقلها إلى أنبوب جديد. استخدم ماصة نقل معقمة أو ماصة مصلية بحجم 2 مل لهذه الخطوة وقم بتحريك الطبقات بأقل قدر ممكن.
    5. اغسل الخلايا المجمعة: أضف 20 مل من PBS مع 2٪ FBS. عد الخلايا واحسب العدد الكلي للخلايا. الطرد المركزي عند 300 × g، 4 درجات مئوية، لمدة 10 دقائق، مع تشغيل الفاصل. من الآن فصاعدا، أبق الخلايا على الثلاجة واعمل مع المواد المبردة.
    6. اضرب من السوبرناتان. تستخدم الحسابات التالية لما يصل إلى 1 ×10 خلايا 7 ويمكن تكبيرها وفقا لذلك. أعد تعليق حبيبات الخلية في 80 ميكرولتر من PBS مع 0.5٪ ألبومين مصل البقري (BSA) و2 ملليمولار إيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA).
    7. امزج 10 ميكرولتر من حبيبات CD4 مع 10 ميكرولتر من حبات CD8. أضف خليط الخرز إلى أقراص PBMC المعلقة. اخلط جيدا وحضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    8. في هذه الأثناء، ضع عمود تدفق الجاذبية في المجال المغناطيسي لجهاز فصل مناسب. جهز العمود عن طريق شطفه ب 3 مل من PBS مع BSA وEDTA.
    9. بعد مرحلة الحضانة، اغسل الخلايا بإضافة 2 مل من PBS مع BSA وEDTA. الطرد المركزي عند 300 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 10 دقائق. تخلص من الفائق وأعد تعليق الخلايا حتى 10⁸ في 500 ميكرولتر من PBS باستخدام BSA وEDTA.
    10. ضع تعليق الخلية على العمود. يتم الاحتفاظ بالخلايا الموسومة في العمود بواسطة جهاز الفصل المغناطيسي. يحتوي التدفق على خلايا غير معنونة (PBMCs مزدوجة السالبة CD4 وCD8) ويمكن جمعها إذا رغب الأمر. اغسل العمود ثلاث مرات عن طريق شطفه ب 3 × 3 مل من PBS باستخدام BSA وEDTA. أضف مخزن مؤقت جديد بمجرد أن يصبح العمود فارغا.
    11. لإزالة الخلايا الموسومة، قم بإزالة عمود تدفق الجاذبية من الفااصل المغناطيسي وضع مخرجه فوق أنبوب جمع جديد. بيبت 5 مل من PBS يحتوي على BSA وEDTA على العمود، ثم ادفع المكبس بقوة داخل العمود لإدخال الخلايا. تابع مع القسم 1.3.
      ملاحظة: تتوفر مجموعات الأجسام المضادة المغناطيسية كمجموعات خلايا تائية شاملة وكذلك لمجموعات محددة من خلايا تائية، ويمكن أن تكون مجموعات اختيار إيجابية أو سلبية. في كل حالة، تحتفظ بالخلايا الموسومة بواسطة جهاز الفصل المغناطيسي. بالنسبة للانتقاء الإيجابي، يتم وسم الخلايا التائية (أو مجموعاتها الفرعية) بحبيبات مغناطيسية عبر الجسم المضاد المرتبط بها. بالنسبة للانتقاء السلبي، يتم تصنيف جميع الخلايا التي لا تنتمي إلى مجموعة الخلايا التائية المحددة بحبات مغناطيسية. لذلك، توجد خلايا T في التدفق المروري.
  3. تجميد الخلايا التائية المعزولة
    1. اغسل خلايا T ب 20 مل من PBS مع 2٪ FBS. الطرد المركزي عند 300 × جم، RT، لمدة 10 دقائق. يمكن تشغيل الكسر مرة أخرى. تخلص من السوبرناتانت.
    2. أعد تعليق الخلايا في 5-10 مل من PBS مع 2٪ FBS. لاستخدام الخلايا مباشرة للزراعة، تابع القسم 2.4. لتجميد الخلايا، تابع القسم التالي.
      ملاحظة: لا يلزم تجميد الخلايا إذا تم استخدام الخلايا التائية المعزولة فورا للتنشيط والزراعة.
    3. عد الخلايا المعلقة وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم، 4 درجات مئوية، لمدة 10 دقائق. في هذه الأثناء، احسب عدد الخلايا التي سيتم تجميدها. يجب أن يحتوي الليكوت الواحد على خلية T على 5-20 ×10 6 خلايا. جهز العدد المطلوب من قوارير التجميد الموسومة بالإضافة إلى وسط التجميد (انظر الجدول 1).
    4. بعد الطرد المركزي، تخلص من المادة الفائقة والماصة من السائل المتبقي. اعمل بسرعة من الآن فصاعدا.
    5. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في 1 مل من وسط تجميد مبرد مسبقا لكل أليكوت (مثلا، إذا تم تجهيز خمسة أليكوات، أعد تعليق الحبيبة في 5 مل من وسط تجميد). تعليق خلوي بسعة 1 مل في كل قارورة تجميد. جمد القوارير المجمدة فورا عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: ينصح بالتجميد بمعدل مضبوط. لتحقيق ذلك، استخدم حاويات تجميد مناسبة. انقل الخلايا إلى النيتروجين السائل بعد التجميد عند -80 درجة مئوية (مثلا، في اليوم التالي أو خلال أسبوعين).
المكونالتركيز النهائي
ثنائي ميثيل سلفوكسيد10٪ (v/v)
مصل الأبقار الجنيني45٪ (صوت/صورة)
RPMI 1640 مع الفينول الأحمر45٪ (صوت/صورة)

الجدول 1: تركيب وسط التجميد. يستخدم وسط التجميد للحفاظ على سلامة الخلية وقدرتها على البقاء أثناء التجميد والتخزين.

2. إذابة وتنشيط وتوسع الخلايا التائية الأولية

  1. قم بجميع الخطوات تحت ظروف عمل معقمة باستخدام خزانة أمان بيولوجية.
  2. متوسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 قبل التدفئة بدون إضافات عند 37 درجة مئوية وينقل 20 مل إلى أنبوب طرد مركزي. قم بإذابة كمية كبيرة من الخلايا التائية المجمدة عن طريق تعريض الأنبوب بسرعة لماء دافئ. توقف عن الذوبان عندما يكون هناك حبيبة ثلجية صغيرة لا تزال مرئية داخل القارورة التجميدية.
  3. أضف فورا 1 مل من RPMI المسخن مسبقا إلى تعليق الخلية وانقله بعناية إلى أنبوب الطرد المركزي. اشطف قارورة التبريد ب 1 مل من RPMI. تجنب خطوات إعادة التعليق الإضافية، التي قد تعرض الخلايا لإجهاد القص.
  4. خلايا الطرد المركزي عند 300 × جم، RT، لمدة 5 دقائق. تخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في وسط خلية T كاملة. يتكون وسط الخلايا التائية الكاملة من RPMI 1640 مع 10٪ FBS، 1٪ بنسلين/ستريبتومايسين، 5 نانوغرام/مل إنترلوكين 7 (IL-7)، و10 نانوغرام/مل إنترلوكين 15 (IL-15) (انظر الجدول 2).
  5. عد الخلايا المعلقة. خلايا البذور في وسط خلية T كاملة بكثافة 1 × 106 خلايا/مل في صفيحة بئر مناسبة. أضف الكمية المطلوبة من مادة التفعيل، كما هو موضح في الدليل المعني. على سبيل المثال، لتنشيط 1 ×10 خلايا 6، يتم زرع خلايا البذور في 1 مل من وسط خلية T كاملة في صفيحة مكونة من 24 بئرا. أضف إما 25 ميكرولتر من خرز CD3/28 أو 10 ميكرولتر من كاشف TransAct.
    ملاحظة: إذا لم تكن الخلايا كثيفة بما فيه الكفاية (أي أن عدد الخلايا أقل من 1 ×10 6 خلايا/مل)، فيقوم بالطرد المركزي مرة أخرى بنفس الظروف السابقة. أعد تعليق الحبيبات في الكمية المناسبة من وسط خلايا T الكاملة للوصول إلى كثافة 1 × 106 خلايا/مل.
  6. احتضن الخلايا عند حرارة 37 درجة مئوية في حاضنةببيئة تحتوي على ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. عد الخلايا كل 2-3 أيام واضبط الكثافة إلى 0.3-0.5 ×10 6 خلايا/مل بإضافة وسط خلية T ممتلئ طازج. يجب ألا تتجاوز كثافة الخلايا 1.5 ×10 6 خلايا/مل، لأن الخلايا التائية الأولية قد لا تعود إلى مرحلة النمو الأسي إذا تم زراعتها بكثافات عالية.
    ملاحظة: خاصة في الأيام الأولى بعد التفعيل، قد تكون تجمعات الخلايا الكبرى مرئية (انظر الشكل 2D). وهذا متوقع، حيث تتجمع الخلايا حول مادة التنشيط عند تهيئة التكاثر. بشكل عام، تكون الخلايا جاهزة للاستخدام بعد حوالي أسبوع من التفعيل. ومع ذلك، يعتمد التوقيت على الإعداد التجريبي وعدد الخلايا المطلوب. يوصى باستخدام خلايا T دائما ضمن نفس النطاق بعد التنشيط للنسخ البيولوجية (أي بعد 9-12 يوما من التفعيل).
المكونالتركيز النهائي
مصل الأبقار الجنيني10٪ (v/v)
إنترلوكين 15 (IL-15)10 نانوغرام/مل
إنترلوكين 7 (IL-7)5 نانوغرام/مل
البنسلين/ستريبتوميسين 10,000 وحدة لكل مل1٪ (v/v)
RPMI 1640 مع الفينول الأحمرNA

الجدول 2: تركيب وسط الخلايا التائية الكامل. وسط يستخدم لزراعة الخلايا التائية البشرية الأولية بعد التفعيل.

3. التلوين للتحديد الظاهري وعلامات التنشيط

  1. عد الخلايا التائية. استخدم 0.1 ×10 6 خلايا لكل تفاعل صبغ. احسب حجم تعليق الخلية المطلوب وانقله إلى أنبوب بوليسترين مناسب ذو قاع دائري.
    ملاحظة: يمكن تقليل عدد الخلايا الملونة إلى حد أدنى 50,000 خلية إذا لزم الأمر. من الممكن تلوين عدد أكبر من الخلايا أكثر من الكمية المطلوبة، طالما أن الأجسام المضادة زائدة في المول، كما هو موضح سابقا18,19.
  2. اغسل الخلايا مرة واحدة بإضافة 1 مل من محلول التلوين مباشرة، يتكون من PBS مع 0.5٪ FBS. جهاز طرد مركزي عند 300 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 5 دقائق. من الآن فصاعدا، احتفظ بالخلايا على الثلاجة واعمل مع المواد المبردة.
  3. في هذه الأثناء، حضر خليط رئيسي للأجسام المضادة لجميع الأنابيب كما هو موضح في الجدول 3. قم بتخفيف الأجسام المضادة إلى التركيز النهائي في محلول التلوين. يتم التلوين بحجم 50 ميكرولتر لكل أنبوب. امزج جيدا، على سبيل المثال، عن طريق الدوامة.
    ملاحظة: يمكن دمج هذا البروتوكول مع تجارب تلوين أخرى، مثل التلوين لتعبير CAR كما هو موضح في القسم 6. يمكن إضافة صبغة تلوين حية/ميتة للمساعدة في تثبيط الخلايا الحية. في هذه الحالة، يجب اختيار أطياف الانبعاث بشكل مناسب لتجنب التداخل مع الفلوروفورات الأخرى المستخدمة.
  4. بعد الطرد المركزي، تخلص من المادة الفائقة والماصة من السائل المتبقي. أعد تعليق كل حبة في 50 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الرئيسي.
  5. حضن الأنابيب عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. يمكن تمديد هذه الخطوة الحضانة حتى عدة ساعات.
  6. غسل الخلايا بإضافة 1 مل من محلول التلوين مباشرة إلى تفاعل التلوين. الطرد المركزي عند 300 × g، 4 درجات مئوية، لمدة 5 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت. كرر هذا القسم بنفس الشروط. بعد الخطوة الثانية من الغسيل، تخلص من السوبرناتانت، مع ترك كمية صغيرة من العزل المتبقي في الأنابيب لمنع جفاف الخلايا.
  7. احتفظ بالخلايا الملونة بحبيبات وعلى الثلج حتى القياس. أعد تعليق الحبيبة في 100 ميكرولتر من حاجز التلوين قبل القياس مباشرة.
    ملاحظة: هذا البروتوكول محسن للتلوين الذي يجرى في أنابيب دائرية قاع بحجم 5 مل. كما يمكن التلوين في ألواح 96 بئر باستخدام بروتوكول معدل قليلا. نظرا لأن حجم العمل للألواح أقل، ينصح بإجراء خطوتين غسيل بسعة 200 ميكرولتر قبل التلوين. إذا تم زرع أكثر من 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر، تقوم خلايا الحبيبات بالتخلص من المادة الفائقة قبل الانتقال إلى خطوات الغسيل. يتم أيضا التلوين بسعة 50 ميكرولتر لكل بئر. بعد التلوين، قم بإجراء ثلاث خطوات غسيل بدلا من اثنتين باستخدام محلول تلوين بسعة 200 ميكرولتر. يتم إجراء الطرد المركزي بنفس الإعدادات الموضحة أعلاه.
لون الليزرليزر λ (nm)مرشح الانبعاثنطاق المرشح (نانومتر)الصبغة الفلوريةالمستضدالتخفيف النهائينوع العلامة
فيوليت405450/45427.5–472.5فيوبلوCD451:100بان-كريات الدم البيضاء
فيوليت405525/40505–545فيوجرينCD691:50التفعيل
فيوليت405610/20600–620فيو برايت V600CD45RA1:100النمط الظاهري
الأزرق488525/40500–545FITCCD81:100النمط الظاهري
الأزرق488690/50665–715PerCP–Vio 700CD1541:50التفعيل
أصفر/أخضر561585/42564–606التربية البدنيةCD1341:50التفعيل
أصفر/أخضر561675/30660–690PE–Vio 670CD31:100خلية بان تي
أصفر/أخضر561780/60750–810PE–Vio 770CD251:50التفعيل
الأحمر638660/20650–670ناقل الحركة الجنويةCD1371:50التفعيل
الأحمر638712/25699.5–724.5فيو برايت R720CD62L1:100النمط الظاهري
الأحمر638780/60750–810APC–Vio 770CD41:100النمط الظاهري

الجدول 3: نظرة عامة على لوحة الأجسام المضادة والفلوروفورات المقترحة لتحليل التعبير الأولي عن النمط الظاهري وعلامات التنشيط في الخلايا التائية. يتطلب إجراء هذه التجربة جهاز قياس تدفق خلوي يحتوي على ما لا يقل عن 4 ليزرات وإعداد المرشح المناسب. إذا كان إعداد الجهاز مختلفا، يجب تعديل الفلوروفورات وفقا لذلك.

4. النسخ الصناعي للحمض النووي المشفر ب CAR لتوليد mRNA

  1. صمم قالب DNA مناسب للنسخ الصناعي (IVT) إلى mRNA. يتضمن محفز T7 لبوليميراز RNA من T7، وتسلسل كوزاك، وكودون بداية، وتسلسل ببتيدات الإشارة، وتسلسل CAR المطلوب، وكودون التوقف (الشكل 1).
    ملاحظة: تسلسل كوزاك هو نمط تعرف حاسم لبدء ترجمة البروتين من خلال دعم التجميع الصحيح لكودون البداية بواسطة الريبوسوم. يطلب ببتيد الإشارة للمعالجة الصحيحة ل CAR في الجولجي ودمجها في غشاء البلازما. لاكتشاف تعبير CAR، من المفيد تضمين علامة على الجزء خارج الخلوي من CAR (مثل علامة DYKDDDDK أو علامة MAP). قد يتم أيضا اكتشاف بعض CAR باستخدام مستضدها القابل للذوبان المرتبط بفلوروفور، أو أجسام مضادة ضد هياكل شائعة أخرى، مثل مجال رابط scFv (مثل الأجسام المضادة لرابط G4S أو الأجسام المضادة لرابط ويتلو).
  2. تضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل بوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات تحيط ببنية CAR، بما في ذلك محفز T7. بالنسبة للتلقيح الداخلي، هناك حاجة إلى 1 ميكروغرام من CAR-DNA. تحقق من الطول الصحيح لمنتج PCR عن طريق إجراء الرحلان الكهربائي التحليلي بجل الأغاروز. قم بتنقية منتج PCR عن طريق تنقية الأعمدة باستخدام اختبار PCR ومجموعة تنظيف الحمض النووي قبل الانتقال إلى IVT. يمكن تخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد يكون من المفيد تضمين 5-10 نيوكليوتيدات عشوائية في مناطق البرايمر قبل وبعد النسخ لتحقيق ارتباط أفضل للبوليميراز. نظرا لأن كمية كبيرة من الحمض النووي مطلوبة لعملية IVT، يمكن زيادة حجم تفاعل PCR وفقا لذلك.
  3. استخدم مجموعة IVT تتضمن خطوة ذيل بولي (A) لتوليد mRNA متعدد الأدينيل. قم بإجراء IVT في خزانة أمان بيولوجي ونظف الأسطح جيدا بالمطهر. اتبع تعليمات المجموعة لإجراء اختبار IVT.
    ملاحظة: إطالة خطوة النسخ إلى عدة ساعات قد تزيد من إنتاج mRNA. يجب الحفاظ على مدة خطوة البولي أدينيل ثابتة عبر العينات، لأنها تؤثر مباشرة على طول ذيل البولي (A). وهذا بدوره يمكن أن يؤثر على استقرار وكفاءة التعبير في الحمض النووي الريبي (mRNA) في الجسم الحي 20.
  4. قم بتنقية mRNA باستخدام مجموعة تنظيف RNA تعتمد على الأعمدة وحدد تركيز mRNA المنقى باستخدام جهاز مناسب.
    ملاحظة: هناك عدة طرق لتقييم جودة mRNA المنسوخ، بما في ذلك الرحلان الكهربائي الهلامي التحليلي قبل وبعد خطوة الذيل البولي (A) وطرق نسبة الامتصاص لتحديد تركيز mRNA. نسبة A260/230 الموصى بها هي 2.0-2.2؛ تشير القيم الأقل من 1.8 إلى وجود تلوث واحتمال ضعف الأداء في اختبارات التعبير. تم وصف أهمية تعديلات وتنقية mRNA قبل التقميم الكهربائي في مكان آخر 21,22,23.
  5. أليكوت 3-5 ميكروغرام من mRNA المنقى (الكمية النهائية من mRNA التي ستستخدم في تجارب لعملية التثقيف الكهربائي الواحدة) وتخزين الأليكوات عند -80 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.

الشكل 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لمكونات قالب الحمض النووي المطلوب لتوليد mRNA لنقل الخلايا التائية. يجب أن يحتوي الحمض النووي النموذجي ل IVT على محفز T7، وتسلسل كوزاك، وكودون بداية يليه ببتيد إشارة لتمكين إفراز البروتين إلى الفضاء خارج الخلية، وتسلسل CAR المطلوب، وكودون إيقاف. الاختصارات؛ mRNA = حمض الريبونوكليك الرسولي؛ DNA = حمض النيوكسي الريبونوكليك؛ CAR = مستقبل المستضد الكيميري؛ IVT = النسخ الصناعي . يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. النقل العابر لخلايا التائية الأولية بواسطة التسامح الكهربائي mRNA

  1. قبل يوم واحد من النقل، قم بتخفيف الخلايا التائية إلى كثافة 0.3 × 106 خلايا/مل في وسط خلية T كاملة (انظر الجدول 2). يجب أن تكون الخلايا في مرحلة النمو الأسي في يوم النقل (أي بكثافة أقل من 1 × 106 خلايا/مل) لتعبير CAR فعال.
  2. في يوم النقل، قم بتسخين جميع الوسائط المطلوبة مسبقا عند 37 درجة مئوية.
  3. عد الخلايا التائية واحسب الحجم المطلوب. استخدم 1-5 ×10 خلايا 6 لكل CAR-mRNA.
    ملاحظة: ينصح دائما بتضمين ترانسفيكشن "موكي" (أي الخلايا التائية التي تخضع لإجراء النقل ولكن دون إضافة mRNA). يمكن أيضا استخدام هذه الخلايا كأدوات تحكم سلبية للتلوين والتجارب. حافظ على ثابت رقم الخلية داخل التجربة.
  4. انقل الحجم المطلوب من تعليق خلايا T إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي. الطرد المركزي عند 300 × جم، RT، لمدة 5 دقائق. تخلص من السوبرناتانت. يتم تكرار جميع خطوات الطرد المركزي في الأقسام التالية تحت هذه الظروف.
    ملاحظة: إذا تجاوز الحجم المطلوب سعة أنبوب طرد مركزي مخروطي واحد، يمكن تقسيمه إلى أجزاء متساوية عبر أنبوبين أو أكثر. في هذه الحالة، أعد تعليق جميع الحبيبات بحجم إجمالي 20 مل RPMI وسط وجمعها أثناء أول خطوة غسيل (القسم 5.6).
  5. جهز وسط كامل لخلايا T في صفيحة مناسبة لاستعادة الخلايا التائية بعد الحفر الكهربائي.
    ملاحظة: استخدم هذه الاعتبارات للحساب: يجب أن تزرع الخلايا بكثافة تقريبية بين 0.5-1.0 ×10 6 خلايا/مل بعد التسامية الكهربائية. حوالي ثلث إلى نصف الخلايا تموت أثناء أو بعد التعرض الكهربائي. على سبيل المثال، إذا تم استخدام 2 ×10 6 خلايا لكل عملية التسامي الكهربائي، فمن المتوقع أن تبقى على الأقل 1 ×10 6 خلايا. للوصول إلى الكثافة الخلوية المطلوبة، استخدم 2.0 مل من وسط خلية T كاملة (في صفيحة تحتوي على 12 بئر). قم بتسخين اللوح الذي يحتوي على وسط الخلية التائية مسبقا عند 37 درجة مئوية حتى يتم إجراء التقميم الكهربائي.
  6. قم بأول خطوة غسيل باستخدام 20 مل من RPMI مع الفينول الأحمر وبدون مكملات. ضغط RPMI على الأجزاء فوق الخلايا، وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم، وRT لمدة 5 دقائق، وتخلص من السوبرناتانت.
  7. قم بالخطوة الثانية للغسل باستخدام 20 مل من RPMI بدون فينول ريد وبدون مكملات كما هو موضح أعلاه.
    ملاحظة: إذا تم استخدام خلايا T من عدة متبرعين للتقمية الكهربائية، يمكن تحضير الخلايا بالتوازي حتى القسم 5.8. استخدم دفعة واحدة فقط من خلية T لأداء الخطوة الأخيرة للغسل (القسم 5.8). اترك الخلايا الأخرى متكئة دون التخلص من المادة الفائقة وتابع الخطوة الأخيرة للغسل عندما تنتهي الجولة الأولى من التثقيف الكهربائي.
  8. قم بتنفيذ الخطوة الثالثة للغسل باستخدام 20 مل من وسط مصل مخفض كما هو موضح أعلاه.
  9. خلال الخطوة الأخيرة للطرد المركزي، اجمع جميع أليكوات mRNA المطلوبة من الفريزر واحتفظ بها على الثلج. ضع علامة على كوفيتات التخمير الكهربائي واللوح بالوسط المسخن مسبقا.
  10. قم بضبط الظروف على جهاز التسامية الكهربائية. هنا، يستخدم نظام إكس سيل النبالي الجيني الكلي. يجب أن تكون إعدادات البروتوكول لخلايا T الأولية:
    بروتوكول الموجة المربعة: الجهد: 500 فولت، عدد النبضات: 1، طول النبضة: 5 مللي ثانية، فترة النبض: 0، قطر الكوفيت: 4 مم
    ملاحظة: هذا البروتوكول محسن للخلايا التائية الأولية. أنواع أخرى من الخلايا قد تتطلب تعديل الإعدادات، خاصة طول النبض.
  11. تخلص من المادة الفائقة تماما عن طريق إزالة السائل المتبقي دون إزعاج الحبيبة. أعد تعليق حبيبة الخلية في 100 ميكرولتر من وسط مصل مخفض لكل عملية تسامية كهربائية (مثلا، إذا أجريت خمس عمليات اقتحام كهربائي، أعد تعليق الحبيبة بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر).
  12. استخدم 100 ميكرولتر من تعليق خلية T و3-5 ميكروغرام من mRNA لكل مسامية كهربائية. حضر فقط عملية إلكتروبوريشن واحدة في كل مرة. أضف تعليق خلية T إلى الأنبوب الذي يحتوي على mRNA، وامزجه بلطف. تجنب الرش بالحبات صعودا وهبوطا. اعمل بسرعة من الآن فصاعدا.
    ملاحظة: يجب ألا يتجاوز حجم mRNA المضاف 10 ميكرولتر. يمكن تعديل كمية mRNA إذا لزم الأمر. عند مقارنة CARs أو التجارب، استخدم دائما نفس عدد الخلايا والmRNA لكل عملية اقتراب كهربائي. وهذا مهم، لأن كمية mRNA مرتبطة مباشرة بمستويات تعبير CAR (انظر الشكل 5).
  13. انقل خليط mRNA/خلايا T إلى كوفيت الاقتراب. تأكد من أن نظام التعليق يغطي أسفل الكوفيت. لا تضع الماصة صعودا وهبوطا.
  14. انقل بسرعة الكوفيت الذي يحتوي على مزيج mRNA/خلايا T إلى جهاز التسامية الكهربائية وقم بإجراء التثقيف الكهربائي باستخدام الإعدادات كما هو محضر في القسم 5.11.
  15. بعد التثقيف الكهربائي، يتم استرجاع الخلايا التائية بعناية في وسط خلية T المدفأ مسبقا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من الوسط من صفيحة البئر إلى الكوفيت، ثم نقل الخلايا مرة أخرى إلى اللوحة. اشطف الكوفيت ب 100 ميكرولتر من المتوسط.
    ملاحظة: الخلايا حساسة لإجهاد القص بعد الحفر الكهربائي. تجنب تكرار خطوات إعادة التعليق.
  16. كرر الأقسام من 5.12 إلى 5.15 لجميع تراكيب mRNA.
  17. حضن الخلايا التائية المنقولة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. إذا تم تجهيز دفعة أخرى من خلايا T الآن، استمر في القسم 5.8 مع هذه الدفعة الآن.
  18. قم بالتجربة المناسبة خلال 24 ساعة.
    ملاحظة: تعبير CAR سيكون قابلا للكشف في وقت مبكر من 3-6 ساعات بعد التثقيف الكهربائي. قد تعتمد مستويات التعبير القصوى والحركية على بناء mRNA ويجب اختبارها في تجارب أولية. تتوفر بروتوكولات مفصلة تصف اختبارات القوة اللاحقة المحتملة، مثل تحليل سمية خلايا CAR T أو مستويات إفراز السيتوكينات عند الزراعة المشتركة مع الخلايا المستهدفة للورم، في أماكن أخرى 23,24,25,26,27.

6. تحليل تعبير CAR بعد التقشير الكهربائي

  1. بعد 6-24 ساعة من التقطيع الكهربائي، أعد تعليق وأعد الخلايا التائية. استخدم 50,000-100,000 خلية في كل تفاعل صبغ. نقل الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى أنبوب بوليسترين مناسب ذو قاع مستدير. يمكن إجراء الأقسام التالية خارج خزانة السلامة البيولوجية.
  2. غسل الخلايا بإضافة 1 مل من محلول التلوين، يتكون من PBS مع 0.5٪ FBS. جهاز طرد مركزي عند 300 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 5 دقائق. من الآن فصاعدا، احتفظ بالخلايا على الثلاجة واعمل مع المواد المبردة.
  3. حضر خلطة رئيسية تحتوي على جميع الأجسام المضادة المستخدمة في لوحة التلوين. أضف جسما مضادا يتيح اكتشاف CAR (على سبيل المثال، من خلال وسم ببتيد مدمج مثل علامة DYKDDDK). يتم تخفيف الأجسام المضادة كما هو موصى بها في حجم تلوين نهائي يبلغ 50 ميكرولتر (على سبيل المثال، للحصول على تخفيف بنسبة 1:50، يضاف 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة إلى 49 ميكرولتر من المخزن لكل أنبوب).
    ملاحظة: قد يتم التلوين للتعبير عن CAR فقط باستخدام جسم مضاد للكشف من CAR أو مع التلوين الظاهري وعلامة التفعيل. يمكن تعديل الجسم المضاد، بالإضافة إلى الفلوروفور المترافق. عند تبادل الأجسام المضادة و/أو الفلوروفورات، ضع في اعتبارك أطياف الإثارة والانبعاث المعنية. APC متوافق مع صبغة 7-أمينوأكتينوميسين D (7-AAD) المقترحة للصبغ المتزامن للقابلية للبقاء في نفس الوقت.
  4. بعد الطرد المركزي، تخلص من المادة الفائقة تماما عن طريق إزالة السائل المتبقي دون الإخلال بحبيبات الخلية. أعد تعليق كل حبيبة في 50 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة المحضر.
  5. حضن الأنابيب عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. يمكن تمديد هذه الخطوة الحضانة حتى عدة ساعات.
  6. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من محلول التلوين مباشرة إلى الأنبوب. استخدم الطرد المركزي عند 300 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 5 دقائق ثم تخلص من المادة الفائقة تماما عن طريق تفريغ السائل المتبقي. أعد تعليق حبيبات الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول التلوين لكل أنبوب.
  7. قبل بدء القياس، أضف 2 ميكرولتر من محلول 7-AAD إلى الأنابيب وامزج جيدا. حضن لمدة 10 دقائق في RT في الظلام. تابع القياس فورا.
    ملاحظة: لا تحضن الخلايا باستخدام 7-AAD لأكثر من 15 دقيقة، لأن ذلك قد يؤثر على النتائج. لتحقيق أوقات حضانة متجانسة، فكر في إضافة 7-AAD إما بشكل متسلسل أو على دفعات. هذا البروتوكول محسن للصبغ الذي يجرى في أنابيب دائرية قاع بحجم 5 مل. يمكن أيضا إجراء التلوين في صفائح 96 بئر باستخدام بروتوكول معدل قليلا. نظرا لأن حجم العمل للألواح أقل (حد أقصى 250 ميكرولتر)، ينصح بإجراء خطوتي غسل مع 200 ميكرولتر من العزل قبل التلوين. إذا تم زرع أكثر من 50 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر، قم بإلقاء الحبيبات على الخلايا وتخلص من المادة الفائقة قبل الانتقال إلى خطوات الغسيل. يتم أيضا التلوين بسعة 50 ميكرولتر لكل بئر. بعد الحضانة، قم بغسلتين باستخدام محلول تلوين بسعة 200 ميكرولتر. يتم إجراء الطرد المركزي بنفس الإعدادات الموضحة أعلاه.

النتائج

تنشيط وتوسع الخلايا التائية البشرية الأولية
تم إذابة وتنشيط الخلايا التائية الأولية في اليوم 0 إما بخرزات CD3/28 أو TransAct، وتم توسيعها لمدة 23 يوما، وتم عدها كل 2-3 أيام (الشكل 2A). في أيام العد، تم ضبط كثافات الخلايا إلى 0.3-0.5 ×10 6 خلايا/مل. في الأيام 0/2/5/9/14/20، تم استخدام الخلايا التائية لتحليل تدفق الخلايا الخلوية لتقييم النمط الظاهري والتعبير عن علامات التفعيل. خلال الأسبوع الأول بعد التفعيل، تكاثرت الخلايا التائية وتوسعت بسرعة باستخدام كلتا كواشفي التنشيط (الشكل 2B)، مع توسع طي أقل قليلا للأيام التالية لخلايا T المنشطة بواسطة TransAct (الشكل 2C). ومن الجدير بالذكر أن تنشيط الخلايا التائية كان مرئيا أيضا من خلال التحليل المجهري، حيث تشكلت تجمعات الخلايا التائية حول كواشف التنشيط (الشكل 2D).

الشكل 2
الشكل 2: تنشيط وتوسع الخلايا التائية الأولية باستخدام كاشفين تنشيطيين مختلفين. (أ) تمثيل تخطيطي للخط الزمني التجريبي. تم تنشيط الخلايا إما بخرزات CD3/28 أو TransAct في اليوم 0 وزراعتها لمدة 23 يوما. النقاط الزرقاء تصور الأيام التي تم فيها عد الخلايا، والنقاط الحمراء التي تمثل الأيام التي تم فيها تحليل الخلايا بواسطة قياس تدفق الخلية، والنقاط البنفسجية التي ترمز إلى الأيام التي أجريت فيها كلا التحليلين. (ب) و(ج) توسع الخلايا التائية الأولية خلال (ب) الأسبوع الأول أو (ج) خلال 16 يوما من الزراعة. توضح القيم متوسط ± الانحراف المعياري ل 4 (خرزات CD3/28) أو 3 (TransAct) متبرعين بخلايا تائية سليمة مختلفة. (د) صور مجهرية ممثلة لخلايا تائية منشطة مع تجمع خلوي مرئي في اليومين الأول والثاني بعد التفعيل. تم التقاط الصور باستخدام مجهر مقلوب. المسطرة تساوي 200 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تلوين النمط الظاهري وعلامات التنشيط لخلايا T
لتحليل تدفق الخلايا القياسية، تم تطبيق استراتيجية البوابات التالية (الشكل 3): تم تطبيق بوابة أولى (ارتفاع FSC-ارتفاع مقابل ارتفاع SSC) لإزالة حطام الخلايا والخرز، تلتها بوابات للخلايا المفردة (عرض FSC-عرض مقابل SSC-Area). يجب أن تكون نسبة خلايا CD3+ في نطاق 98-100٪. أسفر التقسيم الفرعي الإضافي عن نسبة خلايا T من CD4+ (مساعد) وخلايا CD8+ (السامة للخلايا)، والتي تم تثبيتها أيضا لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية باستخدام العلامات CD45RA و CD62L. تم تحليل خلايا T في CD3+ أيضا للتعبير عن علامات التنشيط (CD25/CD69/CD134/CD137/CD154).

الشكل 3
الشكل 3: استراتيجية البوابات لتحليل التدفق الخلوي. تظهر مخططات نقطية تمثيلية لمعطي خلية T واحدة تم تفعيلها بخرزات CD3/28 في اليوم الخامس (n = 4). الاختصارات؛ TEMRA = خلايا ذاكرة T المؤثر التي تعيد التعبير عن CD45RA؛ TSCM = خلايا ذاكرة تشبه الخلايا الجذعية؛ TEM = خلايا T الذاكرة المؤثرة؛ الطب الصيني التقليدي = خلايا الذاكرة المركزية التائية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بعد التنشيط باستخدام خرزات CD3/28، انخفضت نسبة خلايا T من CD4+ مقارنة بخلايا T من CD8+ مع مرور الوقت، حيث انخفضت نسبة خلايا T من CD4+ 74.3٪ (± 7.4٪) في اليوم الخامس، والتي انخفضت إلى 14.6٪ (± 3.4٪) في اليوم العشرين بعد التفعيل. ارتفعت خلايا T في CD8+ من 20.7٪ (± 6.4٪) في اليوم الخامس إلى 82.4٪ (± 3.1٪) في اليوم 20 (الشكل 4A). تم اكتشاف اتجاهات مماثلة بعد التفعيل باستخدام TransAct، مع نسب أقل قليلا من خلايا CD8+ T في اليوم 20 (72.5٪ ± 0.7٪). لذلك، فإن تمدد الخلايا التائية الأبطأ قليلا الذي لوحظ بعد التنشيط باستخدام TransAct كان يتوافق مع نسبة أقل من CD8+ ونسبة أعلى من خلايا CD4+ خلال فترة التوسع. كانت الفروقات في تركيب الخلايا التائية الظاهرية مشابهة مع كلا الكاشفين النشطين (الشكل 4B). ومع ذلك، كانت ترددات خلايا الذاكرة الفعالة التائية التي تعيد التعبير عن CD45RA (TEMRA) أعلى بشكل عام لخلايا CD8+ مقارنة بخلايا CD4+ . وبشكل متوافق، أظهرت خلايا CD4+ التائية نسب أعلى من خلايا الذاكرة المركزية (TCM) وخلايا الذاكرة الشبيهة بالخلايا الجذعية (TSCM) (الشكل 4B).

كان CD134 هو المؤشر الوحيد للتنشيط الذي تم تنظيمه بالفعل بعد إذابة الخلايا التائية، حيث تم تنشيط 37.6٪ (± 4.1٪) من خلايا CD134+ التائية باستخدام خرزات CD3/28 و36.1٪ (±4.4٪) خلايا تائية CD134+ لخلايا تائية مفعلة بتقنية TransAct (الشكل 4C). في كلتا استراتيجيتي التفعيل، تم زيادة كبيرة في التنظيم من اليوم 25 و69 وCD134 بحلول اليوم الثاني. بالنسبة للخرزات في اليوم الثالث و28 من الدورة، بلغ تعبير CD69 وCD134 ذروته في اليوم الثاني، بينما بلغ اليوم 25 ذروته في اليوم الخامس. لوحظت نتائج مماثلة لخلايا T المنشطة بواسطة TransAct. تم رفع مستويات CD134 وCD154 فقط في اليوم الرابع عشر لكل من خرزات CD3/28 والخلايا المنشطة بواسطة TransAct. بشكل عام، كانت الاتجاهات الملحوظة متشابهة جدا بين كاشفي التفعيل. ومع ذلك، كان تعبير CD69 في اليوم الرابع عشر أعلى قليلا في خلايا T المنشطة ب CD3/28 مقارنة بنظيراتها TransAct (97.1٪ ± 0.9٪ مقابل 86.5٪ ± 5.1٪). وهذا يتوافق مع معدل التوسع العالي المطول الذي يلاحظ مع الخلايا المنشطة بالخرزات في CD3/28. لتلخيص الأمر، تتضمن لوحة علامات التنشيط المقترحة علامات يتم رفع تنظيمها في الفترات الزمنية المبكرة واللاحقة بعد التفعيل، مع حساسية متفاوتة بين علامات التنشيط المختلفة، ولكن بشكل عام، اتجاهات متشابهة لكلا الكاشفين النشطين.

الشكل 4
الشكل 4: تحليل النمط الظاهري لخلايا T وتعبير علامات التنشيط باستخدام كواشف تنشيط مختلفة خلال فترة زراعة مدتها 20 يوما. (أ) نسب خلايا T من CD4+/CD8+ أثناء الزراعة بعد التنشيط باستخدام خرزات CD3/28 (يسار) أو TransAct (يمين). (ب) تمايز الخلايا التائية بعد التفعيل مع خرزات CD3/28 (لوحتان يساريان) أو TransAct (لوحتان يمينيتان)، كل واحدة لخلايا CD4+ أو CD8+. تم تقييم النمط الظاهري باستخدام المؤشرات CD45RA و CD62L. TEMRA: CD45RA+ CD62L-، TEM: CD45RA- CD62L-، TCM: CD45RA-CD62L+، TSCM: CD45RA+ CD62L+. (ج) التعبير عن علامات التنشيط بعد التفعيل باستخدام خرزات CD3/28 أو TransAct وخلال فترة التوسع. تظهر ترددات [٪] لخلايا T من CD3+ في المجموعة الأم (متوسط انحراف معياري ± 4 [خرزات CD3/28] أو 3 معطين صحيين مختلفين من خلايا T [TransAct]). الاختصارات؛ TEMRA = خلايا ذاكرة T المؤثر التي تعيد التعبير عن CD45RA؛ TSCM = خلايا ذاكرة تشبه الخلايا الجذعية؛ TEM = خلايا T الذاكرة المؤثرة؛ الطب الصيني التقليدي = خلايا الذاكرة المركزية التائية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النقل العابر لخلايا T الأولية وتحليل تعبير CAR
تم نقل الخلايا التائية الأولية بواسطة mRNA عن طريق التقميص الكهربائي في اليوم السابع بعد التفعيل باستخدام خرزات CD3/28 أو TransAct. كنموذج، تم استخدام ترميز mRNA لجهاز CAR من الجيل الثاني يستهدف بروتيوغليكان كبريتات الكوندرويتين 4 (CSPG4) مع تحفيز CD28 المشترك ومجال إشارة CD3ζ. تم تضمين علامة DYKDDDDK (علامة علم) لتمكين الكشف عن تدفق القياس الخلوي. تم تقييم مدى بقاء الخلايا التائية وتعبير CAR بعد 3 و6 و24 و48 ساعة بعد التسامح الكهربائي. تم إجراء التلوين كما هو موضح في القسم 6 من البروتوكول.

على الرغم من أن بقاء كل من خلايا T المنشطة بالخرزة وخلايا الترانس أكت في CD3/28 كانت منخفضة بعد 3 ساعات من التقشير الكهربائي، إلا أن قدرة خلايا CAR T المنقولة تراوحت بشكل عام بين 51-85٪ ولم تختلف بشكل كبير بين استراتيجيتي التنشيط (الشكل 5A). كان CAR قابلا للكشف بالفعل في هذه المرحلة المبكرة بعد التعرض الكهربائي. على الرغم من أن نسبة خلايا CAR+ انخفضت تدريجيا مع مرور الوقت، إلا أن أعلى تردد لخلايا CAR+ كان قابلا للكشف خلال 24 ساعة بعد التعرض الكهربائي (الشكل 5B، اللوحة اليسرى). ومن الجدير بالذكر أن شدة الإشارة كانت مستقرة خلال أول 6 ساعات بعد التسامية الكهربائية ثم انخفضت تدريجيا بعد ذلك (الشكل 5B، اللوحة اليمنى). كان تعبير CAR شبه غائب بعد 48 ساعة، مما يوضح الطبيعة المؤقتة للتلاعب بالخلايا وأهمية اختيار نافذة زمنية مبكرة للاختبارات اللاحقة. تظهر مخططات النقاط التمثيلية لتعبير CAR لمتبرع واحد في الشكل 5C. بالنسبة لكلا كاشفي التفعيل، لم تختلف نسبة CD4/CD8 بين الخلايا التي تم تحويلها بواسطة MOCK (الشكل 5D). تماشيا مع نتائجنا السابقة، أظهرت الخلايا التائية التي تم تفعيلها بواسطة خرزات CD3/28 تكرارا أعلى قليلا لخلايا CD8+ التائية مقارنة بالخلايا المنشطة بواسطة TransAct. في التحليل الظاهري، يظهر متبرع ممثل واحد بسبب اختلافات كبيرة تعتمد على المتبرع (الشكل 5E). بينما يؤثر كل من مادة التنشيط وحالة CD4/CD8 على النمط الظاهري للخلايا التائية، لا يسبب تعبير CAR تغييرا في النمط الظاهري مقارنة بالخلايا التي تم نقلها بواسطة MOCK.

لتقييم تأثير تركيز mRNA على مستويات التعبير، تم نقل الخلايا التائية الأولية ب mRNA مشفرة لنسخة طفرة من GFP (muGFP) باستخدام 0.1، 0.3، 1، 3 أو 6 ميكروغرام من mRNA. تم قياس إشارة GFP بواسطة قياس التدفق الخلوي بعد 24 ساعة من التعرض الكهربائي. كما هو متوقع، أدت كميات صغيرة من mRNA مثل 0.1 ميكروغرام إلى إشارة GFP قابلة للكشف، مع زيادة تدريجية في شدة الإشارة مع زيادة كميات mRNA. في تجاربنا، كان 1 ميكروغرام من mRNA مشبعا بالفعل، ولم تؤدي الكميات الأكبر (3 و6 ميكروغرام من mRNA) إلى زيادة إشارة GFP (الشكل 5F). هذا يبرز إمكانية استخدام كميات متفاوتة من mRNA لتعديل مستويات التعبير، مما يمكن أن يكون مفيدا لاختبار تأثير مستويات تعبير المستضدات المختلفة في CAR أو حتى المستهدف28.

الشكل 5
الشكل 5: حركية التعبير في خلايا CAR T المحولة وتحليل النمط الظاهري لخلايا CAR T المنقولة. (أ) قابلية حياة خلايا CAR T بعد التسامية الكهربائية باستخدام mRNA المشفر ل CAR. تم استخدام 2 ميكرولتر من 7-AAD في 100 ميكرولتر من محلول التلوين لتقييم الجدوى بعد 10 دقائق من الحضانة. n = 2-3 معطين فرديين (B) التلوين لتعبير CAR بجسم مضاد مضاد ل-DYKDDDDK (مرتبط ب APC، تخفيف نهائي بنسبة 1:50). بعد البوابة على الخلايا القابلة للحياة، تم تحليل نسبة الخلايا الموجبة ل CAR بالنسبة للعناصر التي تم تحويلها إلى MOCK (اللوحة اليسرى) أو الوسيط الهندسي لشدة الفلورة (GeoMean، اللوحة اليمنى) لجميع السكان. موضحة متوسطات n = 3 متبرعين فرديين ± مخططات نقاط ممثلة لمتبرع واحد من (B) توضح حركية تعبير CAR مع مرور الوقت. (د) تحليل خلايا التائية CD4+/CD8+ ومقارنة خلايا T المنقولة ب MOCK مع الخلايا التائية المنقولة بواسطة CAR، واستراتيجيتين مختلفتين للتفعيل بعد 24 ساعة من التسامية الكهربائية. موضحة متوسطات n = 3 متبرعين فرديين ± S.D. (E) تحليل ظاهري لخلايا T المحولة MOCK وCAR، والتي ظهرت في (B) بعد 24 ساعة من التعرض الكهربائي. يظهر متبرع ممثل واحد ل n = 3. (و) تحليل تعبير muGFP بعد 24 ساعة من التقميم الكهربائي باستخدام كميات مختلفة من mRNA. تم إجراء التداخل للخلايا الحية قبل قياس المتوسط الجغرافي ل GFP. موضحة متوسطات n = 3 متبرعين ± اختصارات S.D. CAR = مستقبل المستضد الكيميري؛ mRNA = حمض الريبونوكليك الرسولي؛ 7-AAD = 7-أمينواكتينوميسين؛ RT = درجة حرارة الغرفة؛ muGFP = بروتين فلوري أخضر متحول؛ S.D. = الانحراف المعياري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يوفر عزل وزراعة الخلايا التائية البشرية الأولية الأساس للدراسات المختبرية وفي الجسم الحي. من المعروف جيدا أنه عند التنشيط والتوسع في المختبر، تتمايز الخلايا التائية إلى نمط ظاهري يشبه المؤثر، وأن اختيار مكملات السيتوكين يؤثر بشكل كبير على مصير التمايز9. أظهرت خلايا CAR T التي زرعت ب IL-7 وIL-15 تحسنا في الاستمرارية ونشاطا أفضل ضد الأورام في نماذج الفئران مقارنة بالخلايا التائية التي تم توسيعها مع IL-229. لذلك، فإن اختيار كل من كواشف التنشيط ومكملات السيتوكين مهم لإنتاج خلايا تائية ذات النمط الظاهري المطلوب. قارنا بين كواشفي تنشيط (خرزات CD3/28 وTransAct)، يؤثران بشكل تفاضلي على حركية تمدد الخلايا التائية، والانضجاب، ونسبة CD4/CD8، على مدى فترة تمدد مدتها ثلاثة أسابيع. بشكل عام، توسعت خلايا T بعد تنشيط خرزات CD3/28 أظهرت نسبة أعلى من CD8+ وترددات أقل لخلايا CD4+ مقارنة بعد تفعيل TransAct. مع تمايز خلايا T في CD8⁺ بشكل مفضل نحو نمط TEMRA يشبه المؤثر، فإن اختيار الكاشف هو متغير رئيسي يجب أن يتوافق مع أهداف التجربة. بالإضافة إلى العلامات السطحية الظاهرية، فإن زيادة تنظيم علامات التنشيط تعطي معلومات عن حالة الخلية التائية ووظائف المؤثر. كل من CD25 وCD69 هما علامات تنشيط حساسة وعادة ما يتم رفع تنظيمهما في النقاط الزمنية المبكرة بعد التفعيل. تستخدم عادة لتقييم تنشيط الخلايا التائية، وكذلك لأنواع أخرى من الخلايا مثل خلايا القاتل الطبيعية (NK)30، 31، 32. في المقابل، أظهرت علامات التنشيط CD137 وCD154 تعبيرا أقل في الخلايا التائية المتوسعة، مما يبرز قدرتها على تقييم زيادة محددة في خلايا CAR T عند الزراعة المشتركة مع الخلايا المستهدفة. ومن الجدير بالذكر أنه عند تطبيق لوحة علامات التنشيط لتقييم نشاط خلايا CAR T عند الزراعة المشتركة مع الخلايا المستهدفة (أي الخلايا الورمية)، يلزم اختيار مؤشرات التنشيط بعناية لتجنب التعبير العالي لتلك العلامات على الخلايا التائية حتى في غياب الخلايا المستهدفة.

عند العمل مع الخلايا التائية الأولية، يجب أن يكون الشخص على علم بأن ملفات توسعها وتمايزها تعتمد بشكل كبير على المتبرع. ومع ذلك، فإن تخزين العينة الأولية عند 4 درجات مئوية قبل عزل الخلايا التائية ووقت التعامل القصير بشكل عام يحسن من إنتاج وجودة الخلايا المعزولة. تتأثر صلاحية الخلية بمدة خطوات التجميد والذوبان، حيث يحتوي وسط التجميد على مواد تجميد مثل كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO). بينما يعد DMSO ضروريا للحفاظ على الهياكل الخلوية عند التجميد، إلا أنه سام للخلايا في درجة حرارة الغرفة. لذلك، يتطلب التعامل السريع وتخفيف DMSO بعد الذوبان. عند التأثير الكهربائي للخلايا التائية، تكون الخلايا أكثر حساسية بعد النبضة الكهربائية، التي تهدف إلى جعل جدار الخلية قابلا للنفاذية لل mRNA. التعامل مع الخلايا بحذر من خلال تجنب إجهاد القص الإضافي والعمل مع المحاليل المسخنة مسبقا قد يزيد بشكل كبير من تعافي الخلايا وقدرتها على البقاء. قد يكون من المفيد إضافة mRNA إيجابي للتحكم الأساسي، مثل CAR بتعبير معروف أو بروتين تقرير مثل GFP، عند اختبار تركيب CAR جديد. كما ينصح أيضا بتضمين الخلايا المنقولة على الأقل MOCK (أي الخلايا التي تم تكهرب بدون mRNA) كعناصر تحكم سلبية. بالنسبة للاختبارات الوظيفية، قد يستخدم ترميز mRNA لجهاز CAR موجه نحو هدف مختلف لتقييم التنشيط الخاص ب CAR.

نظرا لأن حركيات التعبير قد تعتمد على تسلسل mRNA، فإن تقييم الحركيات بشكل فردي يعد أداة قيمة لاختيار نقطة زمنية مثالية لتوصيل الاختبارات في المراحل اللاحقة. تهدف هذه الطريقة أساسا إلى طريقة سريعة وسهلة لفحص عدة تراكيب CAR بالتوازي. نظرا لقصر الفترة الزمنية التي يعبر خلالها عن CAR على سطح الخلية T، لا يمكن إجراء اختبارات طويلة الأمد. ومع ذلك، من خلال تجارب النقل الأولية، يمكن تحديد أفضل تصميم CAR للانتقال إلى الفيروسات، إذا رغب في ذلك.

وأخيرا، قد يتم تبادل الأجسام المضادة أو الفلوروفورات المترافقة لتناسب الإعداد التجريبي. ومع ذلك، من الضروري النظر في أطياف الإثارة والانبعاث الخاصة بالفلوروفورات لتفسير النتائج بشكل موثوق. علاوة على ذلك، يمكن إجراء تلوين واحد بجسم مضاد واحد في كل مرة في التجارب الأولية لضمان التعويض الصحيح لللوحة متعددة الألوان. بينما لم نكن بحاجة إلى تعويض طيفي للوحة الأجسام المضادة المقترحة، قد يكون من الضروري إعداد مصفوفة تعويض عند تغيير اللوح.

يقدم بروتوكول IVT وتحليل الكهرباء المقدم بديلا بسيطا ومرنا للنقل الفيروسي لإدخال تراكيب CAR في الخلايا التائية البشرية الأولية. ونظرا لأنها تعتمد كليا على التوصيل المعتمد على RNA، يمكن تنفيذها في مختبرات دون الوصول إلى بنية BSL-2، مما يقلل بشكل كبير من الحاجز أمام أبحاث خلايا CAR T الآن. على الرغم من أن نقل الفيروسات فعال جدا ويستخدم بشكل رئيسي في مجال CAR، إلا أنه يصاحبه مخاوف تتعلق بالسلامة المتعلقة بالاندماج الجينيني، وهو سبب محتمل للأورام الخبيثة الثانوية، بالإضافة إلى الإنتاج المكثف والعمالة 33,34. علاوة على ذلك، تجعل الطبيعة المؤقتة لتعبير CAR هذا النهج مناسبا بشكل خاص للفحص السريع والمتوازي لعدة تصاميم CAR35، مما يسمح للباحثين بمقارنة أداء البناء بطريقة عالية الإنتاجية. العيب في هذه الطريقة هو الوقت المحدود لتعبير CAR، والذي يبلغ ذروته عادة حوالي 6-12 ساعة بعد التسامح الكهربائي22، 24، 35، 36. مع النقل العابر، لا يمكن إجراء الزراعة طويلة الأمد، مثل اختبارات التحفيز المتكررة، بسبب خفض تنظيم CAR. ومع ذلك، نقترح تحديد أكثر بنى CAR واعدا باستخدام تقميم كهربائي لل mRNA قبل النظر في الانتقال إلى أنظمة تعبير مستقرة بعدد محدود من المرشحين.

التثقيف الكهربائي لل mRNA إلى الخلايا الأولية هو تقنية متعددة الاستخدامات للتعبير عن البروتينات مثل المستضدات في أنواع خلايا مختلفة، بما في ذلك PBMCs، وخلايا التائية، وخلايا B، وخلايا NK،والخلايا التغصنية. ومن الجدير بالذكر أن هناك احتمالا آخر لتوصيل CAR العابر هو الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs)36,38، التي تسمح بتوصيل mRNA أو DNA مشفر ب CAR إلى خلايا T دون ناقلات فيروسية وتتيح التعبير الخالي من التكامل عن CAR. على النقيض من ذلك، يحقق نظام الترانسبوزون الجميلةالنائمة 39,40,41 تكاملا مستقرا دون الحاجة إلى مكونات فيروسية. الخيار الأنسب لنقل أو تحويل الخلايا التائية يعتمد على التطبيق المقصود والاعتبارات المتعلقة بالتوسع والتصنيع. تم استخدام خلايا CAR T القائمة على mRNA بنجاح في الدراسات ما قبل السريرية والسريرية ضد مجموعة متنوعة من الكيانات المختلفة، بما في ذلك الأورام الدموية والصلبة وأمراض المناعة الذاتية 42,43,44. تقدم CAR المعبر بشكل مؤقت مزايا مقارنة ب CAR المعبر عنها بشكل مستقر، حيث يمكن أن يمنع أو يقلل من الآثار الجانبية25.

باختصار، يوفر هذا السير بروتوكولا مباشرا خطوة بخطوة لعزل وتنشيط وزراعة وتحليل ونقل الخلايا التائية الأولية لتوليد خلايا CAR T الطبيعية. من السهل تنفيذه، ولا يتطلب مرافق مختبرية BSL-2، ويمكن دمجه بسهولة في مختبرات مجهزة بمرافق قياسية لعلم الأحياء الجزيئي وزراعة الخلايا.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق العلوم النمساوي (مشروع FWF ESP 465-B). نحن نعترف بالمرافق الأساسية للجامعة الطبية، وحدة قياس تدفق الليتومترية. نشكر جميع المتبرعين الأصحاء المتطوعين على مشاركتهم وتبرعهم بالعينات، وفريق التمريض على دعمهم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 mL Microcentrifuge Tubes, High PerformanceVWR525-1164
12-well plates, flat bottom, TC-treated VWR734-2324
24-well plates, flat bottom, TC-treatedVWR734-2325
6-well plates, flat bottom, TC-treated VWR734-2323
7-AAD staining solutionMiltenyi Biotec130-111-568
Anti-Flag DYKDDDDK Antibody, APC, REAfinityMiltenyi Biotec130-119-584
BD FACSCanto II Clinical Flow Cytometry SystemBD BiosciencesFACSCanto II
Bovine Serum AlbuminMerckA4503-10Gللعزل بعزلة الجاذبية
CD134 (OX40) Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-126-048المركّب: PE
CD137 (4-1BB) Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-764المركّب: APC
CD154 (CD40L) Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-114-142المركّب: PerCP-VIO 700
CD25 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-114-541المركّب: PE-Vio 770
CD3 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-132-352المركّب: PE-Vio 670
CD4 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-113-223المركّب: APC-Vio 770
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-045-101للعزل بعزلة الجاذبية
CD45 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-775المركّب: VioBlue
CD45RA Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-132-270المركّب: Vio Bright V600
CD62L Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-127-499المركّب: Vio Bright R720
CD69 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-112-800المركّب: VioGreen
CD8 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-677المركّب: FITC
CD8 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-045-201للعزل بعزلة الجاذبية
Cellstar 96 Well Suspension Culture Plate, U-bottomGreiner Bio-one650 185
Centrifuge 5810 REppendorf5811000015
CO2 incubator ICO150MemmertICO150
CoolNat Ice MachineZiegra Eismaschinen GmbHZBE 30-10
Corning CoolCell Freezer ContainerCorningCLS432000
Counting chamber, Bürker-Türk pattern, BLAUBRANDBrand719520
CryoPure tubes, 2 mL, QuickSeal screw capSarstedt72,380
CytoFLEX LX Flow CytometerBeckmann CoulterC11185
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN0447S
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture gradeAppliChemA3672
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190-144
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Gibco11131D
Electroporation Cuvettes with 4 mm gap size, yellow capVWR732-1137
Eppendorf Research plus pipette, 0.1–2.5 µLEppendorf3123000012
Eppendorf Research plus pipette, 100–1000 µLEppendorf3123000063
Eppendorf Research plus pipette, 2–20 µLEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus pipette, 20–200 µLEppendorf3123000055
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)MerckE6758-100Gللعزل بعزلة الجاذبية
Falcon 15 mL PP Centrifuge Tube, Conical BottomCorning352196
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test TubeCorning352008
Falcon 50 mL PP Centrifuge Tube, Conical BottomCorning325098
Fetal Bovine Serum, Value FBSGibcoA52567-01
Ficoll PM 400Sigma-AldrichF4375-10Gللعزل بالتدرج الكثالي
Fisherbrand Sterile Graduated Transfer PipetsFisher Scientific13469108
Gene Pulser Xcell Total SystemBioRad1652660مع وحدة الكمبيوتر ووحدة CE
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)New England BiolabsE2060S
Human IL-15, research gradeMiltenyi Biotec130-093-955
Human IL-7, research gradeMiltenyi Biotec130-095-367
Integra Biosciences Corp PIPETBOY acu 2 pipet aidFisher ScientificNC0085685
LE AgaroseBiozym840004
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401للعزل بعزلة الجاذبية
Microplate, 96 well, PS, V-bottom, clear, non-bindingGreiner Bio-one651901
Monarch RNA Cleanup Kit (50 μg)New England Bio

المراجع

  1. Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells. PLoS One. 4 (5), e5430(2009).
  2. Smeets, R. L., et al. Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling. BMC Immunol. 13 (12), (2012).
  3. Wilson, A., et al. Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function. Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).
  4. Dobersberger, M., et al. An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells. Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).
  5. Van Bruggen, J. A. C., et al. Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy. Blood. 134 (1), 44-58 (2019).
  6. Hoffmann, J. M., et al. Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients. Front Immunol. 8 (1956), (2017).
  7. Zhang, D. K. Y., et al. Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 14 (1), 506(2023).
  8. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. J Transl Med. 8 (104), (2010).
  9. Xu, X. J., et al. Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo. Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).
  10. Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15. Blood. 108 (2), 600-608 (2006).
  11. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  12. Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy. Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).
  13. Becker, S. A., et al. Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers. Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).
  14. Wiesinger, M., et al. Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance. Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).
  15. Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology. Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).
  16. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).
  17. Underwood, S., et al. T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function. Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).
  18. Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins. Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).
  19. Seigner, J., et al. Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity. Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).
  20. Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big. Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).
  21. Foster, J. B., et al. Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response. Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).
  22. Kitte, R., et al. Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation. Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).
  23. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  24. Hu, L., et al. A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy. J Vis Exp. (216), e67548(2025).
  25. Foster, J. B., et al. Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models. Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).
  26. Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level. J Vis Exp. (217), e67657(2025).
  27. Subham, S., et al. Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging. J Vis Exp. (200), e65560(2023).
  28. Zhao, Y., et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation. Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).
  29. Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
  30. Clausen, J., et al. Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells. Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).
  31. Poloni, C., et al. T-cell activation-induced marker assays in health and disease. Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).
  32. Rotta, G., et al. Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection. STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).
  33. Elsallab, M., et al. Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system. Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).
  34. Verdun, N., Marks, P. Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy. N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).
  35. Krug, C., et al. Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone. Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).
  36. Kitte, R., et al. Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).
  37. Sauerer, T., et al. Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins. Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).
  38. Bimbo, J. F., et al. T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles. J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).
  39. Hudecek, M., et al. Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).
  40. Prommersberger, S., et al. Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview. Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).
  41. Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).
  42. Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update. Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).
  43. Granit, V., et al. Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study. Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).
  44. Dagher, O. K., et al. Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الخلايا التائيةتنشيط الخلايا التائيةتوسيع الخلايا التائيةبروتوكول التثقيب الكهربائيقياس التدفق الخلويترانسفكشن الرنا المرسالالنمط الظاهري للخلايا التائية
عزل وزراعة ونقل مؤقت لخلايا تائية بشرية أولية لتوليد خلايا تائية مستقبلات مستضدات كيميرية (CAR)
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.