مقالة منهجية

إنتاج واختبار الببتيدات المضادة للميكروبات ومحاكاتها

1.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70178

⸱

أبريل 10, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry, University of New South Wales, 2School of Optometry and Vision Science, University of New South Wales

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة لإنتاج وتقييم النشاط المضاد للميكروبات وسمية الخلايا للببتيد الكاتيوني Mel4 والمقلد الببتيد RK758. من خلال دمج التخليق الكيميائي، والتعبير المؤتلف، والاختبارات الوظيفية الموحدة، يوفر ذلك سير عمل مبسط لإنتاج واختبار الببتيدات ومحاكاة الجزيئات الصغيرة.

الملخص

الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) ومحاكاتها الصناعية تظهر كبدائل واعدة للمضادات الحيوية التقليدية، خاصة استجابة للتهديد المتزايد لمقاومة المضادات الحيوية. تعد الميكروبات الطبيعية مكونات أساسية في الجهاز المناعي الفطري وتظهر نشاطا واسع الطيف ضد مسببات الأمراض الميكروبية المتنوعة، بينما تهدف مقلداتها الاصطناعية، بما في ذلك الببتيدوميتيكس والنظائر البوليمرية، لتعزيز الاستقرار، وتقليل السمية، وتحسين الحراكية الدوائية. تهدف هذه الدراسة إلى إظهار إنتاج وتوصيف وتقييم بيولوجي لمضادات الحمض النووي المكثف ومحاكاة الببتيدات الجزيئية الصغيرة. يتم توليد الحمض الأمبيكراتي باستخدام أنظمة التعبير المؤتلف أو تخليق الببتيدات ذات الطور الصلب، مما يتيح تحكما دقيقا في تسلسل الأحماض الأمينية وخصائصها البنيوية. يتم تصنيع محاكاة الببتيدات الجزيئات الصغيرة باستخدام استراتيجيات كيميائية، بما في ذلك سقالة حمض الأنثرانيليك (2-أمينوبنزويك حمض الأمينوبينزويك) لتعزيز الاستقرار الهيكلي والأداء الدوائي. بعد التخليق، يتم تنقية المركبات وتوصيف كيميائيا قبل إجراء الاختبارات البيولوجية. يتم تقييم النشاط المضاد للميكروبات باستخدام اختبارات التركيز المثبط الأدنى في المختبر ، ويتم تقييم سمية الخلايا ضد خطوط الخلايا الثديية لتحديد الانتقائية. تظهر النتائج التمثيلية أن كل من AMPs ومقلداتها تظهر نشاطا قويا ضد Klebsiella pneumoniae و Escherichia coli، مما يبرز إمكاناتها المضادة للبكتيريا واسعة الطيف. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول إطارا شاملا وقابلا للتكرار لتطوير وتقييم منهجية الببتيدات المضادة للميكروبات ومحاكاتها كعوامل مضادة للعدوى من الجيل التالي.

المقدمة

برزت مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) كتهديد صحي عالمي رئيسي1. وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO)، كان المقاومة المضادة للنمو مسؤولا مباشرة عن حوالي 1.27 مليون وفاة في عام 2019 وساهم في ما يقدر ب 4.95 مليون حالةوفاة حول العالم. لقد سلط الاستخدام المفرط وسوء استخدام المضادات الحيوية الموجودة الضوء على ظهور مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة، مما ترك خيارات علاجية محدودة ضد الميكروبات مثل البكتيريا والفطريات والفيروسات والبروتوزوا 2,3. أدت أزمة مقاومة الميكروبات هذه إلى بدء البحث عن استراتيجيات بديلة لمضادات الميكروبات تكون فعالة ومستقرة وأقل عرضة لتطوير المقاومة. من بين أكثر المرشحين الواعدين AMPs ومحاكاته الصناعية4.

AMPs هي جزيئات طبيعية تلعب دورا حيويا في الجهاز المناعي الفطري للبشر والحيواناتوالنباتات. عادة ما تظهر هذه الأنظمة نشاطا مضادا للميكروبات واسع الطيف من خلال آليات مثل اضطراب الغشاء، والتدخل في الأيض الميكروبي، وتعديل الاستجابات المناعية6. على سبيل المثال، أظهر ببتيد الكاثيليسيدين البشري LL-37 نشاطا قويا ضد البكتيريا والفطريات والفيروسات. ومع ذلك، وعلى الرغم من إمكاناتها الواعدة4، فإن الاستخدام العلاجي واسع النطاق للحمض الطبيعي غالبا ما يكون مقيدا بانخفاض وفرة الحمض الطبيعي لها. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون الحصول على أشكالها النشطة من مصادر طبيعية أمرا صعبا، حيث تتطلب العديد من الببتيدات تعديلات محددة بعد الترجمة لتصبح نشطة وظيفيا8.

لمعالجة القيود المرتبطة بالأمبيرات الطبيعية، طور الباحثون نظائر اصطناعية ومحاكاة للببتيدات. يمكن أن تكون هذه المقلدات جزيئات صغيرة مصممة بشكل عقلاني تحافظ على فعالية مضادات الميكروبات الطبيعية مع تقديم استقرار وانتقائية وأداء دوائي أفضل9.

مكنت التطورات الحديثة في كيمياء الببتيدات وعلم الأحياء الجزيئي الإنتاج الفعال للببتيدات المضادة من خلال طرق مثل تخليق الببتيدات ذات الطور الصلب (SPPS)، وتخليق الببتيدات في الطور السائل (LPPS)، وأنظمة التعبير المؤتلف، مما يوفر تحكما دقيقا في المعايير الهيكلية الرئيسية مثل تركيب التسلسل، توزيع الشحنة، والبرمائية10. أنظمة التعبير المؤتلف مناسبة للإنتاج على نطاق واسع وللببتيدات الأطول أو الأكثر تعقيدا. بمجرد تحسينها، توفر الطرق المؤتلفة—التي تستخدم عادة أنظمة التخمير أو المفاعلات الحيوية—نهجا فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتوسع للإنتاج الصناعي للببتيدات العلاجية11.

توضح هذه المقالة الأساليب التكميلية لإنتاج وتقييم الميكروبات المضخمة ومحاكاتها. بينما يستخدم التخليق الكيميائي بالطور الصلب على نطاق واسع لتوليد الببتيدات، إلا أنه قد يصبح غير فعال ومكلف للتسلسلات الأطول أو الببتيدات ذات الكاتيونية العالية بسبب التجميع، وانخفاض الإنتاجية، وتحديات التنقية12. على النقيض من ذلك، يظل التخليق الكيميائي مفيدا للغاية لتوليد محاكاة الببتيدات القصيرة مع تعديلات هيكلية دقيقة وبقايا غير طبيعية13. أما أنظمة التعبير المؤتلف، فهي تمكن من إنتاج ببتيدات أطول أو معقدة هيكليا بشكل فعال من حيث التكلفة وقابلا للتوسع في العائل الميكروبية، متغلبة على قيود الطول والعائد المرتبطة بالأساليب الصناعية البحتة12. من خلال دمج استراتيجيات الإنتاج الكيميائي والبيولوجي، يوفر هذا الإطار المشترك مرونة وقابلية توسع وإمكانية ترجمة أكبر من أي من الطريقتين فقط، مما يجعله مناسبا بشكل خاص للبحث الميكانيكي والتطوير العلاجي.

بعد الإنتاج، يتم التقييم البيولوجي لهذه المركبات من خلال اختبارين رئيسيين. يقيس اختبار النشاط المضاد للميكروبات القدرة المثبطة لكل ببتيد أو مقلد ضد الكائنات الدقيقة الممثلة، مما يوفر رؤى حول طيفها وقوتها. يقيم اختبار السمية التوافق الخلوي باستخدام خطوط خلايا الثدييات لضمان السلامة والانتقائية. من خلال دمج هذه النماذج التجريبية من تصميم الخطوات، والتركيب، والاختبارات الوظيفية، يوفر هذا البروتوكول إطارا شاملا لتوصيف فعالية وسلامة الميكروبات المضافة ونظائرها الاصطناعية. معا، تضع هذه المنهجيات نهجا منهجيا لتطوير والتحقق من صحة العوامل المضادة للميكروبات الجديدة لمواجهة التحدي العالمي المتزايد لمقاومة مقاومة الميكروبات.

البروتوكول

1. تخليق ببتيد الأنثرانياميد الذي يحاكي RK758

  1. يتم تصنيع RK758 داخليا من الكتل العضوية الرئيسية المحمية ب N-Benzyl من الكربامات L-تريبتوفان و5-برومو إيزاتويك أنهيدريد. تم الإبلاغ عن عدة طرق تركيبية؛ ومع ذلك، أظهر النهج المذكور أدناه قابلية توسع جيدة وعائد عام، وهو تحسن مقارنة بالبروتوكولات التركيبية المنشورة سابقا14,15.
    1. الطريقة 1: تخليق البنزيل (S)-(1-((2-((3-بوتوكسي كاربونيل)أمينو)إيثيل)أمينو)-3-(1H-إندول-3-يل)-1-أوكسوبروبان-2-إيل) كاربامات (2):
      1. في قارورة ذات عنق واحد بسعة 250 مل، مزودة بقضيب تحريك مغناطيسي، قم بوزن Cbz-L-تريبتوفان (10.0 جم، 29.6 ملليمول) واذاب في 30 مل من DMF و80 مل من DCM.
        تحذير: يشتبه في أن DMF يسبب تشوهات خلقية؛ تجنب التعامل معها أثناء الحمل، واستخدم فقط غطاء أبخرة.
      2. أضف HOBt (4.08 جم، 29.6 ملليمول)، N-Boc-إيثيلين ديامين (4.66 مل، 29.6 ملليمول)، وثنائي إيزوبروبروبيليليأمين (8.31 مل، 59.0 ملليمول) وتحرك لمدة 15 دقيقة.
      3. أضف ملح هيدروكلوريد EDC (11.3 جرام، 59 ملليمول). حركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 ساعة.
        تحذير: الكربوديميدات، مثل EDC، معروفة بأنها تحسس تجاه ردود الفعل التحسسية عند التعرض المتكرر؛ تأكد من ارتداء القفازات المناسبة.
      4. تحقق من TLC باستخدام نسبة 1:1 (v/v) DCM/إيثيل أسيتات لترى إذا تم استهلاك كل CBZ-L-Trp.
      5. بعد الانتهاء من التفاعل، استخدم مبخر دوار لتركيز التفاعل لإزالة ثنائي كلوروميثان من الخليط.
      6. قم بحل العجينة بحوالي 300-400 مل من أسيتات الإيثيل
        ملاحظة: الخطوة 1.1.1.6 تعطي مخجا في ثنائي ميثيل فورميد. استخدم كمية كافية من أسيتات الإيثيل لإذابة التعليق.
      7. اسكب المحلول في قمع فصل بسعة 500 مل مع 50 مل من الماء. هز القمع الفاصل.
        تحذير: بما أن كمية كبيرة من المذيب المتطاير يستخدم هنا، فمن الضروري تفريغ القمع الفاصل بشكل متقطع.
      8. قم بتصريف الطبقة المائية، مع الاحتفاظ بطبقة أسيتات الإيثيل العضوية.
      9. كرر الخطوة 1.1.1.7-1.1.1.8 باستخدام 50 مل من الماء، و50 مل من بيكربونات الصوديوم المشبع، و50 مل من كلوريد الصوديوم المائي المشبع.
      10. انقل الطبقة العضوية المحتجزة إلى قارورة مخروطية بسعة 1 لتر. جفف المواد العضوية بإضافة كبريتات الصوديوم اللامائية وتدوير القارورة حتى يتكون مسحوق حر التدفق.
      11. قم بترشيح الخليط إلى قارورة ذات قاع دائري بسعة 1 لتر، ثم ركز حتى يجف على مبخر دوار (حمام ماء بدرجة 40 درجة مئوية باستخدام فراغ 180 م.بار).
      12. أضف 50 مل من الإيثر ثنائي الإيثيل وقضيب تحريك مغناطيسي، وحرك العجينة لمدة 45-60 دقيقة.
        ملاحظة: يمكن أن يكون من الفعال كشط المواد الصلبة عن جدار القارورة باستخدام ملعقة معدنية.
      13. قم بتصفية العجينة لجمع المواد الصلبة المتراكبة. اغسل كعكة الفلتر مرتين أخريين بحصص 50 مل من إيثر الديثيل. جفف المواد الصلبة تحت الشفط للحصول على المركب 2 كمسحوق بيج بنسبة 87٪ من الإنتاجية.
    2. الطريقة 2: تخليق تيرت-بيوتيل (S)-(2-(2-أمينو-3-(1H-إندول-3-yl) بروباناميدو) إيثيل) كاربامات (3)
      1. في قارورة ذات عنق دائري قاع بسعة 250 مل مزودة بحاجز مطاطي وحاجز زجاجي، قم بإذابة المنتج 2 (10.8 جم، 22.3 ممول) في 100 مل من الميثانول باستخدام التحريك المغناطيسي
        ملاحظة: لا تدهون سدادة الزجاج بالدهن، لأن ذلك قد يؤدي إلى التلوث.
      2. أثناء التحريك، أضف 10٪ بالاديوم على الكربون (1.07 جم) عبر فتحة السدادة الزجاجية. باستخدام مشعب شلينك، قم بتمرير غاز النيتروجين الفقاعي عبر الخليط لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
        ملاحظة: يمكن استخدام أي غاز خامل، مثل الأرجون؛ ومع ذلك، فإن البيت N2 كاف في هذه الحالة.
      3. استبدل سدادة الزجاج بمحول تأريض زجاجي ثنائي الاتجاه، حيث يكون أحد الخطين متصلا ببالون هيدروجين والآخر متصل بفراغ. ضع شريط PTFE حول المفصل لعمل ختم محكم الهواء.
      4. افتح القارورة لتفريغ حتى يبدأ الميثانول بالغليان فقط، ثم افتح القارورة بسرعة إلى بالون الهيدروجين. كرر ذلك مرتين إضافيتين.
      5. راقب التفاعل من خلال كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (باستخدام أسيتات الإيثيل 1:1 أو ثنائي كلوروميثان كمحلول مسحور) عن طريق استخراج كميات صغيرة من خليط التفاعل عبر الحاجز المطاطي باستخدام حقنة والترشيح عبر فلتر غشائي PTFE بقطر 40 ميكرومتر.
      6. على مشعب شلينك، حول الفراغ إلى نيتروجين. أزل الحاجز المطاطي من القارورة ودع النيتروجين يطهر الهيدروجين المتبقي لمدة حوالي 5 دقائق.
        تحذير: يمكن أن يشتعل بالاديوم على الكربون تلقائيا في الهواء عندما يمتص الهيدروجين عليه. من المهم التعامل مع التفاعل تحت غطاء غاز خامل.
      7. تحضير طبقة من الأرض الدياتومية، عن طريق تكوين خليط من الأرض الدياتومية في أسيتات الإيثيل ونقل الخلاط إلى قمع مرشح زجاجي متوسط المسامية متصل بقارورة قاعية دائرية بحجم 500 مل، وسحب فراغ خفيف حتى يصبح المذيب فوق مستوى الأرض الدياتومية
        ملاحظة: يجب أن يكون عمود الأرض الدياتومية ارتفاعا لا يقل عن 2–4 سم عند تحميله في القمع.
        تحذير: التراب الدياتومي/السيليكا البلورية شديدة السرطان ومعروفة بأنها تسبب الورم المتوسط من خلال التعرض للتنفس. يجب دائما التعامل معه بغطاء بخار أو مع ارتداء جهاز تنفس مناسب.
      8. باستخدام الماصة أو غيرها، انقل خليط التفاعل إلى أعلى عمود السيليت، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقة العليا من السيليت. كرر العملية حتى يتبقى كمية صغيرة فقط من خليط التفاعل (<2 مل) في القارورة
        ملاحظة: بعد وضع رأس مذيب كاف فوق السرير، يمكن صب محتويات القارورة في قمع الفلتر.
      9. اسحب تفريغ خفيف بشكل متقطع على القمع/القارورة حتى يصبح رأس المذيب فوق القاعة مباشرة، ثم اغسل محتويات القارورة بكميات صغيرة من أسيتات الإيثيل، وكرر العملية 3–4 مرات
        ملاحظة: يجب ألا تتعرض طبقة البلاديوم/الكربون فوق السيلايت للهواء.
      10. استمر في غسل الفوطة حتى يتم تصفية جميع المنتجات؛ يمكن التحقق من ذلك عن طريق تنقيط بعض المذيب المفلتر على قطعة صغيرة من صفيحة TLC ورؤية تحت ضوء UV.
      11. قم بإزالة كل المذيب من المبخر الدوار. أضف كمية قليلة من ثنائي كلوروميثان (5 مل) إلى البقايا وترسيب المنتج بإضافة إيثر ثنائي إيل (50 مل).
      12. قم بترشيح الخليط، مع الاحتفاظ بالراسب الذي يوفر المتوسط 3 في العائد الكمي.
    3. الطريقة 3: تخليق تيرت-بيوتيل (S)-(2-(2-(2-أمينو-5-بروموبينزاميدو)-3-(1H-إندول-3-يل)بروباناميدو)إيثيل) كاربامات (4)
      1. في قارورة مجففة بحجم 250 مل في فرن ذات عنق واحد ودائرية قاع، قم بوزن المنتج 3 (5.00 جم، 14.5 ملليمول) و5 أنهيدريد بروموزاتويك (5) (3.50 جم، 14.5 ملليمول). أضف 50 مل من الأسيتونيتريل اللامائي.
        ملاحظة: تم الحصول على الأسيتونونتريل اللامائي من نظام تنقية المذيب عن طريق تمرير المذيب عبر عمود من الألومينا المنشطة.
      2. قم بتركيب قارورة بمكثف ارتجاع مبرد بالماء وأنبوب تجفيف مملوء بكلوريد الكالسيوم اللامائي وإغلاق الوصلات بشريط PTFE.
      3. سخن الخليط حتى يصل إلى الارتجاع (ب. ب. أسيتونونتريل = 82 درجة مئوية)، درجة حرارة حمام الزيت = 100 درجة مئوية. حرك عند الارتجاع لمدة 18 ساعة أو حتى تظهر TLC استهلاكا لثلاث ساعات. بعد الانتهاء، تركز خليط التفاعل حتى يصبح جافا تحت الفراغ.
      4. أضف إلى المواد الصلبة 30 مل من الأسيتونيتريل و50 مل من الإيثر ثنائي الإيثيل وترشيح الخليط، مع الاحتفاظ بالمنتج الصلب. اجمع المنتج الصلب لتحصل على مركب العنوان 4 بعائد 78٪.
    4. الطريقة 4: تخليق تيرت-بيوتيل (S)-(2-(2-(2-(2-(2-نفثاميدو)-5-بروموبينزاميدو)-3-(1H-إندول-3-يل)بروباناميدو)إيثيل) كاربامات (6)
      1. في قارورة مجففة بسعة 50 مل في فرن ذات عنق واحد ذات قاع دائري، قم بإذابة كلوريد 2-نفثويل (572 ملغ، 3.0 ملليمول) في 10 مل من ثنائي كلوروميثان. ضع القارورة بفتحة مطاطية. يشار إلى هذه القارورة باسم "القارورة أ" فيما بعد.
        ملاحظة: تم استخدام كلوريد نفثويل من مورد تجاري في الدراسة، لكن تم إنتاجه من حمض نفثويك 2 باستخدام كلوريد الأكساليل كما هوموضح 14).
      2. في قارورة منفصلة مجففة في الفرن بسعة 100 مل ذات عنق واحد ودائرية قاع، قم بوزن المنتج 4 (544 ملغ، 1.0 ملليمول). يشار إلى هذه القارورة باسم "القارورة B" من الآن فصاعدا.
      3. قم بتركيب الحاجز المطاطي للقارورة B وتوصيله بمشعب Schlenk باستخدام إبرة حقنة ومحول لوير. قم بتطهير القارورة B تحت التفريغ واملأها بالنيتروجين، كرر العملية مرتين.
      4. أضف 20 مل من ثنائي كلوروميثان اللامائي عبر الحقنة إلى قارورة B. أضف ثلاثي الإيثيل أمين (455 ميكرولتر، 3.24 ملليمول) عبر الحقنة إلى القارورة B. برد على حمام ثلج لمدة 10 دقائق.
      5. اسحب محتويات القارورة A في حقنة بحجم مناسب. أضف المحلول من الحقنة إلى قارورة B بقطرة مع التحريك.
        ملاحظة: قد يرى إنتاج ثلاثي إيثيل أمين هيدروكلوريد على شكل أبخرة بيضاء فوق المذيب. أزلها من حمام الثلج بعد إضافة محلول الكلوريد الحمضي.
      6. حرك الخليط حتى يتم استهلاك المركب 4 بالكامل بناء على تحليل TLC. ركز الخليط حتى يصل إلى حد الجفاف تقريبا على مبخر دوار (600 ملي بار، 40 درجة مئوية).
      7. قسم الخليط بين الماء (30 مل) وأسيتات الإيثيل (70 مل). دمج الطبقات عن طريق هز قمع منفصل والتخلص من الطبقة المائية.
      8. اغسل الخليط العضوي بمحاليل مائية مشبعة من NaHCO3 (30 مل) وNaCl. جفف الطبقة العضوية بإضافة Na2SO4 اللامائي حتى يلاحظ وجود مسحوق يتدفق بحرية أثناء الخلط.
      9. ركز حتى يجف على مبخر دوار (170 ملي بار، 40 درجة مئوية). قم بتثبيط المواد الصلبة الخام باستخدام الأسيتونيتريل (15 مل) وإيثر ثنائي إيثيل (15 مل) للحصول على المركب المثالي كمادة صلبة بيضاء مائلة للصفرة بنسبة 70٪.
    5. الطريقة 5: تخليق (S)-N-(2-((1-((2-(2-أمينوإيثيل)أمينو)-3-(1H-إندول-3-yl)-1-أوكسوبروبان-2-إيل)كاربامويل)-4-بروموفينيل)-2-نفثاميد (7)
      1. عالج معلقا بدرجة 6 متوسطة (1.5 جرام، 2.15 ميليمول) في ثنائي كلوروميثان (تركيز نهائي 0.2 م) ب 1,2-إيثانيديثيول (حجم 20٪ بالنسبة لحجم DCM).
        تحذير: 1,2-إيثانيديثيول له رائحة مزعجة قد تسبب الغثيان حتى عند تركيزات منخفضة، يضع في غطاء أبخرة.
      2. برد الخليط في حمام ثلج، ثم عالج بحمض ثلاثي فلورو أسيتيك (نفس الحجم المستخدم في DCM). حرك الخليط على درجة حرارة 0 درجة مئوية لمدة ساعتين.
      3. بعد الانتهاء، تركز خليط التفاعل عن طريق تطهيره بغاز النيتروجين
        ملاحظة: قد يتم دفع غازات العادم عبر مصيدة مبيض للحد من إطلاق الروائح.
      4. قم بتثبيث المواد الصلبة الخام مع إيثر الثنائي ثيل (10 مل) وقم بالتصفية لجمع المواد الصلبة. اغسل كعكة الفلتر مرتين بإيثر الثنائي إيثيل (10 مل لكل منهما)، ثم اترك المواد الصلبة تجف تحت الشفط.
    6. الطريقة 6: تخليق تيرت-بيوتيل (S,Z)-(3-((1H-إندول-3-إيل)ميثيل)-1-(2-(2-نفثاميدو)-5-بروموفينيل)-1,4-ديوكسو-9-(فينيليمينو)-2,5,8,10-تترازادودكان-12-إيل) كاربامات (9)
      1. شحن قارورة ذات عنق واحد ذات قاع دائري بحجم متوسط 7 (1.0 جرام، 1.4 ملليمول)، مشتق ثيوريا 8 (415 ملغ، 1.4 ملليمول)، وثلاثي إيثيلامين (1.01 مل، 4.2 ملليمول) بالنيتروجين وثنائي ميثيل فوراميد (5 مل).
      2. برد التفاعل إلى -5 درجة مئوية في حمام بمحلول ملحي وثلج وأضف كلوريد الزئبق (II) (760 ملغ، 2.8 ملليمول) وحركه لمدة 16 ساعة.
        تحذير: كلوريد الزئبق (II) قاتل عن طريق التعرض الفموي والجلدي والتنفسي. كما أنه سام جدا للحياة المائية. ارتد قفازات مقاومة للمواد الكيميائية، وحماية للعين، وحماية للجسم. بالإضافة إلى ذلك، تجنب المحاليل التي تحتوي على كلوريد الزئبق (II) وتعامل معها داخل غطاء بخار. تأكد من فصل النفايات الناتجة عن هذه العملية عن تدفقات النفايات العضوية الأخرى وضمان عدم دخول أي نفايات زئبقية إلى المصارف.
      3. بعد الانتهاء، قم بتخفيف الخليط ب 2-بروبانول وترشيح طبقة من السيلايت، مع جمع الترشيح.
      4. تركيز المادة المفلحة حتى تجف على مبخر دوار وعرض البقايا لعمل كروماتوغرافيا عمودية الفلاش على السيليكا باستخدام ميثانول/ديكلوروميثان بنسبة 3:97 كمحلول للسيلكا.
      5. حلل الكسور المجمعة باستخدام TLC ثم اجمع الكسور النقية لتحمل تكلفة مركب الملكية.
    7. الطريقة 7: تخليق RK758
      1. الطريقة التي تقوم ب Boc بإزالة الحماية من الوسيط 8 لتشكيل RK758 هي نفسها الخطوة 1.1.5.
      2. أعد إذابة المنتج الناتج في 5 مل من أسيتونيتريل 1:1 (v/v) مع ماء فائق النقي، ثم انقله إلى غطاء برغي، قارورة زجاجية بوروسيليكات. جمد المحلول في حمام من النيتروجين السائل ثم جففه بالتجميد للحصول على المنتج.
        ملاحظة: من المهم التأكد من أن القارورة المستخدمة مصنوعة من البوروسيليكات لمنع التشقق عند التجميد.
        تحذير: التعرض للنيتروجين السائل قد يسبب قضمة الصقيع أو تلف الجلد. تأكد من ارتداء القفازات وحماية العين المناسبة.

2. إنتاج وتنقية إعادة تركيب الببتيد المضاد للميكروبات الكاتيونية عالية Mel4 (KNKRKRRRRRGGRRR)

  1. بروتوكول محسن للإنتاج
    1. تخليق الجينات
      1. تصميم وتصنيع شريط الجين بالمكونات التالية: HIS (علامة هيستيدين 6x/7x لعزل الببتيدات المؤتلفة، وسم إيزوميراز الكيتوستيرويدي (KSI) لتكوين جسم الإدراج (IB)، وموقع تقسيم فيروس تبغ (TEV) (ENLYFQ↓G, S, A, M, C, H)، لاستئصال مستدام وخال من المواد الكيميائية لعلامة KSI وHis-Tag من نمط البروتين.
      2. اختر الحمض الأميني مباشرة بعد القطع (G, S, A, M, C, H) بحيث لا يؤثر على نشاط الأم (AMP).
        ملاحظة: الجلايسين يقدم أعلى كفاءة في انقسام TEV. حمض أميني واحد يقع إما عند الطرف N أو C قد يؤثر على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للحمض الأمبي، ومن هنا نشاطها.
      3. تخليق تسلسل الجينات الاصطناعية، بما في ذلك المناطق الجانبية، مع مواقع تقييد 5' XbaI و3' XhoI. تسلسل الأحماض الأمينية مذكور في الجدول 1 ومخطط في الشكل 1.
    2. الاستنساخ
      1. هضم ناقل pET باستخدام إنزيمات تقييد متوافقة.
        ملاحظة: في هذه الحالة، تم هضم بلازميد p15TVL (مشتق pET15b، مضخمr، ومحفز T7) مع XbaI، XhoI، وScaI (لقطع الشظية غير المرغوب فيها).
      2. لمنع إعادة ربط الشظايا المهضومة، عالج بفوسفاتاز قلوي في أمعاء العجل لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. هضم جين His-KSI-Mel4 الصناعي باستخدام XbaI و XhoI في تفاعل بحجم 20 ميكرولتر.
      3. قم بتنقية الشظايا من جميع إنزيمات التقييد باستخدام مجموعة تنقية QIAquick PCR. بدلا من ذلك، قم بإجراء الرحلان الكهربائي الهلامي وقطع الشريط المرتبط بالجزء المتجه المطلوب، ثم استخلاص الشظية من الجل باستخدام مجموعة استخراج الجل.
        ملاحظة: تأكد من أن الشظايا المنقاة يتم قياسها باستخدام طريقة الطيفية الضوئية (NanoDrop) لتحسين الربط.
    3. الربط والتحول
      1. قم بتفتيش الجين الصناعي المهضم المدخل في ناقل pET. تأكد من أن نسبة الإدخال والمتجه متساوية الوضع.
      2. حضن الخليط مع ليغاز T4 طوال الليل عند درجة حرارة 16 درجة مئوية. تحول إلى DH5α كيميائيا أو كهربائيا باستخدام طرق الصدمة الحرارية أو التسامية الكهربائية على التوالي.
      3. اخلط بلطف خلاياDH5 α الكيميائية الفعالة مع الحمض النووي البلازميدي وحضنه على الثلج للسماح بالتماسك في الحمض النووي. ثم يصعق الخلايا بالحرارة لمدة 30 ثانية عند 42 درجة مئوية لتسهيل امتصاص الحمض النووي، ثم يبرد بسرعة على الجليد.
      4. بعد التعافي في وسط 450 ميكرولتر رطل من المرق خالي من المضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة، قم بتغليف الخلايا على الأجار الانتقائي الذي يحتوي على المضاد الحيوي المناسب.
        ملاحظة: عادة ما تظهر المستعمرات المتحولة بعد الحضانة الليلية. بالنسبة لخلايا DH5α الكهربائية، امزج حجم صغير من حمض نووي البلازميدي المنقى والخالي من الملح (عادة 1–2 ميكرولتر من 10–100 نانوغرام في خلايا ~50 ميكرولتر) مع الخلايا في كوفيت مثقل بالكهرباء.
      5. بعد برودة قصيرة، قم بإعطاء نبضة واحدة (الإعدادات الشائعة: 1.8 كيلوفولت لكوفيت بفجوة 0.2 سم مما يعطي ثابت زمني ~5 مللي ثانية؛ عدل حسب جهازك/كوفيتك)، مع الحرص على تجنب القوس باستخدام حمض نووي مزيل الملح وكواشف باردة جدا.
      6. أضف فورا ~450 ميكرولتر من LB المسخن مسبقا، ثم استعيد عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة ساعة، ثم ضع طبقة على الأجار الانتقائي.
      7. محولات الزراعة توضع طوال الليل في مرق LB لعزل البلازميدات باستخدام مجموعة تنقية البلازميد. تحقق من البناء النهائي للبلازميدات بواسطة PCR باستخدام البادئات في الجدول 1 وتأكيد التسلسل بواسطة تسلسل سانجر.
    4. حول البلازميد المثبت إلى المضيف المعتمد (كيميائيا أو كهربائيا)، وهو E. coli BL21(DE3)، كما ذكر أعلاه.
  2. إنتاج الجسم المحسن للتعبير والشمول (IB)
    1. قم بتلقيح مرق 10 مل رطل (100 ميكروغرام/مل أمبيسيلين) وانمو عند 37 درجة مئوية خلال الليل. استخدم هذا لتلقيح 100 مل، ثم لزرع إنتاج بسعة 1 لتر.
    2. تخفيف في الكتلة إلى الكثافة الضوئية (OD600) من الزراعة عند الزمن 0 = 0.1. استخدم وسط LB مع مكمل 1٪ جلوكوز و100 ميكروغرام/مل أمبيسيلين.
    3. حضانة عند 37 درجة مئوية ومراقبة الجرعة الزائدة للوصول إلى مرحلة اللوغاريتيوم (OD600 0.5–0.6). تحفز بتركيز منخفض من الأيزوبروبيل β-D-1-ثيوجالاكتوبيرانوزيد IPTG، عادة 0.1 ملليمو.
      حافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16–24 ساعة لتعزيز تكوين الأجسام الداخلية.
    4. استمر في الحضانة لمدة 16 إلى 24 ساعة. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي (5000 × جم، 4 درجات مئوية) لمدة 10 دقائق وتخزين الحبيبات عند -80 درجة مئوية.
  3. تحلل الخلايا وتجزئة البروتينات
    1. إذابة حبيبات الخلايا على الجليد وإعادة تعليقها في مادة Bugbuster لبدء التحليل الكيميائي. قم بطرد مركزي بالمادة الليزات عند 4000 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الفائقة كجزء بروتين قابل للذوبان.
    2. اغسل الحبيبات المتبقية وأعد تعليقها في مادة Bugbuster بنسبة 10٪ (v/v) في ماء MilliQ. إخضاع التعليق للصوت لاستعادة الجزء البروتيني غير القابل للذوبان بالكامل (أجسام الاحتواء).
    3. عالج العينات ب 100 ميكرولتر من مخزن العينة SDS-PAGE الذي يحتوي على 5٪ β ميركابتوإيثانول. حضن الخليط عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لضمان إزالة البروتين بالكامل.
  4. الرحلان الكهربائي SDS-PAGE
    1. قم بتحميل المحللات المزيفة على جل SDS-PAGE مكرر بنسبة 15٪ للفصل الكهربائي القياسي.
    2. اغسل جل واحد بالماء لمدة ساعة. صبغ الصبغ طوال الليل باستخدام كاشف الصبغة الأزرق GelCode. قم بإزالة الصبغة بالماء في اليوم التالي حتى تظهر الأشرطة بوضوح.
    3. تصور وتوثيق الجل المصبوغ (الشكل 2A) لتقييم ملفات البروتين الكلية (TCP) وتوزيع الكسور باستخدام أداة Biorad Gel Doc مع مختبر الصورة.
  5. الطلاء الغربي (كشف المناعة)
    1. توازن الجل غير المصبوغ، غشاء نيتروسيلولوز، أوراق الترشيح، والإسفنجات في مخزن النقل (20 ملليموتر تريس-HCl pH 7.4، 150 ملليمولار NaCl، 0.1٪ Tween 20). قم بتجميع ساندويتش النقل وتنفيذ النقل عند 100 فولت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة المحيط.
    2. حضن الغشاء في محلول حاجز (5٪ حليب خالي الدسم في TBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد.
    3. حضن الغشاء بالجسم المضاد الأولي لمضاد HisTag من نوع Mouse (مخفف بنسبة 1:1,000 في محلول حاجب) طوال الليل عند حرارة 4 درجات مئوية مع تحريك لطيف.
    4. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 5 دقائق لكل مرة. حضن الغشاء باستخدام IgG مضاد للفئران مرتبط ب HRP (مخفف بنسبة 1:5,000 في حاجز الحجب) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    5. قم بجولة نهائية من ثلاث غسلات TBST. تطبيق ركيزة التلميض الكيميائي المعزز (ECL) على الغشاء لمدة دقيقة واحدة وتصور باستخدام جهاز تصوير الإضاءة الكيميائية أو من خلال التعرض لفيلم الأشعة السينية. وثق الصورة (كما هو موضح في الشكل 2B).
  6. عزل IB وتنقية الألفة
    1. أعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن التحلل (100 ملليموتر تريس· Cl، pH 7.0، 5 mM EDTA، 5 mM DTT (770 ملغ/لتر)، 5 ملليمول بنزاميدين· HCl (780 ملغ/لتر)) ويقوم بالتحلل الميكانيكي (مثل الفرنش برس/سونيكشن). الطرد المركزي (20,000 × جم، 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة) لعزل حبيبة KSI-Mel4 IB غير القابلة للذوبان.
    2. اغسل الحبيبات جيدا باستخدام مخزن الغسيل (100 ململر تريس· Cl، pH 7، 5 mM EDTA، 5 mM DTT، 2 M يوريا، 2٪ (مع الفتح) Triton X-100). ذوبان الحبيبات في كمية لا تزيد عن 2 مليون يوريا.
      ملاحظة: يجب أن يكون تركيز اليوريا المستخدم لإذابة IB ضمن نطاق عمل بروتيز TEV.
    3. قم بقياس كمية IB المعزول باستخدام مجموعة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      1. امزج كاشف الثقب B مع المادة A بنسبة حجم إلى حجم 1:50. حساب الحجم الكلي المطلوب بناء على عدد المعايير والعينات التي سيتم تشغيلها في ثلاث نسخ.
      2. باستخدام ألبومين مصل البقر (BSA) كمرجع، أعد سلسلة من التخفيفات لإنشاء منحنى قياسي يتراوح من 3000 ميكروغرام/مل إلى 200 ميكروغرام/مل.
      3. باستخدام صفيحة بسعة 96 بئر، استخدم ماصة بسعة 25 ميكرولتر من كل معيار BSA وعينة (بما في ذلك الفائق المنقى والرواسب المعلقة المعاد تعليقها) إلى الآبار.
      4. أضف 200 ميكرولتر من مادة BCA العامل المحضرة إلى كل بئر يحتوي على معيار أو عينة. اخلط اللوحة لفترة وجيزة واحتضن لمدة ساعة إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية للسماح بتطور اللون.
      5. بعد الحضانة، قس امتصاص الصفيحة عند 562 نانومتر باستخدام مقياس طيف فوتومتر. رسم امتصاص معايير BSA مقابل تركيزاتها المعروفة لتوليد منحنى قياسي خطي أو تربيعي.
      6. تحديد تركيز البروتين في عينات His-KSI-Mel4 أو Mel4 المؤتلفة من خلال مقارنة قيم امتصاصها مع المنحنى القياسي المولد. تظهر التراكيز قبل وبعد انقسام TEV في الشكل 3.
  7. الانقسام الإنزيمي وإزالة العلامات
    1. تفاعل الانقسام: بروتياز TEV مع العلامة (نسبة الأضراس الموصى بها 1:50 إلى 1:100 بروتياز بروتيز: بروتين اندماج). حضن 16 ساعة عند 4 درجات مئوية لتحقيق أقصى كفاءة.
    2. إزالة العلامات وتنقية كروماتوغرافيا الألفة المعدنية الثابتة (IMAC):
      1. مرر خليط تفاعل الانقسام فوق عمود جديد من حمض النيكل-نيتريلوترايسيتيك (Ni-NTA). موازنة راتنج Ni-NTA مع مخزن الارتباط (مخزن التحلل).
      2. حمل خليط تفاعل الانقسام. ترتبط المكونات الموسومة ب His-Flag (شظية KSI وبروتيز TEV) بالراتنج.
      3. اجمع تدفق المرور، الذي يحتوي على ببتيد Mel4 المؤتلف غير الموسوم مع أحماض أمينية متبقية من G وS وA وM وC وH من موقع انقسام TEV.
      4. تأكد من أن هذا الحمض الأميني الإضافي لا يؤثر على نشاط AMP من خلال إجراء اختبار MIC باستخدام Mel4 الصناعي كيميائيا كوسيلة تحكم.
      5. يتم إخراج شظية KSI المرتبطة وبروتياز TEV باستخدام تدرج مخزن الإزالة (500 ملليمولين إيميدازول، 500 ملليمولين NaCl، 20 ملليمول مخزن فوسفات الصوديوم، درجة الحموضة 8).
      6. قم بإجراء اختبار BCA كما هو موضح في الخطوة 2.6.3.

3. النشاط المضاد للميكروبات

  1. تحضير الإعلام
    1. حضر الوسائط [مرق مولر هينتون، معدل بالكاتيونات (CAMHB)، مرق الصويا التريبتيكاز (TSB)، مرق معادل D/E، وأجار الصويا من التربتيكاز (TSA)] حسب تعليمات الشركة المصنعة. أيضا، حضر 1 × محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) من 10 × PBS مركز. ثم قم بتعقيم هذه القطع عند 121 درجة مئوية عند 15 رطل/إن2.
  2. تحضير مخزون الببتيدات
    1. إذابة AMP ومحاكاة في ماء معقم بتركيز عال، مثل 20 ملليمول أو على الأقل 2 ملغ/مل. إذا كان الببتيد غير قابل للذوبان، استخدم ماء معقم يحتوي على تركيز نهائي من 0.01٪ حمض الخليك16. إذا كان من المتوقع امتصاص على الأسطح البلاستيكية، يمكنك إضافة محلول المحلول الأصلي إلى 0.2٪ (بدون ضبط) BSA، لأنه يعمل كعامل حاجب17.
      ملاحظة: يوصى أيضا باستخدام كبريتيد ثنائي ميثيل (DMSO) لإذابة الببتيدات أو المقلدات غير القابلة للذوبان في الماء. حضر محلول مخزن مركز، مثل 20 ملليمول أو 2 ملغ/مل.
    2. تعقيم مخزون الببتيدات بالفلتر باستخدام مرشح حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر في ظروف معقمة.
    3. جهز أليكوتات مخزون AMP وتخزينه عند -20 درجة مئوية (أو حسب استقرار AMP). جهز وحدة تحكم مذيب مماثلة.
  3. تحضير اللقاح البكتيري
    1. انشر العزل البكتيري ليتم اختباره على وسط غني بالمغذيات مثل TSA للحصول على مستعمرات نقية ومعزولة جيدا.
    2. حضن اللوح هوائيا عند 36 ± 1 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
    3. اختر من ثلاث إلى خمس مستعمرات متشابهة شكليا ومعزولة جيدا من صفيحة الزراعة باستخدام حلقة تلقيح معقمة. انقلها إلى أنبوب معقم يحتوي على 5–10 مل من TSB أو CAMHB. لتحقيق تعليق متجانس، قم بفرك الحلقة بلطف باستخدام مستعمرات بكتيرية على الجدار الداخلي للأنبوب المائل للحصول على تعليق متجانس.
    4. حضن زراعة المرق عند 36 ± 1 درجة مئوية مع هز 180 دورة في الدقيقة لمدة 18 إلى 24 ساعة.
    5. قم بالطرد المركزي في الزراعة الليلة على حرارة 3000 x g لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية وغسل الحبيبات البكتيرية ثلاث مرات بمحلول معقم 1 × PBS.
    6. في حاوية معقمة، يتم صرف 2 مل من 1 × PBS، ثم أضف 50–100 ميكرولتر من التعليق البكتيري المغسول، ودوامة لمدة 5–10 ثوان لتحقيق التجانس.
    7. قس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) باستخدام مقياس طيف فوتوميتر. باختصار، أضف 200 ميكرولتر من التعليق البكتيري إلى صفيحة بسعة 96 بئرا، مع نفس حجم 1× PBS مثل الفارغ، وقس OD600 للحصول على ما يعادل 0.1، وهو ما يعادل تقريبا 1–2 × 108 CFU/mL (تحقق من خلال عدد الصفائح القابل للتطبيق على TSA).
    8. قم بتخفيف التعليق المعدل بنسبة 1:100 في CAMHB للحصول على لقاح نهائي بمقدار10 6 وحدة CFU/مل.
  4. إعداد اللوحة
    1. ضع علامة على صفيحة معقمة ذات قاع مسطح بسعة 96 بئر تحمل السلالة البكتيرية، واسم AMP، والتاريخ، والأحرف الأولى من اسم العالم. على اللوحة، حدد مواقع آبار الاختبار والفراغ والتحكم على الغطاء.
    2. قم بتوزيع 200 ميكرولتر من محلول AMP (أعلى تركيز) في العمود الأول من اللوحة. إلى الآبار المتبقية، من العمود 2 إلى 12، أضف 100 ميكرولتر من CAMHB.
    3. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإجراء تخفيف تسلسلي مزدوج لحجم AMP من العمود 1 حتى العمود 10، مع حذف 100 ميكرولتر من العمود العاشر.
    4. أضف 100 ميكرولتر من اللقاح البكتيري المحضر (106 وحدة CFU/mL) إلى كل بئر باستثناء جهاز التحكم في التعقيم (فراغ). سيؤدي ذلك إلى تركيز نهائي للبكتيريا يبلغ حوالي 5 × 105 CFU/mL في آبار الاختبار. أضف 100 ميكرولتر من CAMHB إلى الآبار الفارغة ليصل الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر. جهز آبار ثلاثية لكل تركيز.
      ملاحظة: بالنسبة للأم بول الذي يترسب عند تخفيفه في CAMHB، قد يحل إضافة حمض الأسيتيك بنسبة 0.1–0.2٪ BSA المشكلة؛ قد يتطلب التحسين اختبارا تجريبيا16. في مثل هذه الحالات، تشمل آبار التحكم في المذيبات (التي تحتوي على CAMHB بالإضافة إلى حمض الخليك و/أو BSA).
    5. وبالمثل، قم بإجراء MIC لمضاد AMP (RK758) والمضاد الحيوي المقارن (مثل كوليستين).
    6. غط الطبق بغطاءه، وأغلقه بلفافة لاصقة لمنع التبخر، وحضن عند 36 ± 1 درجة مئوية لمدة 18–24 ساعة.
    7. يشمل سلالة مرجعية من الإشريكية القولونية (مثل إشريكية الإشريكية القولونية MCR-1 التي تحتوي على الإشريكية القولونية NCTC 13846) بالتوازي ويتم معالجتها بطريقة مشابهة للببتيد أو محاكاة الببتيد.
    8. بعد الحضانة، سجل الميكروفون.
  5. تحديد MIC
    1. قس OD600 لكل بئر باستخدام قارئ الميكروبلايت. احسب نسبة الانخفاض في النمو بالنسبة لضبط النمو غير المعالج. يعرف MIC بأنه أدنى تركيز من AMP مما يؤدي إلى انخفاض لا يقل عن 90٪ في OD600 مقارنة ب18 في مركز السيطرة على النمو.
    2. تحديد قيم MIC من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل أجريت بثلاث نسخ. أبلغ عن النتائج كمتوسط ± انحراف معياري لضمان قابلية التكرار.
      ملاحظة: يجب أن يكون MIC لسلالة الضابط، E. coli NCTC 13846، ضمن تخفيفة مزدوجة واحدة من الكمية المتوقعة للكوليستين. تأكد من أن ضوابط المذيبات التي تحتوي على DMSO وحمض الخليك وBSA لم يكن لها أي نشاط مثبط بمفردها.
  6. تحديد الحد الأدنى لتركيز البكتيريا (MBC)
    1. من الآبار الموجودة فوق الميكروفون الميكروبي، بالإضافة إلى تركيز واحد تحته، نقل 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري إلى 900 ميكرولتر من مرق D/E لتحضير التخفيف التسلسلي.
    2. ضع لوحة بحجم 20 ميكرولتر من كل تعليق مخفف على TSA في ثلاث نسخ لتحديد عدد البكتيريا القابلة للحياة.
    3. بعد الحضانة الليلية عند 36 ± 1 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، قم بعدد المستعمرات، واضرب في عامل التخفيف المعني، وقارن العد القابل للحياة مع تلك الناتجة عن بئر التحكم في النمو المعالج بنفس الطريقة.
    4. يعرف MBC بأنه أقل تركيز من العامل المضاد للميكروبات الذي يؤدي إلى انخفاض بنسبة 99.9٪ (≥ 3 log10) في عدد البكتيريا القابل للحياة مقارنة باللقاح الأولي بعد 24 ساعة من الحضانة (مكافحة النمو) في الظروف القياسية19.
  7. التقارير
    1. أبلغ عن MIC و MBC بوحدات ميكروغرام/مل وميكرومول.
    2. تحويل μg/mL إلى μM باستخدام μM = μg/mL × 1000/ وزن جزيئي (g/mol)
  8. التخلص من النفايات المعدية
    1. تخلص من جميع المواد التي تلامست مع المزارع البكتيرية الحية، بما في ذلك ألواح الميكروتيتر ذات 96 بئرا وأرؤوس الماصات وأنابيب فالكون، في أكياس نفايات مخصصة للخطر البيولوجي.
    2. قم بتعقيم النفايات البيولوجية المجمعة عند 121 درجة مئوية لمدة 15–20 دقيقة تحت ضغط 15 psi لضمان التعقيم الكامل قبل التخلص منها، وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية.

4. السمية الخلوية

  1. عد الخلايا والبذر لاختبار السمية
    1. حافظ على الخلايا، مثل خلايا L929 الليفية للفئران في قارورة بحجم 75 سم2 في وسط أساسي دالبكو الأدنى (DMEM) يحتوي على 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) و1٪ مضادات حيوية (كبريتات الستربتوميسين والبنسلين G) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    2. اغسل الخلايا ب 1x PBS وقم بالتربسين بنسبة 0.25٪ تريبسين-إيدتا. عد الخلايا بخلط 50 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 50 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان بلو وتحميل 10 ميكرولتر في جهاز قياس الهيموسيتومتر.
    3. عد الخلايا الحية (غير المصبوغة) والميتة (الزرقاء) في أربعة مربعات في الزوايا واحسب إجمالي عدد الخلايا باستخدام: إجمالي الخلايا = (متوسط عدد الخلايا الحية ×10 4 × 2 [عامل التخفيف]).
    4. احسب الجدوى (٪) = (حي / [حي + ميت]) × 100.
    5. اضبط تركيز الخلايا النهائي إلى 5 × 104 خلايا/مل (ما يعادل 5000 خلية/بئر في 100 ميكرولتر باستخدام وسط DMEM).
    6. زرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة معقمة بسعة 96 بئرا. حضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونللسماح بالالتصاق.
  2. تحضير حلول اختبار Mel4 و RK758
    1. تحضير المحاليل العملية ل Mel4/RK758 في DMEM العادي (بدون FBS والمضادات الحيوية) عند التركيزات المستهدفة النهائية (1,000، 500، 250، 125، 62.5، 31.25، 15.6، 7.8، و3.9 ميكرومول) باستخدام المحلول الأصلي المعد كما هو موضح في الخطوة 3.2.
    2. أزل وسط الزراعة من كل بئر. أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل المقابل 1× Mel4/RK758 مباشرة إلى الآبار.
    3. أضف 100 ميكرولتر من DMEM إلى آبار التحكم السالبة (NC) المحددة.
    4. أضف 100 ميكرولتر من DMSO في الآبار المخصصة للتحكم الإيجابي (PC) (بالإضافة إلى DMSO، ينصح بعامل سام خلوي مثل Triton X-100 كمادة تحكم إيجابية).
    5. أضف 100 ميكرولتر من 1 × PBS كوحدة تحكم فارغة.
      ملاحظة: قم بجميع العلاجات والتحكم بثلاث نسخ. التعامل مع DMSO بالقفازات وحماية العين؛ تجنب ملامسة الجلد والتخلص من نفايات المذيبات وفقا لإجراءات المؤسسات.
  3. اختبار 3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-YL)-2,5-ديفينيل تيترازوليوم بروميد (MTT)
    1. بعد 24 ساعة من التعرض لميل4/RK758، قم بسحب وسط الاختبار بحذر دون إزعاج الخلايا.
      ملاحظة: قد تختلف مدة العلاج بالمركبات المضادة للميكروبات حسب التصميم التجريبي المحدد.
    2. تحضير محلول عمل MTT عن طريق تخفيف محلول المخزون 5 ملغ/مل بنسبة 1:9 باستخدام DMEM عادي (تركيز نهائي 0.5 ملغ/مل).
    3. أضف 100 ميكرولتر من محلول MTT العامل إلى كل بئر. غط اللوحة بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء وحضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية حتى تتكون بلورات الفورمازان البنفسجية.
      ملاحظة: MTT حساس للضوء وسام. التعامل مع القفازات والتخلص من النفايات وفقا لإجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية. دائما أطفئ الضوء أثناء المعالجة باستخدام مادة MTT.
  4. قياس ذوبان الفورمازان والامتصاص
    1. قم بإزالة محلول MTT بعناية من كل بئر. أضف 100 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر لإذابة بلورات الفورمازان.
    2. ضع الطبق على هزاز لمدة 5 دقائق لضمان الذوبان التام. قس الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام قارئ ميكروبليت (microplate).
  5. تحليل البيانات وتحديد تركيز 50٪ من السمية الخلوية (IC50 أو CC50)
    1. اطرح قيم الامتصاص الفارغة (PBS) من جميع القراءات واستخدم القيم المصححة للحساب.
    2. احسب قابلية البقاء (٪) باستخدام المعادلة: قابلية البقاء (٪) = (Aمعالج/ A NC (خلية)) × 100.
    3. احسب IC50 أو CC50 باستخدام برنامج GraphPad Prism.
      ملاحظة: كرر التجارب بثلاث نسخ وقدم بيانات كمتوسط ± انحراف معياري.

النتائج

تخليق RK758
تم نشر بيانات تحليلية حتى المستوى المتوسط 7 سابقا14. البيانات التحليلية ل RK758 والمتوسطين 8–9 هي كما يلي:

تيرت-بيوتيل (2-(3-فينيل ثيوريدو)إيثيل)كاربامات (8):
تم الحصول على حاصل الضرب 8 كمادة صلبة بيضاء مائلة إلى الصفر (1.89 جم، 87٪); m.p. 167.4–168.3 °C; 1H NMR (300 ميجاهرتز، DMSO-d 6) δ 9.58 (s, 1H)، 7.71 (s, 1H)، 7.44–7.29 (m, 4H)، 7.11 (t, J = 12.0 هرتز، 1H)، 6.88 (br s, 1H)، 3.55-3.53 (m, 2H)، 3.13 (q, J = 4.0 هرتز، 2H)، 1.59 (ث، 9H); 13C NMR (75 ميجاهرتز، DMSO-d6) δ 180.9، 156.3، 139.5، 129.1، 124.7، 123.7، 78.2، 44.3، 28.7؛ معدل ضربات القلب (ESI+): m/z المحسوب ل C14H21N3O2 SNa+ [M + Na]+: 318.1247، وجد: 318.1252.

تيرت-بيوتيل (S,Z)-(3-((1H-إندول-3-إيل)ميثيل)-1-(2-(2-نفثاميدو)-5-بروموفينيل)- 1,4-ديوكسو-9-(فينيليمينو)-2,5,8,10-تترازادودكان-12-إيل)كاربامات (9):
تم الحصول على المنتج 9 كمادة صلبة بيضاء (0.253 جم، 62٪); m.p. 173.4–174.9 °C; 1H NMR (400 ميجاهرتز، DMSO-d 6) δ 12.23 (s, 1H)، 10.86 (s, 1H), 9.61 (s, 1H), 9.27 (d, J = 8.0 هرتز، 1H), 8.57-8.54 (m, 2H), 8.44 (s, 1H), 8.11 (d, J = 4.0 هرتز، 1H), 8.06-8.03 (m, 3H), 7.84 (dd, J = 4.0, 12.0 هرتز، 1H), 7.78 (d, J = 12.0 هرتز، 2H)، 7.69–7.60 (m, 2H), 7.36 (ت، ج = 8.0 هرتز، 2 حاط)، 7.27-7.23 (م، 5 حاط)، 7.01-6.97 (م، 3 حاط)، 4.82-4.78 (م، 1 حاط)، 3.14-3.13 (م، 10 حاط)، 1.32 (م، 9 حاط); 13C NMR (100 ميجاهرتز، DMSO-d 6) δ 172.3، 167.8، 165.1، 156.3، 154.4، 138.9، 136.5، 135.4، 134.9، 132.6، 131.7، 129.9، 129.1، 128.7، 128.4، 128.2، 127.6، 127.6، 126.4، 124.8، 124.1، 123.6، 122.8، 121.4، 118.9، 118.7، 115.1، 111.8، 110.9، 78.4، 55.2، 42.3، 41.9، 39.4، 38.3، 29.5، 28.6، 27.9؛ HRMS (ESI+): m/z محسوبة ل C45H47BrN8O5 [M + H]+: 859.2926، وجدت: 859.2925.

(S,E)-N-(2-((1-((2-(3-(2-(2-أمينوإيثيل)-2-فينيل غوانيدينو)إيثيل)أمينو)-3-(1H-إندول-3-yl)-1-أوكسوبروبان-2-yl)كاربامويل)-4-بروموفينيل)-2-نفثاميد (RK758) (10):
تم الحصول على RK758 كمادة صلبة ذات لون أبيض مائل إلى الصفر (0.039 جم، 75٪); m.p. 240.0–240.9 °C; 1H NMR (400 ميجاهرتز، MeOD-d 4): δ 8.39 (s, 1H), 8.27 (d, J = 12.0 هرتز، 1H), 7.98–7.95 (m, 3H), 7.88 (d, J = 8.0 هرتز، 1H), 7.79 (d, J = 4.0 هرتز، 1H), 7.71-7.60 (m, 4H), 7.40 (t, J = 8.0 هرتز، 1H), 7.30-7.20 (م، 4H)، 7.16 (م، 1H)، 7.05-6.97 (م، 2H)، 4.88-4.86 (م، 1H)، 3.33-3.32 (م، 3 ضربات)، 3.27-3.24 (ضرب، 5 ضربات); 13C NMR (100 ميجاهرتز، MeOD-d 4): δ 174.3، 168.5، 166.4، 154.6، 137.1، 136.7، 135.1، 134.7، 131.4، 132.6، 131.3، 130.8، 129.8، 128.9، 127.97، 127.8، 127.9، 127.6، 127.5، 127.2، 126.8، 125.6، 123.5، 123.24، 123.2، 118.6، 117.8، 116.1، 111.1، 109.6؛ HRMS (ESI+): m/z محسوب ل C40H39BrN8O3 [M + H]+: 759.2401، وجد: 759.2407.

تم إجراء تخليق RK758 بعائد إجمالي قدره 17٪ من Cbz-L-Tryptophan على 7 خطوات (الشكل 4). كان العائد الإجمالي لهذه العملية 44٪ مقابل الوسيط الرئيسي 7 و19٪ مقابل RK758. تشير بيانات الرنين المغناطيسي النووي بمقدار 1H إلى نقاء عالي للمركب النهائي دون وجود شوائب رئيسية يمكن اكتشافها.

أكد فحص PCR في كولوني نجاح إدخال أشرطة Mel4 و His-KSI-Mel4 في محولات مختارة (الشكل 5A). وقد أكدت تحليلات PCR للبلازميدات المعزولة ب miniprep الحجم المتوقع للأمبليكون، داعمة التجميع الصحيح للبناء قبل التحويل إلى BL21(DE3) للتعبير (الشكل 5B).

إنتاج وتنقية الببتيدات المضادة للميكروبات الكاتيونية عالية الكاتونز Mel4
على الرغم من أن Mel4 تم الحصول عليه تجاريا من شركة AusPep Peptide بأقل نقاء 90٪، إلا أنه تم تصنيعه بواسطة SPPS، كما تم استخدام نهج إعادة تركيب لإنتاج Mel4 بيولوجيا. في نهاية البروتوكول، أكد تحليل البقعة الغربية لبروتين الخلية الكلية (TCP) من الحبيبات الخلوية المتحللة تعبير بروتين الاندماج المؤتلف HIS-KSI-Mel4. تم فصل عينات البروتين بواسطة SDS-PAGE وتم تصورها باستخدام سلم البروتين كمرجع للوزن الجزيئي. لوحظ شريط مميز يتوافق مع الوزن الجزيئي المتوقع لبروتين اندماج HIS-KSI-Mel4، مؤكدا نجاحا في التعبير عن البروتين المستهدف في الخلايا المضيفة (الشكل 5B).

من تسلسل البروتين للنمط المختار، تم حساب التركيب النظري للأحماض الأمينية ومقارنته مع نتائج تحليل الأحماض الأمينية التجريبية التي تم الحصول عليها من ببتيد HIS-KSI-TEV-Mel4 IB المنقي. أظهرت المقارنة ارتباطا جيدا بين نسب الأحماض الأمينية المتوقعة والمحددة تجريبيا، مما أكد دقة تسلسل الببتيدات المعبر عنه وعزله الناجح في جزء الجسم الشامل (الجدول 2).

يتحول الأسباريجين إلى حمض الأسبارتيك والجلوتامين إلى حمض الجلوتاميك. طريقة تحليل الأحماض الأمينية غير حساسة للسيستين والتريبتوفان ولا يتم تحليلهما بهذه الطريقة. يجب أخذ هذا في الاعتبار عند تحليل النتائج.

النشاط المضاد للبكتيريا ل Mel4 و RK758
تم تقييم التركيزات المثبطة الدنيا (MICs) ل RK758 وMel4 والكوليستين مقابل سلالتين بكتيريا سالبة جرام، K. pneumoniae JIE 2709 وE. coli NCTC 13846 (الجدول 3). أظهر RK758 معدل MIC بلغ 16 ميكروغرام/مل (21 ميكرومولار) ضد كل من K. pneumoniae والإشريكية القولونية. للمقارنة، أظهر Mel4 معدلات MIC تبلغ 62.5 ميكروغرام/مل (26.6 ميكرومول) ل K. pneumoniae و125 ميكروغرام/مل (53.2 ميكرومولار) للإشريكية القولونية، مما يشير إلى قوة أقل من RK758. استخدم كوليستين كمضاد حيوي مقارن، حيث أظهر أدنى MIC بقيمة 1 ميكروغرام/مل (0.87 ميكرومولار) لعلاج K. pneumoniae، بينما أظهر سلالة الإشريكية القولونية المقاومة للكوليستين MIC بمقدار 8 ميكروغرام/مل (6.9 ميكرومولار).

تأثير السمية الخلوية ل Mel4 و RK758
تم تقييم الجهد السام الخلوي ل Mel4 وRK758 في خلايا الليفي البروسية الفأرية L929 (ATCC CCL-1) باستخدام اختبار MTT بعد التعرض لمدة 24 ساعة لتركيزات متسلسلة. أظهر كلا المركبين منحنيات استجابة جرعة سيغمويدية نموذجية تم تحليلها بواسطة الانحدار غير الخطي باستخدام نموذج "المثبط مقابل الاستجابة الطبيعية - ميل متغير" في منشور GraphPad (الإصدار 9.5.1)، مؤكدا تثبيط الاعتماد على التركيز لبقاء الخلية. أظهر RK758 قيمة CC50 تبلغ 172.6 ميكرومولار، بينما أظهر Mel4 قوة سامة خلوية أعلى قليلا مع CC50 بقيمة 147.5 ميكرومتر، مما يمثل سمية خلوية أكبر بحوالي 1.17 مرة من RK758 (الشكل 6 والشكل 7).

figure-results-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لشريط التعبير في p15TV-L-His-KSI-Mel4. خريطة تخطيطية لبناء تعبير p15TV-L تظهر محفز T7، موقع ارتباط الريبوسوم (RBS)، 6× علامة التنقية الخاصة به، شريك اندماج الإيزوميراز الكيتوستيرويدي (KSI)، موقع انقسام بروتيز TEV، وتسلسل ببتيد Mel4 يليه منهي النسخ T7. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل SDS-PAGE وتحليل النقطة الغربية لتعبير البروتينات المؤتلفة. (A) SDS-PAGE لأجسام الإدراج وبروتينات الخلايا الكلية بعد الترشيح والتدفق عبر محلل الخلايا الخام. (ب) البقعة الغربية من بروتين الخلايا الكلي. يشير السهم الأخضر إلى موقع البروتين المعني عند الوزن الجزيئي المتوقع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: قياس البروتين المؤتلف قبل وبعد انقسام TEV. يوضح الرسم البياني الشريطي تركيزات البروتين التي تم تحديدها بواسطة اختبار BCA لجزء الجسم المعزول للشمول والمولد المؤتلف المقسوم Mel4 الذي تم الحصول عليه بعد معالجة بروتياز TEV. تمثل أشرطة الخطأ التفاوت التجريبي بين القياسات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: النهج الصناعي العام للحصول على RK758. مخطط التفاعل الذي يوضح التخليق الكيميائي المكون من سبع خطوات ل RK758 بدءا من Cbz-L-تريبتوفان، بما في ذلك التكوين الوسيط، وتحويلات المجموعة الوظيفية، وإزالة الحماية النهائية للحصول على محاكاة الببتيد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: الرحلان الكهربائي الهلام الأجاروز للبلازميدات المؤتلفة. (أ) PCR مستعمرة للمحولات ل His-Mel4 و His-KSI-Mel4. (ب) تأكيد PCR للبلازميدات بعد التحضير الصغير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6. سمية الخلايا في RK758 ضد خلايا الأرومات الليفية L929. منحنى استجابة الجرعة يظهر تأثير RK758 على بقاء الخلايا عبر تركيزات متزايدة. تم حساب قيم CC50 بواسطة الانحدار غير الخطي باستخدام نموذج "المثبط مقابل الاستجابة الطبيعية - ميل متغير" في منشور GraphPad، مؤكدا تثبيط القدرة على البقاء بقاء الخلايا يعتمد على التركيز. تمثل البيانات متوسط ± SD لثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7: سمية الخلايا في Mel4 ضد خلايا L929. منحنى استجابة الجرعة يظهر التأثير المعتمد على التركيز ل Mel4 على بقاء الخلية. تم حساب قيم CC50 بواسطة الانحدار غير الخطي باستخدام نموذج "المثبط مقابل الاستجابة الطبيعية - ميل متغير" في منشور GraphPad، مؤكدا تثبيط القدرة على البقاء بقاء الخلايا يعتمد على التركيز. تمثل البيانات متوسط ± SD لثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-8
الشكل 8: استراتيجية تركيبية معدلة تبدأ من Cbz-L-تريبتوفان. مسار صناعي بديل يوضح تحضير وسطيات الأنثرانياميد باستخدام Cbz-L-تريبتوفان وخطوات الوظيفية اللاحقة لتمكين تنويع الهيكل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-9
الشكل 9: تلية ألكلة الثيووريا تليها الاستبدال النووي بسوكيز أمين. مسار تفاعل مقترح يتضمن ألكلة كبريت الثيووريا تليها استبدال نوكليوفيلبي بركيزة أمين لإنتاج منتجات تحتوي على الجوانيدين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

القسمالاسم/الميزةالتسلسل
المقدماتXbaI_KNRPR_Start5'-TAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATATATT-3'
T7_TERM_REV5'-CCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCA-3'
شريط جينتسلسل الأحماض الأمينية His-KSI-Mel4MDHHHHHHMMIDETQRKATVLEYFERVNAKDLDGVVKLF
ATDAVVADPVGAPPVAGEEALRAYFQRVLHEFDTHDVPGV
PSGAQDGQSVALPLKATINNPQDPTGGVRLDVNLVSVFTIG
EDGLISEMRAYWGLTDIAPAGASSGRENLYFQGKNKRKRRR
RRRGGRRRR
تسلسل الحمض النووي5'-TAACAATTCCCCTCTAGAAATATTTTTTTTTACTTTAAGAGGA
غاتاكاتغاتغاجاك
GCAACGTAAAGCGACGGTCTTAGAGTATTTTGAACGCGTGAATGCAA
AAGACTTGGATGGCGTGGTTAAACTCTTTGCGACGCCGTGT
AGCCGACCCTGTTGGTGCACCACCAGTGGGTGGTGAGGCACTC
CGTGCCTACTTCCAGCGCGTCTTGCATGAATTTGACACCCATGATGTCC
CGGGCGTTCCATCTGGTGCTCAGGATGGCCAATCAGTCGCACTCCACC
TTAAAGCAACCATCAACACATCCTCAAGATCCAAGGCGGGGGGCCGCC
TTGATGTGAACTTAGTGAGCGTATTCACGATGGCAGGGGTAT
CTCCGAGATGCGTGCGTACTGGGGTGACTGATATTGCTCCGGCAGGT
GCAAGCAGTGGTCGCGAACTTGTACTTCAAGGTAAGAACAAGCGTA
AGAGACGGGCGCCGCCGGGGGGAGGAGAGACGCGCTAATCGAAC
TCGAGATCCGGCT-3'

الجدول 1: تسلسلات التمهيد المستخدمة للتحقق من PCR وتسلسل كاسيت الجين الكامل للبنية النهائية للبلازميد.

حمض الأمينواسیدمحسوبةتم الاختبار
هستيدين4.70%4.70%
سيرين3.60%3.40%
الأرجينين10.70%9.20%
الجلايسين9.50%11%
حمض الأسبارتيك11.30%11.50%
حمض الجلوتاميك8.90%8.90%
ثريونين4.70%4.60%
ألانين9.50%9.70%
برولين5.30%5.30%
ليسين4.10%4.50%
تيروسين2.40%2.20%
الميثيونين1.80%1.90%
الإيزوليوسين3.00%3.20%
لوسين7.10%7.40%
فينيالانين3.60%3.60%
فالين9.50%8.90%
التربتوفان0.60%-

الجدول 2: تحليل تركيبات الأحماض الأمينية.

السلالات البكتيريةميكروغرام/مل (ميكرومول)
RK758ميل4كوليستين
ك. الرئوي JIE 270916 (21)62.5 (26.6)1 (0.87)
الإشريكية القولونية NCTC 1384616 (21)125 (53.2)8 (6.9)

الجدول 3: MIC ل RK758، Mel4، والكوليستين ضد البكتيريا سالبة الجرام.

المناقشة

يوفر البروتوكول الموضح هنا إطارا شاملا لإنتاج وتقييم وظيفي AMP الكاتيوني Mel4 (الذي يمكن تعديله لاستخدامه مع AMPs أخرى) والببتيد المقلد RK758. يجمع هذا السير بين التخليق الكيميائي متعدد الخطوات أو التعبير المؤتلف في الإشريكية القولونية مع اختبارات مضادات الميكروبات والسمية الخلوية. يوفر دمج هذه الأساليب منصة متعددة الاستخدامات للأبحاث المنهجية حول AMP، مما يتيح مقارنات مباشرة بين الببتيدات المصنعة كيميائيا والمنتجة بيولوجيا. تعد عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة بشكل خاص لنجاح إنتاج الببتيدات وتقييم نشاطها.

RK758 هو مقلد صناعي للببتيدات يعتمد على سقالة الأنثرانيلاميد. خلال مرحلة الفحص المركب لاكتشاف محاكاة AMP جديدة، يصعب استخدامه في فحص السيليكو لتخطيط مكتبة مركبات. لذلك، من المهم أن تبني هذه المحاكاة على هيكل يسمح بالتنوع في مكتبة المركبات. تم اختيار سقالة الأنثرانياميد لهذا السبب. من الفوائد الإضافية للسقالة القائمة على الأنثرانياميد أن ميتابوليت RK758، حمض 5-بروموآنثرانيليك، ثبت أنه يمتلك خصائص مضادة للميكروبات.

استخدمت الأعمال السابقة التي تحسنت بنية ونشاط RK758 ونظيره إجراءات صناعية مختلفة. بحثت الدراسة الأصلية لتحسين البنية في تأثير مجموعات كاتيونية مختلفة وبدائل على مجموعة الفينيل الأنثرانيلي. لذا، بدأ التخليق بفتح حلقة مشتقات الأنهيدريد الإيزاويك باستخدام إستر ميثيل إل-تريبتوفان. يمكن بعد ذلك تعديل المنتج كما أظهر كوبوسامي وآخرون 15. بحثت دراسة متابعة في بنية وموقع المجموعة الكارهة للماء. أظهرت الدراسة التالية أن السقالة المستبدلة ببرومو تتحمل مجموعة متنوعة من المجموعات الكارهة للماء في موضع النفثيل وأن الوسيط 4 كان مناسبا للاقتران المتقاطع لسوزوكي في موقع البرومو، كما هو موضح في الشكل 8.

العمل الحالي تناول بعض مشاكل الأساليب السابقة. في النهج الموضح في الشكل 4، على الرغم من تخليق الفئة المتوسطة 11 التي تبلغ عن تنقية عبر الترويث مع إيثر ثنائي الإيثيل، إلا أن محاولات تكرار هذه النتيجة أسفرت منذ ذلك الحين عن خلطات لزجة غير نقية تتطلب تنقية كروماتوغرافية. بالإضافة إلى ذلك، تطلب المستوى السادس الوسيط أيضا تنقية كروماتوغرافية باستخدام هذا النهج. بشكل عام، حصل العمل الأصلي على عائد متوسط 7 في 21٪ في ست خطوات من هيدروكلوريد إستري إل-تريبتوفان ميثيل. أما النهجالثاني 15، رغم أنه كان أقل إنتاجية (14٪ من Cbz-L-تريبتوفان)، فقد أنتج وسطيات أسهل في التعامل بها بخطوات أقل.

حددت هذه الدراسة أن ربط Cbz-L-Trp مع N-Boc-إيثيلينيديامين يتطلب تحسينا لضمان عدم بقاء DMF متبقي في المنتج، كما لوحظ خلال الدراسات الأولية لتوسيع نطاق هذا التفاعل. استخدام نظام مذيب مختلط بنسبة 3:8 (v/v) بين DMF إلى DCM يقلل من كمية DMF، مما سهل إزالته أثناء التحضير؛ ومع ذلك، قد يثير استبدال المذيبات المكلورة مخاوف بشأن الأثر البيئي. كما حسن هذا التعديل العائد إلى 87٪، ويرجح أن ذلك يعزى إلى ناتج اليوريا الثانوي الناتج عن ترسب EDC في خليط DCM، حيث كان القوة الدافعة للتفاعل. تم تحديد الهدرجة أيضا على أنها عنق زجاجة، حيث أن هذه التفاعلات عادة ما تعطي >90٪. وجدت هذه الدراسة أن استبدال THF بالميثانول أعطى 3 في العائد الكمي، مقارنة ب 85٪ في العمل السابق، وخفض زمن التفاعل إلى 4 ساعات. يمكن أيضا عزو ذلك إلى استخدام مادة أولية أنقى، حيث من المحتمل أن الدراسة الأصلية احتوت على بقايا DMF، والتي قد تكون سممت محفز البلاديوم. بشكل عام، مقارنة بالأساليب السابقة، تحسن العائد إلى المتوسط 7 إلى 48٪ في 5 خطوات مقارنة ب Cbz-L-Tryptophan. في تجارب سابقة (نوقشت أعلاه)، كان العائد الإجمالي 21٪، مع 14٪ للتفاعلات اللاحقة، بينما في هذه الدراسة تم تحقيق عائد إجمالي بنسبة 48٪ للمركب 7، مما يوضح تنوع النظائر التي يمكن تصنيعها من مشتقات الأنهيدريد الإيزاتويكي المستبدلة بشكل مناسب.

الأمين المعزز جدا في الأنثرانياميد 4 (انظر الشكل 8) يتطلب ثلاثة مكافئات من كلوريد الحمض لتحقيق تفاعل فعال. عندما تستخدم فقط كميات ستوكيومترية، يحدث تحويل غير كامل من 4 إلى 6، مما يعقد التنقية بسبب تشابه خصائص الكروماتوغرافية والذوبانية للوسطين 4 و6. يعترف المؤلفون بأن هذا هو قيد في السقالة ويعملون على تطوير منهجية جديدة لتقليل الحمض الزائد المطلوب من كلوريد.

التفاعل قبل الأخير لربط ثيوريا 8 بأمين 7 يتطلب كلوريد الزئبق (II)، وهو سام للغاية وضار جدا بالبيئة، مما قد يمنع هذه الطريقة من التخليق واسع النطاق. تم استخدام هذا النهج في العمل الحالي، حيث يتم التصاق الثيوريا بالزئبق (II) في درجة حرارة الغرفة. طريقة بديلة باستخدام ثيوريا 8 تتضمن ألكيلة ذرة الكبريت، تليها الاستبدال النووي بسويستة أمين، كما هو موضح في الشكل 9. تم الإبلاغ عن هذا النوع من التفاعل، ومع ذلك، في كثير من الحالات، يتطلب درجات حرارة مرتفعة وظروف أساسية قد تؤدي إلى تكوين منتجات جانبية مع الركائز 20,21. بدلا من ذلك، باستخدام ركيزة ثيوريا مثيلة مماثلة، تم الإبلاغ عن نهج تحفيز ضوئي من قبل Saetan وآخرون. يذكرون أن هذا التفاعل يحدث عند درجة حرارة البيئة تحت إشعاع بضوء من LED أبيض. وقد أفيد أن هذا التفاعل يحدث مع مجموعة متنوعة من الأمينات الأولية والثانوية، مما ينتج منتجات تتجاوز 80٪. بالنسبة للتفاعل النهائي، فإن التآكل مع إيثر الثنائي إيثيل يليه التجفيف بالتجميد ينتج منتجا عادة لا يتطلب تنقية إضافية (>95٪ نقي بواسطة 1H NMR في MeOD-d4). الشوائب الأساسية هي 1,2-إيثانيديثيول المتبقي عالي الدرجة الغليان، والذي يمكن اكتشافه بسهولة بفضل رائحته المميزة الشبيهة بالكرنب. يتطلب التعبير المؤتلف ل Mel4 الحث بكثافة بصرية مثلى (OD600 0.5–0.6) وصيانة دقيقة لدرجة حرارة الحث لتعظيم تكوين جسم الشمول مع الحفاظ على فعالية البكتيريا22.

تشمل اختبارات المضادات الحيوية وسمية الخلايا أيضا خطوات ضرورية للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. يتطلب الأمر تحضيرا دقيقا لللقاح وتخفيف متسلسل للببتيدات، حيث يمكن أن تغير التغيرات الصغيرة في كثافة البكتيريا أو ذوبانية الببتيدات بشكل كبير قيم MIC وMBC المقاسة16. في اختبارات السمية الخلوية MTT، يعد الخلايا بدقة، والبذر الموحد، والذوبان الكامل للفورمازان ضروريان للحصول على قراءات أيضية موثوقة23.

يمكن لعدة تعديلات على البروتوكول معالجة التحديات الشائعة. يمكن إذابة الببتيدات ذات الذوبانية المائية المحدودة في حمض الأسيتيك16 بنسبة 0.01٪، بينما يمكن أيضا إذابة الببتيدات أو المقلدات في DMSO24 أو إضافة 0.1–0.2٪ ل BSA17 لمنع الامتصاص على الأسطح البلاستيكية أثناء تحديد MIC. يمكن إذابة وإعادة طي أجسام الشوائب المؤتلفة عن طريق تعديل تركيزات كلوريد الجوانيدينيوم أو اليوريا، تليها غسيل تدريجي. بالنسبة لاختبارات MTT، يمكن أن يقلل الهز الخفيف والذوبان الكامل ل DMSO من تباين قراءات الامتصاص.

تكمن أهمية هذا البروتوكول في دمجها لاستراتيجيات الإنتاج والتقييم التكميلية، مما يوفر مزايا مقارنة بالطرق التقليدية ذات الطريقة الواحدة. تركز العديد من الدراسات على طريقة واحدة لإنتاج الببتيدات أو المحاكاة، لكن لا يوجد نهج واحد مثالي لجميع المركبات؛ اختيار الطريقة المناسبة بناء على خصائص الببتيدات يضمن تحقيق العائد الأمثل والوظيفة. على سبيل المثال، يسمح التخليق الكيميائي بدمج دقيق للأحماض الأمينية غير الطبيعية ومحاكاة الببتيدات4، وهو ما قد يكون تحديا في الأنظمة المؤتلفة. وعلى العكس، يوفر التعبير المؤتلف إنتاجا فعالا من حيث التكلفة لببتيدات كاتيونية عالية الارتفاع25 قد تتجمع أثناء التخليق الكيميائي. من خلال دمج كلا الطريقتين مع اختبارات وظيفية موحدة، يتيح البروتوكول توصيفا دقيقا لنشاط AMP وسمية الخلايا، متجاوزا نطاق اختبارات MIC القياسيةوحدها 26.

مقارنة بالطرق التقليدية المستقلة، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق بشكل واسع على أبحاث الببتيدات المضادة للميكروبات وتطويرها العلاجي. يمكن تكييفها لاستكشاف علاقات البنية والنشاط، وتحسين قوة الببتيدات، وتقييم السمية. علاوة على ذلك، يمكن للطرق دعم الفحص عالي الإنتاجية لمكتبات الببتيدات، ودراسة آليات مقاومة البكتيريا، وتقييم العلاجات المركبة مع المضادات الحيوية التقليدية. بعيدا عن التطبيقات المضادة للبكتيريا، يمكن تطبيق هذا السير أيضا على اختبار الببتيدات المضادة للفيروسات أو الفطريات، والطلاءات السطحية لمكافحة العدوى، والتطبيقات الطبية الحيوية مثل اضطراب الأغشية الحيوية أو التعديل المناعي.

في الختام، يوفر هذا البروتوكول سير عمل متعدد الاستخدامات وقابل للتكرار لإنتاج وتنقية وتقييم وظيفي للحمض النووي المكثف ومحاكاة الببتيدات. من خلال معالجة الاعتبارات المنهجية الحيوية، وتقديم استراتيجيات لحل المشكلات، وتمكين تطبيقات متنوعة، يؤسس أساسا قويا للأبحاث المضادة للميكروبات والطب الحيوي.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

يرغب المؤلفون في الشكر على مركز مارك وينرايت التحليلي ومنشأة المنتجات المؤتليفة (RPF) في جامعة نيو ساوث ويلز. على وجه الخصوص، مرفق مطيافية الكتلة التحليلية الحيوية لتحليل HRMS ومرفق الرنين المغناطيسي النووي للوصول إلى أجهزة الرنين المغناطيسي النووي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1,2-إيثانيديثيولأوكوود M03555
100X المضادات الحيويةسيغما ألدريتشA5955-20ML
1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل)كربوديميد هيدروكلوريدكتل الكومبيSS-7536ويشار إليها لاحقا باسم EDC
2-كلوريد نفثويلكتل الكومبيOR-0173
حمض الخليك  آياكس فينيكيمR18401O
الأسيتونيتريلVWR 20060.35
الفوسفاتاز القلويمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0525S
ألبومين مصل البقر (BSA)سيغما ألدريتشA1933
مرق مولر-هينتون المعدل للكاتيون (CAMHB)بيكتون، ديكنسون وشركاه212322
سي بي زي-إل-تربكتل الكومبيQB-6691
كوليستين سيغما ألدريتشC4461
دي-إنغلي (D/E) المرق المعادلأكسويدR453042
الأرض الدياتومية (Celite 545)سيغما ألدريتش102693حجم الجسيمات 0.02-0.1 مم
ثنائي الكلور وميثان (DCM)VWR 23366.327
الإيثر ثنائي إيثيلكيم-سبلايEA036
كبريتات ثنائي الميثيل (DMSO)شركة كيم-سبلاي المحدودة LCS-CHEM-0098
ديثيوثرايتول (DTT)ثيرمو ساينتفيكJ15397.03
وسيط الزراعة DMEMثيرمو فيشر ساينتفيك UCS-BIO-0058
مضيف الإشريكية القولونية BL21(DE3)سيغما ألدريتش70235-M
الكهربائيثيرمو ساينتفيكNEON1SK
أسيتات الإيثيلكيم-سبلايEA011-2.5L-P
حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA)ثيرمو ساينتفيك118432500
مصل الأبقار الجنيني (FBS)سيغما ألدريتش12003C-500ML
وسم TEV Protease سيغما ألدريتشT4455
هيدروكسي بنزوتريازول هيدراتكيم-إمبليكس24755
إيميدازولثيرمو ساينتفيك288-32-4
إيزوبروبيل &بيتا;-D-1-ثيوجالاكتوبيرانوسايد (IPTG)سيغما ألدريتشI6758
شورت لوريا-بيرتاني (LB), ثيرمو ساينتفيك12795027
مخزن ليسيس  ثيرمو ساينتفيك89822
كلوريد الزئبق (II)سيغما ألدريتش215465
الميثانول (معالجة HPLC)VWRA452-4K
واشاف MTTسيغما ألدريتشM2128-100MG
N,N-ثنائي الأيزوبروبيل إيثيل أمين (DIPEA)سيغما ألدريتش3440
N,N-ثنائي ميثيل فوراميد (DMF)كيم-سبلايRP1051
نانودروبثيرمو ساينتفيكND-ONE
ن-بوك-إيثيلين ديامينكتل كومبيAM-1613
عمود راتنج التوافق NTAسيغما ألدريتش70666
البلاديوم على الكربونسيغما ألدريتش20569910٪ مع المرض
مجموعة تنقية البلازميداتكياغين27104
أنابيب البولي بروبيلين الميكروتيتر SARSTEDT 72.690.008
جل السيليكا لكروماتوغرافيا أعمدة الفلاشسيليسيكلR12030Bجل السيليكا 60، 230-400 شبكة وحجم شبي؛
هلام السيليكا لوحة كروماتوغرافيا رقيقةميرك1055540001سمك طبقة 0.2 مم على خلفية من الألمنيوم مع مؤشر فلوري 254 نانومتر
فوسفات الصوديوم، محلول محلول 0.2Mثيرمو ساينتفيكJ63816. أسوشيتد برس
صفيحة ميكروتيتر بولي بروبيلين مسطحة القاع المعقمة ذات 96 بئر مع غطاءكورنينغ3599
ليغاز الحمض النووي T4مختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0202S
ثلاثي إيثيل أمين (Et3N)كيم-سبلايTR02151000
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA)سيغما ألدريتشT6508
تريس-إتش سي إلثيرمو ساينتفيكJ62848. AK
ترايتون X-100ثيرمو ساينتفيكA16046.AE
تريبان بلوMP BIOMEDICALS AUSTRALIA PTY LTD
تريبسين-إيدتا (0.25٪)سيغما ألدريتشT4049-500ML
Trypticase soya agar بيكتون، ديكنسون وشركاه211043
اليوريا  ثيرمو ساينتفيك29700
فيكتور (محفز T7)-البلازميد عالي النسخة المفضل

المراجع

  1. Naghavi, M., et al. Global burden of bacterial antimicrobial resistance 1990–2021: a systematic analysis with forecasts to 2050. Lancet. 404 (10459), 1199-1226 (2024).
  2. Antimicrobial resistance. , World Health Organization. Available at: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance (2023).
  3. Puri, B., Vaishya, R., Vaish, A. Antimicrobial resistance: Current challenges and future directions. Med. J. Armed Forces India. 81 (3), 247-258 (2025).
  4. Zhang, T., Jin, Q., Ji, J. Antimicrobial peptides and their mimetics: promising candidates of next-generation therapeutic agents combating multidrug-resistant bacteria. Adv. Biol. 9 (4), 2400461(2025).
  5. Pasupuleti, M., Schmidtchen, A., Malmsten, M. Antimicrobial peptides: key components of the innate immune system. Crit. Rev. Biotechnol. 32 (2), 143-171 (2012).
  6. Oliveira Júnior, N. G., et al. Antimicrobial peptides: structure, functions and translational applications. Nat. Rev. Microbiol. , (2025).
  7. Keshri, A. K., et al. LL-37, the master antimicrobial peptide, its multifaceted role from combating infections to cancer immunity. Int. J. Antimicrob. Agents. 65 (1), 107398(2025).
  8. Alzain, M., et al. Antimicrobial peptides: mechanisms, applications, and therapeutic potential. Infect. Drug Resist. , 4385-4426 (2025).
  9. Kuppusamy, R., Willcox, M., Black, D. S., Kumar, N. Short cationic peptidomimetic antimicrobials. Antibiotics. 8 (2), (2019).
  10. Xu, J. Peptides chemistry, manufacturing, and controls. Peptide Science: Chemical Ligation, Lead Generation, and Therapeutic Advances. , 471-508 (2025).
  11. Wang, Q., et al. Expression and purification of antimicrobial peptide buforin IIb in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (11), 2121-2126 (2011).
  12. Cai, Z., et al. Peptide synthesis: a review of classical and emerging methods. Biofabrication. 18 (1), 012001(2026).
  13. Gentilucci, L., De Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide bonds, and cyclization. Curr. Pharm pseudo-peptide. Des. 16 (28), 3185-3203 (2010).
  14. Kuppusamy, R., et al. Tuning the anthranilamide peptidomimetic design to selectively target planktonic bacteria and biofilm. Antibiotics. 12 (3), 585(2023).
  15. Kuppusamy, R., et al. Guanidine functionalized anthranilamides as effective antibacterials with biofilm disruption activity. Org. Biomol. Chem. 16 (32), 5871-5888 (2018).
  16. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat. Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  17. Ji, S., et al. Adsorption and morphology analysis of bovine serum albumin on a micropillar-enhanced quartz crystal microbalance. J. Phys. Chem. B. 128 (41), 10247-10257 (2024).
  18. Yasir, M., Dutta, D., Willcox, M. D. Activity of antimicrobial peptides and ciprofloxacin against Pseudomonas aeruginosa biofilms. Molecules. 25 (17), (2020).
  19. Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. terminology. Clin. Microbiol. Infect. 4 (5), 291-296 (1998).
  20. Saetan, T., Sukwattanasinitt, M., Wacharasindhu, S. A mild photocatalytic synthesis of guanidine from thiourea under visible light. Org. Lett. 22 (20), 7864-7869 (2020).
  21. Woodring, J. L., et al. Disrupting the conserved salt bridge in the trimerization of influenza A nucleoprotein. J. Med. Chem. 63 (1), 205-215 (2019).
  22. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  23. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnol. Annu. Rev. 11, 127-152 (2005).
  24. Deni, W. H., Gao, T., Wu, J. Protocol for reconstituting peptides/peptidomimetics from DMSO to aqueous buffers for circular dichroism analyses. STAR Protoc. 5 (1), 102850(2024).
  25. Lou, M., et al. Microbial production systems and optimization strategies of antimicrobial peptides: a review. World J. Microbiol. Biotechnol. 41 (2), 66(2025).
  26. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nat. Biotechnol. 24 (12), 1551-1557 (2006).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

محاكيات الببتيدالتركيز المثبط الأدنىمقايسة السُمية الخلويةالتخليق على الطور الصلبالتعبير المأشوبمحاكيات الببتيدالممرضات البكتيريةحيوية الخليةاكتشاف الأدوية
إنتاج واختبار الببتيدات المضادة للميكروبات ومحاكاتها
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.