مقالة منهجية

سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني للأنسجة السميكة موضح في حصين الفئران

DOI:

10.3791/70192

⸱

مارس 27, 2026

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقوم هذا البروتوكول بتوحيد التصوير المقطعي بالإلكترونات التجميدية (cryo-ET) للأنسجة السميكة من خلال دمج التجميد عالي الضغط (HPF) مع طريقة الوافل، ورفع شعاع الأيونات المركز بالتجميد (cryo-FIB)، والاكتساب المتوازي المتماثل مع الجرعة، مما ينتج صفائح رقيقة وعينات مزجاجة بشكل موحد لتحليل ميداني قابل للتكرار في الحصين الفأري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح التصوير المقطعي الإلكتروني البارد (cryo-ET) التصور ثلاثي الأبعاد للبنية الفائقة الخلوية الأصلية، لكن تطبيقه على الأنسجة السميكة محدود بسبب نقص التزاجج الموثوق وتحضير اللاميلا منخفض الإنتاجية. هنا، يتم تقديم سير عمل شامل من الطرف إلى الطرف يدمج التجميد عالي الضغط (HPF؛ ~2100 بار؛ وقت التشريح إلى التجمد ≤90 ثانية) باستخدام مجموعة "وافل" مع ورق نحاسي لتركيب الأنسجة الرقيقة مسبقا، ورفع الألياف بالتجميد (Cryo-FIB)، وتخفيف متحكم فيه إلى 120–200 نانومتر من الصفائح مع تعويض الإمالة الزائدة. الطلاء الموصل موحى (Sputter-Pt 30 mA/15 s؛ غطاء نظم المعلومات الجغرافية 0.5–1.0 ميكرومتر) لتقليل الستائر. جمع بيانات آلي متماثل الجرعة (0°، ±3°، ±6°... إلى ±60–66°; حجم الخطوة من 2–3°؛ الجرعة الكلية 100–150 e⁻/Å2) يتم تنفيذها عبر نصوص PACEtomo، حيث تستمد زاوية الميل الابتدائية من زاوية الطحن واتجاه العينة. توفر المعالجة باستخدام AreTomo 3 وظائف لتصحيح الحركة، وتقدير CTF، ومحاذاة، وإعادة بناء WBP في الوقت شبه الحقيقي؛ قد تقلل IsoNet اختياريا من تباين الوتد المفقود. يتبع متوسط التصوير الفرعي (RELION 4.0) استراتيجية شبه تحت التوموغرام مع تقارير دقة تعتمد على حد FSC عند 0.143. وقد تم عرض هذا المسار على حصين الفأر، وينتج بشكل روتيني عينات مزججة جيدا وصفائح موحدة (السمك المستهدف 150 ± 40 نانومتر) ويحقق مجموعا عالي الإنتاج من سلسلة الميل (عادة من 5 إلى 8 دقائق لكل ميل). يوفر هذا البروتوكول مسارا قابلا للتكرار لدراسة علم الأحياء البنيوي في الموقع مباشرة من بيئات الأنسجة المعقدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برز التصوير المقطعي الإلكتروني البارد (cryo-ET) كتقنية محورية لتصور المجمعات الجزيئية الكبيرة وبنى الخلايا في حالتها الأصلية المائية 1,2,3,4,5. من خلال إعادة بناء أحجام ثلاثية الأبعاد من سلسلة الصور الإسقاطية المائلة، يجسر التجميد ET الفجوة بين السياق الخلوي والدقة القريبة من الذرة، مقدما رؤى غير مسبوقة حول علم الأحياء البنيوي في الموقع6. بينما أصبحت سير عمل التصوير المقطعي بالإلكترون المجمد للعينات الخلوية7 (بما في ذلك الخلايا المخففة بالتجميد في الأنظمة المعلقة والخلايا الملتصقة) راسخا الآن، إلا أن امتدادها المباشر إلى الأنسجة السميكة والسليمة معماريا لا يزال تحديا كبيرا 8,9,10. وهذا ينطبق بشكل خاص على الأنسجة ذات المحتوى العالي من الماء مثل الدماغ11، حيث تستمر عملية التزجيج الموثوق وتحضير الصفائح الشفافة للإلكترونات (عادة <200 نانومتر) في تشكيل عنق زجاجة مستمر12.

تحقيق التزجيج في الأنسجة يمثل تحديا بسبب محتواها العالي من الماء وقلة انتقال الحرارة. بينما التجميد الغاطسي فعال للعينات الرقيقة (≤20 ميكرومتر)13، إلا أنه يفشل في معظم الأنسجة. يقوم التجميد عالي الضغط (HPF) بتثبيط تكوين نوى الجليد عن طريق تطبيق ضغط عال، مما يتيح تزجيج عينات حتى ~200 ميكرومتر نظريا. ومع ذلك، فإن كفاءة HPF التقليدية غالبا ما تكون أقل مثالية في تزجيج الأنسجة. لتحسين النتائج، استخدمت الجهود الحديثة استراتيجيات مثل إضافة واقيات التبريد14 وإجراء القطع المسبق15،16 (مثل استخدام الاهتزاز) لتقليل سمك العينة ميكانيكيا قبل تجميد11،17. بينما يمكن لهذه الطرق تحسين جودة التزجيج، إلا أنها غالبا ما تتطلب التعامل مع خارج الجسم الحي لفترة طويلة واستخدام إضافات كيميائية قد تتسبب في تغيير البنية الأصلية. ولمعالجة هذه القيود، عدلت هذه الدراسة استراتيجية حاملة "الوافل" التي طورها كيلي وآخرون في الأصل من خلال دمج تحسين حاسم: حيث يتم ضغط نسيج الدماغ فعليا باستخدام حاملين نحاسيين مصقولين قبل التجميد، مما يرقق العينة مسبقا مع تثبيتها في الوقت نفسه بين شبكة مغلفة ورقائق نحاسية. لا يعزز هذا التصميم فقط التزجيج السريع والموحد، بل يعزز أيضا الاستقرار الميكانيكي بشكل كبير، مما يمنع بشكل فعال انكسار الشبكة وفقدان العينات أثناء التعامل اللاحق، مما يؤسس أساسا قويا للحصول على عينات نسيجية مجمدة عالية الجودة وسليمة.

بعد التزاوج، يظل التزجيج عقبة رئيسية أمام الإنتاجية والجودة. كتقنية مبكرة ومعتمدة على نطاق واسع، تمكن تقنية التبريد فائق الميكروتومي من العديد من الدراسات الهيكلية الأساسية في الموقع. ومع ذلك، غالبا ما تقدم تشوهات الضغط والقطعالتي تضر بالسلامة الهيكلية. على النقيض من ذلك، يوفر طحن شعاع الأيونات المركز بالتجميد (cryo-FIB)21 دقة فائقة وتشويه طفيف بسيط7،22. في البداية، تم تطبيق الطحن بالكريو-FIB مباشرة على عينات مزججة على الشبكات لإنتاج الصفائح23؛ ومع ذلك، فإن هذا النهج في الموقع فعال بشكل أساسي للعينات الرقيقة24,25 (مثل الخلايا المزروعة أو مناطق الأنسجة الطرفية) ولا يمكنه الوصول إلى هياكل أعمق داخل الأنسجة السميكة والضخمة. لتجاوز هذا الحد من العمق، تم تطوير استراتيجيات رفع26، مما أتاح استخراج المناطق ذات الاهتمام (ROIs) من داخل العينات حسب الموقع المحدد. شهدت التطورات المنهجية اللاحقة، بما في ذلك الرفعالتسلسلي 27 والتقسيم التسلسلي على الشبكة (SOLIST)28، مزيدا من تحسين سرعة الإنتاج، واستقرار الصفائح، ودقة الاستهداف ثلاثي الأبعاد في الأنسجة المعقدة. ومؤخرا، استمرت الابتكارات في تطوير المجال، بما في ذلك طريقة التثبيت الستة أوجه من قبل تانغ وآخرون، والتي تعزز التثبيت الميكانيكي أثناء الرفع والتخفيف، بالإضافة إلى أساليب طحن جديدة على الشبكة من بنيامين سي. كريكمور وآخرون تتيح الوصول إلى الهياكل العميقة مع الحفاظ على سياق الأنسجة الأصلي. على الرغم من هذه التقدمات، لا تزال البروتوكولات تختلف في الكفاءة وقابلية التكرار والقدرة على التكيف بين أنواع الأنسجة المختلفة. لا تزال هناك فجوة حرجة قائمة في إنشاء سير عمل موحد وسهل التكرار وواسع التطبيق يدمج هذه التحسينات في خط أنابيب متماسك لأنواع متنوعة من الأنسجة السميكة.

يتم معالجة هذه الفجوة هنا من خلال دمج التفاصيل التقنية الرئيسية من المنهجيات المعتمدة وتحديثها في خط أنابيب عام من البداية إلى النهاية. لا يستخدم هذا البروتوكول فقط طريقة HPF-Waffle المحسنة للتزجيج القوي، بل يدمج أيضا سلسلة من الخطوات المحسنة في رفع وتخفيف الألياف الكريو-FIB، مثل تعويض الإمالة الزائدة المنهجية، والطلاء الموصل الموحد، وتسلسلات الطحن المعايرة، التي تعزز معا تجانس الصفائح، وتقلل من التشوهات (مثل الستائر)، وتحسن معدل الإنتاج. على عكس البروتوكولات المصممة لأنواع الخلايا أو الكائنات النموذجية المحددة، تم تصميم هذا السير مع إمكانية التعميم في جوهره، حيث يوفر إطارا متعدد الاستخدامات قابلا للتكيف مع مجموعة واسعة من الأنسجة السميكة والمعقدة، بما في ذلك تلك التي تكون ناعمة نسبيا وعرضة للضغط، بخلاف الحصين الموجود للفأر.

وقد ظهر ذلك في نموذج الحصين الجريء الصعب للفأر، المعروف بقابليته لتلف الجليد وتعقيده الهيكلي، وينتج هذا السير المتكامل والعام صفائح عالية الجودة (120–200 نانومتر) ويدعم الاكتساب الفعال على سلسلة الميل (5–8 دقائق في السلسلة). يوفر هذا الدمج لأفضل الممارسات في بروتوكول متماسك وسهل الوصول وقابل للتطبيق على نطاق واسع إطار عمل قابل للتكرار يقلل من الحاجز التقني أمام تطبيق تقنية التجميد المبكر في أبحاث الأنسجة السميكة عبر سياقات بيولوجية وطبية حيوية متنوعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الإجراءات المتعلقة بأنسجة الحيوانات امتثلت لبروتوكول SUSTech IACUC (بروتوكول SUSTech-JY202501019). يتم إدراج الوصاة والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تحضير دعم عينات

  1. تحضير حاملات HPF (انظر الشكل 1A)
    1. احصل على زوج من حاملات HPF النحاسية بقطر 6 مم (النوع B). تأكد من أن أحد الحاملات له سطح مستو.
    2. بلل السطح المستوي للحاملة وبدأ في الطحن. أولا، استخدم ورق صنفرة 8000 حبيبة حتى تزال علامات التشغيل الأصلية بالكامل. ثم انتقل إلى ورق صنفرة 12000 واستمر في الطحن حتى تختفي الخدوش من الخطوة السابقة إلى حد كبير، مما ينتج عنه طلاء ناعم بشكل موحد. يوضح الشكل 2 صورا نموذجية لسطح الحامل أثناء عملية الطحن والتلميع.
    3. تلمع سطح الأرض باستخدام قطعة قماش معدنية ناعمة ومعجون ألماس W0.5: أولا، ضع المعجون على القماش، ثم تلمع السطح بحركة دائرية لمدة 1–2 دقيقة حتى يتم الحصول على لمسة نهائية ناعمة ومصقولة للغاية. اشطف الحامل جيدا بالإيثانول، ثم بالماء المقطر لإزالة جميع بقايا الكاشط.
    4. اغمر الحاملات المصقولة في 1-سداسي لمدة لا تقل عن 4 ساعات (أو ليلة واحدة) قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحاملات المصقولة والمعالجة مغمورة في 1-سداسي الهواء.
      تحذير: 1-الهكساديسين قابل للاشتعال وضار إذا تم استنشاقه؛ اعمل في غطاء بخاري مع معدات الحماية الشخصية.
  2. تحضير شبكة دعم TEM (انظر الشكل 1B)
    1. استخدم شبكات نحاسية ب 100 شبكة مع فيلم دعم مستمر من فورمفار/كربون.
    2. قم بطلاء جانبي الشبكة بالذهب باستخدام طبقة طلاء البوتر: اضبط التيار على 50 مللي أمبير وغطي كل جانب لمدة 120 ثانية لتحقيق طبقة تقارب 6 نانومتر لكل جانب.
  3. تحضير رقائق النحاس (انظر الشكل 1C)
    1. احصل على رقائق نحاسية عالية النقاء بسماكة 1 ميكرومتر.
      ملاحظة: تختلف التوصيلية الحرارية للنحاس حسب النقاء، وانخفاض النقاء يؤدي إلى انخفاض التوصيل الحراري. لذلك، يطلب ورق النحاس عالي النقاء (Cu ≥ 99.9٪).
    2. قم بثقب ورق النحاس في أقراص بقطر 3 مم باستخدام ثقب دائري.

2. التجمد عالي الضغط

  1. ضع قطرة بحجم 10 ميكرولتر تحتوي على محلول السكروز 10٪ على سطح زجاجي نظيف.
  2. قم بتفكيك الحصين بسرعة من فأر تم إعدامه حديثا. قم بإزالة قطع الأنسجة الصغيرة بحجم حوالي 0.5–1 مم3 باستخدام شفرة حلاقة حادة (انظر الشكل 1D).
  3. انقل النسيج إلى شبكات دعم النحاسية (100 شبكة) داخل حامل HPF باستخدام عود أسنان أو فرشاة دقيقة. استخدم 2-ميثيل بوتان (إيزوبنتان) لتحريك النسيج بلطف في مكانه مع تقليل الإجهاد الميكانيكي على الشبكة.
    تحذير: 2-ميثيلبوتان (إيزوبنتان) قابل للاشتعال للغاية. تعامل معه في غطاء بخار بدون مصادر إشعال.
  4. غط النسيج والشبكة بقرص من رقائق النحاس بقطر 3 مم. أكمل التجميع بوضع حامل HPF الثاني (مسطحا ووجهه للأسفل) في الأعلى لتشكيل ساندويتش "وافل" المغلق (انظر الشكل 1E).
    ملاحظة: يؤدي ورق النحاس وظيفة ميكانيكية حيوية في مجموعة الوافل. يضع النسيج بين شبكة TEM والرقائق نفسها. أثناء التجميع، يطبق هذا التكوين ضغطا لطيفا، مما يساعد على تكوين شريحة نسيج أرق وأكثر انتظاما مثالية للتزجيج. علاوة على ذلك، يمنع الرقاد فقدان الأنسجة أثناء التعامل ويساعد في توزيع الضغط أثناء التجميد عالي الضغط، مما يقلل من خطر انقطاع الشبكة. بعد التجميد، يسهل الرقاع أيضا فصل الحاملات عن شبكة العينات المزججة. ومع ذلك، يمكن أن تسبب هذه الطريقة تلف الضغط الميكانيكي وقد لا تكون مناسبة للعينات الحساسة للتشويشات الناتجة عن الضغط. بالنسبة لهذه العينات، يجب النظر في تقنيات قطع بديلة تحقق سمكا مناسبا دون ضغط، مثل تقسيم الاهتزاز أو ثقب العينة.
  5. ابدأ فورا إجراء التجميد عالي الضغط وفقا لبروتوكول التشغيل الخاص بالشركة المصنعة. اضبط الضغط المستهدف على ~2100 بار وتأكد من أن الوقت الكلي من تشريح الأنسجة حتى التجميد لا يتجاوز 90 ثانية.
    ملاحظة: يجب إكمال العملية كاملة من التشريح إلى التجميد خلال 90 ثانية لتقليل التغيرات الهيكلية المرتبطة بفترة الخروج الطويلة من الجسم . نطاق سمك الأنسجة للأدمغة يتراوح بين 20–40 ميكرومتر.

3. طحن الرجعة الرجعية (FIB) والرفع

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية باستخدام مجهر ثنائي الشعاع مزود بمرحلة تجميدية. حافظ على درجة حرارة العينة تحت -170 درجة مئوية طوال الوقت.

  1. إعداد شبكة المستقبل
    1. احصل على شبكة ذهبية جديدة ب 300 شبكة لتكون شبكة المستقبل النهائية لإجراء الإخراج.
    2. تحت ميكروسكوب ستيريو في درجة حرارة الغرفة، قم بتثبيت الشبكة بلطف في حلقة AutoGrid متوافقة من نوع Cryo-FIB.
    3. تخزين الأوتوغريد المجمع مباشرة في فرن جاف يحافظ عليه عند حوالي 40 درجة مئوية لتقليل تراكم الصقيع قبل استخدامه.
      ملاحظة: أثناء القص تأكد من أن الشبكة مستوية ومركزية لمنع الانحناء أو الانحراف في المحاذاة.
  2. استرجاع وتركيب شبكة الأنسجة المزجاجة
    1. أثناء غمر المجموعة باستمرار في النيتروجين السائل (LN₂)، افصل بعناية شبكة TEM المزجاجة (التي تحتوي على النسيج ورقاع النحاس) عن مكونات التجميع المحيطة ب "الوافل".
      ملاحظة: عادة ما يجعل فاصل رقائق النحاس الشبكة سهلة الفصل عن الحاملات.
    2. على محطة عمل تحميل بالتبرير المبردة مسبقا، قم بتركيب شبكة الأنسجة المعزولة في حلقة أوتوجريد FIB ثانية تحت حماية LN₂.
  3. التحميل المشترك للشبكات على محمل النقل بالتجميد
    1. حمل كلا الشبكات التلقائية في الفتحات المخصصة لمكوك النقل بالتجميد.
    2. وجه كل شبكة أوتوماجريد بحيث تواجه شق التفريز للخارج وتكون عمودية.
    3. حافظ على المكوك المحمل تحت غمر LN₂ أو مبردا مسبقا حتى يتم نقله إلى مجهر FIB/SEM.
  4. تحديد الموقع والطلاء الموصل في FIB/SEM
    1. بعد النقل بالتجميد إلى المجهر، انتقل إلى شبكة الأنسجة بتكبير SEM منخفض.
    2. ضع طبقة موصلة وواقية على كامل سطح الشبكة.
      1. قم بطلاء سطح الشبكة بالبلاتين (Pt) عند 30 مللي أمبير لمدة 15 ثانية.
      2. يتم إيداع غطاء Pt عضوي معدني بسماكة 0.5–1.0 ميكرومتر باستخدام نظام حقن الغاز (GIS).
      3. تطبيق طبقة Pt نهائية مغطاة بالرشاشات على سطح الشبكة عند 30 مللي أمبير لمدة 15 ثانية.
        ملاحظة: غطاء نظم المعلومات الجغرافية ضروري لتقليل تشوهات الستائر.
  5. عزل ورفع كتلة الأنسجة (انظر الشكل 3)
    1. اختيار الموقع والتوجيه
      1. انتقل إلى المنطقة المحددة (ROI) على شبكة الأنسجة باستخدام صورة شعاع الإلكترونات SEM.
      2. وجه العينة للطحن من الجانب الأمامي. يتم ضبط موضع المرحلة النموذجي على دوران 110° وإمالة 7°، ويقدم هذا الموقع سطح العينة بزاوية مناسبة للوصول إلى شعاع الأيونات.
        ملاحظة: في غياب علامات الفلورية يمكن اتباع استراتيجية فحص مسبقية. تهدف هذه الاستراتيجية إلى تحديد منطقة الأنسجة المستهدفة واستبعاد المناطق التي تحتوي على مكونات واقية من التبريد أو مكونات غير نسيجية أخرى. بعد اختيار منطقة خالية من الجليد السطحي على ما يبدو، قم بحفر خندق اختبار صغير باستخدام تيار شعاع أعلى (مثلا 15 نانوأمبير عند 30 كيلو فولت) في الاتجاه الأمامي القياسي وتلميع باستخدام تيار شعاع أقل (مثلا 1 نانوأمبير عند 30 كيلو فولت). انتقل إلى شعاع الإلكترونات لفحص المقطع العرضي: يظهر النسيج تباينا ممتازا تحت شعاع الإلكترون، وهي خاصية تظهر بشكل خاص في البنى الغشائية والمناطق الغنية بالعناصر الثقيلة؛ على النقيض من ذلك، يظهر الواقي بالتجميد عادة تباين منتظم تحت شعاع الإلكترونات. يتيح ذلك التحقق السريع قبل المضي قدما في إجراء الرفع الكامل.
    2. طحن الخندق لعزل الكتلة (الشكل 3A)
      1. حدد خندقا مستطيلا يحيط بكتلة الأنسجة المستهدفة باستخدام شعاع الأيونات الذي يعمل بجهد 30 كيلوفولت.
      2. ابدأ الطحن على مسافة معينة من الكتلة باستخدام تيار مرتفع نسبيا يبلغ 15 نانوأمبير لتحقيق إزالة سريعة للمواد.
      3. عندما تقترب جدران الخنادق من الكتلة حتى بضعة ميكرومترات، قلل تيار شعاع الأيونات إلى 7 نانوأمتر. تقليل التيار يحقق تحكما أكثر دقة ويقلل من تلف حزمة الأيونات وتسخين المادة البيولوجية في المنطقة المعنية.
      4. اترك جانبا من الكتلة مثبتا على المادة السائبة ك "لبنة" لتثبيتها مؤقتا.
    3. خيار التفريز الصناعي للكتل السميكة (الشكل 3B)
      1. بالنسبة لكتل الأنسجة التي يقدر بسماكتها أكثر من 20 ميكرومتر، قم بتنفيذ خطوة طحن تحت القطع من الجانب الخلفي لتسهيل الرفع النهائي.
      2. قم بتدوير المسرح (مثلا، إلى -70°) وضبط ميل المسرح (مثلا، إلى 23°) للوصول إلى أسفل البلوك.
      3. قم بعمل التوصيل السفلي باستخدام التيار السفلي بقوة 30 كيلوفولت وتيار 3 نانوأمبير.
    4. التثبيت على إبرة الميكرو مانبوليتور (الشكل 3C)
      1. لتثبيت العينة بالإبرة، قم بتنفيذ أنماط طحن مقطعية متسلسلة.
        ملاحظة: يمكن استخراج كتلة الذهب من قضيب شبكة ذهبية مكونة من 300 شبكة.
    5. رفع كتلة الأنسجة (الشكل 3D)
      1. اقطع "التبويب" المتبقي الذي يربط الكتلة بعينة الكتلة باستخدام FIB (30 كيلوفولت، 1 نانوأمبير).
      2. حرك إبرة المعالجة الدقيقة بحذر لرفع كتلة الأنسجة المعزولة الآن بحيث تكون خالية تماما من الخندق والشبكة الأصلية المحيطة. ثم اسحب الإبرة وانقل الكتلة إلى شبكة المستقبل.
    6. نقل الكتل، اللحام، وإعادة الطلاء
      1. انقل الإبرة إلى شبكة استقبال ذهبية بسعة 300 شبكة مبردة مسبقا.
      2. خفض الكتلة إلى مربع شبكة مختار. اجعل كتلة الأنسجة تلامس الفيلم على الشبكة، ثم ارفع الكتلة عموديا لكسر التلامس. قم بتشكيل شريحة بسماكة ~3–4 ميكرومتر من الكتلة إلى فيلم الشبكة باستخدام شعاع الأيونات (30 كيلوفولت، 1 نانوأمبير) (الشكل 3E).
        ملاحظة: إذا كان هناك حطام ثلج، قم بتنظيف موقع التثبيت مسبقا بنمط مستطيل (30 كيلو فولت، 50 باسكون). تأكد من أن الكتلة تلامس فيلم الشبكة لتقليل الشحنة الكهروستاتيكية، والتي قد تزيح الشريحة عشوائيا.
      3. قم بلحام الشريحة بأمان عن طريق الطحن باستخدام أنماط مقطع التنظيف على جانبي الوصلة (30 كيلو فولت، 30 بيسو أمبير) (الشكل 3F).
      4. أعد تطبيق الطلاء الموصل/الواقي كما هو موضح في الخطوة 3.4.2 (الشكل 3G).
        ملاحظة: في هذه الخطوة من طلاء نظم المعلومات الجغرافية يمكن تقليل المدة حسب حجم الكتلة.
    7. تخفيف الصفائح
      1. قم بتدوير المرحلة (مثلا، إلى -70°) وضبط ميل المرحلة الأولي (مثلا 15°) (الشكل 3H).
        ملاحظة: يتميز حامل العينة بميل مسبق بزاوية 45°.
      2. حدد الموضع النهائي للصفيحة ضمن منطقة ناعمة من كتلة النسيج.
        ملاحظة: تأكد من أن المنطقة المحددة خالية من تلوث الجليد.
      3. قم بإجراء الطحن المنهجي باستخدام تيارات شعاع الأيونات المحددة في الجدول 1. يتم التقدم من التيارات الأعلى إلى الأدنى مع الاقتراب من مستوى الهدف (الشكل 3I,J). اختياريا، عندما تكون اللوميلا ضمن 1–2 ميكرومتر من الصفيحة، يمكن حفر خندق تخفيف الإجهاد على بعد حوالي 1.5 ميكرومتر لمنع انحناء أو انحناء الصفيحة30,31.
        ملاحظة: عندما تكون المادة المتبقية ضمن ~1 ميكرومتر من المستوى المستهدف، حدد السماكة التي تزال في كل مرور.

4. جمع بيانات Cryo-ET

  1. بعد التحضير الناجح للصفائح، يتم تحميل الشبكة بعناية في مجهر إلكتروني ناقل (TEM) مزود بحامل تجميد، ومرشح طاقة، وبرنامج تصوير مقطعي (مثل SerialEM).
  2. احصل على خريطة أطلس للشبكة بأكملها (مثلا، الشكل 4A؛ التكبير النموذجي هو 155×).
  3. انتقل إلى موقع الصفيحة واحصل على خريطة مونتاج (مثلا، الشكل 4B؛ التكبير النموذجي هو 3600× مع انحراف تركيز -100 ميكرومتر).
  4. تعيين التكبير الاسمي للتسجيل والتحقق من أن حجم البكسل مناسب للدقة المقصودة؛ في هذه الدراسة، تم استخدام حجم بكسل 2.109 أنجلوس. ضبط معايير الإضاءة المقابلة، بما في ذلك حجم البقعة، وقطر فتحة C2، ومساحة الإضاءة، لتحقيق معدل جرعة محسن لكاشف الإلكترونات المباشر.
  5. قم بضبط شروط التركيز وإضاءة التجربة لتطابق مع تلك المحددة لمعلمة Record.
  6. قم بجمع البيانات باستخدام سكريبتات PaceTomo32، باتباع الخطوات التالية:
    1. اختر الأهداف مسبقا على خريطة المونتاج باستخدام وظيفة "إضافة نقاط" في الملاح، لضمان أن الميزة الأولى تظهر تباين كاف.
    2. اختر الأهداف باستخدام السكربتPACEtomo_selectTargets.py 32، مع تعديل المنطقة المميزة عند تكبير المعاينة إذا لزم الأمر. تظهر المناطق النموذجية ذات الاهتمام في الشكل 4C.
    3. احصل على سلسلة إمالة باستخدام مخطط متماثل الجرعة (مثلا: 0°، +3°، -3°، +6°، -6°... حتى ±60°–66°) مع زيادة قدرها 2° أو 3°. تعيين معلمات الاكتساب في سكريبت PACEtomo.py: يتم تحديد زاوية ميل البداية بواسطة زاوية الطحن المحددة في الخطوة 3.7.1 (أي 8°)، وتعتمد علامتها على اتجاه تحميل العينة في التجميد الكهرومغناطيسي؛ الزوايا الدنيا والعظمى للميل تشير إلى القيم المطلقة؛ وحجم الخطوة يتوافق مع زيادة الميل (مثلا، 3°).
      ملاحظة: تم تصميم زاوية الميل الابتدائية هذه لوضع الصفيحة أفقيا وعموديا على شعاع الإلكترون. إذا كانت زاوية الطحن غير معروفة، قم بإمالة الصورة لعرض الصفيحة عند أعلى ارتفاع ظاهري لها؛ وهذا يوفر محاذاة دقيقة بما فيه الكفاية.
    4. حافظ على جرعة إلكترونية تراكمية تتراوح بين 100–150 e⁻/Å2 موزعة على جميع الإمالات. إذا كان متوفرا، استخدم مرشح طاقة بعرض شق 10 إلكترون فولت.
    5. ابدأ جمع البيانات. يتم تنفيذ التركيز والتتبع الآلي عند كل زاوية ميل. الوقت المعتاد للاكتساب لسلسلة ميلان واحدة هو 5–8 دقائق.
      ملاحظة: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها مقدم في الجدول 2.

5. معالجة البيانات

  1. عملية تصحيح الحركة على سلسلة الإمالة، تقدير CTF، المحاذاة، وإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام AreTomo 333 لتنفيذ ثلاث خطوات أساسية: (1) تصحيح حركة إطارات الصور الخام، (2) تقدير دالة نقل التباين (CTF) لكل صورة إمالة، و(3) محاذاة سلسلة الإمالة الكاملة.
    1. بعد المحاذاة، يتم إعادة بناء التوموغرامات ثلاثية الأبعاد ( 3D) باستخدام خوارزمية الإسقاط العكسي المرجح. شملت المدخلات المطلوبة لهذه الخطوة: إطارات الصور الخام، ملفات بيانات mdoc الوصفية (التي توثق معلمات اكتساب سلسلة الإمالة)، ومحور الدوران المحدد مسبقا للعينة.
  2. تصحيح الوتد المفقود
    1. بعد إعادة البناء، تخضع التوموغرامات المصورة الناتجة لتصحيح الوتد المفقود باستخدام IsoNet34.
  3. اختيار الجسيمات وتنظيمها
    1. قم باختيار الجسيمات في EMAN 2.935 باستخدام طريقة مطابقة القوالب. بعد الاختيار الآلي، تم استبعاد الإيجابيات الكاذبة (أي المناطق غير المستهدفة أو المناطق المختارة خطأ) يدويا لضمان جودة مجموعة بيانات الجسيمات المختارة.
  4. المتوسط الفرعي
    1. استورد سلسلة الميل وإحداثيات الجسيمات المقابلة لها إلى RELION 4.0. قم بإجراء المتوسط الفرعي وفقا لسير العمل القياسي الموضح في وثائق RELION 4.0 (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html)، مما يضمن الالتزام بأفضل الممارسات المعتمدة لإمكانية التكرار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح التطبيق الناجح لهذا البروتوكول إنتاج صفائح أنسجة عالية الجودة ومزججة وإعادة بناء التصوير المقطعي الذي يكشف عن البنية الخلوية الفائقة الطبيعية. النتائج التالية، التي أظهرت باستخدام نسيج حصين الفئران، تمثل تجربة ناجحة.

أظهرت كتل الأنسجة التي تعالج بالتجميد عالي الضغط بطريقة "وافل" مظهرا موحدا وشفافا للإلكترونات (الشكل 4B,C). أظهرت العينات المزججة بالكامل عدم وجود تباين حيود مرتبط بالجليد البلور. أظهرت أطياف الق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤسس سير العمل المعروض هنا خط أنابيب عام ومحسن وقابل للتكرار لتصوير مقطعي إلكتروني بالتجميد في الموقع للأنسجة السميكة الأصلية. تكمن مساهمتها الأساسية ليس في اختراع تقنيات فردية، بل في التكامل المنهجي، والتطوير، والتوحيد التفصيلي للعملية بأكملها، من التزجيج القوي باستخدام طريقة وافل-HPF المعدلة إلى بروتوكول رفع وتخفيف التجميد البارد المعاير بدقة. يعالج هذا التركيب الفجوة الحرجة التي تحدث غالبا عند تطبيق التجميد على الأنسجة المعقدة وقابلة التكرار وسهولة الوصول إليها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون موظفي مركز Cryo-EM في جامعة العلوم والتكنولوجيا الجنوبية على دعمهم الفني. وقد دعم هذا المشروع الابتكار الوطني للعلوم والتكنولوجيا (تكنولوجيا علوم الدماغ والذكاء الشبيه بالدماغ – المشروع الرئيسي الوطني للعلوم والتكنولوجيا، منحة رقم 2022ZD0211905) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32200998 ورقم 32161133022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-هيكساديسينسيغما-ألدرتشH2131الكيماويات والعلوم الكيميائية المواد الكيميائية
2-ميثيلبنتانسيغما-ألدرتشM65807الكيماويات والعلوم الكيميائية المواد الكيميائية
حلقة المشبكثيرمو فيشر العلمي1131750; 1188953المواد الاستهلاكية
رقائق النحاسمواد فنغتشنغ المعدنية1 & سمك mالمواد الاستهلاكية
شبكات TEM الداعمة للنحاس (100 شبكة)شركة بكين تشونغجينغكي للتكنولوجيا المحدودةBZ10021bالمواد الاستهلاكية
كريو-إي إمثيرمو فيشر العلميكريوس G4المعدات  
التجميد الصناعيثيرمو فيشر العلميأكويلوس 2المعدات  
كريو-فيب أوتوجريدثيرمو فيشر العلمي1205101المواد الاستهلاكية
الشبكات (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 مش)الكومانتيفولايدألترأوفويلالمواد الاستهلاكية
فريزر عالي الضغطلايكا مايكروسيستمزإم آيسالمعدات  
حاملة HPF، نحاسيةلايكا مايكروسيستمزالنوع B (6 مم)المواد الاستهلاكية
مغطى الأيون المتناثرالقاعدة الانتخابيةQ150RS بلسالمعدات  
معجون التلميع المعدنيلاب-تستيكW0.5المواد الاستهلاكية
قماش تلميعالگورالB00809المواد الاستهلاكية
ورق صنفرةورق صنفرة إيغل براند8000 حبيبة، 12000 حبيبةالمواد الاستهلاكية
المجهر المجسملايكا مايكروسيستمزS9i<اسم="ميدان! D17">Equipment 
سكروزسيغما-ألدرتش200-334-9الكيماويات والعلوم الكيميائية المواد الكيميائية
برنامج الاستحواذ على سلسلة تيلتhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9البرمجيات
محاذاة سلسلة الميل والمواهب برنامج إعادة البناءhttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 ؛أريتومو 3البرمجيات
برنامج الاستحواذ على سلسلة تيلتhttps://github.com/eisfabian/PACEtomoبايس توموالبرمجيات
محاذاة سلسلة الميل والمواهب برنامج إعادة البناءhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetالبرمجيات
محاذاة سلسلة الميل والمواهب برنامج إعادة البناءhttps://github.com/cryoem/eman2إيمان2البرمجيات
محاذاة سلسلة الميل والمواهب برنامج إعادة البناءhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.htmlرليون 4البرمجيات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52 (1), 573-595 (2023).
  2. Baumeister, W. Cryo-electron tomography: A long journey to the inner space of cells. Cell. 185 (15), 2649-2652 (2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: The resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52 (1), 339-360 (2023).
  4. Nogales, E., Mahamid, J. Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy. Nature. 628 (8006), 47-56 (2024).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 58, 1-9 (2019).
  6. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ—the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  7. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  8. McCafferty, C. L., et al. Integrating cellular electron microscopy with multimodal data to explore biology across space and time. Cell. 187 (3), 563-584 (2024).
  9. Pöge, M., et al. Making plant tissue accessible for cryo-electron tomography. Elife. 106455, 1-41 (2025).
  10. Bäuerlein, F. J. B., et al. Cryo-electron tomography of large biological specimens vitrified by plunge freezing. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  11. Creekmore, B. C., Kixmoeller, K., Black, B. E., Lee, E. B., Chang, Y. -W. Ultrastructure of human brain tissue vitrified from autopsy revealed by cryo-ET with cryo-plasma fib milling. Nat Commun. 15 (1), 2660(2024).
  12. Chen, Z., Guo, Q. Innovations in cryo-electron tomography for tissues: Challenges and future prospects. Curr Opin Struct Biol. 93, 103112(2025).
  13. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (2009).
  14. Matsui, A., et al. Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses. Elife. 13, RP98458(2024).
  15. Ning, J., et al. Uncovering synaptic and cellular nanoarchitecture of brain tissue via seamless in situ trimming and milling for cryo-electron tomography. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  16. Zhang, J., et al. Vhut-cryo-fib, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography. J Struct Biol. 213 (3), 107763(2021).
  17. Glynn, C., et al. A generalizable and targeted molecular biopsy approach for in situ cryogenic electron tomography of vitreous brain tissue. Cell Rep Methods. 5 (7), 101080(2025).
  18. Kelley, K., et al. Waffle method: A general and flexible approach for improving throughput in fib-milling. Nat Commun. 13 (1), 1857(2022).
  19. Pierson, J., Ziese, U., Sani, M., Peters, P. J. Exploring vitreous cryo-section-induced compression at the macromolecular level using electron cryo-tomography; 80s yeast ribosomes appear unaffected. J Struct Biol. 173 (2), 345-349 (2011).
  20. Alamoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 150 (1), 109-121 (2005).
  21. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  22. Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. J Struct Biol. 192 (2), 262-269 (2015).
  23. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nat Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  24. Engel, B. D., et al. Native architecture of the Chlamydomonas chloroplast revealed by in situ cryo-electron tomography. Elife. 4, e04889(2015).
  25. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 172 (2), 180-190 (2010).
  26. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo transmission electron microscopy. J Struct Biol. 180 (3), 572-576 (2012).
  27. Schiøtz, O. H., et al. Serial lift-out: Sampling the molecular anatomy of whole organisms. Nat Methods. 21 (9), 1684-1692 (2023).
  28. Nguyen, H. T. D., et al. Serialized on-grid lift-in sectioning for tomography (solist) enables a biopsy at the nanoscale. Nat Methods. 21 (9), 1693-1701 (2024).
  29. Tang, X., et al. Step-by-step procedure for an optimized serial lift-out cryo-focused ion beam milling technique in tissue analysis. Biophys Rep. 11, 1-13 (2025).
  30. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of fib-milled cryo-lamellae. J Struct Biol. 208 (3), 107389(2019).
  31. Berger, C., Watson, H., Naismith, J. H., Dumoux, M., Grange, M. Xenon plasma focused ion beam lamella fabrication on high-pressure frozen specimens for structural cell biology. Nat Commun. 16 (1), 2286(2025).
  32. Eisenstein, F., et al. Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae. Nat Methods. 20 (1), 131-138 (2022).
  33. Peck, A., et al. Aretomolive: Automated reconstruction of comprehensively-corrected and denoised cryo-electron tomograms in real-time and at high throughput. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  34. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  35. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  36. Yang, Q., et al. The reduction of fib damage on cryo-lamella by lowering energy of ion beam revealed by a quantitative analysis. Structure. 31 (10), 1275-1281.e4 (2023).
  37. Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. J Struct Biol. 213 (3), 107743(2021).
  38. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Elife. 11, e82891(2022).
  39. Yang, J., et al. Integrated fluorescence microscopy (IFLM) for cryo-fib-milling and in-situ cryo-ET. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  40. Li, S., et al. Eli trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  41. Medeiros, J. M., et al. Robust workflow and instrumentation for cryo-focused ion beam milling of samples for electron cryotomography. Ultramicroscopy. 190, 1-11 (2018).
  42. Goetz, S. K., et al. A modular platform for automated cryo-fib workflows. Elife. 10, e70506(2021).
  43. Eisenstein, F., Fukuda, Y., Danev, R. Smart parallel automated cryo-electron tomography. Nat Methods. 21 (9), 1612-1615 (2024).
  44. Swulius, M. T., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

High Pressure FreezingTissue Lamella PreparationCryo FIB MillingPlatinum Sputter CoatingSubtomogram AveragingCorrelative MicroscopyNative Cellular UltrastructureSynaptic Structures

مقالات ذات صلة