قياس التغيرات في وحدات تكوين مستعمرات البيفيدوبكتيريا واللاكتوباضيليل أثناء علاج الريفاكسيمين وهلام السينبيوتيكس لدى المتطوعين الأصحاء

Summary

قيمت هذه التجربة السريرية أعداد البكتيريا الثنائية واللاكتوباكتسيلين بعد أسبوع من علاج الريفاكسيمين، وجل سينبيوتيك مكون من لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس NCFM وبيفيدوباكتيريوم لاكتيس بي07، مع أنولين الأغاف، خلال علاج الريفاكسيمين و4 أسابيع بعده، مقارنة بجل وهمي، مما أظهر أن جل السينبيوتيكي قد يساعد في الحفاظ على اللكتوباثيليل والبكتيريا البيفيدوباكيريا.

Abstract

على الرغم من أن ميكروبيوم الأمعاء مستقر عموما، إلا أنه يمكن أن يتأثر بالعلاج بالمضادات الحيوية. يستخدم ريفاكسيمين لعلاج اضطرابات الجهاز الهضمي، وغالبا ما يعطى مع البروبيوتيك لتقليل خطر الإصابة باضطراب التوازن (ديسبيوزيس). يتفاعل لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس مع خلايا الأمعاء ويستخدم مركبات بريبيوتيكية. بيفيدوبكتيريا، وخاصة بيفيدوباكتيريوم إنفانتيس إسسب. لاكتيس بي07، هي بروبيوتيك ارتبط بتأثيرات مفيدة في الأمعاء. أظهرت الدراسات المخبرية تفوق فروكتان الأغاف على إنولين الهندباء. لم توثق أي دراسات تغييرات في عدد لاكتوباسيلات البراز وبكتيريا البيفيدوباكتيريا بعد إعطاء الريفاكسيمين والسينبيوتيك بالتزامن. كان هدفنا تقييم التغيرات في عدد البكتيريا الثنائية في الأمعاء وبكتيريا اللاكتوباسيليل لدى المتطوعين الأصحاء بعد تناول الجل السينبيوتيكي، الذي يحتوي على لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس NCFM، وبيفيدوباكتيريوم لاكتيس بي07، وأغاف إينولين كبريبايوتيك، خلال أسبوع واحد من علاج الريفاكسيمين ولمدة 4 أسابيع بعده. في تجربة سريرية عشوائية ومحكمة الدواء الوهمي، تم العشوائية 1:1 على المشاركين الأصحاء الذين لم يتلقوا علاجا مضادا للميكروبات في الشهر السابق بنسبة 1:1 في مجموعتين (10 مشاركين لكل مجموعة). تلقت مجموعة الهلام السينبيوتيك 10.32 جرام من أنولين الأغاف كبريبيوتيك و4 ×^{10 9} وحدة CFU/g من لاكتوباسيلوس الحمضي NCFM و4 ×^{10 9} وحدة CFU/g من بيفيدوباكتيريوم لاكتيس Bi07 يوميا لمدة 5 أسابيع، و200 ملغ ريفاكسيمين مرتين يوميا خلال الأسبوع الأول. تلقت مجموعة جل الدواء الوهمي جل الوهمي لمدة 5 أسابيع و200 ملغ ريفاكسيمين مرتين يوميا خلال الأسبوع الأول. تم تقدير التغيرات البكتيرية من خلال قياس الكتلة الخالية من الكثافة من البرواز من خلال التقييم الميكروبيولوجي للبراز. بعد خمسة أسابيع، لم تتغير مجموعات اللاكتوباستيليس والبكتيريا الثنائية (بيفيدوباكيريا). يشير اكتشاف لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس NCFM وبيفيدوباكتيريوم لاكتيس Bi07 في بعض عينات البراز إلى استعمارات عابرة وجزئية، مما يبرز الحاجة إلى دراسات جرعة الاستجابة لهذا المنتج السينبيوتيكي.

Introduction

ميكروبيوتا الأمعاء البشرية هي مجتمع مكتظ بالسكان يشمل أنواعا محلية دائمة وبكائنات دقيقة عابرة أخرى. على الرغم من أن تركيبه قد يختلف بين الأفراد، إلا أنه يعتبر عموما مستقرا. ومع ذلك، يمكن أن يتأثر بالعمر والعدوى وعلاج المضادات الحيوية ^1,2,3. ريفاكسيمين، مضاد حيوي واسع الطيف ذو امتصاص منخفض في الأمعاء، يستخدم لعلاج اضطرابات الأمعاء ويمكن أن يغير الميكروبيوتا. تستخدم بكتيريا البروبيوتيك من أجناس لاكتوباسيلوس وبيفيدوكتيريوم للتخفيف من هذه التأثيرات².

تم الإبلاغ عن أن سلالات أنواع بيفيدوباكتيريوم مقاومة^{للريفاكسيمين 2}، والتي لها تأثير مثير للاهتمام في تعزيز أعداد كافية من الكائنات الحية في الأمعاء التي تحتوي على مجموعات من أنواع بيفيدوباكتيريوم لتحقيق تأثيرات بروبيوتية مفيدة.

علاوة على ذلك، تم الاعتراف على نطاق واسع ب Lactobacillus acidophilus لقدرته على التفاعل مع ظهارة الجهاز الهضمي⁴ وقدرته على استخدام البريبوتيك مثل عديدات السكريات، والأوليجوسكاريدات، والفركتوليغوسكاريدات. ومع ذلك، تم تحديد عدد قليل فقط من سلالات البروبيوتيك، مثل سلالة لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس نورث كارولينا (NCFM). لذلك، دراسة تأثيراتها في الجسم الحي، كما هو الحال مع وجود بكتيريا Bifidobacterium lactis Bi07 في الجهاز الهضمي، كما تم ربطه بفوائد صحية مختلفة ^2,5. تتطلب هذه البروبيوتيك وجود بريبيوتيك لتنمو بشكل مثالي، ولهذا السبب يعمل التركيب الذي يحتوي على بروبيوتيك وبريبيوتيك معا بشكل تآزئي؛ أي أن تأثيره الإيجابي أعلى من تأثير البروبيوتيك وحده. مع البريبيوتيك التي تعمل كركائز للبروبيوتيك، من المتوقع أن يعزز هذا التعايش بقاء الكائنات الدقيقة البروبيوتية في الجهاز الهضمي، مما يؤدي إلى استعادة أكبر للميكروبيوتا⁶.

مصدر مهم للبريبيوتيك هو فركتان الأغاف، التي أبلغ عن تأثيرها في المختبر أفضل على الميكروبيوم مقارنة بجذر الهندباء (Cichorium intybus L.)⁷. أفادت الدراسات عن تأثيرات استهلاك البروبيوتيك؛ على سبيل المثال، قام إنجلبريكتسون وآخرون بتقييم ما إذا كان تناول البروبيوتيك أثناء وبعد إعطاء المضادات الحيوية يمكن أن يقلل من التغيرات في الميكروبيوتا الناتجة عن المضادات الحيوية⁸. وجدوا أن المجموعة التي تلقت مزيج البروبيوتيك أظهرت تعافا أسرع للميكروبيوتا الطبيعية مقارنة بمن لم يتلقاها⁸. علاوة على ذلك، درس كونينغ وآخرون الخلل الحيوي في ميكروبيوتا الأمعاء لدى 40 متطوعا صحيا عولجوا بجرعة 500 ملغ من الأموكسيسيلين مرتين يوميا لمدة 7 أيام، بالإضافة إلى إمكانية تعافي الميكروبيوتا بعد تناول خليط بروبيوتيك. أظهرت النتائج أن علاج الأموكسيسيلين أثر على تركيب الميكروبيوم الأصلي. عند إعطاء مزيج من البروبيوتيك، تعافت الميكروبيوتا بشكل كبير بعد شهرين من الاستهلاك⁹.

ومع ذلك، تشير الأدبيات إلى أنه لم تبحث أي دراسات في تأثير استهلاك السينبيوتيكات (مع فركتانات الأغاف كبريبيوت) على ميكروبيوتا الأمعاء أثناء وبعد إعطاء المضادات الحيوية، مثل الريفاكسيمين؛ وجدنا فقط دراسات تحتوي على البروبيوتيك. لذلك، قامت هذه الدراسة بتقييم التغيرات في عدد البكتيريا الثنائية في الأمعاء واللاكتوباسيليل لدى المتطوعين الأصحاء بعد تناول الهلام السينبيوتيكي، الذي يحتوي على لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس NCFM، وبيفيدوباكتيريوم لاكتيس بي07، وإينولين الأغاف كمادة بريبيوتيكية، خلال أسبوع واحد من علاج الريفاكسيمين ولمدة 4 أسابيع بعده.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية للأبحاث الطبية الحيوية في الإنسان (CIIBH) التابعة للمعهد الوطني للعلوم الطبية والتغذية في سالفادور زوبيران (INCMNSZ) (المرجع 1734). قدم جميع المشاركين موافقة مستنيرة قبل إدراجهم في هذه الدراسة.

تصميم الدراسة والسكان

كانت هذه تجربة سريرية عشوائية، خاضعة للرقابة الوهمية، مزدوجة التعمية، مع فترة متابعة مدتها 5 أسابيع. تمت دعوة العاملين في INCMNSZ للمشاركة في الدراسة، وتم تضمين متطوعين أصحاء تتراوح أعمارهم بين 20 و50 عاما بدون علاج مضاد للميكروبات في الشهر السابق، والذين قبلوا ووقعوا على نموذج الموافقة المستنيرة بين عامي 2011 و2012. تم توزيع المشاركين عشوائيا بنسبة 1:1 إلى مجموعة الهلام السينبيوتيكي مع 10.32 جرام من أنولين الأغاف كبريبايوتيك و4 × 10⁹ CFU/g من لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس NCFM و4 × 10⁹ CFU/g من Bifidobacterium lactis Bi07 يوميا، محوى في 4 أكياس لمدة 5 أسابيع، و200 ملغ ريفاكسيمين مرتين يوميا خلال الأسبوع الأول. تلقت مجموعة جل الدواء الوهمي 4 عبوات من 15 جرام من جل الدواء الوهمي، بنفس العرض والخصائص الحسية مثل جل السينبيوتيك، لمدة 5 أسابيع، و200 ملغ ريفاكسيمين مرتين يوميا خلال الأسبوع الأول (الشكل 1).

التقييم السريري

في كلتا مجموعتي الدراسة، تم تقييم الأعراض ومظهر البراز باستخدام مقياس بريستول. كما تم قياس الوزن والطول ومؤشر كتلة الجسم (BMI). تم استخدام دفتر يوميات لتقييم استهلاك الجل السينبيوتيك، وهلام الدواء الوهمي، والريفاكسيمين ولتسجيل وجود أو غياب الآثار الجانبية المرتبطة بتناول الهلام.

استهلاك الألياف

تم تقييم تناول الألياف باستخدام دفتر يوميات الطعام واستدعاء لمدة 24 ساعة أسبوعيا في كلا المجموعتين.

الالتزام بالعلاج

تم تقييم الالتزام بتناول الريفاكسيمين والجل من خلال عد جرعات الريفاكسيمين وعدد أكياس الهلام السينبيوتيكية والوهائية التي تم تناولها لكل مشارك. تم اكتشاف وجود لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس وبيفيدوباكتيريوم لاكتيس باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

التقييم الميكروبيولوجي للبراز

في الزيارة 0 وأسبوعيا لمدة 5 زيارات (6 زيارات) في كل مجموعة، تم تقييم أعداد اللاكتوباسيل، والبفيدوبكتيريا، والبكتيريا المعوية في 120 عينة براز باستخدام طريقة عد اللواح. تقيس هذه الطريقة وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) عن طريق وضع عينات مخففة على وسط صلب متخصص¹⁰. تم جمع عينات البراز في بداية كل زيارة.

لتحديد الكائنات الدقيقة، تم جمع عينات براز وتخزينها في أنابيب BBL. تم استخدام قارورة PBG للبكتيريا اللاهوائية، وتم نقل عينات البراز في مبرد من الستايروفوم يحتوي على عبوات جل مجمدة للحفاظ على درجة حرارة منخفضة قبل المعالجة في المختبر. تمت إزالة غطاء قارورة PBG الخاصة بالزراعة المشتركة، وتم جمع عينة البراز باستخدام مسحة، لضمان أن المسحة مشبعة بالعينة. ثم يوضع جهاز التطبيق في أنبوب يحتوي على وسط زراعة صلب.

بالنسبة للبكتيريا اللاهوائية، تم وزن القوارير، وجمع 5–10 جرامات من البراز باستخدام ملعقة. ثم خلط البراز مع محتويات القارورة وأغلق بإحكام. لمعالجة العينات، تم وزن القوارير التي تحتوي على العينات وأكياس المعقم المعقمة. تم تفريغ العينة في كيس، وتم تمركزها لمدة 60 ثانية، ثم أضيف 4.5 مل من ماء البيبتون 0.1٪. بعد ذلك، تم نقل 500 ميكرولتر من العينة إلى قارورة وتحويلها إلى دوامة لتوحيد الخليج. بعد تلقيح 100 ميكرولتر من العينة بنسخة مكررة على كل لوحة من الوسط الانتقائي المحدد، وسط مان روغوسا شارب (MRS) لللاكتوباضيليل، ووسط DP Beerens بالسيستين + السيكلوهكسيميد (للقضاء على الفلورا غير المرغوب فيها) للبكتيريا الثنائية (حتى التخفيف 8 (عامل التخفيف 0.1 مل). بالنسبة للبكتيريا المعوية، استخدم وسط ماكونكي عند التخفيف 5–8 (عامل التخفيف 0.1 مل)، حيث تم فصل مستعمرات البكتيريا وقياسها¹¹. تم إذابة كل مسحوق وسط في ماء مقطر منقي، وسخن المحلول حتى الغليان لضمان الذوبان الكامل، ثم تم تعقيمه في جهاز تعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تم تبريد الخليط إلى 46.5 درجة مئوية لتنفيذ تقنية الصب، حيث يتم صب 1 مل لكل طبق مكررا في أطباق بترى معقمة تحتوي على 15–20 مل من وسط الزراعة، مما يسمح للألواح بالتصلب الطبيعي. تم حضن العينات التي تم تلقيحها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في غلاف جوي مغني بثاني أكسيد الكربون₂ في أنظمة GasPak اللاهوائية للحفاظ على ظروف لا هوائية لمدة 24–48 ساعة. تم تمييز وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) بقلم وعددها¹². تم تطبيق الصيغة التالية:

CFU/mL = (عدد المستعمرات × عامل التخفيف الكلي)/حجم الزراعة المطلية (mL)

تحديد الخصائص الشكلية لباسيتات اللاكتوباضيل والبكتيريا الثنائية

تم استخدام صبغة جرام لتحديد الخصائص الشكلية للعينة. تم وضع عينة من مستعمرات البكتيريا من كل سلالة على شريحة مجهرية، وصبغت باللون البنفسجي الكريستالي لمدة دقيقة واحدة، ثم شطفت بالماء المقطر. تم تطبيق محلول اليود لمدة دقيقة واحدة ثم شطفه بالماء المقطر. تم استخدام محلول كحولي وأسيتون لمدة 10 ثوان كمزيل لون وشطف بالماء المقطر. وأخيرا، تم وضع السافرانين كصبغة مضادة لمدة دقيقة واحدة وشطفها بالماء المقطر. تمت ملاحظة شرائح المجهر تحت المجهر البصري باستخدام زيت غمر بهدف 100x.

تم إجراء القياس الكلي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR) على عينات براز مختارة عشوائيا من خمسة أشخاص في كل مجموعة، وحصل على ما مجموعه 60 عينة خلال 5 أسابيع. تمت معالجة العزلات من وسط الزراعة لاستخراج المادة الوراثية. تم إجراء PCR باستخدام بادئات بكتيرية عالمية لتضخيم جزء من جين 16S rRNA¹³. تم تنقية منتجات PCR وتسلسلها. تم التحقق من التسلسلات وتقديمها إلى قاعدة بيانات GenBank لتأكيد وجود سلالات لاكتوباسيلوس وبيفيدوباكتيريا معزولة من عينات البراز.

التحليل الإحصائي

تعرض البيانات كترددات مطلقة ونسبية أو وسيطة (p25th-P75th). تم تحديد شدة الأعراض التراكمية باستخدام درجة ليكرت (خفيفة، 1؛ متوسطة، 2؛ شديدة، 3) في كل متابعة. تم إجراء المقارنات بين المجموعات باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتبة واختبار كاي-تربيع أو اختبار فيشر الدقيق. أجريت مقارنات داخل المجموعات بين الأسبوعين 0 و5 باستخدام اختبار فريدمان وعدة مقارنات مع دوربين-كونوفر. تم تحديد الدلالة الإحصائية عند P < 0.05.

Results

تم تقسيم عشرين متطوعا أصحاء عشوائيا إلى مجموعة الهلام السينبيوتيك (n = 10) ومجموعة الهلام الوهمي (n = 10) (الشكل 2 والجدول 1). في مجموعة الهلام السينبيوتيكي، كان سبعة رجال وثلاثة نساء، بمتوسط عمر 31 سنة (النطاق 27–35 سنة)؛ في مجموعة جل الدواء الوهمي، كان ثلاثة رجال وسبعة نساء، بمتوسط عمر 33 سنة (النطاق 28–38 سنة). كانت المجموعات متشابهة من حيث العمر والجنس والوزن ومؤشر كتلة الجسم. كان الالتزام بالعلاج بنسبة 100٪ في مجموعة ا...

Discussion

في هذه الدراسة، وجدنا انخفاضا كبيرا في أعداد البكتيريا المعوية في عينات البراز من المشاركين في مجموعة الدواء الوهمي منذ الأسبوع الأول من التدخل وفي المشاركين في مجموعة الهلام السينبيوتيك في الأسبوعين الأول والثاني. يمكن تفسير هذا التغير باستخدام الريفاكسيمين، الذي وصف بأنه يخفف من نمو البكتيريا الممرض¹⁴. في دراستنا، أظهرت مجموعة الجل السينبيوتيك التي تبعت ريفاكسيمين تأثيرا إيجابيا: حيث لم يتغير متوسط عدد سلالة اللاكتوباسيلوس عن الوضع الأساسي طوال فترة التدخل، وانخ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
أنبوب BBL	NA	NA	أي علامة تجارية يمكن استخدامها
DP medium	NA	NA	أي علامة تجارية يمكن استخدامها
عبوات الجل المجمدة
ماكونكي الوسيط	NA	NA
متوسط MRS	NA	NA	أي علامة تجارية يمكن استخدامها
قارورة PBG			محلول الفوسفات، الجيلاتين، الأملاح 0.05٪ سيستين كعامل مختزل ل 02
أطباق بيتري
مزيج الدواء الوهمي	كوراجو بيوتيك-بيبي كات.	NA	نفس الخصائص الفيزيائية والحسية مثل الجل التكافلي، لكن بدون المكونات الفعالة
الكونتينر المصنوع من الستايروفوم
المزيج التكافلي	كوراجو بيوتيك-بيبي كات.	NA	منتج غير ألبان يتكون من لاكتوباسيلوس أسودوفيلوس NCMF وبيفيدوباكتيريوم إنفانتيس بي-07 (2 × 109  CFU/g)، و17.2 جرام من الإنولين الأغافي كبريبيوتيك في عبوة من 15 جراما