بروتوكول لتخصيب قطرات الدهون حسب الحجم من خلايا ظهارية الثدي والأنسجة الثديية في الأبقار

ملخص

يهدف هذا البروتوكول إلى تحقيق فصل وتعزيز قطرات الدهون حسب الحجم عبر الطرد المركزي المتسلسل، مما يتيح تحقيقا دقيقا وقابلا للتكرار في آليات أيض الدهون والعمليات البيولوجية المرتبطة بقطرات الدهون.

الملخص

يصف هذا البروتوكول نهجا تفريقيا للطرد المركزي التفريقي لإثراء قطرات الدهون (LDs) بأحجام مختلفة من خلايا ظهارة الثدييات البقرية (BMECs) وأنسجة الثدي، مما يتيح تحليلا بحجم يتجاوز طرق العزل الجماعي التقليدية لل LD. باعتبارها مراكز تنظيمية ديناميكية لاستقلاب الدهون داخل الخلايا، تؤدي LDs وظائف حيوية من خلال تخزين الدهون المحايدة (مثل الدهون الثلاثية وإسترات الكوليستيريل) وتنسيق تخليقها وتحللها ونقلها. تلعب دورا مركزيا في الحفاظ على توازن الطاقة، ودعم تكوين الأغشية، وتسهيل نقل الإشارات الخلوية. يعد استخراج LD ضروريا لدراسة الآليات التنظيمية لاستقلابية الدهون. دراسة استقلاب الدهون في الغدد الثدية لها آثار كبيرة على نمو الرضع، وصحة الإنسان، والاقتصاد الزراعي، وعلم الأحياء الخلوي الأساسية. لذلك، نحن نصف طريقة طرد مركزي تفريقي لاستخراج LDs من BMECs وأنسجة الغدد الثديية. على عكس أساليب العزل الجماعي التقليدية للولادة الكلية، يتيح هذا البروتوكول إثراء مجموعات فرعية من العزلة الطويلة بناء على الحجم من خلال تعديل القوى الطرد المركزية بشكل متسلسل. يتم تقييم سلامة وزيادة الإثراء النسبي لكسر LD بشكل مبدئي باستخدام التلوين BODIPY493/503، مما يوفر نهجا عمليا وقابلا للتكرار لتحليلات لاحقة لأيض الدهون والعمليات المرتبطة به.

المقدمة

قطرات الدهون (LDs) هي عضيات ديناميكية داخل الخلايا تعمل كمواقع تخزين أساسية للدهون المحايدة¹. يرتبط التراكم غير الطبيعي للكبد الدهني بمجموعة واسعة من الأمراض، التي تتجاوز السمنة لتشمل حالات مثل مرض الكبد الدهني²، أمراض القلب والأوعية الدموية³، السكري⁴، والسرطان⁵. وعلى العكس، فإن نقص عدد ال LDs يمكن أن يؤدي أيضا إلى عواقب وخيمة، مما يؤدي إلى فقدان احتياطيات الطاقة الخلوية وحدوث اضطرابات وظيفية لاحقة.⁶. في سياق الاقتصاد الزراعي، يمكن أن يؤدي نقص LDs في المجترات إلى إفراز غير كاف لدهون الحليب، مما يؤدي إلى انخفاض دهون الحليب، والذي بدوره يؤثر على القيمة الغذائية وقابلية تسويق منتجات الألبان⁷. حاليا، برز تنظيم أيض LD كمجال بحث مهم.

لقد كان تطوير تقنيات الاستخراج من LDs منذ القرن العشرين يهدف باستمرار إلى استخراج ال LDs بكميات أكبر، مع نقاء أعلى ونشاط بيولوجي محفوظ بشكل أفضل. يتضمن ذلك تأسيس وتحسين المنهجيات باستمرار. حاليا، صممت عدة شركات مجموعات تجارية لفصل LD⁸. على الرغم من أن هذه المجموعات تقلل كثيرا من وقت الفصل وتتطلب فقط استخدام الطرد المركزي التقليدي، إلا أن العينات التي يصعب فصلها لا يمكن تعديل الكواشف، ويصعب تحسين خطوات الاختبار. علاوة على ذلك، يلعب استخراج الكبد الدهني دورا لا غنى عنه في توضيح آليات الأمراض، بما في ذلك أمراض الأيض مثل الكبد^{الدهني 9}، والسرطان¹⁰، والأمراض التنكسية^{العصبية 11}، حيث يعمل كمسبار متعدد الأبعاد لفك رموز المسارات المرضية. يمكن أيضا تشريح تركيبات البروتين والدهون عن طريق استخراج LDs لكشف تنوع الوظائف البيولوجية ل LD¹².

تكوين دهون الحليب ليس مجرد عملية تحلل الركيزة؛ بل يمثل عملية تصنيع وتغليف الدهون المنسقة للغاية تنفذها خلايا الثدييات الظهارية. ¹³. يعتمد توليد دهون الحليب في أبقار الحلوب على آلية إفراز الغشاء القمي لهذه الخلايا: حيث تشكل الدهون الثلاثية في الشبكة الإندوبلازمية عناصر LD سيتوبلازمية، والتي تنقل بعد ذلك إلى الغشاء القمي وتفرز عبر البرعم. خلال هذه العملية، تغلف الكرات اللينية بغشاء كروي من دهون الحليب مشتق من الغشاء القمي، مما يؤدي إلى تكوين كرات دهون الحليب المستقرة^{هيكليا 14}. تعد الغدة الثديية البقرية نموذجا كلاسيكيا لدراسة الرضاعة لدى الثدييات، والآليات الأساسية التي تحكم تخليق وإفراز LD محفوظة بشدة لدى البشر¹⁵. يمكن لوضع طرق لاستخراج LDs من كل من BMECs وأنسجة الثدي أن يربط بين إنتاج المواشي وصحة الإنسان. يمكن لاحقا الاستفادة من التحليلات البروتيومية والدهنية للحليبات المستخرجة لتحسين إنتاجية الحليب وجودته، مما يضمن السلامة والأمان.

تعتمد الطريقة الحالية بشكل أساسي على خاصية الكثافة المنخفضة لل LD، والتي تسبب طفوها إلى أعلى التدرج أثناء الطرد المركزي¹⁶. يتكون إجراء الاستخلاص من ثلاث خطوات رئيسية: جمع العينات، والطرد المركزي الفائق لطفو LD، وغسل LD. يضاف السكروز (2.5 م) إلى المخزن لحماية ال LDs، ثم يتم ضبط سرعة الطرد المركزي وفقا لمتطلبات التجريب؛ عادة، يمكن إثراء الديويرات الكبيرة عند قوى أقل من 10,000 × جم، بينما تستخدم سرعات أعلى (فوق 10,000 × جم) لاستخراج الديكورات الصغيرة، حيث قد تتمزق الديكورات الأكبر تحت هذه الظروف. وأخيرا، تخضع الأقراص المستخرجة لغسلات متعددة لمنع التلوث، ويتم تقييم نقاء الاستخلاص بشكل مبدئي باستخدام تلوين BODIPY493/503.

تحقق طرق العزل التقليدية لديلان بشكل أساسي الاسترداد الجماعي لمجموعات اللانتومور اللينيوم غير المتجانسة، مما يحد من تحليل الفروق الهيكلية والوظيفية المعتمدة على الحجم. يوسع البروتوكول الحالي الأساليب القياسية من خلال تمكين الإثراء القائم على الحجم لمجموعات الديلان الدماغية من خلال الطرد المركزي التفاضلي المتسلسل، مما يسهل دراسة نمو الديمن، ودوران الجسم، وحركة الداخل الخلوي، والاستخدام التفاضلي عبر المسارات الدهنية أو الالتامية الذاتية. يحقق هذا النهج الإثراء بدلا من التنقية المطلقة، وقد يحدث تداخل جزئي بين كسور الحجم بسبب توزيعات الحجم المستمرة والخصائص الفيزيائية المشتركة.

البروتوكول

حدد حجم قطرات الدهون المستهدفة للتخصيب (الشكل 1).

1. إعداد الكاشف

1. PBS: الوزن 8 جرام NaCl، 0.2 جرام KCl، 3.58 جرام Na₂HPO‚·12H₂O، و0.24 جرام KH₂PO₄ إلى 800 مل ddH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام HCl، وامزجه جيدا، وارفع الحجم إلى 1 لتر. يخزن عند 4 °م لمدة تصل إلى سنة واحدة بعد التعقيم التلقائي.
2. السكروز (2.5 م): يزن 856 جرام من السكروز ويذيبه في 400 مل من ddH₂O. حركه جيدا حتى يذوب السكروز تماما، ثم اضبط الحجم إلى 1 لتر. استخدم المعقم للمحلول ويخزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
3. المخزن A: وزن 1.79 جرام من ترايسين وذوبه في 400 مل من ddH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 باستخدام KOH. بعد ضبط الرقم الهيدروجيني، أضف 50 مل من محلول السكروز المحضر مسبقا بوزن 2.5 م. اخلط جيدا واضبط الصوت إلى 500 مل. بعد التعقيم الداخلي، يمكن تخزين المخزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
4. المخزن B: يزن 0.95 جرام HEPES، 1.49 جرام KCl، و0.038 جرام MgCl₷6H₂O بشكل منفصل في 180 مل ddH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام KOH، وامزجه جيدا، وارفع الحجم إلى 200 مل. بعد التعقيم (الأوتوكلاف)، خزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
5. PMSF (1,000x، 0.2 م): يزن 0.175 جرام من PMSF ويذيبه في 5 مل من DMSO. تخزين التخزين محميا من الضوء عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
   ملاحظة: PMSF شديدة السمية؛ يجب اتخاذ التدابير الوقائية المناسبة. أثناء التحضير، تأكد من الحماية الكاملة من الضوء؛ من الصعب إذابة PMSF ويمكن تحويله إلى أنابيب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5 مل.

2. استخراج LDs من الخلايا

1. ثقافة BMEC
   1. استرجاع خمسة أنابيب من خلايا BMEC المجمدة من ثلاجة -80 درجة مئوية وإذابتها بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. قم بطرد المركزي بالأنابيب بقوة 250 × g لمدة 4 دقائق و30 ثانية بعد إذابة الدماغ الكاملة.
   2. تخلص من وسط الحفظ بالتجميد باستخدام الماصة، أضف 1 مل من 10٪ FBS لإعادة تعليق الخلايا، اخلط وأضف الخلايا بلطف إلى طبق زراعة خلايا بحجم 100 مم يحتوي على 6 مل من 10٪ FBS. اهز الطبق بلطف لضمان توزيع الخلايا بشكل متساو وحضن الطبق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
   3. راقب شكل الخلايا تحت المجهر وقم بإجراء الزراعة الفرعية عندما تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 80٪–90٪.
      ملاحظة: تأكد من حالة الخلية المثلى وعدد خلوي كاف قبل استخراج LD لتحسين الإنتاج وقابلية التكاثر.
   4. تخلص من وسط الزراعة الأصلي في طبق البتري باستخدام ماصة، وأضف 1 مل من زبدة الفول السوداني على طول جدار كل طبق. بعد الغسل مرتين، أضف 1 مل من التربسين إلى كل طبق وحضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و30 ثانية.
   5. راقب ما إذا كانت الخلايا مهضمة بالكامل تحت المجهر، أضف 1 مل من 10٪ FBS لإنهاء الهضم بعد اكتمال الهضم. أعد تعليق الخلايا بلطف عن طريق التقطيع، ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 2 مل، ثم قم بالطرد المركزي بقوة 250 x g لمدة 4 دقائق و30 ثانية.
   6. تخلص من المادة الفائقة وكرر الإجراءات الموضحة في الخطوة 1.2.
   7. قم بتوسيع الخلايا باستخدام حوالي 30 وعاء زراعة أو أوعية زراعة أكبر، أو استخدم أطباق زراعة أكبر لزراعة الزرعة. أضف 150 ميكرومول/لتر t10,c12-CLA (مخفف ب DMEM) لعلاج الخلايا في الليلة التي تسبق الخلج. استخدم 7 مل من وسط الزراعة لكل طبق زراعة بحجم 100 مم. يعتمد وقت الزراعة على حجم ال LD التي يجب فصلها.
      ملاحظة: استنادا إلى التحسين السابق، عالج BMECs ب t10، c12-CLA لمدة 6 ساعات لإثراء الدياني الكبير أو لمدة 12–24 ساعة لإثراء الدياني الصغير. نظرا لأن الخلايا تحتوي على عدد قليل من LDs، عادة ما تضاف الأحماض الدهنية الخارجية لتحفيز تراكم LDs. في هذه الدراسة، أضف t10,c12-CLA إلى الخلايا المزروعة لتحفيز تراكم LDs.
2. جمع عينات
   1. تخلص من الوسط الأصلي، أضف 1 مل من PBS البارد جدا واغسله ثلاث مرات. لا تتخلص من PBS أثناء الغسل النهائي. باستخدام 30 طبقا من خلايا 100 مم كمثال، اجمع الخلايا من كل 10 ألواح في أنبوب طرد مركزي واحد بسعة 15 مل، يحتوي كل أنبوب على حوالي 1×108 قطعة، مما ينتج عنه 3 أنابيب طرد مركزي.
      ملاحظة: حافظ على جميع العينات عند ≤4 درجة مئوية طوال عملية الاستخلاص لمنع تحلل البروتين في العينات الصغيرة.
   2. بعد التوازن، استخدم الطرد المركزي عند 1000 × g، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
   3. تخلص من PBS. أضف 10 مل من المخزن A المحضر مسبقا و10 ميكرولتر من PMSF (1,000x، 0.2 M) إلى أنبوب الطرد المركزي. اخلط جيدا وحضنه على الثلج لمدة 20 دقيقة.
3. تحلل الخلية والتجزئة الأولية
   1. الخلايا المعطلة باستخدام جهاز تجانس فوق صوتي من نوع المجس يعمل في دورات نابضة ب 5 ثوان تشغيلا و10 ثوان إيقاف، مما ينتج عنه زمن صوت فعال إجمالي يبلغ 10 دقائق خلال فترة 30 دقيقة. ضبط الجهاز على قدرة 40٪ (ما يعادل سعة المجس حوالي 76 ميكرومتر) باستخدام مسبار بقطر 3 مم.
      ملاحظة: احتفظ بالعينات في الثلاجة طوال العملية لمنع ارتفاع درجة الحرارة.
   2. قم بطرد المركزي بالتجانس عند 3000 × جرام و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة النوى والحطام الخلوي. اجمع المادة الفائقة كفائقة ما بعد النووية (PNS).
4. الطرد المركزي الفائق للبقايا العائمة
   1. قم بترشيح المادة الفائقة عبر مصفاة خلوية بحجم 100 ميكرومتر.
   2. اقطع 10 مل من PNS في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل. أضف 2 مل من السكروز (2.5 م) و2 مل من المخزن B بشكل متسلسل إلى أعلى جهاز التخزين الخامي (يمكن تقليل حجم السكروز بشكل مناسب مع زيادة حجم المخزن B لتعزيز نقاء LD)، ثم استخدام الطرد المركزي لأول مرة (5000 × جم، 4 درجات مئوية، 20 دقيقة).
   3. بعد الطرد المركزي، اجمع طبقة LD الحليبية الشبيهة بالكريمة في أعلى الأنبوب. لجمع الميكرو ليستريفيج، أضف أولا 100 ميكرولتر من المخزن B إلى أنبوب ميكرو طرد مركزي بسعة 1.5 مل، ثم استخدم ماصة بسعة 20 ميكرولتر لاستنشاق طبقة LD العائمة بلطف عدة مرات، وجمع أكبر عدد ممكن من الطبقة الدقيقة العائمة.
      ملاحظة: تشكل ال LD طبقة كريمة عائمة في الأعلى؛ تجنب استنشاق المحلول الأساسي قدر الإمكان لمنع التلوث.
   4. قم بإجراء طرد مركزي ثان (10,000 × g، 4 °C، 30 دقيقة) وجمع ال LDs.
   5. انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي فائق متوافق مع دوار دلو متأرجح، ثم أغلقه، ووازن الأنابيب. قم بإجراء الطرد المركزي الثالث في جهاز طرد مركزي فوق فائق (50,000 × g، 4 °C، 40 دقيقة) وجمع ال LDs.
      ملاحظة: قم بموازنة الأنابيب بدقة (حتى 0.0001 جم) لضمان تشغيل الطرد المركزي الخارق بشكل آمن.
   6. بعد التوازن، قم بإجراء الطرد المركزي الرابع (150,000 × g، 4 °C، 50 دقيقة) لمواصلة جمع LDs. تحسين السرعة ومدة الطرد المركزي وفقا لحجم LD المستهدف.
      ملاحظة: الطرد المركزي عالي السرعة المطول أو المتكرر قد يسبب اضطرابات الصدمة. على النقيض من ذلك، يقوم الطرد المركزي قصير المدة عند 10,000 x g أثناء الغسيل بشكل أساسي بإزالة الشوائب وله تأثير ضئيل على سلامة LD. هذه الطريقة قابلة للتكيف؛ قد يكون هناك حاجة إلى تحسين لأنواع الخلايا أو الأنسجة المختلفة.
5. غسل الأقراص الطويلة
   1. أعد تعليق ال LDs المجمعة في المخزن البارد B والطرد المركزي عند 10,000 x g و4 °C لمدة 5 دقائق.
   2. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية وكرر خطوة الغسيل أربع مرات على الأقل باستخدام نفس حجم المخزن وقوة الطرد المركزي ووقت الطرد المركزي. بالنسبة للصلب الصغير، زد القوة الطرد المركزية حسب الحاجة لضمان فصل فعال.
   3. بعد الغسل النهائي، قم بتجميع كسور LD، وامزج برفق، وخزن عند −80 درجة مئوية.
      ملاحظة: لا تتجاهل خطوات الغسيل، حتى وإن كان فقدان ال LD حتميا. استمر في الغسل حتى لا يبقى أي بقايا غشائية مرئية.

3. استخراج LDs من الأنسجة

1. جمع عينات
   1. استرجاع عينات من أنسجة الثدييات البقرية من النيتروجين السائل. زن 5 جرام من النسيج واذيبها على الثلج حتى لا يبقى بلورات ثلج.
   2. شطف الأنسجة ب PBS أو محلول ملحي فسيولوجي.
   3. قم بتقطيع النسيج إلى قطع بحجم 1-2 مم باستخدام مقص جراحي.
   4. انقل النسيج المفروم إلى هاون مبرد مسبقا يحتوي على 12 مل من Buffer A و10 ميكرولتر من PMSF (1,000x، 0.2 M). اطحن الخليط على الثلج لمدة تقارب 10 دقائق.
   5. حضن الخليط المتجانس على الثلج لمدة 20 دقيقة.
   6. بعد الطحن الشامل، اجمع التجانس في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل.
   7. الطرد المركزي عند 2,500 × جم، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. الفائق الناتج هو PNS.
2. الطرد المركزي الفائق للبقايا العائمة
   1. قم بترشيح المادة الفائقة عبر مصفاة خلوية بحجم 100 ميكرومتر.
   2. اقطع 10 مل من PNS في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل. أضف 2 مل من السكروز و2 مل من محلول المخزن B بشكل متتالي. قم بإجراء أول عملية طرد مركزي (4000 × g، 4 °C، 20 دقيقة). اجمع المادة الحليبية التي تشبه الكريمة.
   3. قم بإجراء عملية طرد مركزية ثانية (7,000 × g، 4 °C، 30 دقيقة) وجمع الأشعة الطولية.
   4. قم بإجراء عملية طرد مركزي ثالثة (10,000 × g، 4 °C، 40 دقيقة) وجمع ال LDs.
   5. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب SW40 وقم بإجراء الطرد المركزي فوق الفائق (50,000 × g، 4 °C، 50 دقيقة). اجمع الرموز الصغيرة.
   6. قم بإجراء طرد مركزي خامس (100,000 × g، 4 °C، 60 دقيقة). اجمع الرموز الصغيرة.
3. غسل الأقراص الطويلة
   راجع طريقة الغسيل للاستخلاص الخلوي (LDs) المستخرجة من الخلايا.

4. التحقق الأولي لنقاء LD عن طريق التلوين

1. حضر محلول صبغة فلورية دهنية محايدة بسعة 10 ميكروغرام/مل مسبقا تحت ظروف محمية من الضوء (BODIPY: المخزن B = 1:100، V/V).
2. أضف كمية مناسبة من الميكرو لاينتريفوج وبافر B المختلط إلى أنبوب الطرد المركزي المجهري. في ظروف محمية من الضوء، أضف كمية مناسبة من محلول صبغة الفلورسنت الدهني المحايد. اخلط جيدا واحتضن لمدة 10 دقائق.
3. حضر شريحة مجهر نظيفة. قم بتوزيع 2.5 ميكرولتر من الخليط على غطاء الغطاء. ضع السلايد برفق فوق الخليط، مع تجنب فقاعات الهواء. راقب تحت مجهر فلوري مقلوب.

5. التحقق من نقاء LD بواسطة البقعة الغربية

1. تم قياس تركيز البروتين في كسور LD باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA.
2. لتحليل البقعة الغربية، اخلط 20 ميكروغرام من البروتين من كل عينة مع 5x من حاجز التحميل SDS وسخنه عند 99 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لضمان إزالة الطلاء الكامل.
3. ثم فصل البروتينات بواسطة SDS–PAGE على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪ حسب أوزانها الجزيئية.
4. بعد الرحلان الكهربائي، انقل البروتينات إلى أغشية PVDF مفعلة مسبقا، ثم قم بحجبها بنسبة 5٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة. بعد ذلك، يتم حضن الأغشية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية، بما في ذلك مضاد الأرنب المضاد لبيريبين 2 (1:500) ومضاد β الأكتين للأرانب (1:5000).
5. اغسل الأغشية ثلاث مرات مع 1x TBST لمدة 10 دقائق لكل منها، ثم حضن الأغشية باستخدام الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب المكون ب HRP (1:5000) لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
6. بعد ثلاث غسلات إضافية باستخدام TBST، اكتشف أشرطة البروتين باستخدام مجموعة الإضاءة الكيميائية المعززة (ECL) ويمكنك الرؤية بنظام تصوير هلامي.

6. نقاط التوقف وإرشادات التخزين

1. حافظ على جهاز PNS في الثلاجة لمدة تصل إلى ساعة إلى ساعتين قبل التنظيف فوق الطرد المركزي.
2. احتفظ بأحلام LD المجمعة على الثلاجة لمدة تصل إلى ساعة إلى ساعتين قبل الغسيل. للتخزين قصير المدى، قم بتخزين النوافذ على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. للتخزين طويل الأمد، تخزين LDs عند −80 درجة مئوية وقلل من دورات التجميد-الذوبان إلى دورة واحدة لا تزيد عن دورة واحدة للحفاظ على سلامة LD.
3. خلال جميع فترات التوقف التجريبي، احتفظ بالعينات على الثلج مع إغلاق أغطية الأنابيب لتقليل التلوث.

7. استكشاف الأخطاء

1. طبقة عائمة رقيقة: اضبط حجم المخزن أو قوة الطرد المركزي.
2. ضعف الطفو: زيادة سرعة الطرد المركزي أو تمديد الوقت.
3. التلوث: تأكد من التعامل المعقم مع القطع المخازن والمفلترة.
4. تمزق LD: أبق العينات على الثلج، قلل قوة الطرد المركزي، أو أعد تعليقها بلطف.

النتائج

سير العمل والإطار المنهجي
تم إنشاء مخطط شجرة القرار (الشكل 1) لتوجيه اختيار شروط الطرد المركزي وفقا للأهداف التجريبية. تحديدا، استخدمت قوى الطرد المركزي ≤10,000 × g لإثراء الديناتورات الدقيقة الكبيرة (≥2 ميكرومتر)، بينما تم تطبيق قوى >10,000 x g لإثراء الديناتورات الصغيرة (<1 ميكرومتر). يوفر هذا الإطار أساسا عمليا لتحقيق فصل LD بناء على الحجم. يتم توضيح سير العمل العام لعزل LD من BMECs وأنسجة الثدي في

المناقشة

ال LDs هي عضيات فريدة تتميز بنواة دهنية محايدة محاطة بطبقة أحادية من الفوسفوليبيد. تنمو من الشبكة الإندوبلازمية وتغير حجمها وعددها ديناميكيا، مما يسهل النقل داخل الخلايا والتواصل الواسع مع هياكل تحت الخلية الأخرى لتنسيق توازن الدهون الخلوي 17,18,19. يتم تعديل هذا السلوك الديناميكي بشكل أكبر بواسطة الإشارات الأيضية الجهازية، حيث ثبت أن الأنسولين ينسق التفاعل الأيضي بين الجلوكوز والدهون، مما يؤثر ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.25٪ trypsin-EDTA	جيبكو	25200072	الواشف
مجموعات تحضير سريع جل 10٪ من PAGE	بيومان بكين	PG112	الواشف
100 μ مصفاة خلية M	بيوتايم	FSTR100	الواشف
طبق زراعة الخلايا بحجم 100 مم	كورنينغ	490167	الواشف
أمرشام إيميجر 600	علوم الحياة في GE للرعاية الصحية	600	المعدات
الأوتوكلاف	باناسونيك	MLS-3751L	المعدات
مجموعة اختبار بروتين BCA	دينغقو بكين.	BCA01	الواشف
بوديبي 493/503	إنفيتروجين	D3922	الواشف
الطرد المركزي	إبندورف		المعدات
DMEM	هايكلون	SH30022.01	الواشف
DMSO	سولاربيولوجيا	D8370	الواشف
مصل الأبقار الجنيني	جيبكو	2492319	الواشف
هيبس	ميدكيم إكسبريس	HY-D0857	الواشف
الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب من AffiniPure الماعز المرافق ب HRP	بروتين تك	SA00001-2	الواشف
KCl	هوشي	20030666	الواشف
KH2PO4	هوشي	10017608	الواشف
MgCl2	هوشي	20059028	الواشف
Na2HPO4· 12H2O	هوشي	S112623	الواشف
NaCl	هوشي	10019328	الواشف
مخزن تحميل البروتين الفوري Omni-Easy	شنغهاي إبيزيم للتكنولوجيا الطبية الحيوية	LT101S	الواشف
مجموعة كشف التلميع الكيميائي فائقة الحساسية من Omni-ECL	شنغهاي إبيزيم للتكنولوجيا الطبية الحيوية	SQ201	الواشف
PBS	هايكلون	SH30256.01	الواشف
البنسلين والبنسيلين ستريبتوميسين 100&00؛	NCM Biotech	CLOOC5	الواشف
مقياس الرقم الهيدروجيني	ميتلر توليدو	S220K	المعدات
بيبيتي	إبندورف		المعدات
PMSF	كولابر	CP8651	الواشف
مجموعة نقل الغشاء PVDF	GenScript	eBlot L1	الواشف
رابيت أنتي-بيريبين 2	أبكام	15294-1-AP	الواشف
الأرنب مضاد للأكتين وبيتا	بروتين تك	20536-1-AP	الواشف
مجهر فلوري مقلوب بدرجة بحثية	أوليمبوس	IX73	المعدات
سكروز	سولاربيولوجيا	S8271	الواشف
دوار SW 40 Ti	بيكمان كولتر	331301	المعدات
ترانس-10، حمض اللينوليك المترافق، سيس-12	كايمان	90145	الواشف
ترايسين	كولابر	CT11331	الواشف
الطرد المركزي فوق الفائق	بيكمان كولتر	أوبتيما XE-100	المعدات
كسارة الخلايا بالموجات فوق الصوتية	SCIENTZ	JY92-11N	المعدات