مقالة منهجية

لاكتلة الليسين الخاصة بالموقع عبر توسع الشيفرة الجينية في الإشريكية القولونية وخلايا الثدييات

DOI:

10.3791/70209

⸱

فبراير 24, 2026

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology Center for Chinese Medicine, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أسست هذه الدراسة طريقة تستخدم توسع الشيفرة الجينية لدمج اللاكتيل-ليسين (Klac) بنجاح في مواقع محددة من الإنولاز-1 البشري (hENO1) والسوبرفولد GFP (sfGFP) في الخلايا الإشريكية القولونية والثدييات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اللاكتلة هي تعديل ما بعد الترجمة (PTM) تم اكتشافها حديثا ذات وظائف بيولوجية متنوعة. منذ التعرف الأولي على الزراعة في عام 2019 كمنظم لاستقطاب البلاعميات، برزت لاكتلة الهيستون كحلقة محورية تربط الأيض الخلوي بالتنظيم الوظيفي. كيميائيا حيويا، يتضمن النقل التساهمي لمجموعة اللاكتيل إلى بقايا الليسين، إما بواسطة اللاكتيل ترانسفيراز باستخدام لاكتيل-CoA كمانح للأسييل أو بواسطة سنثيتازات أمينوأسيل-ترنا (AARSs) عبر وسيط لاكتيل-AMP. من خلال هذه الآليات، ترتبط مستويات اللاكتات داخل الخلايا مباشرة بتعديل البروتين ووظيفته. تتوسط عملية اللاكتلة مجموعة من العمليات الخلوية الحيوية، بدءا من الوظائف الفسيولوجية مثل تنظيم الجينات، وإصلاح الحمض النووي، وإعادة برمجة الأيض، وتعديل المناعة، وصولا إلى العمليات المرضية مثل تقدم الورم وانتشاره. على الرغم من تحديد العديد من مواقع اللقطلة بواسطة البروتينيات، لا يزال تحقيق لاكتلة الليسين الخاصة بالموقع من خلال الطفرات تحديا. لمعالجة ذلك، نستخدم تقنية توسيع الشيفرة الوراثية، باستخدام إنزيم تصنيع أمينوأسيل tRNA خاص باللاكتيل ليسين (KlacRS) وtRNA المرتبط به لدمج اللاكتيل-ليسين (Klac) بدقة في البقايا المحددة. تمكن هذه الاستراتيجية من توليد متغيرات بروتينية متجانسة لإجراء دراسات وظيفية مباشرة. هنا، نصف بروتوكولا مبسطا لعلاج البروتين الخاص بالموقع، تم التحقق منه في كل من الإشريكية القولونية (E. coli) وخلايا الثدييات، باستخدام الإينولاز-1 البشري (hENO1) ونظام المعالجة السوبرفولد GFP (sfGFP) كأنظمة نموذجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لاكتلة الليسين (Klac)، التي تم تحديدها أصلا على الهيستونات، ظهرت كعقدة رئيسية تربط بين استقلاب الورم الشاذ والتنظيم اللاجيني1. يوفر تراكم اللاكتات الناتج عن تحلل السكر الهوائي المعزز في خلايا الورم أساسا أيضيا لللاكتيلية، مما يمكن اللاكتات من العمل ليس فقط كمنتج أيضي ثانوي بل كجزيء إشارة ينظم وظيفة البروتين مباشرة. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الاكتلة تشارك بشكل واسع في بدء وتطور الورم من خلال تنسيق تكاثر خلايا السرطان 2,3,4,5، والنقائل6، وإعادة البرمجة الأيضية 7، والمقاومة العلاجية 8,9.

على المستوى الظاهري، يرتبط ارتفاع اللاكتلة ارتباطا وثيقا بزيادة عدوانية الأورام. على سبيل المثال، في سرطان الخلايا الكلوية الشفافة (ccRCC)، يعزز لاكتلة H3K18 التكاثر والانتشار من خلال زيادة تنظيم مستقبل عامل النمو المستخرج من الصفائح الدموية β(PDGFRβ)، مما يخلق حلقة تغذية راجعة إيجابية بين تراكم اللاكتات والإشارات المسرحية10. وبالمثل، في سرطان القولون والمستقيم (CRC)، يؤدي ارتفاع لاكتلة H3K18 إلى دفع تقدم الورم عبر تحسين نسخ معزز الالتهام الذاتي الشبيه بالروبيكون (RUBCNL)، مما يعزز نضج الابتلام الذاتي ويدعم بقاء خلايا السرطان11.

بعيدا عن التأثيرات المباشرة على عدوانية الأورام، تتوسط عملية اللاكتلة أيضا إعادة برمجة أيض الورم من خلال تعديل تعبير ونشاط الجينات المرتبطة بالتمثيل الغذائي7. في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، يقلل لاكتلة الهيستون من تنظيم الإنزيمات المرتبطة بالتحلل الجليكولي بينما يرفع من إنزيمات دورة حمض التريكربوكسيليك (TCA)، مما يعزز امتصاص جلوكوز الخلايا الورمية ويزيد من اضطراب الأيض12. بشكل مستمر، يكشف التحليل العام لللاكتيلية أن اللاكتيلة تستهدف بشكل مفضل الإنزيمات المشاركة في المسارات الأيضية المركزية، بما في ذلك استقلاب، دورة TCA، استقلابية الأحماض الأمينية/الأحماض الدهنية، وهذه التعديلات ترتبط ارتباطا وثيقا بأنماط الأورام العدوانية7.

ومن المهم أن العواقب البيولوجية لللاكتلة تعتمد بشكل كبير على الموقع، وقد برز هذا التعديل كعامل رئيسي في مقاومة الأورام العلاجية. في CRC، يعزز لاكتيليشن K673 لإعادة التركيب الاختزالي 11 (MRE11) إصلاح إعادة التركيب المتماثل (HR)، مما يمنح مقاومة للعلاج الكيميائي ومثبطات البوليميراز (ADP-ريبوز)13. في الورم الأرومي الدبقي (GBM)، يؤدي التفاعل بين عضو عائلة ديهيدروجيناز الألديهيد 1 A3 (ALDH1A3) وكيناز البيروفات M2 (PKM2) إلى زيادة إنتاج اللاكتات، مما يؤدي لاحقا إلى تحفيز لاكتلة K247 لبروتين مكمل متقاطع لإصلاح الأشعة السينية 1 (XRCC1) لتعزيز إصلاح تلف الحمض النووي، مما يدفع مقاومة الإشعاع ومقاومة التيموزولوميد (TMZ) الكيميائية14. تسلط هذه الدراسات الضوء مجتمعة على أن التحكم الدقيق في اللاكتلة عند بقايا الليسين المحددة ضروري للتشريح الآلي والاستهداف العلاجي.

كشفت التطورات في مطيافية الكتلة عالية الدقة عن انتشار لاكتلة عبر الإنزيمات الأيضية، وعوامل النسخ ومحولات الإشارات، مما يبرز دوره الواسع في التحكم في الأيض، ونقل الإشارات، وفسيولوجيا الخلايا 15,16,17,18. حتى الآن، تم الإبلاغ عن عدة إنزيمات كاتبة تحفز لاكتلة اللاكتلة - على سبيل المثال، AARS1 يتوسط لاكتلة p53 لتعزيز تكوين العضلات19، وAARS1/2 ينظم لاكتلة cGAS لقمع المناعة الفطرية - ومع ذلك فإن هذه الإنزيمات انتقائية للركيزة ولا يمكنها حاليا تحقيق لاكتلة محددة الموقع بالكامل على أي بروتينات20. لذا، لا يزال المجال يواجه تحديا في كيفية التلاعب بكلاك بطريقة موجهة لأغراض بحثية أو علاجية.

لا تزال الدراسات الوظيفية تعتمد بشكل رئيسي على الطفرات الموجهة للموقع—عادة ما تستبدل الليسين (K) بالجلوتامين (Q) لمحاكاة الحالة غير المشحونة لتعديلات الأسيل-ليسين مثل الأسيتلة أو اللاكتلة 21,22,23,24. ومع ذلك، فإن هذا النهج له قيود كبيرة في إعادة صياغة اللاكتيل الأصلية بدقة: فالبنية الكيميائية وهندسة السلسلة الجانبية للجلوتامين تختلف عن تلك الموجودة في الليسين اللاكتيلي، والأهم من ذلك أن استبدال K إلى Q لا يمكنه التمييز بين الحالات الأسيتلة والحالة اللاكتيلية عندما يحدث كلا التعديلين في نفس الموقع.

يوفر توسع الشيفرة الجينية (GCE) حلا قويا لهذه القيود من خلال تمكين دمج الأحماض الأمينية غير التقليدية مباشرة في البروتينات في مواقع محددة. من خلال فحص إيجابي لمكتبة طفرات من نوع Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase (MmPylRS)، حددنا سابقا متحولا يظهر نموا معتمدا على Klac. هذا الطفر، الذي يحمل طفرات L301M، Y306L، L309A، وC348F، تم تسميته KlacRS125,26. يقوم KlacRS1 بتحويل tRNA المتعامد المتجانس مع Klac، ويقلل من كودون التوقف الكهرماني، ويتيح دمج Klac بشكل فعال ومحدد الموقع في البروتينات المستهدفة. بالإضافة إلى KlacRS1، تم الإبلاغ عن عدة نسخ أخرى من aaRS قادرة على دمج Klac، بما في ذلك LacKRS المشتق من MbPylRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) وLacKRS3 (Y271M/C313S)19,27، بالإضافة إلى LacKRS مشتق من MmPylRS (C348T/Y384F)28. معا، تؤسس هذه الأدوات مجموعة أدوات جينية متعددة الاستخدامات لإنتاج متغيرات بروتينية مقطعة لاكتيلية محددة الموقع لفهم العواقب البيولوجية لأحداث اللاكتيلة الفردية.

في دراساتنا السابقة، طبقنا هذا النظام القائم على GCE للتعبير عن بروتينات ALDOA التي تحمل لاكتلة محددة الموقع عند Lys147 في كل من الإشريكية القولونية وخلايا الثدييات. أظهرت التحليلات الوظيفية أن اللاكتلة في Lys147 تؤثر على التغذية الراجعة السلبية على التحلل السكري، وتعزز الاستقرار الحراري والكيميائي ل ALDOA، وتعزز انتقالها من السيتوبلازم إلى النواة. لم تكشف هذه النتائج فقط عن آلية تنظيمية لم تكن معترف بها سابقا ل ALDOA، بل أكدت أيضا متانة ومرونة وفائدة عملية لهذه المنصة الخاصة بالموقع25,26. استنادا إلى هذا الأساس، نستخدم هنا الإينولاز-1 البشري (hENO1) ومؤشر الغلاف الفائق (sfGFP) كأمثلة تمثيلية لوصف استراتيجية مبسطة لدمج Klac بدقة باستخدام نظام KlacRS/tRNA المتعامد لدينا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. طفرات الكودون التوقف الكهرماني لترميز اللاكتييليسين في الجين المستهدف

  1. إدخال كودون توقف كهرماني من نوع TAG عند الموضع 89 من جين hENO1 والموضع 149 من جينsGFP عبر الطفرات الموجهة الموقع وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، تنقية منتج PCR، وإجراء إعادة تركيب متماثلة. استخدم البادئات التالية:
    ENO1-K89TAG-F CACAGACAGAGtagATTGACAAACTGATGATCGAG
    ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTTCTGTGACGTCAGTTTTTG
    sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATCACCGCCGACAAGC
    sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTACTCCAGC
    ملاحظة: لدمج الليسين اللاكتيلي الخاص بكل موقع، يجب أن يتحول الموقع المستهدف إلى كودون توقف كهرماني (TAG)، أو كودونات غير منطقية أخرى، ويجب استخدام TAA أو TGA ككودون توقف حقيقي.
  2. قم بإذابة الخلايا المؤهلة DH5α على الثلج، وامزج 5 ميكرولتر من منتج إعادة التركيب مع 50 ميكرولتر من الخلايا، وحضن على الجليد لمدة 30 دقيقة. تعرض الخليط لصدمة حرارية لمدة 45 ثانية عند 42 درجة مئوية، ثم ضعه على الثلج لمدة 2-3 دقائق. أضف 350 ميكرولتر من الوسط الخفيف وحضن الحوض عند 37 درجة مئوية مع هز (220 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة واحدة.
  3. انشر الخلايا على صفيحة LB محمية مسبقا تحتوي على الأمبيسيلين وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة. اختر مستعمرتين منفردتين لتسلسل سانجر لتأكيد الطفرة.

2. تعبير البروتين اللاكتيلي في خلايا الإشريكية القولونية

  1. التحويل المشترك 50 ميكرولتر من خلايا DH10B المؤهلة كيميائيا بحجم 50 ميكرولتر من الإشريكية القولونية مع حوالي 100 نانوغرام لكل من pBad-ENO1-K89TAG، الذي يشفر الجين المستهدف، وpEvol-MmKlacRS1 (بلازميد Addgene # 232157)، الذي يشفر زوج KlacRS و tRNA.
  2. حضن الخليط على الثلج لمدة 25 دقيقة، واستخدم الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، ثم أعد إلى الثلج لمدة 3 دقائق. أضف 350 ميكرولتر من وسط LB بدرجة حرارة الغرفة، وهز بقوة عند 220 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
  3. انشر مزرعة الخلية على LB/لوحة مدعومة ب 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسيلين (أمبير 100) و50 ميكروغرام/مل من الكلورامفينيكول (50 سم). حضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  4. اختر مستعمرة واحدة لتطعيم زراعة بداية بحجم 4 مل واحتضنها طوال الليل. في اليوم التالي، قم بتوسيع الزراعة الليوية إلى 400 مل من LB/Amp100Cm50 ثم اهتز عند 220 دورة في الدقيقة و37 درجة مئوية بقوة حتى يصل OD 600 إلى 0.6-0.8.
  5. تحفز ب 0.2٪ L-أرابينوز و1 ملي مولار Klac؛ الحضانة عند 30 درجة مئوية، 220 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة إضافية.

3. الترميز الجيني للاكتيليزين في خلايا HEK 293T

  1. خلايا البذور في صفائح مكونة من 12 بئر بكثافة 1 × 10خلايا لكل بئر مع 1 مل من وسط DMEM. بعد 24 ساعة من الحضانة، عندما يصل التقاء الخلايا إلى 70٪-80٪، قم بإجراء النقل الخلوي.
    ملاحظة: يوصى بالتقاء بين 70٪-80٪ للنقل، بينما تتطلب اختبارات تكوين المستعمرات كثافات بذر أقل، ويجب تحديد ذلك تجريبيا.
  2. لتحضير محلول DNA مخفف، أضف 0.75 ميكروغرام من pcDNA-sfGFP-N149TAG وpNeu-KlacRS (بلازميد Addgene # 232155) بنسبة 1:1 إلى 38 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل مع مستوى عالي من السكر. استخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل أو الدوامة لفترة قصيرة للخلط.
  3. لتحضير كاشف التحويل المخفف، أضف 2.25 ميكرولتر من كاشف النقل إلى 38 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل مع مستوى عالي الجلوكوز. استخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل 3 إلى 4 مرات للخلط.
    ملاحظة: ما إذا كان يمكن استخدام أوبتي-مم يعتمد على تعليمات الشركة المصنعة، حيث قد يتداخل محتوى المصل مع كفاءة النقل الكهربائي.
  4. أضف مادة التحويل المخفف فورا إلى محلول الحمض النووي المخفف دفعة واحدة.
    ملاحظة: لا تخلط المحاليل بترتيب عكسي.
  5. قم فورا بعمل الماصة للأعلى والأسفل 3x-4x أو دوامة لفترة وجيزة للخلط. حضن لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوين مركبات النقل والحمض النووي.
    ملاحظة: يجب استخدام مركب النقل/الحمض النووي خلال 20 دقيقة من التحضير.
  6. أضف خليط 50 ميكرولتر التحويلي/الحمض النووي قطرة على الوسط في كل بئر وتوحيد الخليط عن طريق تدوير اللوحة بلطف.
  7. بعد 6 ساعات من النقل، استبدل الوسط ب DMEM طازج يحتوي على 1 مللي مولار كللاك. الزراعة لمدة 24-48 ساعة.
    ملاحظة: استنادا إلى بياناتنا السابقة، لم يظهر Klac بتركيزات 1-5 ملليمولار أي تأثيرات سامة على الخلايا26. يجب تحسين تركيز Klac العامل بناء على مستوى تعبير البروتين. إذا كان البروتين المستهدف عرضة لفقدان تعديل اللاكتلة، ينصح بإعطاء مثبطات HDAC (مثل تريكوستاتين A) أو مثبط السيرتوين، NAM (نيكوتيناميد).

4. تنقية البروتين اللاكتيلي بالعلامة الخاصة ب His-tag في خلايا الإشريكية القولونية

  1. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 6,900 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليقها في 50 مل من محلول التحلل (20 ملليمولايت ثلاثي الهيدروجين، رقم الهيدروجينيوم 8.0، 200 ملليمويل NaCl). الليزر بالموجات فوق الصوتية على الجليد لمدة 3 ثوان، و8 ثوان على 200 واط لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي عند 13,800 × g، 4 °C لمدة 30 دقيقة ثم جمع السوبرناتانت.
    ملاحظة: إذا كان البروتين المستهدف عرضة للقص الميكانيكي، يمكن استبدال خطوة الموجات فوق الصوتية بتحلل خلوي لطيف باستخدام مادة استخلاص بروتينية مصممة مناسبة للإشريكية القولونية.
  2. قم بترشيح المادة الفائقة عبر غشاء بحجم 0.45 ميكرومتر لجمع الكسور القابلة للذوبان. قم بتحميل الليزاتات المصفية على عمود جاذبية Ni-NTA بحجم 1 مل. الغسل بحوالي 5 مل من العزل A (20 ملليمول ثلاثي HCl، درجة حموضة 8.0، 200 ملليمول NaCl,
    5 ملليموتر إيميدازول) حتى لا يعثر على بروتين قابل للكشف في المشروب المائل. قم بسحب البروتين ب 1 مل من محلول B (20 ملمولار تريس-HCl، درجة حموضة 8.0، 200 ملليمولار NaCl، 200 ملليمول إيميدازول) لمدة 5 أضعاف. احفظ جميع الكسور. تحقق من وجود بروتين مائل باستخدام اختبار برادفورد السريع.
  3. ادمج كسور البروتين المنقى وقم بتبادل المخزن إلى مخزن التخزين (20 ملليموتر Tris-HCl، pH 8.0، 150 ملليمولار NaCl). أليكوت البروتينات المركزة في 50 ميكرولتر في كل أنبوب، ثم تجميد فلاش، وخزنها عند -80 درجة مئوية للتحليل التالي.

5. التوصيف الكيميائي الحيوي للبروتين المدمج باللاكتيلات

  1. SDS-PAGE و Western Blotting
    1. افصل البروتين بواسطة SDS-PAGE (90 فولت لمدة 20 دقيقة، ثم 150 فولت لمدة 50 دقيقة). صبغ الجل ب Coomassie Blue، سخن لمدة 15 ثانية في الميكروويف، ثم قم بإزالة الصبغ بمحلول إزالة اللون (40٪ إيثانول مطلق، 10٪ حمض الخليك الجليدي، و50٪ ماء منزوع الأيون) على جهاز هزاز (50 دورة في الدقيقة، 15 دقيقة). كرر خطوة إزالة الصبغ حتى تصبح أشرطة البروتين واضحة للرؤية.
    2. فعل غشاء PVDF في الميثانول لمدة دقيقة واحدة. قم بتجميع مجموعة النقل بالترتيب: إسفنجة، ورق فلتر، جل، غشاء، ورق فلتر، إسفنجة. نفذ النقل عند 250 مللي أمبير لمدة ساعة واحدة في مخزن مبرد مسبقا. سد الغشاء بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ لمدة 1.5 ساعة، ثم اغسله 3 مرات باستخدام TBST (10 دقائق لكل مرة).
    3. حضانة الأجسام المضادة الأولية (مضاد له 1:10,000؛ مضاد ل-لاكتيل ليسين 1:1,000) عند 4 درجات مئوية خلال الليل. اغسل ثلاث مرات باستخدام TBST.
      ملاحظة: يجب تحديد نسب التخفيف المثلى تجريبيا للأجسام المضادة التي يتم الحصول عليها من مصادر تجارية مختلفة.
    4. حضن الأجسام المضادة الثانوية للأرنب (1:10,000) لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل ثلاث مرات باستخدام TBST. الصورة باستخدام التلويض الكيميائي وحفظ البيانات في مختبر الصورة.
  2. تحليلات مطيافية الكتلة
    1. لتحليل الكتلة السليمة، يتم تخفيف البروتينات إلى تركيز نهائي 0.1 ميكروغرام/ميكرولتر مع ماء يحتوي على 0.1٪ حمض الفورميك (FA) ثم خضعها لنظام كروماتوغرافيا سائل فائق الأداء (UPLC). تكونت المرحلة المتحركة من مذيب A (0.1٪ FA في الماء) ومذيب B (أسيتونيتريل ACN) بمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة.
    2. قس الأوزان الجزيئية ل hENO1-89Klac باستخدام مطياف الكتلة رباعي القطب عالي الدقة مع ضبط نطاق m/z بين 300-2000. جمع ومعالجة جميع البيانات باستخدام برنامج MassLynx.
    3. لتحليل البروتين، يتم تحليل محللات الخلايا المهضومة كما هو موضح سابقا، باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل بتدفق نانوي مقترن بمطياف كتلة ثلاثي الدقة عالي الدقة مزود بمحلل. تكونت المرحلة المتحركة من مذيب A (0.1٪ فولة أ في الماء) ومذيب B (ACN/ماء، 8:2، فولت/فولت) بمعدل تدفق 300 نانولتر/دقيقة.
    4. ببتيدات منفصلة على عمود شعيرات C18 معكوس الطور (75 ميكرومتر × 250 مم) مع تدرج 90 دقيقة: 3٪-8٪ B (0-5 دقائق)، 8٪-28٪ B (5-60 دقيقة)، 28٪-38٪ B (60-75 دقيقة)، 38٪-100٪ B (75-80 دقيقة)، و100٪ B (80-90 دقيقة). احصل على طيف MS1 على m/z 350-1800 بدقة 120,000 وهدف AGC 4e5. توليد طيف MS2 عن طريق تجزئة تفكك تصادم عالي الطاقة (HCD) (طاقة تصادم = 32٪)، مع كتلة أولى m/z 110، ودقة 30,000، وهدف AGC 5e4.
  3. تحليل قياس التدفق الخلوي
    1. اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن PBS مبرد مسبقا، ثم اغسل الطرد المركزي بقوة 1,380 مرة جرام لمدة 3 دقائق بعد كل غسل. أعد تعليق الحبيبات الخلوية التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي في 500 ميكرولتر من مخزن PBS واستخدم الماصة بلطف لخلطها. قم بترشيح تعليق الخلية عبر شاش معقم مكون من 300 شبكة، واجمع الترشيح في أنبوب قياس خلوي تدفق لتقليل التداخل من تجمعات الخلايا أثناء الكشف. تحليل العينة المحضرة باستخدام مقياس تدفق خلوي مزود بليزر مزدوج، مع إثارة عند 405 نانومتر وكشف عند 488 نانومتر لإشارات الفلورة المقابلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا أولا بتقييم خصوصية دمج Klac في البروتينات في الإشريكية القولونية. تم تصميم جين الإنولاز البشري 1 (hENO1) ليحتوي على كودون توقف كهرماني عند بقايا K89 (hENO1-89TAG)، وقد تم التعبير عن هذا التركيب بالتزامن مع KlacRS المتعامد وزوج tRNA المتجانس له في الإشريكية القولونية. في غياب تكميلات 1 مللي مليول كللاك، لم يتم اكتشاف hENO1 بطول كامل؛ وعلى النقيض من ذلك، عندما أضيف 1 مللي مولار Klac إلى وسط النمو، تم إنتاج hENO1 الكامل يحتوي على Klac عند الموقع 89 (hENO1-89Klac) بعائد ~1.2 ملغ/لتر (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نصف استراتيجية لدمج Klac في البروتينات في كل من الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة. من خلال إدخال كودون توقف كهرماني في الموقع المطلوب للجين المستهدف والتعبير عنه مع زوج KlacRS/tRNA المتعامد في الخلايا المضيفة، يمكن دمج اللاكتيل ليسين الأصلي بدقة في البروتينات في الخلايا الحية، مما يوفر أداة قوية لاستكشاف بيولوجيا خاصة باللاكتلة المرضية.

أثبتنا جدوى هذا السير باستخدام البروتين الوظيفي الممثل hENO1 وsfGFP كأنظمة نموذجية. hENO1 هو إنزيم جليكوليكي متعدد ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين أي تضارب مصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا البحث المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (22377058)، والتمويل متعدد التخصصات لعلم الأحياء التركيبي في الطب الصيني التقليدي من جامعة نانجينغ للطب الصيني، وبرامج الدعم الخاصة للمواهب الوطنية عالية المستوى (برنامج 10,000 موهبة) - المواهب الشابة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6*له، وسمه الجسم المضاد وحيد النسيلة المؤتلف.بروتين تك84814-1-RRفئة من الغلوبولينات المناعية المحددة تستهدف 6&00 وسمه (ببتيد قصير يتكون من ستة بقايا هيستيدين متتالية، HHHHHH) في بروتينات مؤتلفة.
نظام ACQUITY UPLCالمياهكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء
تحليل الأرنب المضاد ل-لاكتيليسين mAbمختبرات PTM البيولوجيةPTM-1401RMفئة من الغلوبولينات المناعية المحددة تستهدف L-Lactyl Lysine (Klac)، وهو تعديل ما بعد الترجمة (PTM) للبروتينات.
مجموعة ClonExpress II لاستنساخ خطوة واحدةفازيم C112استنادا إلى تقنية استنساخ DNA بسلس بسيطة وسريعة وفعالة، يمكن استنساخ شظايا الإدخال اتجاهيا في أي موقع لأي ناقل.
جهاز قياس تدفق السيتوفليكسبيكمان كولترمقياس تدفق خلوي مع قدرة كشف عالية الحساسية وتحليل متعدد الألوان
DH10Bالأرابيت الحيويEC005H-Sنوع من الخلايا الكفؤة لتحويل البلازميدات، واستنساخ الجينات، والفحص الأزرق-الأبيض.
DH5αفازيم C502نوع من الخلايا الكفؤة لتحويل البلازميدات، واستنساخ الجينات، والفحص الأزرق-الأبيض.
نظام EASY-nano LC 1200ثيرمو فيشر العلميكروماتوغرافيا النانو-السائل لفصل عينات معقدة عالية الحساسية ودقة عالية
مطياف الكتلة أوربيترب إكليبس تريبريدثيرمو فيشر العلمينظام رائد عالي الجودة لتحليل الكروماتوغرافيا السائل ثلاثي التيار الكتلي (LC-MS)
بوليميراز DNA فانتا ماكس فائق الدقةفازيم P505إنزيم واحد عالي الدقة يجمع بين التضخيم السريع والدقة
بولي جيتسيجناجينSL100688تم صياغة كاشف الحمض النووي الصناعي في المختبر ليكون كاشف نقل قوي يضمن النقل الفعال والقابل للتكرار مع سمية خلوية أقل.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  2. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m6A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  3. Pan, L., et al. Demethylzeylasteral targets lactate by inhibiting histone lactylation to suppress the tumorigenicity of liver cancer stem cells. Pharmacol Res. 181, 106270(2022).
  4. Xu, H., et al. Royal jelly acid suppresses hepatocellular carcinoma tumorigenicity by inhibiting H3 histone lactylation at H3K9la and H3K14la sites. Phytomedicine. 118, 154940(2023).
  5. Chai, P., Zhao, F., Jia, R., Zhou, X., Fan, X. Lactate/lactylation in ocular development and diseases. Trends Mol Med. 31 (12), 1073-1076 (2025).
  6. Wang, G., et al. The relationship and clinical significance of lactylation modification in digestive system tumors. Cancer Cell Int. 24 (1), 246(2024).
  7. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  8. Chen, L., et al. Lactate-lactylation hands between metabolic reprogramming and immunosuppression. Int J Mol Sci. 23 (19), 11943(2022).
  9. Sun, X., et al. The diapause-like colorectal cancer cells induced by smc4 attenuation are characterized by low proliferation and chemotherapy insensitivity. Cell Metab. 35 (9), 1563-1579 (2023).
  10. Yang, J., et al. A positive feedback loop between inactive VHL-triggered histone lactylation and PDGFRβ signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression. Int J Biol Sci. 18 (8), 3470-3483 (2022).
  11. Li, W., et al. Tumor-derived lactate promotes resistance to bevacizumab treatment by facilitating autophagy enhancer protein Rubcnl expression through histone H3 lysine 18 lactylation (H3K18la) in colorectal cancer. Autophagy. 20 (1), 114-130 (2024).
  12. Jiang, J., et al. Lactate modulates cellular metabolism through histone lactylation-mediated gene expression in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 11, 647559(2021).
  13. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311 (2024).
  14. Li, G., et al. Glycometabolic reprogramming-induced XRCC1 lactylation confers therapeutic resistance in ALDH1A3-overexpressing glioblastoma. Cell Metab. 36 (8), 1696-1710.e10 (2024).
  15. Liberti, M. V., Locasale, J. W. The warburg effect: How does it benefit cancer cells. Trends Biochem Sci. 41 (3), 211-218 (2016).
  16. Varner, E. L., et al. Quantification of lactoyl-CoA (lactyl-CoA) by liquid chromatography mass spectrometry in mammalian cells and tissues. Open Biol. 10 (9), 200187(2020).
  17. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311.e21 (2024).
  18. Chen, H., et al. NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature. 631 (8021), 663-669 (2024).
  19. Zong, Z., et al. Alanyl-trna synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis. Cell. 187 (10), 2375-2392.e33 (2024).
  20. Ju, J., et al. The alanyl-tRNA synthetase AARS1 moonlights as a lactyltransferase to promote YAP signaling in gastric cancer. J Clin Invest. 134 (10), e174587(2024).
  21. Sun, L., et al. Lactylation of METTl16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 14 (1), 6523(2023).
  22. Mao, Y., et al. Hypoxia induces mitochondrial protein lactylation to limit oxidative phosphorylation. Cell Res. 34 (1), 13-30 (2024).
  23. Lv, L., et al. Mitogenic and oncogenic stimulation of K433 acetylation promotes PKM2 protein kinase activity and nuclear localization. Mol Cell. 52 (3), 340-352 (2013).
  24. Okada, A. K., et al. Lysine acetylation regulates the interaction between proteins and membranes. Nat Commun. 12 (1), 6466(2021).
  25. Wan, N., et al. Cyclic immonium ion of lactyllysine reveals widespread lactylation in the human proteome. Nat Methods. 19 (7), 854-864 (2022).
  26. Shao, C., et al. Genetic code expansion reveals site-specific lactylation in living cells reshapes protein functions. Nat Commun. 16 (1), 227(2025).
  27. Sun, Y., et al. Genetic encoding of ε-N-L-lactyllysine for detecting delactylase activity in living cells. Chem Commun (Camb). 58 (61), 8544-8547 (2022).
  28. Ren, C., et al. Expanding the scope of genetically encoded lysine post-translational modifications with lactylation, β-hydroxybutyrylation and lipoylation. Chembiochem. 23 (18), e202200302(2022).
  29. Hu, Y., et al. Engineering unnatural cells with a 21st amino acid as a living epigenetic sensor. Nat Commun. 16 (1), 9388(2025).
  30. Elsasser, S. J., Ernst, R. J., Walker, O. S., Chin, J. W. Genetic code expansion in stable cell lines enables encoded chromatin modification. Nat Methods. 13 (2), 158-164 (2016).
  31. Zhu, W., Fan, C., Hou, Y., Zhang, Y. Lactylation in tumor microenvironment and immunotherapy resistance: New mechanisms and challenges. Cancer Lett. 627, 217835(2025).
  32. Mills, E. M., Barlow, V. L., Jones, A. T., Tsai, Y. H. Development of mammalian cell logic gates controlled by unnatural amino acids. Cell Rep Methods. 1 (6), 100073(2021).
  33. Italia, J. S., et al. Genetically encoded protein sulfation in mammalian cells. Nat Chem Biol. 16 (4), 379-382 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

tRNA

مقالات ذات صلة