يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
تحدد هذه الدراسة انخفاض تنوع ميكروبيومات الأمعاء والمسارات الأيضية المتغيرة في مرضى السكري من النوع الثاني، مما يبرز زيادة البروتينيا البكتيريا وانخفاض الأنواع المفيدة، مما يشير إلى أن خلل الميكروبات مرتبط بمرض السكري من النوع الثاني وقد يساهم في فيزيولوجيته المرضية.
يؤكد الارتفاع العالمي في مرض السكري من النوع الثاني (T2DM) على الحاجة لفهم أفضل لآلياته البيولوجية الأساسية، خاصة تلك التي تتعلق بتفاعلات المضيف والميكروبيوم. هدفت هذه الدراسة إلى توصيف تنوع ميكروبات الأمعاء، والتركيب التصنيفي، والمسارات الأيضية المتوقعة لدى مرضى السكري الثاني المشخصين حديثا مقارنة بمجموعة غير المصابين بالسكري (NM). تم تحليل عينات البراز الطازجة باستخدام تسلسل 16S rDNA. تم حساب تنوع ألفا (مؤشرات تشاو، ACE، شانون، وسيمبسون) وتنوع بيتا لتقييم بنية مجتمع الميكروبات. تم تقييم الفروق التصنيفية باستخدام اختبارات ويلكوكسون لمجموع الرتبة وحجم تأثير التحليل الخطي المميز (LEfSe). تم إجراء التنبؤ بالمسار الوظيفي باستخدام التحقيق التطوري للمجتمعات من خلال إعادة بناء الحالات غير المرصودة (PICRUSt2) بناء على تعليقات KEGG وMetaCyc. تم تطبيق تحليل العشوائية المندليانية (MR)، بما في ذلك الوزن العكسي، وMR-Egger، وطرق الوسيط المرجح، لتقييم الارتباطات المتوقعة جينيا بين الأنواع الميكروبية وT2DM. أظهرت النتائج انخفاضا في غنى الميكروبات، كما يظهر في انخفاض مؤشرات تشاو وACE، وتغير هيكل التنوع، كما يظهر في انخفاض مؤشر شانون وارتفاع مؤشرات سيمبسون، لدى مرضى السكري من النوع الثاني، مصحوبا بتغيرات تركيبية كبيرة. لوحظت زيادة نسبية في وفرة البروتينيا وانخفاض في وفرة الأنواع المفيدة مثل لاكنوسبيراسي وبلوتيا. أشارت التنبؤات الوظيفية إلى انخفاض وفرة المسارات المتعلقة بمسار فوسفات البنتوزات غير التأكسدية، والتخليق الحيوي لإيزوبيوتانول، وتخليق L-إيزوليوسين. قدم تحليل الرنين المغناطيسي أدلة مكملة تدعم الروابط بين الأنواع الميكروبية المحددة وقابلية الإصابة بمرض السكري من النوع الثاني. في الختام، يرتبط T2DM بانخفاض غنى الميكروبات، وتغير في بنية التنوع، وتغيرات تصنيفية ووظيفية مميزة. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية ميكروبيوم الأمعاء في مرض النوع الثاني من النوع الثاني وتدعم الفائدة المحتملة للمؤشرات الحيوية القائمة على الميكروبيوم والاستراتيجيات العلاجية. هناك حاجة إلى دراسات إضافية للتحقق من صحة هذه النتائج وتوضيح الآليات الأساسية.
أصبح مرض السكري من النوع الثاني (T2DM) واحدا من أسرع الأمراض المزمنة نموا في العالم، مدفوعا بالتحضر السريع، وأنماط الغذاء الغربية، وأنماط الحياة الراكمة بشكل متزايد 1,2. يعد مساهما رئيسيا في المراضة والوفيات عالميا ويفرض عبئا كبيرا على الصحة العامة3. على الرغم من أن القابلية الجينية تلعب دورا، إلا أن الارتفاع السريع في حالات السكري من النوع الثاني يبرز أهمية المحددات البيئية والأيضية4. لذلك، فإن تحديد الآليات البيولوجية القابلة للتعديل أمر ضروري لتحسين استراتيجيات الكشف المبكر والوقاية. وقد حددت التطورات الحديثة ميكروبيوتا الأمعاء كمنظم رئيسي للتوازن الأيضي5. يؤثر النظام البيئي الميكروبي المعوي على استقلاب الجلوكوز، ووظائف المناعة، وسلامة الحاجز المعوي، والالتهاب المزمن منخفض الدرجة، وكلها عوامل مركزية في سبب مرض T2DM6. ارتبط الخلل الحيوي بالسمنة، ومقاومة الأنسولين، والسموم الداخلية، وتغير توازن الطاقة، مما يشير إلى وجود علاقة ميكانيكية بين التغيرات الميكروبية وتطور المرض7. بالإضافة إلى ذلك، تم الارتباط بوجود مستقلبات ميكروبية، بما في ذلك الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، وأحماض الصفراء، والأحماض الأمينية المتفرعة، في تعديل حساسية الأنسولين واستقلاب المضيف8.
بينما تدعم الأدلة المتراكمة دور ميكروبيوم الأمعاء في السكري من النوع الثاني، تعتمد معظم الدراسات الحالية على تصاميم رصدية تحد من الاستنتاج السببي. يمكن للطرق البديلة، مثل علم الميتاجينوميات باستخدام البندقية والاستقلاب المستهدفة، أن توفر رؤى وظيفية عالية الدقة، لكنها غالبا ما تكون مقيدة بالتكلفة والتعقيد الحسابي ومحدودية الجدوى في الدراسات الاستكشافية أو التجريبية على نطاق تجريبي. على النقيض من ذلك، يعد تسلسل 16S rDNA طريقة فعالة من حيث التكلفة وتعتمد على نطاق واسع لتحليل تركيبة مجتمع الميكروبات، رغم أن دقتها التصنيفية محدودة بمستوى النوع ولا يمكنها تحديد المستقلبات الوظيفية بشكل مباشر. لذلك، تم اختيار تسلسل 16S rDNA لهذه الدراسة كنهج فعال من حيث التكلفة وقابل للتوسع مناسب للمجموعات السريرية الاستكشافية، مع تمكين التكامل مع التنبؤ الوظيفي اللاحق والأطر التحليلية التكميلية. لذلك، قد يوفر دمج التنميط الميكروبي القائم على 16S مع التنبؤ الوظيفي بالمعلوماتية الحيوية والأساليب التكميلية مثل العشوائية المندلية (MR) إطارا متوازنا لاستكشاف العلاقات التركيبية والسببية المحتملة.
ومن الجدير بالذكر أن هناك نقصا نسبيا في البيانات التي تركز تحديدا على مرضى السكري من النوع الثاني الذين تم تشخيصهم حديثا وغير متقبلين للعلاج. في مثل هذه التجمعات، تكون التغيرات الميكروبية أقل عرضة لأن تتأثر بالتدخلات الدوائية، خاصة الميتفورمين، الذي يعرف أنه يغير بشكل كبير تركيب ووظيفة ميكروبيوتا الأمعاء9. يمثل هذا فجوة مهمة في الأدبيات الحالية، حيث تشمل العديد من الدراسات الحالية مجموعات مرضى متجانسة مع تعرضات علاجية متفاوتة وتكامل محدود بين تنميط الميكروبيوم ومناهج تحليلية مستنيرة جينيا.
في هذا السياق، هدفت الدراسة الحالية إلى توصيف تنوع ميكروبيوتا الأمعاء، والتركيب التصنيفي، والمسارات الوظيفية المتوقعة لدى مرضى T2DM الذين تم تشخيصهم حديثا مقارنة بمجموعة NM، باستخدام تسلسل 16S rDNA وتحليل المعلوماتية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، تم تطبيق العشوائية المندلية باستخدام بيانات الارتباط الجينومية المتاحة للجمهور لاستكشاف الارتباطات المحتملة المتوقعة جينيا بين أنواع ميكروبية محددة ومخاطر الإصابة بالسكري من النوع الثاني. تسمح هذه الاستراتيجية التحليلية المجمعة برؤى تكميلية من التنميط المجتمعي الميكروبي والبيانات الجينية على مستوى السكان. على وجه التحديد، يوفر تسلسل 16S rDNA توصيفا مباشرا لتركيب الميكروبات في مجموعة الدراسة، بينما يستخدم العشوائية المندلية الأدوات الجينية من مجموعات مستقلة لتقييم ما إذا كانت الارتباطات المرصودة متوافقة مع العلاقات المتوقعة جينيا. يهدف هذا التكامل إلى معالجة قيد رئيسي في دراسات الميكروبيوم الرصدي من خلال تقديم أدلة مكملة تدعم متانة الروابط بين الميكروبيوتا والنوع الثاني من الميكروبيوم. لذلك، فإن دمج هذه الأساليب يهدف إلى توفير التحقق المتقاطع بدلا من التكرار، مما يعزز قابلية تفسير ارتباطات الميكروبيوتا والنوع الثاني من الميكروبيوتا.
تركز الدراسة الحالية على ثلاثة جوانب. أولا، يقيم التحليل تغيرات ميكروبيوتا الأمعاء لدى مرضى السكري من النوع الثاني المزمنة الذين تم تشخيصهم حديثا وغير متمرسين في العلاج لتقليل الارتباك الناتج عن التدخلات الدوائية. ثانيا، يدمج التصنيف التصنيفي مع المسارات الوظيفية المتوقعة لتوفير رؤية على مستوى النظام للتغيرات الأيضية المرتبطة بالميكروبيوتا. ثالثا، يتضمن تحليل العشوائية المندلية لتقييم ما إذا كانت الارتباطات المرصودة متسقة مع العلاقات المتوقعة جينيا، مما يوفر مثلثا منهجيا. مجتمعة، توفر هذه الجوانب إطارا مكملا وقابلا للتكرار لتحليل الميكروبيوم بدلا من دراسة وصفية بحتة، مما يميز هذا العمل عن الدراسات السابقة التي تعتمد عادة على تصاميم رصدية أحادية الطريقة ولا تدمج التنميط الميكروبي، والتنبؤ الوظيفي، والاستدلال الوراثي ضمن إطار تحليلي موحد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين واعتمادها من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى تشونغتشينغ تشينجياتشياو (الموافقة رقم 20240131). تم الحصول على موافقة مستنيرة كتابية من جميع المشاركين قبل جمع العينات. تم التعامل مع جميع عينات البراز ومعلومات المشاركين باستخدام رموز دراسة غير محددة، كما هو مذكور في جدول المواد.
فحص المشاركين والتسجيل
تم فحص المرضى الذين تم تشخيصهم حديثا بمرض السكري من النوع الثاني الذين زاروا مستشفى تشونغتشينغ تشينجياتشياو بين يونيو 2023 وديسمبر 2023 للتحقق من الأهلية. تم تسجيل المشاركين في مجموعة الطب الطبي إذا كانوا بين 20 و65 عاما، وتم تشخيصهم بمرض السكري من النوع الثاني، ووافقوا على تقديم عينة جديدة من البراز، وأكملوا التقييم الطبي والفحوصات السريرية المطلوبة. تم تضمين المتطوعين الأصحاء الذين تم تجنيدهم خلال نفس الفترة ضمن مجموعة غير المصابين بالسكري (NM) وتم مطابقتهم مع مجموعة DM بأقرب شكل ممكن من حيث العمر والجنس والخصائص الديموغرافية العامة. تم استبعاد المشاركين إذا كانوا يعانون من اضطرابات دموية أو أمراض الجهاز العصبي المركزي أو مرض روماتيزمي نشط أو أمراض مناعة ذاتية أو عدوى حادة أو مزمنة في الجهاز الهضمي أو إسهال مزمن أو إمساك أو قرحة الجهاز الهضمي النشطة أو التعافية أو أمراض الأمعاء الالتهابية أو متلازمة القولون العصبي العصبي أو السل المعوي أو أورام الجهاز الهضمي أو أورام خبيثة أخرى الأمراض، سوء التغذية، نقص المناعة، اضطرابات الأيض الخلقية، الأمراض النفسية، استخدام المهدئ والمنوم، أو تعاطي المخدرات. كما تم استبعاد المشاركين إذا كانوا قد تلقوا مضادات حيوية، أو عوامل مثبطة للأحموضة، أو أدوية حركة الجهاز الهضمي، أو بروبيوتيك، أو جلوكوكورتيكويدات، أو مثبطات المناعة خلال شهر واحد قبل جمع البراز. بالإضافة إلى ذلك، تم استبعاد الأشخاص الذين عانوا من الإسهال، أو خضعوا لجراحة الجهاز الهضمي أو تنظير الجهاز الهضمي، أو أبلغوا عن تغييرات مفاجئة في بيئة المعيشة أو عاداتهم الغذائية خلال شهر واحد قبل جمع البراز. تم تخصيص رمز دراسة فريد لكل مشارك مؤهل قبل جمع العينات. من بين المجموعة المؤهلة، تم اختيار 12 مشاركا تم تشخيصهم حديثا بمرض T2DM و12 مشاركا من النوع النانومي لإجراء تسلسل الحمض النووي 16S rDNA وتحليلات الميكروبيوم بناء على توفر العينات ومتطلبات جودة التسلسل.
جمع عينات البراز وتخزينها
تم تزويد كل مشارك بحاوية لجمع البراز المعقمة تحمل فقط رمز الدراسة المخصص لضمان إزالة الهوية. تم توجيه المشاركين إلى تفريغ مثانتهم قبل التغوط لتقليل تلوث البول وجمع البراز الطازج مباشرة في الحاوية المعقمة دون ملامسة مياه المرحاض أو البول أو المطهرات أو أي ملوثات محتملة أخرى. مباشرة بعد الجمع، تم نقل حوالي 1–2 جرام من البراز إلى أنبوب تبريد معقم باستخدام ملعقة عينات معقمة قابلة للاستخدام مرة واحدة. كان الأنبوب مغلقا بإحكام ويوضع فورا على الثلج الجاف أو في حاوية نقل مبردة مسبقا. تم نقل جميع العينات إلى المختبر خلال ساعتين من الجمع. عند الوصول إلى المختبر، تم التحقق من رمز الدراسة، وتم فحص كل أنبوب بحثا عن تسرب أو تلوث ظاهر. تم تسجيل أوقات الجمع والتخزين لجميع العينات. تم تخزين عينات البراز بعد ذلك عند درجة حرارة −80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الجيني. اعتبرت العينات مقبولة للتحليل في المراحل النهائية فقط إذا بقيت مجمدة تماما أثناء التخزين والنقل ولم تظهر أي دليل على تسرب الأنابيب أو تلوث خارجي.
استخراج الحمض النووي الجيني
تمت إزالة عينات البراز من التخزين بدرجة حرارة −80 درجة مئوية ووضعها على الثلج قبل المعالجة. تم إذابة كل عينة فقط حتى يصبح من الممكن التجانس لتقليل التدهور المرتبط بدورات التجميد-الذوبان المتكررة. تم نقل حوالي 200 ملغ من البراز إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم، وأضيف مخزن التحلل المقدم في مجموعة استخراج الحمض النووي للبراز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة المدرجة في جدول المواد. تم تدوير العينات بقوة لمدة 30 ثانية لتحقيق التجانس الكامل ثم حضنتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5–10 دقائق لتسهيل تحلل الخلية. بعد التحلل، تم طرد العينات على حرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم نقل المادة الفائقة بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم جديد دون إزعاج الحبيبة. تم استخراج الحمض النووي الجيني لاحقا باستخدام مخزن الإزالة المرفق مع المجموعة أو ماء خال من النوكلياز وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تخزين الحمض النووي المستخرج عند −20 درجة مئوية للاستخدام قصير الأمد أو عند −80 درجة مئوية للحفاظ على المدى الطويل. بدت عينات الحمض النووي التي اعتبرت مناسبة للتحليل اللاحق شفافة وخالية من المواد الجسيمية المرئية.
تقييم جودة الحمض النووي
تم تقييم جودة الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز والقياس القائم على الفلورة. تم تحضير جل أغاروز بنسبة 1٪ في مخزن الرحلان الكهربائي، وتم تحميل عينات الحمض النووي المستخرجة، الممزوجة بمخزن التحميل، في آبار الهلام. تم إجراء الرحلان الكهربائي حتى يتم فصل أشرطة الحمض النووي بشكل كاف، ثم تم فحص الهلام تحت إضاءة فوق بنفسجية أو ضوء أزرق. كان يعتبر سلامة الحمض النووي مقبولا عندما يلاحظ شريط حمض نووي جينومي سليم دون تدهور ملحوظ أو تلطيخ مفرط. تم قياس تركيز الحمض النووي لاحقا باستخدام نظام قياس الحمض النووي القائم على الفلورة. ثم تم تخفيف العينات إلى التركيز المطلوب لتضخيم PCR في المراحل اللاحقة. عادة ما أظهرت عينات الحمض النووي عالية الجودة نطاقا مميزا في الرحلان الكهربائي الهلامي للأجاروز وكانت مركزة بما يكفي لإجراءات التضخيم اللاحقة.
تضخيم PCR لمنطقة 16S rDNA V3–V4
تم تضخيم منطقة المتغير الفائق V3–V4 من الحمض النووي البكتيري 16S باستخدام بادئات مشفرة شريطيا. كانت تسلسلات التمهيد كما يلي: التمهيد الأمامي 5′-ACTCCTACGGGGGCAG-3′ والبرايمر العكسي 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. تم إعداد تفاعلات PCR على الثلج في حجم نهائي 20 ميكرولتر يحتوي على 4 ميكرولتر من محلول PCR، و2 ميكرولتر من خليط النيوكليوتيدات (2.5 ميليمول/لتر)، و0.8 ميكرولتر لكل من البرايمر الأمامي والعكسي (5 ميكرومول/لتر)، و0.4 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة، و10 نانوغرام من الحمض النووي القالب، والماء الخالي من النوكلياز إلى الحجم. كانت خلطات التفاعل تخلط بلطف عن طريق الماصات ويتم تمركزها لفترة وجيزة لجمع السائل في قاع الأنبوب. تم إجراء تضخيم PCR باستخدام ظروف الدورة التالية: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها 25 دورة إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، مع خطوة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لتقليل تحيز التضخيم، تم تضخيم كل عينة في تفاعلات ثلاثية، وتم تجميع منتجات PCR الناتجة من نفس العينة لاحقا في أنبوب واحد. تم تأكيد نجاح التضخيم بوجود شريط مكبر واضح بالحجم المتوقع في الرحلان الكهربائي الهلامي للأجاروز.
التحقق والتنقية من منتجات PCR
تم التحقق من منتجات PCR باستخدام الرحلان الكهربائي الجل للأجوروز بنسبة 2٪. تم تحميل منتجات PCR المجمعة من كل عينة على الجل وتحويلها إلى الرحلان الكهربائي حتى يتم فصل نطاقات الأمبلكون المستهدف بوضوح. تم استئصال الأشرطة التي تتوافق مع حجم الأمبليكون المتوقع باستخدام شفرة معقمة نظيفة وتنقيتها بمجموعة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة المدرجة في جدول المواد. تم تفريغ منتجات PCR المنقاة لاحقا في محلول محلول الإزالة أو مياه خالية من النوكليز. تم قياس تركيز كل منتج PCR منقى باستخدام نظام قياس الحمض النووي القائم على الفلورة، وتم تسجيل قيم التركيز لتحضير المكتبة في المراحل النهائية. تم تأكيد نجاح التضخيم والتنقية بواسطة شريط واحد شفاف بحجم المضخم المتوقع في الرحلان الكهربائي الهلامي للأجاروز.
تحضير المكتبة وتجميعها
تم إعداد مكتبات التسلسل باستخدام مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة المدرجة في جدول المواد. تم ربط تسلسلات محولات التسلسل بالمضخمات المنقاة وفقا لسير عمل إعداد المكتبة القياسي. تم تنقية المنتجات المرتبطة بالمحولات لاحقا باستخدام استخراج الهلام أو طريقة تنقية تعتمد على الخرز، حسب بروتوكول تحضير المكتبة المختار. تم تقييم منتجات المكتبة المنقاة باستخدام الرحلان الكهربائي من جل الأغاروز بنسبة 2٪ لتأكيد توزيع الشظايا المناسب. تم قياس تركيزات المكتبة باستخدام نظام قياس كمية الحمض النووي القائم على التألق. استنادا إلى تركيز الحمض النووي وحجم الشظايا، تم تطبيع كل مكتبة إلى نفس التركيز الأضراسي لضمان عمق تسلسل متوازن عبر العينات. ثم تم تجميع كميات متساوية من المكتبات الفردية بنسبة 1:1 لتوليد تجمع مكتبات التسلسل النهائي. قبل التسلسل، كانت المكتبة المجمعة تتغير حسب بروتوكول منصة التسلسل قبل تحميل العينة. أظهرت المكتبات التي اعتبرت مناسبة للتسلسل توزيع واضح للشظايا ضمن نطاق الحجم المتوقع وتركيزا كافيا لتحليل تسلسل التسلسل في المراحل النهائية.
تسلسل الطرف المزدوج
تم تحميل المكتبة المجمعة النهائية على منصة تسلسل مزدوجة النهايات وفقا لإجراءات التشغيل القياسية للمصنع. تم إجراء تسلسل الطرفين باستخدام تكوين 2 × 250 بيس أو 2 × 300 بيس لكل بوصة لضمان عمق التسلسل الكافي لتوصيف شامل لتنوع الميكروبات في كل عينة. تمت مراقبة جودة التسلسل طوال فترة التشغيل باستخدام مقاييس جودة تم إنشاؤها من المنصة. بعد الانتهاء من التسلسل، تم تصدير ملفات FASTQ الخام المزدوجة لكل عينة لتحليل المعلوماتية الحيوية في المرحلة النهائية. اعتبرت مجموعات بيانات التسلسل مقبولة عندما أظهرت عمق قراءة كاف لكل عينة، ودرجات جودة Q30 مناسبة، وتعيين باركود ناجح.
معالجة التسلسل الخام
تم استيراد ملفات FASTQ الخام ذات النهاية المزدوجة إلى خط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية للميكروبيوم للمعالجة لاحقا. تم فك التسلسلات بناء على الرموز الشريطية المخصصة لكل عينة. تم إجراء ترشيح عالي الجودة لاحقا لإزالة القراءات التي تحتوي على درجات منخفضة الجودة، أو قواعد غامضة، أو تشوهات تسلسلية. تم تقليم القواعد منخفضة الجودة الموجودة في نهايات القراءات بناء على توزيع درجات الجودة لتحسين موثوقية التسلسل بشكل عام. بعد مراقبة الجودة، تم دمج القراءات ذات النهايات المزدوجة عبر مناطق متداخلة لإعادة بناء تسلسلات كاملة الطول. تم الاحتفاظ فقط بتسلسلات مدمجة عالية الجودة لتحليلات الميكروبيوم اللاحقة.
توليد تسلسل Amplicon (ASV) والتعليقات التصنيفية
تم إجراء إزالة الضوضاء بالتسلسل باستخدام خوارزمية إزالة الضوضاء المعتمدة، بما في ذلك DADA2 أو Deblur، لتصحيح أخطاء التسلسل وتحسين دقة التسلسل. تم تحديد وإزالة تسلسلات الكيميرية أثناء عملية إزالة الضوضاء. تم لاحقا توليد تسلسلات ASV التمثيلية وجداول وفرة ASV المقابلة لكل عينة. تم إجراء التعيين التصنيفي لتسلسلات ASV باستخدام مصنف بايز ساذج، وأجري تعليق تصنيفي على قاعدة بيانات SILVA 138 المرجعية. تم تصدير جداول الوفرة التصنيفية على مستوى الشعبة، والعائلة، والجنس للتحليل اللاحق. تضمنت مجموعة بيانات ASV النهائية تسلسلات تمثيلية، ومعلومات الوفرة، والتعليقات التصنيفية المقابلة لكل عينة.
تحليل التنوع ألفا وبيتا
تم حساب مؤشرات التنوع ألفا، بما في ذلك مؤشرات تشاو، ACE، شانون، سيمبسون، ومؤشرات التغطية، لتقييم التنوع الميكروبي داخل العينة وغناتها. تم التعبير عن مؤشرات التنوع ألفا كمتوسط ± انحراف معياري. تم تقييم طبيعية البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. تمت مقارنة المتغيرات الموزعة بشكل طبيعي بين مجموعتي DM وNM باستخدام اختبارات t للطالب، بينما تم تحليل المتغيرات غير الموزعة بشكل طبيعي باستخدام اختبارات ويلكوكسون لمجموع الرتب. تم حساب مسافات تنوع بيتا لاحقا باستخدام مصفوفة مسافات مناسبة لتقييم الفروقات في تركيب المجتمعات الميكروبية بين العينات. تم إجراء تحليل الإحداثيات الرئيسية (PCoA) لعرض الفروقات في بنية المجتمعات الميكروبية بين المجموعات. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل أوجه التشابه (ANOSIM) لتحديد ما إذا كانت الفروق بين المجموعات تتجاوز التباين داخل المجموعة، وتم الإبلاغ عن قيم R و p المقابلة ل ANOSIM. عكس تحليل التنوع ألفا التنوع الميكروبي داخل العينة، بينما قيم تحليل التنوع البيتا الفروقات في تركيب المجتمعات الميكروبية بين المجموعات.
التحليل التصنيفي التفاضلي
تم تلخيص تركيب المجتمعات الميكروبية على مستوى الشعبة، والعائلة، والجنس. تم إنشاء مخططات بارية مكدسة لعرض الوفرة النسبية للأصناف السائدة عبر العينات الفردية ومجموعات الدراسة. تم بناء منحنيات Pan/Core ومخططات Venn بشكل إضافي لمقارنة ASVs المشتركة والخاصة بالمجموعات بين مجموعتي DM وNM. تم تقييم الفروق في وفرة التصنيفات بين المجموعات باستخدام اختبارات ويلكوكسون لمجموع الترتيب. تم إجراء تحليل LEfSe لاحقا لتحديد الأنواع الميكروبية التي ساهمت بشكل أكبر في التمييز بين المجموعات. مكن التحليل التصنيفي التفاضلي من تحديد الأنواع الميكروبية الغنية في مجموعة DM أو NM.
التنبؤ الوظيفي
تم استخدام PICRUSt2 أو خط أنابيب تنبؤ وظيفي متحقق مكافئ لاستنتاج المسارات الوظيفية الميكروبية من ملفات تسلسل 16S rDNA. تم تطبيع بيانات وفرة ASV وفقا لمتطلبات خط التحليل المختار، وتم تعيين الوظائف المتوقعة إلى تعليقات مسار KEGG أو MetaCyc. تمت مقارنة وفرة المسارات المتوقعة لاحقا بين مجموعتي DM وNM. تم تصور مسارات مختلفة بشكل كبير باستخدام خرائط الحرارة أو طرق رسومية مناسبة أخرى. تم تفسير الوظائف المتوقعة على أنها جهد أيضي ميكروبي مستنتاج بدلا من وفرة المستقلبات المقاسة مباشرة. مكن تحليل التنبؤ الوظيفي من تحديد المسارات الميكروبية المرشحة التي تختلف بين المجموعات، بما في ذلك المسارات المرتبطة بأيض الكربوهيدرات والأحماض الأمينية.
تحليل العشوائية المندلية
تم الحصول على إحصائيات ملخصة لدراسة الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) لميكروبيوم الأمعاء من مجموعات بيانات متاحة للجمهور10. تم استرجاع بيانات الارتباط المهمة على مستوى الجينوم للأصناف الميكروبية من فهرس NHGRI-EBI GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) باستخدام أرقام وصول تتراوح بين GCST90032172 إلى GCST90032644. تم الوصول إلى بيانات ميتاجينومية إضافية من مجموعة FINRISK 2002 من خلال أرشيف الجينوم-فينوم الأوروبي (معرف البحث: EGAS00001005020). كما تم الحصول على إحصائيات ملخصة GWAS لمرض السكري من النوع الثاني من كتالوج NHGRI-EBI GWAS (رقم الوصول: EBI-A-GCST006867). تم اختيار المتغيرات الجينية المرتبطة بالأنواع الميكروبية كمتغيرات أدوات وفقا لعتبات إحصائية محددة مسبقا، وتم استبعاد المتغيرات في اختلال التوازن بين الارتباطات. تم توحيد مجموعات بيانات التعرض والنتائج لضمان اتساق اتجاه الأليليل. تم إجراء تحليل العشوائية المندلية لاحقا باستخدام طريقة التباين العكسي الموزون (IVW) كنهج تحليلي أساسي. أجريت تحليلات الحساسية باستخدام طرق MR-Egger وطرق الوسيط الموزون. تم تقييم قوة الجهاز باستخدام إحصائيات F، بينما تم تقييم التباين بين المتغيرات الأداتية باستخدام اختبار Q الخاص بكوكران. تم فحص التكاثر الأفقي باستخدام اختبار اعتراض MR-Egger. تم تطبيق تصحيح بونفيروني لأخذ عدة مقارنات في الاعتبار. تم تفسير نتائج العشوائية المندلية على أنها ارتباطات متوقعة جينيا بدلا من دليل قاطع على السببية.
مخرجات البيانات ونقطة النهاية
شملت النتائج التحليلية النهائية جداول وفرة ASV، ومخططات التركيب التصنيفي، ومقاييس التنوع ألفا، وتحليلات التنوع البيتا، ونتائج تصنيفية تفاضلية، وملفات مسارات وظيفية متوقعة، وتقديرات العشوائية المندلية. تم التحقق من جميع معرفات العينات في مجموعات بيانات التسلسل لضمان الاتساق مع رموز الدراسة غير المحددة المقابلة. تم أرشفة ملفات التسلسل الخام، جداول ASV المعالجة، المخرجات الإحصائية، وملفات مصدر الأرقام لتحليل البيانات وإدارة البيانات لاحقا. اعتبر البروتوكول مكتملا بمجرد توليد وتحقق بيانات تسلسل عالية الجودة، وملفات تصنيفية، ومقاييس التنوع، وتحليلات المسارات الوظيفية المتوقعة، ونتائج العشوائية المندلية بنجاح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تعرض الجدول 1 الخصائص الديموغرافية والسريرية الأساسية للمجموعة السريرية التي تم فحصها أولا. تم اختيار مجموعة فرعية تمثيلية تتكون من 12 مشاركا تم تشخيصهم حديثا بمرض T2DM و12 مشاركا من النوع النوميالي لتسلسل 16S rDNA وتحليلات الميكروبيوم في مرحلة لاحقة.
تقييم عمق التسلسل
تم حساب مؤشر شانون، ورسم منحنى الانكسار لتقييم عمق التسلسل. تم اكتشاف ما مجموعه 1,064,930 تسلسلا عبر جميع العينات، تغطي 4,770 من الو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
في السنوات الأخيرة، برز الميكروبيوم البشري، وخاصة ميكروبيوتا الأمعاء، كعامل معقد ومؤثر في استقلاب المضيف، وتنظيم المناعة، وتطور الأمراض. في المضيف السليم، تساهم ميكروبيوم الأمعاء في التوازن المناعي وسلامة الحاجز المعوي11. ارتبط الخلل الحيوي بمجموعة من الحالات المرضية، بما في ذلك اضطرابات الأيض، وأمراض المناعة الذاتية، والأورام الخبيثة 12,13,14,15,16.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن اعتبارها تضارب محتمل في المصالح.
مساهمات المؤلفين:
قام لينروي شيه وكيميا تشين بتحليل البيانات وصاغوا المخطوطة. شارك شيكان بان في جمع العينات والإجراءات التجريبية. قام شيومي تشونغ وشياويو لي بتصميم الدراسة، وأشرافا على المشروع، وراجعا المخطوطة بشكل نقدي. قام جميع المؤلفين بمراجعة وموافقة على المخطوطة النهائية.
يشكر المؤلفون جميع المشاركين والموظفين المشاركين في جمع العينات ومعالجة البيانات على مساهماتهم في هذه الدراسة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | Universal primers for bacterial 16S region |
| 80 °C Freezer | Haier Biomedical | DW-86L626 | Long-term sample storage |
| Agarose Gel System (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | PCR product validation |
| AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA purification and size selection |
| Bead-beating Tubes (Lysing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | Mechanical lysis of microbial cells |
| Bioinformatics Workstation | Dell | Precision 7920 | Data analysis using QIIME2 and R |
| DADA2 pipeline | Bioconductor | Version 1.28 | Sequence denoising and ASV generation; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Version 2023.5 | Sequence denoising and error correction; https://docs.qiime2.org |
| European Genome-Phenome Archive | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | Public metagenomic dataset repository; https://ega-archive.org |
| GWAS Catalog | NHGRI-EBI | Accessions GCST90032172–GCST90032644 | Public genome-wide association summary statistics database; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Illumina MiSeq Sequencing System | Illumina | SY-410-1003 | High-throughput sequencing platform |
| KEGG database | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | Release 107 | Functional pathway annotation database; https://www.genome.jp/kegg |
| MetaCyc database | SRI International | Version 27.1 | Metabolic pathway database; https://metacyc.org |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Cooling centrifuge for sample preparation |
| Nextera XT Library Prep Kit | Illumina | 20018705 | Library prep for sequencing |
| PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | For high-fidelity PCR |
| PCR Thermocycler | Bio-Rad | T100 | PCR amplification instrument |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Development Team | Version 2.5.2 | Functional pathway prediction from 16S rDNA sequencing data; https://github.com/picrust/picrust2 |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | DNA extraction from stool samples |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | DNA purification from agarose gel |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | DNA quantification |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | Version 4.3.1 | Statistical analysis and Mendelian randomization analysis; https://www.r-project.org |
| SILVA 138 database | SILVA ribosomal RNA database project | Release 138 | Reference database for taxonomic annotation; https://www.arb-silva.de |
| Stool Collection Tube | Sarstedt | 76.9923.001 | Sterile stool specimen collection tube |
| Stool DNA Kit | Omega | D4015-02 | DNA extraction kit |
| TwoSampleMR package | MR-Base | Version 0.5.7 | Mendelian randomization analysis in R; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |