$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى لييوان، كلية تونغجي الطبية، جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا [رقم الموافقة: 2026IEC(RYJ016)]. قدم جميع المرضى موافقة مستنيرة، وكان جمع واستخدام العينات السريرية يتوافق مع الإرشادات الأخلاقية ذات الصلة في إعلان هلسنكي. المواد والأدوات التجريبية الرئيسية المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.
جمع عينات الأنسجة السريرية واكتشاف تعبير CDCP1
تم جمع عينات من الأنسجة الجراحية من سبعة مرضى تم تشخيصهم بسرطان البلعوم الأنفي في مستشفانا بين يناير 2019 وديسمبر 2019. وفي الوقت نفسه، تم جمع عينات من أنسجة الأنف من ستة مرضى يعانون من التهاب الأنف كعينات ضابطة. تم تجميد جميع عينات الأنسجة فورا في النيتروجين السائل بعد جمعها لاستخلاص RNA لاحقا.
استخراج الحمض النووي الريبي والكشف الكمي لتفاعل PCR في الوقت الحقيقي
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من عينات الأنسجة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لكل عينة، تمت معالجة 50–100 ملغ من الأنسجة على الثلج في 1 مل من مادة الاستخلاص باستخدام متجانس الأنسجة. تم إجراء التجانس لمدة 30 ثانية وتكراره ثلاث مرات لضمان تعطيل كامل للأنسجة. بعد تعطيل الأنسجة، يتلقى كل محلل 200 ميكرولتر من الكلوروفورم. كانت الأنابيب تهز بقوة عن طريق الدوامة لمدة 15 ثانية، وتحافظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق، ثم تدور عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لفصل الطورات. تمت إزالة الطبقة المائية الشفافة دون إزعاج الطور التفاعلي ونقلها إلى أنبوب جديد.
تم استرداد الحمض النووي الريبي من هذا الجزء المائي بإضافة الإيزوبروبانول بنسبة حجم 1:1. بعد حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تم طرد المركزي على العينات بحرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإطلاق الرينا الريبي. تم التخلص من المادة الفائقة، وشطفت الحبيبة مرة واحدة ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪. بعد خطوة طرد مركزية ثانية عند 7,500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، تم إزالة غسل الإيثانول. ثم تم تجفيف حبيبة RNA بالهواء لمدة 5–10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وأعيد تعليقها في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من الناز. تم تحديد كمية ونقاء الحمض النووي الريبي مطيافيا فوتومتريا.
لتحضير cDNA، تم استخدام 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي. تم تنفيذ التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم تم تسخينه إلى 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان. تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) لاحقا باستخدام TB Green Premix Ex Taq II على نظام PCR في الوقت الحقيقي. كل تفاعل بسعة 20 ميكرولتر احتوى على 2 ميكرولتر من قالب cDNA، مع بادئات أمامية وخلفية بقوة 0.4 ميكرومول/لتر لكل منهما، و10 ميكرولتر من خليط SYBR الأخضر المسبق السابق، وماء خال من النوكليز. بدأ بروتوكول التضخيم بإزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تبع ذلك 40 دورة، حيث تتكون كل دورة من 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية للتلدين/التمديد. تم سرد تسلسلات البادئات في الجدول 1.
الكشف عن الكيمياء المناعية لتعبير بروتين CDCP1
تم تثبيت عينات الأنسجة أولا في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة، تلاها الجفاف القياسي، ودمج البارافين، وتحضير مقاطع بسماكة 4 ميكرومتر. ثم تمت معالجة مقاطع البرافين بالزيلين لإزالة البارافين وأعيد ترطيبها بشكل متسلسل عبر محاليل الإيثانول المتدرجة. لكشف المستضدات، وضعت الشرائح في مخزن سترات (pH 6.0) وتسخينها في قدر ضغط لمدة 3 دقائق بعد أن يصل المحلول إلى الغليان. تم تبيط نشاط البيروكسيداز الداخلي عن طريق تعريض الأقسام لبيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لمدة 10 دقائق.
بعد حجب النشاط الإنزيمي الداخلي، تم حضن الأقسام طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع تخفيف الأجسام المضادة الأولية المضادة ل CDCP1 عند 1:200. في اليوم التالي، عولجت الشرائح بجسم مضاد ثانوي مرافق من بيروكسيداز الفجل الحار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم تصوير الإشارة باستخدام مجموعة ركيزة DAB، وتم تلوين الأقسام لاحقا بالهيماتوكسيلين. وأخيرا، تم تجفيف الشرائح، وتركيبها، وفحصها تحت المجهر البصري.
زراعة الخلايا والتجميع
تم الحفاظ على خلايا سرطان البلعوم الأنفي البشري CNE2 وHK1 في DMEM عالي الجلوكوز مع 10٪ مصل أبقار جنيني و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين. تم زراعة الخلايا عند حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ CO₂. عندما وصلت الخلايا إلى 70٪–80٪ من التقاء البعض، تم نقلها وفقا للمجموعات التالية: مجموعة التحكم (الضابطة): تم نقلها باستخدام الحمض النووي الريبي الريبي الناقل الفارغ أو الحمض النووي الريبي السلبي للضابطة؛ مجموعة فرط التعبير من CDCP1 (CDCP1-OE): تم نقلها باستخدام بلازميد فرط التعبير من CDCP1؛ مجموعة صمت CDCP1 (si-CDCP1): تم نقلها بواسطة siRNA من CDCP1؛ مجموعة تجارب الإنقاذ (CDCP1-OE + U0126): عولجت بمثبط ERK1/2 الخاص U0126 (10 ميكرومول/لتر) لمدة 48 ساعة بناء على زيادة تعبير CDCP1.
تم إجراء النقل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم طلاء الخلايا قبل 24 ساعة من النقل في صفائح ذات 6 آبار بحجم 2 ×10 5 خلايا/بئر، حيث يحتوي كل بئر على 2 مل من وسط خال من المضادات الحيوية. بدأ النقل عندما وصلت الثقافات إلى حوالي 70٪ من التقاء الثقافات. ثم أزيلت وسيط الزراعة واستبدل بوسط طازج خال من المصل. لكل بئر، تم تحضير إما 2 ميكروغرام من حمض النووي البلازميدي أو 100 ميكروغرام من siRNA بشكل منفصل عن 5 ميكرولتر من كاشف النقل، مع تخفيف كل مكون في 250 ميكرولتر من وسط مصل مختزل. تم الاحتفاظ بكلا الخليطين في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم تم دمج الحمض النووي المخفف وكاشف النقل وتركهما ليقفوا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتوليد مركبات النقل. تمت إضافة هذه المركبات إلى الخلايا باتجاه النزول، وتوزيعها بلطف عبر البئر، وحضنتها مع الخلايا لمدة 6 ساعات. بعد انتهاء فترة الحضانة، تمت إزالة خليط النقل، وتم تزويد الخلايا بوسط كامل يحتوي على 10٪ من FBS.
اختبار تكاثر الخلايا
بعد 48 ساعة من النقل، تم جمع وزرع خلايا CNE2 وHK1 من كل مجموعة في 96 صفيحة بئر بكثافة 3 ×10 3 خلايا/بئر مع 100 ميكرولتر من وسط في كل بئر، مع خمسة آبار مكررة لكل مجموعة. بعد زراعة الخلايا لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة، أضيف 10 ميكرولتر من محلول MTT بتركيز 5 ملغ/مل إلى كل بئر. ثم تم حضن الصفائح مرة أخرى عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 4 ساعات أخرى. بعد هذه الحضانة، تم التخلص بعناية من المادة الفائقة للمزرعة، وأضيف 100 ميكرولتر من كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO) إلى كل بئر لإذابة بلورات الفورمازان. تم تحريك الألواح لمدة 10 دقائق لضمان الذوبان الكامل. ثم تم تسجيل الامتصاص باستخدام قارئ ميكرولوح عند 570 نانومتر، باستخدام 630 نانومتر كطول موجي مرجعي.
اختبار نشاط الاستماتة المبرمج
بعد 48 ساعة من النقل، تم جمع خلايا CNE2 من كل مجموعة، وتم اكتشاف نشاط كاسباز-3 باستخدام مجموعة اختبار نشاط كاسباز-3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تمت إضافة ما مجموعه 100 ميكرولتر من مخزن التحلل إلى 1 × 10خلايا 6 ، ثم تحلل على الجليد لمدة 15 دقيقة، ثم تم طرد مركزها على حرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم نقل المادة الفائقة الناتجة لتحليلها لاحقا. في اختبار كاسباز-3، حصل كل بئر على 50 ميكرولتر من حاجز التفاعل و5 ميكرولتر من ركيزة كاسباز-3 (DEVD-pNA). ثم تم الحفاظ على اللوح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين، وتم قياس الامتصاص عند 405 نانومتر باستخدام قارئ الألواح الدقيقة.
تحليل البقع الغربية
بعد 48 ساعة من النقل، تم جمع خلايا CNE2 وHK1 من كل مجموعة تجريبية لاستخلاص البروتين. تم تعطيل الخلايا في محلول RIPA الذي يحتوي على مثبطات بروتياز وحفظت على الثلج لمدة 30 دقيقة. تم طرد المركزي الناتج من اللزات عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، وبعد ذلك تم جمع الكسور الفائقة. تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA.
لتحليل البلوت الغربي، تم خلط 30 ميكروغرام من البروتين الكلي من كل عينة مع مخزن تحميل 5x وتسخين عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتغيير طبيعة البروتينات. تم فصل العينات على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪ بجهد 120 فولت لمدة 90 دقيقة، تلاها نقلها إلى أغشية PVDF بتيار ثابت 300 مللي أمبير لمدة 90 دقيقة. بعد النقل، تم حجب الأغشية بحليب خالي من الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
تم حضنة الأغشية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد CDCP1 (1:1,000)، E-كاديرين (1:1,000)، فيمنتين (1:1,000)، p-ERK1/2 (1:2,000)، ERK1/2 (1:1,000)، وGAPDH (1:5,000).
في اليوم التالي، تم غسل الأغشية ب TBST ثلاث مرات، واستغرق كل غسيل لمدة 10 دقائق. ثم تعرضوا لأجسام مضادة ثانوية مرافق مع بيروكسيداز الفجل الحار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث غسلات إضافية ل TBST، تم رؤية إشارات البروتين باستخدام ركيزة كيميائية تلألؤ ECL. تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ، واستخدم GAPDH كأداة تحكم للتطبيع.
التحليل الإحصائي
أجريت جميع التجارب بشكل مستقل ثلاث مرات. تعرض النتائج كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم تقييم الفروق بين مجموعات متعددة من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA)، وتم استخدام طريقة توكي للمقارنات الزوجية بعد الواقع. تم اعتبار قيمة P البالغة < 0.05 ذات دلالة إحصائية.