يكشف تحليل النسخ عن مجموعات فرعية مدفوعة بالميتوكوندريا في آفات التهاب الجلد التأتبي

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

يكشف تحليل النسخ عن مجموعات فرعية مدفوعة بالميتوكوندريا في آفات التهاب الجلد التأتبي

DOI:

10.3791/70240

⸱

May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الجلد التأتبي (AD) هو مرض جلدي مزمن التهابي يتميز بتنوع جزيئي كبير. تحدد هذه الدراسة مجموعتين فرعيتين متميزتين من حيث النسخ، مدفوعتين بتعبير جيني ميتوكوندريا وتسلل المناعي، وتكشف عن أربعة جينات مركزية كمؤشرات حيوية محتملة لتصنيف المرضى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الجلد التأتبي (AD) هو مرض جلدي التهابي شائع ومزمن منتشر بشكل عام. تشكل تباينه السريري وآلياته الجزيئية المعقدة تحديات كبيرة أمام تطوير علاجات فعالة. استكشاف التغاير الجزيئي لمرض الزهايمر باستخدام بيانات النسخ الجلدية الآفية، وتوصيف ملفاتهم البيولوجية والمناعية، وتحديد الجينات الرئيسية التي تقوم عليها التمييز. تم تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي باستخدام DESeq2، تلتها تحليلات المسارات والتعبير المشترك عبر GSEA وWGCNA على التوالي. تم استخراج الجينات المرتبطة بالميتوكوندريا من خلال تقاطع وحدات DEGs وWGCNA مع قاعدة بيانات MitoCarta3.0، وتم تقييم أهميتها الوظيفية من خلال إثراء GO وKEGG. تم تحديد جينات المحور من خلال تحليل شبكة تفاعل البروتين مع البروتين، والتي استخدمت لاحقا لبناء نموذج تصنيف. تم التنبؤ بمنظمات النسخ باستخدام hTFtarget، بينما تم قياس تسرب الخلايا المناعية باستخدام CIBERSORT. تم تحديد مجموعتين جزيئيتين. كانت المجموعة الأولى غنية بإشارات الخلايا ومسارات الالتصاق، بينما أظهرت المجموعة الثانية زيادة في تنظيم الفسفرة التأكسدية والعمليات المرتبطة بالبروتيازوم. تم التعبير عن 85 جينا مرتبطا بالميتوكوندريا، يشارك بشكل رئيسي في أيض الطاقة، بشكل مختلف بين العناصر. حدد تحليل شبكات PPI أربعة جينات محور (BAD، BOLA1، CHCHD5، وISOC2)، والتي تم تنظيمها بشكل ملحوظ في المجموعة 1. أظهر مصنف قائم على جينات المحور قوة تمييزية قوية (المساحة تحت المنحنى > 0.7). شملت المنظمات الرئيسية المتوقعة في النسخ ATF3، BRD2، BRD4، وCEBPA. كشف تحليل المناعة عن تسرب أعلى لخلايا تائية تنظيمية في المجموعة 1 وزيادة في الخلايا التائية المساعدة للجريبات في المجموعة 2. تكشف هذه الدراسة عن نوعين فرعيين متميزين جزيئيا ومنائيا من مرض الزهايمر، يتميزان بوظيفة ميتوكوندرية تفاضلية وتوقيعات البيئة الدقيقة المناعية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الجلد التأتبي (AD) هو مرض جلدي التهابي شائع ومزمن يصيب ما يصل إلى 20٪ من الأطفال و10^{٪ من} البالغين. يتميز بحكة شديدة وآفات إكزيمية متكررة². سريريا، ينشأ مرض الزهايمر من تفاعل ديناميكي بين القابلية متعددة الجينات (مثل طفرات فقدان الوظيفة في FLG)، واضطراب تنظيم المناعة، والتعرضات البيئية مثل انخفاض الرطوبة وخلل الميكروبات³. بينما يشترك مرض الزهايمر في بعض السمات الفسيولوجية المرضية مع الصدفية، فإن مظاهرهما السريرية متعارضة، مع تأثيرات جينية مختلفة في مسارات مشتركة وتغيرات مناعية مميزة⁴.

مرض الزهايمر هو مرض غير متجانس، يتميز بملفات نسخ متنوعة عبر مجموعات مرضى مختلفة وأعراض مرضية⁵. أظهرت التحليلات المتكاملة لأنسجة الجلد وخلايا الدم الأحادية النواة الطرفية أن السمات السريرية مثل الاحمرار والتقشير مرتبطة بتوقيعات مناعية مميزة، مما يعكس التفاعل بين الجلد المحلي والاستجابات المناعية الجهازية⁶. تسلط الدراسات واسعة النطاق على دور مسارات IL-13 في مسببات مرض الزهايمر، بينما يظهر AD تباينا جزيئيا أكبر من الصدفية، مع وجود اختلافات في أنماط التعبير الجيني مرتبطة بشدة المرض، وعمر البداية، والخلفية الجينية ^5,7. تؤكد هذه الاختلافات على تعقيد مسببات مرض الزهايمر والحاجة إلى نهج شخصية في البحث والعلاج.

تلعب البروتينات الميتوكوندرية دورا مهما في تكوين مرض مرض الزهايمر من خلال اضطراب الإجهاد التأكسدي والمسارات الأيضية. تكشف الدراسات عن زيادة نشاط معقد الميتوكوندريا I وII في خلايا الكيراتينية غير الآفية، مما يؤدي إلى أكسدة أحماض دهنية طويلة السلسلة بشكل مفرط وزيادة إنتاج ROS، مما يزيد من خلل حاجز البشرة ^8,9. في الوقت نفسه، تحدد التحليلات البروتينية انخفاض بروتينات ومكونات الميتوكوندريا في مسار مضادات الأكسدة NRF2 في بشرة الزهايم، مما يقلل من دقة الإجهاد التأكسدي¹⁰. يساهم تلف الحمض النووي الميتوكوندري بشكل أكبر في الاستجابات الالتهابية، بينما تظهر التدخلات مثل استخدام مضادات الأكسدة الموجهة للميتوكوندريا فعالية في استعادة توازن الجلد من خلال تخفيف ROS^11,12. تؤكد هذه النتائج على وجود بروتينات الميتوكوندريا كمحركات لأمراض مرض الزهايمر وأهداف علاجية محتملة.

لقد ساهمت التحليلات الحديثة بالنسخ النسبية لمرض الزهايمر بشكل كبير في فهم بنيته الجينية وتباين جزيئياه. كشف أول تحليل لتسلسل الحمض النووي الريبي لمرض الزهايمر عن زيادة التعبير في مسار TREM-1 وسيتوكين^{IL-36 13}. كشف تحليل شبكة التعبير المشترك للجينات المرجحة بناء على ملف التعبير الجيني عن وحدات جزيئية وجينات مركزية مميزة، مثل HSPA4 وLCE3E وLCE3D، التي تنسق الاستجابات الالتهابية والتقرنيط، مما يبرز الأهداف العلاجية^{المحتملة 14}. تؤكد هذه الدراسات على قيمة علم النسخ متعدد الأنسجة ونمذجة المخاطر متعددة الجينات في تحسين التنبؤ بالأمراض وكشف الأسس المعقدة للمرض المزيد. ومع ذلك، ركزت الدراسات القائمة بشكل رئيسي على علم النسخ العام لمرض الزهايمر دون تحديد دور جينات الميتوكوندريا في تعريف المجموعات الفرعية الجزيئية. تتقدم الدراسة الحالية إلى ما هو أبعد من التحليلات السابقة للنسخ من خلال دمج مجموعات بيانات GEO متعددة لتحديد مجموعات الزهايمر القائمة على التجميع التوافقي، والتقاطع المنهجي مع الجينات المعبر عنها بشكل مختلف، ووحدات WGCNA، وفهرس جينات الميتوكوندريا المختار لتحديد جينات الميتوكوندريا المركزية التي تحدد هوية المجموعات الفرعية وقد تكون بمثابة علامات حيوية جديدة.

مع فرضية أن جلد مرض الزهايمر الآفي يحتوي على مجموعات فرعية جزيئية مميزة من النسخ، تتميز بتعبير جيني ميتوكوندري تفاضلي، مما قد يدعم التغاير السريري للزهامر. لاختبار ذلك، دمجت هذه الدراسة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من دراسات منشورة وجمعت بيانات تعبير جيني لعينات جلد آفات من 266 مريضا بمرض مرض الزهايد. تم تحديد المجموعات الفرعية الجزيئية بناء على التجميع التوافقي في التعبير الجيني، وتمت مقارنة التعبير الجيني بين المجموعتين الجزيئيتين. تظهر الجينات التي تدفع هذا الاختلاف إثراء وظيفيا في إشارات الخلايا والفسفرة التأكسدية. علاوة على ذلك، تم فحص جينات الميتوكوندريا التي تميز المجموعتين الجزيئيتين، وتم تحديد جينات المحور الرئيسية ضمن شبكة تفاعل البروتين والبروتين. تسلط هذه النتائج الضوء على التباين الجيني لمرض AD وتوسع المعرفة بأدوار البروتينات الميتوكوندرية في علم أمراض AD.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدمت هذه الدراسة مجموعات بيانات تعبير جيني متاحة للجمهور من قاعدة بيانات التعبير الجيني (GEO). لم يتم الوصول إلى بيانات يمكن تحديد هوية المريض، ولم يتم جمع عينات جديدة من المرضى. لذلك، لم يكن هناك حاجة لموافقة لجنة مراجعة مؤسسية (IRB) أو موافقة المريض لهذا التحليل الثانوي للبيانات المتاحة للجمهور. البرامج وقواعد البيانات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1 البيانات والموارد

تم الحصول على بيانات النسخ النصي لمرضى التهاب الجلد التأتبي (AD) من قاعدة بيانات GEO، بما في ذلك أربع دراسات: GSE121212 (N = 55)⁵، GSE157194 (N = 57)¹⁵، GSE193309 (N = 111)¹⁶ و GSE277961 (N = 43)¹⁷. احتوت جميع مجموعات البيانات على بيانات عد خام أو مصحوحة مسبقا من خزعات الجلد الآفية. تم تنزيل مصفوفات العد الخام ودمجها عبر الدراسات. تم تصحيح تأثيرات دفعات الدراسات المشتركة باستخدام طريقة ComBat-seq (حزمة sva R، v3.44.0) لتوحيد ملفات تعريف التعبير عبر مجموعات بيانات GEO الأربع قبل التحليل اللاحق. جميع مجموعات البيانات الأربع تعتمد على تسلسل RNA الذي أجري على عينات خزعة الجلد البشرية، وتم مواءمتها مع الجينوم المرجعي البشري GRCh38 باستخدام خطوط أنابيب خاصة بالدراسة. تم إجراء قياس التعبير على مستوى الجين باستخدام التعليق الجيني Ensembl (v105).

2 التجميع التوافقي

تم إجراء تجميع توافقي غير خاضع للإشراف باستخدام حزمة ConsensusClusterPlus R (v1.64.0)¹⁸ لتصنيف 266 عينة جلدية آفية من مرضى AD بناء على ملفات النسخ النصية. قبل التجميع، تم دمج بيانات العد الخام من جميع الدراسات، وتصحيح تأثيرات دفعات الدراسات المشتركة باستخدام دالة removeBatchEffect من حزمة ليما. ثم تم تحويل بيانات التعبير الجيني بتثبيت التباين (VST) باستخدام DESeq2 وتصفية للاحتفاظ بأفضل 5000 جين متغير. تم إجراء التجميع باستخدام التجميع الهرمي مع ارتباط بيرسون ومتوسط الربط عبر 1000 تكرار، مع أخذ عينات فرعية 80٪ من العينات في كل تكرار. تم تحديد أفضل عدد من المجموعات (تتراوح بين k إلى 10) من خلال تقييم دالة التوزيع التراكمي الإجماعي (CDF)، ومخططات مساحة الدلتا، ودرجات الإجماع بين العنقود. تم التحقق من صحة المجموعات الناتجة باستخدام خرائط الحرارة التوافقية وتحليل PCA، واستخدمت في التحليلات البيولوجية والسريرية اللاحقة.

3 تحليل التعبير الجيني التفاضلي

تمت مقارنة مستويات التعبير الجيني بين المجموعات الفرعية الجزيئية باستخدام حزمة DESeq2 R (v1.46.0)¹⁹. تم إدخال بيانات العد الخام لتقدير التشتت الجيني وملاءمة نموذج ثنائي الحدود سالب. تم تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) باستخدام اختبار Wald، وتم تصفية النتائج باستخدام عتبة دلالة بقيمة p معدلة < 0.01 وتغير مطلق في log2 ρ > 1.

4 تحليل إثراء مجموعات الجينات

تم إجراء تحليل إثراء مجموعات الجينات (GSEA) باستخدام حزمة clusterProfiler R (v4.12.6)²⁰. تم تصنيف جميع الجينات حسب تغير log2 fold الخاص بها من تحليل التعبير التفاضلي، وتم تطبيق دالة GSEA مع معلمات eps = 0، minGSSize = 10، وmaxGSSsize = 500، بينما تم الاحتفاظ بإعدادات أخرى على الوضع الافتراضي. تم إجراء الإثراء ضد مجموعات جينات MSigDB Hallmark. لكل تجمع جزيئي (المجموعة 1 والمجموعة 2)، تم اختيار أفضل ثلاثة مسارات غنية بناء على القيمة الاسمية p ودرجة الإثراء الطبيعية (NES). تم عرض النتائج باستخدام حزمة GseaVis R (الإصدار 0.1.0)²¹.

5 تحليل شبكة التعبير المشترك للجينات المرجحة

تم إجراء تحليل WGCNA على ملف التعبير الجيني لمرضى AD لتحديد وحدات التعبير الجيني المرتبطة بهوية النوع الفرعي النصي باستخدام حزمة R WGCNA (v1.73)²². تم تصفية الجينات للاحتفاظ بأعلى 75٪ مع أعلى تباين عبر جميع العينات. تم بناء شبكة تعبير مشترك موقعة باستخدام قدرة عتبة ناعمة تم اختيارها من 1 إلى 30 لتقريب الطوبولوجيا الخالية من المقياس. تم تحديد وحدات الجينات من خلال التجميع الهرمي وقطع الأشجار الديناميكي. تمت دراسة ارتباطات الوحدات والصفات من خلال ربط الجينات الذاتية المعبر عنها في الوحدات مع علامات النوع الجزيئي، وتم اختيار الوحدات التي أظهرت ارتباطا ذا دلالة (p < 0.05) مع النوع الجزيئي للتحليل اللاحق.

6 بروتينات الميتوكوندريا في المجموعات الجزيئية لمرض الزهايمر

لتحديد الجينات المرتبطة بالميتوكوندريا ضمن وحدات DEGs وWGCNA، تم تداخل هذه المجموعات مع القائمة المنسقة للبروتينات الميتوكوندرية من MitoCarta3.0²³. اعتبرت الجينات المتقاطعة بروتينات ميتوكوندرية محتملة ذات صلة بسياق مرض الزهايمر.

7 أنطولوجيا الجينات وتحليل إثراء KEGG

تحديد الوظائف الخلوية الرئيسية والعمليات البيولوجية التي تميز المجموعات الفرعية الجزيئية. تم إجراء تحليلات إثراء GO وKEGG للجينات المرتبطة بالميتوكوندريا باستخدام clusterProfiler. تم إجراء إثراء GO بشكل منفصل لفئات العملية البيولوجية (BP)، والمكون الخلوي (CC)، والوظيفة الجزيئية (MF) باستخدام دالة enrichGO مع OrgDb = "org". Hs.eg.db"، ont = "ALL"، والمعلمات الافتراضية. تم إجراء إثراء مسار KEGG باستخدام دالة enrichKEGG مع ضبط الكائن الحي على "has". تم اعتبار الحدود الغنية ذات القيمة المئوية المعدلة < 0.05 ذات دلالة كبيرة.

8 شبكات تفاعل البروتين والبروتينات

تم الاستعلام عن 85 DEGs والوحدات المتداخلة المرتبطة ب AD في قاعدة بيانات STRING (https://string-db.org)²⁴ لاسترجاع مثبطات مضخة البروتون المعروفة والمتوقعة. تم إجراء تحليل طوبولوجيا الشبكة باستخدام سبعة مقاييس (الدرجة، القرب، الوسط، المتجه الذاتي، ترتيب الصفحة، المركز، والسلطات) لترتيب أهمية العقدة لكل بروتين. تم اختيار أفضل 30 جينا مصنفا في كل مقياس، وتم تصور التقاطعات عبر جميع الأساليب السبعة باستخدام مخطط UpSet. تم استخدام الجينات الأربعة المتقاطعة من هذه المقاييس لبناء نموذج تصنيف بناء على مستويات تعبير جيناتها. تم حساب دقة النموذج، والحساسية، والنوعية، والمساحة تحت منحنى ROC (AUC) لتقييم أداء التصنيف.

9 تحليل تنظيم النسخ

تم الاستعلام عن قاعدة بيانات hTFtarget (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ لاسترجاع التفاعلات المدعومة تجريبيا بين الهدف والهدف لأربعة جينات مركزية متقاطعة. تم بناء وتصوير شبكة تنظيم جينات TF الناتجة باستخدام حزم igraph²⁶ و ggraph²⁷ R.

10 تحليل تسرب الخلايا المناعية بحجم RNA-seq

تم استخدام خوارزمية CIBERSORT²⁸ (https://cibersort.stanford.edu/) لتقدير النسب النسبية ل 22 نوعا من الخلايا المناعية في بيانات النسخ الجلدية الآفية. تم إدخال بيانات تعبير الجين الطبيعية في CIBERSORT (v0.1.0) مع مصفوفة توقيع LM22. تم إجراء التحليل مع وجود 1000 تبديل وتعطيل تطبيع الكم. تم النظر في عينات بقيم p ناتجة من CIBERSORT < 0.05 للتحليل اللاحق. تمت مقارنة كسور الخلايا المناعية المقدرة بين المجموعات الجزيئية باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتبة مع تصحيح FDR لمقارنات متعددة عبر 22 نوعا من الخلايا المناعية (p.adjust.method = "FDR"), وتم عرض النتائج باستخدام مخططات الصندوق باستخدام حزمة ggplot2²⁹ R.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجموعات الفرعية النسخية في التهاب الجلد التأتبي

تم تحليل بيانات RNA-seq من 266 عينة من مرضى AD للتحقيق في تباين النسخ داخل المرض. بعد مراقبة الجودة وتصحيح تأثيرات الدفعات عبر عدة دراسات، كشف التجميع التوافقي غير الخاضع للإشراف عن مجموعتين جزيئيتين مميزتين (الشكل 1A). تم تقييم استقرار العنقود وعدد التجمع الأمثل باستخدام مخطط دالة التوزيع التراكمي (CDF) (الشكل 1B)، ومخطط منطقة الدلتا (الشكل 1C)، وخريطة الحرارة لمصفوفة الإجماع (الشكل 1D). معا، تدعم هذه النتائج وجود نوعين فرعيين قويين من النسخ في مرض الزهايمر، مما يعكس التباين الجيني الكامن.

الجينات المعبر عنها بشكل مختلف بين المجموعات الفرعية لمرض الزهايمر

وقد أكد مخطط t-SNE المستند إلى مصفوفة التعبير الجيني الطبيعية صحة المجموعات الفرعية التحويلية التي تم تحديدها من خلال التجميع التوافقي. كشف مخطط t-SNE عن مجموعتين منفصلتين جيدا، كل واحدة تتوافق مع إحدى المجموعات الفرعية المحددة سابقا (الشكل 2A)، مما يدعم وجود ملفات جزيئية مميزة بين مرضى الزهايمر. ثم تم تحليل التعبير التفاضلي بين المجموعتين الفرعيتين باستخدام DESeq2، مع عتبة p < 0.01 و|log₂ تغير الطية| > 1. أظهر مخطط البركان الناتج (الشكل 2B) جينات معبرة بشكل تفاضلي (DEGs)، مما يشير إلى تفرع نسخي قوي. أفضل 10 جينات تم تنظيمها هي ABHD2، ADAR، ADCY3، ADCY9، ADD1، ADIPOR2، AFF1، AGFG1، AGRN وAHNAK في المجموعة 1 وC2orf68، CTTN، GPR108، HERPUD1، LRPAP1، MAP1LC3B2، NKIRAS2، NR1H2، PDE5D وPMPCA في المجموعة 2 (الشكل 2C).

مجموعة الجينات المرتبطة بمجموعة الزهايمر الفرعية

كشف تحليل إثراء مجموعات الجينات (GSEA) عن ملفات إثراء وظيفية مميزة بين مجموعتي النسخ (الشكل 3A). أظهر التجمع 1 إثراء كبيرا للمسارات المشاركة في الإشارة والالتصاق الخلوي، بما في ذلك الالتصاق البؤري (الشكل 3B) ومسار إشارات MAPK (الشكل 3C)، مما يشير إلى حالة نشطة تتميز بتفاعلات معززة بين الخلية-الخلية-المصفوفة خارج الخلية وتكاثرها. على النقيض من ذلك، أظهر الكتلة 2 إثراء قويا للفسفرة التأكسدية (الشكل 3D) ووظيفة البروتيزوم (الشكل 3E)، مما يشير إلى وجود نمط أيضي نشط مؤكسد وبروتيولي.

الجينات المعبر عنها في مجموعات جزيئية AD

لتحديد وحدات التعبير المشترك المرتبطة بالأنواع الفرعية النصية، تم إجراء WGCNA بعد معالجة البيانات المسبقة. تم تحديد العينات الشذوذة أولا وإزالتها بناء على التجميع الهرمي لمسافات العينات لضمان متانة بناء الشبكة في الأسفل (الشكل 4A). ثم تم اختيار قدرة عتبة ناعمة باستخدام معيار الطوبولوجيا الخالية من المقياس، مع اختيار قدرة 6 لتحقيق R² > 0.85 (الشكل 4B). تم تحديد وحدات الجينات من خلال التجميع الهرمي وقطع الأشجار الديناميكي، تلاها تجميع الجينات الذاتية لدمج الوحدات ذات الصلة الوثيقة (الشكل 4C والشكل 4D). تم تصور شبكة الجينات الناتجة باستخدام خريطة حرارية للتداخل الطوبولوجي، مؤكدة وجود أنماط تعبير جيني مميزة (الشكل 4E). كشف تحليل علاقة الوحدة بالصفات عن ارتباط قوي ومهم بين وحدة MEyellow (_جين N = 743) والمجموعة الفرعية الجزيئية (الشكل 4F).

الإثراء الوظيفي لجينات الميتوكوندريا المرتبطة بمجموعة الزهايمر

ثم أجري تحليل إثراء GO وKEGG على الجينات المتقاطعة (N = 85) بين DEGs، والجينات في وحدة MEyellow، وقائمة ببروتينات الميتوكوندريا من MitoCarta3.0 (الشكل 5A) لدراسة الأدوار الوظيفية للجينات المرتبطة بالميتوكوندريا التي تدفع الفروق النسخية بين العناصر. حدد تحليل مسار KEGG وجود إثراء في الفسفرة التأكسدية والمسارات الأيضية (الشكل 5B). كشف تحليل تخصيب GO عن تمثيل مفرط كبير للمصطلحات المرتبطة بوظيفة الميتوكوندريا، بما في ذلك تخليق ATP الميتوكوندريا المدفوع بقوة البروتون، ومعقد السلاسل التنفسية، ونشاط ديهيدروجيناز NADH (الشكل 5C)، مما يشير إلى أن هذه الجينات مرتبطة بشكل رئيسي بعملية أيض الطاقة الميتوكوندرية وتنظيم الطاقة.

جينات الميتوكوندريا المحورية في التمايز الجزيئي لمرض الزهايمر

لتحديد الجينات الرئيسية في 85 جينة مرتبطة بمجموعة النسخ الميتوكوندري، تم إنشاء شبكة مثبطات مضخة البروتون (الشكل 6A). استنادا إلى الترتيب في كل من المقاييس الطوبولوجية السبعة (انظر الطرق)، تم اختيار أفضل 30 جينا، وتم تحليل تقاطعاتها وتصويرها في مخطط UpSet (الشكل 6B). أدى هذا التحليل إلى تحديد أربعة جينات مركزية بشكل متسق كعقد مركزية بناء على جميع معايير التصنيف (BAD، BOLA1، CHCHD5، ISOC2). تم فحص ملفات التعبير الخاصة بهم عبر مجموعتي النسخ النصيتين ووجدت أن جميع جينات المحور الأربعة كانت مرتفعة بشكل ملحوظ في المجموعة 1 مقارنة بالمجموعة 2 (الشكل 6C). أظهر تحليل الارتباط بين الجينات الزوجية وجود ارتباطات إيجابية بين جميع الجينات الأربعة، مما يشير إلى تنظيم متناسق، حيث أظهر CHCHD5 وISOC2 أقوى ارتباط (الشكل 6D). علاوة على ذلك، أظهر نموذج تصنيف بنيناه باستخدام تعبير هذه الجينات الأربعة قوة تمييزية قوية بين المجموعتين، حيث أظهر منحنى ال ROC مساحة تحت المنحنى (AUC) > 0.7 (الشكل 6E). بالإضافة إلى ذلك، أجري تحليل لشبكة التحليل التنظيمي لعامل النسخ (TF) لدراسة الآليات التنظيمية التي تحكم تعبير الجينات الأربعة المحددة. تم استعلام جميع عوامل النسخ المعروفة والمتوقعة التي قد تنظم هذه الجينات المركزية من hTFtarget، وتم دمج النتائج وتصويرها كشبكة تنظيمية للنسخ (الشكل 7). في شبكة التنظيم الجيني لمركز TF، كان لدى BAD أكبر عدد من الجينات المحورية، وتفاعلت ATF3 وBRD2 وBRD4 وCEBPA مع جميع جينات المركز الأربعة، مما يشير إلى وجود آلية تنظيمية مشتركة.

مقارنة تسرب الخلايا المناعية بين المجموعات الفرعية للزهايمر

للتحقيق في المشهد المناعي المرتبط بالمجموعات الفرعية النصية، تم إجراء تحليل تسرب الخلايا المناعية باستخدام CIBERSORT، الذي يقدر النسب النسبية ل 22 نوعا من الخلايا المناعية بناء على بيانات النسخ الجماعي (الشكل 8). من بين المجموعات المناعية، وجد أن الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) أكثر وفرة بشكل ملحوظ في المجموعة 1، مما يشير إلى بيئة دقيقة مثبطة للمناعة قد ترتبط بنشاط الميتوكوندريا ومسارات الإشارات التي تنظم في هذه المجموعة. على النقيض من ذلك، كانت خلايا T المساعدة في الجريبات غنية بشكل كبير في المجموعة 2، مما يشير إلى استجابة مناعية تكيفية أكثر نشاطا في هذه المجموعة الفرعية.

توفر البيانات:

البيانات التي تم تحليلها في هذه الدراسة متاحة للجمهور في مستودع التعبير الجيني (GEO) تحت أرقام الإدخال GSE121212، GSE157194، GSE193309، و GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

figure-results-1
الشكل 1: التجميع التوافقي لعينات آفات التهاب الجلد التأتبي بناء على ملفات النسخ النصية. (أ) خريطة حرارية وتجميع هرمي لمصفوفة الإجماع عبر عينات التهاب الجلد التأتبي (AD). (ب) مخطط دالة التوزيع التراكمي (CDF) المستخدم لتحديد العدد الأمثل للعناقيد (k = 2–10). (ج) رسم دلتا لمساحة يوضح التغير النسبي في المساحة تحت منحنى CDF لكل k. (D) تعيين تجمعي توافقي ل k = 2. يمثل كل عمود عينة فردية، وتشير الألوان إلى الانتماء إلى المجموعة (المجموعة 1، الأحمر؛ المجموعة 2، الفيروز). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: التعبير الجيني التفاضلي لأنواع جزيئية التهاب الجلد التأتبي. (A) مخطط تضمين الجيران العشوائي الموزع t (t-SNE) لعينات AD. تمثل كل نقطة عينة معرضة إلى بعدين ويتم تلوينها حسب تعيين العنقود. (ب) رسم البركاني للجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) بين العنقود 1 والمجموعة 2. تمثل كل نقطة جينا، يتم رسمه بواسطة تغيير الطي log2 (محور x) وقيمة p المعدلة −log10 (محور y). تشير النقاط الحمراء والزرقاء إلى جينات مرتفعة بشكل كبير في المجموعة 1 والمجموعة 2 على التوالي، بينما تشير النقاط الرمادية إلى جينات غير ذات دلالة. (ج) خريطة حرارية لأفضل 10 جينات عالية التعبير في المجموعة 1 والمجموعة 2. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تحليل إثراء مجموعات الجينات للأنواع جزيئية من التهاب الجلد التأتبي. (أ) رسم بياني على الشريط ثنائي الوجهين يظهر نتائج GSEA بين المجموعة 1 والمجموعة 2، مع المسارات العليا التي تم إثراؤها بشكل ملحوظ. المسارات التي تم إثراؤها في المجموعة 1 تظهر على اليمين، والمسارات المثرية في المجموعة 2 على اليسار. (B–E) مخططات إثراء تمثيلية للالتصاق البؤري، مسار إشارة MAPK، الفسفرة التأكسدية، ومسارات البروتيازوم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل شبكة التعبير المشترك للجينات المرجحة لعينات التهاب الجلد التأتبي. (أ) تجميع عينات من شجرات بناء على ملفات التعبير الجيني. (ب) مؤشر توافق الطوبولوجيا الخالية من المقياس ومتوسط الاتصال عبر قوى العتبات الناعمة (1–30). (ج) التجميع وخريطة الحرارة للجينات الذاتية للوحدة، مع ألوان تشير إلى الترابطات الزوجية. (د) مخطط تجميع هرمي يظهر الجينات مجمعة في وحدات معبرة بشكل مشترك. (ه) خريطة حرارية لمصفوفة التداخل الطوبولوجي (TOM)، تمثل التشابه في التعبير المشترك بين أزواج الجينات. (و) خريطة حرارية لعلاقات الوحدة والصفات، تظهر الارتباطات بين الجينات الذاتية للوحدة والصفات السريرية. تعرض معاملات الارتباط داخل كل خلية، وتشير شدة اللون إلى قوة واتجاه الارتباط (أحمر، موجب؛ أزرق، سالب). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: أنطولوجيا الجينات وإثراء مسار KEGG لجينات الميتوكوندريا المرتبطة بالأنواع الفرعية. (أ) مخطط فين يوضح التداخل بين الجينات الميتوكوندرية المرتبطة بالنوع الفرعي، وجينات الميتوكوندريا. (ب) مخطط الفقاعة لأفضل 20 مسارا غنية ب KEGG للجينات المتقاطعة. (ج) أفضل 10 مصطلحات غنية بعلم الوجود الجيني (GO) للعملية البيولوجية (BP)، والمكون الخلوي (CC)، والوظيفة الجزيئية (MF). تم إجراء جميع تحليلات الإثراء باستخدام قيمة p معدلة < 0.05 (معدل الاكتشاف الكاذب) كعتبة للدلالة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: تحليل تفاعل البروتين والبروتين وتحديد جينات المحور. (أ) شبكة تفاعل البروتين مع البروتين (PPI) التي تضم 85 جينا متقاطعا. تمثل العقد البروتينات، والحواف تشير إلى تفاعلات متوقعة أو تم التحقق منها تجريبيا من قاعدة بيانات STRING. (ب) مخطط UpSet يظهر التقاطعات بين أفضل 30 جينا مصنفا بناء على سبعة مقاييس مركزية للشبكة. (ج) مخططات مربعية تظهر مستويات التعبير لأربعة جينات محور في المجموعة 1 والمجموعة 2. (د) تحليل الارتباط الزوجي بين جينات المحور الأربعة. (ه) منحنى خاصية تشغيل المستقبل (ROC) يظهر أداء التصنيف، مع رسم الحساسية مقابل النوعية. تشير المساحة تحت المنحنى (AUC) إلى الدقة العامة. تم تقييم الدلالة الإحصائية في اللوحة (C) باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتبة (*p < 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7: الشبكة التنظيمية لجينات المحور. تمثل الدوائر الحمراء جينات المحور، والدوائر الزرقاء تمثل عوامل النسخ المرتبطة (TFs). تشير الحواف إلى التفاعلات التنظيمية. حجم كل عقدة جينية مركزية يعكس عدد المجموعات الجيولوجية المتفاعلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-8
الشكل 8: مقارنة تسلل الخلايا المناعية بين المجموعات الفرعية لالتهاب الجلد التأتبي. مخططات مربعية تظهر النسب المقدرة ل 22 نوعا من الخلايا المناعية في كل عنقود (المجموعة 1، اللون الأحمر؛ المجموعة 2، الفيروز). تشير العلامات النجمية (*) إلى فروقات ذات دلالة إحصائية بين العناصر، تم تقييمها باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتبة مع تصحيح معدل الاكتشاف الكاذب للمقارنات المتعددة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الجلد التأتبي هو اضطراب جلدي التهابي شائع وغير متجانس وراثيا، ويشكل تحديات كبيرة لاستراتيجيات العلاج الشخصية. توفر هذه الدراسة رؤى حول التغاير الجزيئي لمرض الزهايمر من خلال تحديد مجموعتين فرعيتين منفصلتين في 266 عينة جلدية آفية لمرضى الزهايمر. تظهر هذه المجموعات الفرعية إثراء وظائف بيولوجية مختلفة وتسرب الخلايا المناعية، حيث تتميز المجموعة الأولى بإشارات الخلايا النشطة ومسارات الالتصاق وإثراء الخلايا التائية التنظيمية (Tregs)، بينما تعرف المجموعة 2 بزيادة الفسفرة التأكسدية ووظيفة البروتيازوم، إلى جانب زيادة في الخلايا التائية المساعدة للجريبات. ومن المهم أن أربعة جينات مرتبطة بالميتوكوندريا (BAD، BOLA1، CHCHD5، وISOC2) تم تحديدها في المجموعة 1. هي جينات مركزية في شبكة PPI المكونة من 85 جينا تحدد النوعين الفرعيين للنسخ ويمكن تنظيمها في نفس الوقت بواسطة عوامل النسخ، بما في ذلك ATF3 وBRD2 وBRD4 وCEBPA.

تم تحديد مجموعتين مختلفتين بناء على نمط التعبير الجيني، مما يشير إلى أن مرض الزهايمر يظهر تباينا كبيرا في التعبير الجيني. أظهرت دراسات سابقة أن هذا التباين يمكن أن يكون مدفوعا بآليات جينية وفوق جينية ومناعية تحدد الأنماط الجزيئية المميزة ^5,30,31. بين المجموعتين، لوحظ أيضا تسرب خلايا مناعية مختلفة، حيث تتميز المجموعة 1 بخلايا تائية تنظيمية، والعنقود 2 غني بخلايا تائية مساعدة جريبية (Tfh)، مما يشير إلى وجود تغاير مناعي كامن وآليات مرضية محتملة مختلفة في مجموعة الزهايمر. تشير مجموعة تهيمن عليها التريج إلى بيئة مناعية تكون فيها آليات تنظيمية بارزة، مما قد يعكس محاولات للسيطرة على الالتهاب أو استجابة تعويضية للتنشيط المناعي المزمن³²^،³³. ومع ذلك، في مرض الزهايمر، يمكن أن تتأثر وظيفة التريج رغم زيادة الأعداد، مما قد لا يثبط الالتهاب بشكل فعال. على النقيض من ذلك، تشير مجموعة غنية ب Tfh إلى تعزيز مساعدة خلايا B، وزيادة نشاط مركز الإنثارة، وزيادة إنتاج IgE، وهي سمات مميزة للاستجابات التحسسية وأشكال أكثر شدة أو خارجية من AD^34,35. تعرف خلايا Tfh بدعم تمايز الخلايا البائية وتغيير فئات الأجسام المضادة، وتمددها يرتبط بنشاط الأمراض والحساسية التحسسية³⁶. قد يعكس وجود هذه المجموعات المميزة أنماط سريرية مختلفة، أو شدة مرض، أو استجابات للعلاج، ويبرز أهمية الأساليب الشخصية في أبحاث وعلاج مرض الزهايمر.

من المعروف أن خلل الميتوكوندريا يلعب دورا مهما في التسبب بمرض الزهايمر من خلال آليات مثل الحفاظ على الحاجز الجلدي³⁷، وإنتاج نوع الأكسجين التفاعلي³⁸، وتنظيم استجابة الخلايا المناعية³⁹. تم تحديد أربعة بروتينات ميتوكوندرية كعقد مركزية للجينات المرتبطة بالتمايز النصي، والتي يمكنها التنبؤ بالنوع الجزيئي بدقة عالية (AUC>0.7). على الرغم من عدم وجود دراسة سابقة أظهرت العلاقة المباشرة بين هذه الجينات ومرض الزهايمر، إلا أن هذه النتائج تشير إلى أنها مؤشرات حيوية محتملة لتصنيف مرضى الزهايمر وتقييم خلل الميتوكوندريا لدى مرضى الزهايمر. BAD (منبه موت الخلايا المرتبط ب BCL2) هو عضو من عائلة BCL-2 يشارك في الإشارات الاستماتية الميتوكوندرية؛ قد يعكس تزاوجهها في المجموعة 1 زيادة في التحضير الموضعي للميتوكوندريا في هذا النوع الفرعي. BOLA1 هو بروتين ميتوكوندري متورط في تكوين تجمع الحديد والكبريت وتنظيم الإجهاد التأكسدي. CHCHD5 (مجال الملف-الحلزون-الملف-الحلزوني يحتوي على 5) هو بروتين غشائي داخلي ميتوكوندريا مرتبط بتنظيم الكريستاي وكفاءة سلسلة نقل الإلكترونات. تم ربط ISOC2 (مجال الإيزوكوريماتاز الذي يحتوي على 2) بالعمليات الأيضية ووظيفة الميتوكوندريا. يشير التنظيم المنسق لهذه الجينات الأربعة في المجموعة الأولى إلى حالة من النشاط الأيضي الميتوكوندري المتزايد وإشارات الاستماتة في هذه المجموعة الفرعية للزهايد.

لهذه الدراسة عدة قيود. بينما حددت هذه الدراسة مجموعتين جزيئيتين فرعيتين لهما تعبير جيني مميز في جينات الميتوكوندريا وتسلل منفصل لخلايا المناعة، إلا أننا نفتقر إلى بيانات الظاهرة السريرية التفصيلية التي تسمح لنا بربط الطبقات مع شدة المرض واستجابات العلاج الطولية. لفهم كامل لما يعنيه التعبير العالي لهذه الجينات الأربعة في المجموعة الأولى، يجب أن تدمج الدراسات المستقبلية بيانات وصفية سريرية شاملة ويفضل إجراء التحقق الوظيفي في نماذج الخلايا الكيراتينية أو الفئران. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد هذه الدراسة على بيانات RNA-seq المتاحة للجمهور؛ على الرغم من قوته في التحليل واسع النطاق، إلا أنه يفتقر إلى الدقة في أنواع الخلايا المحددة. هذا القيد يجعل من الصعب تحديد ما إذا كان التعبير الملحوظ المختلف لجينات الميتوكوندريا ينشأ من خلايا الكيراتينية أو الخلايا المناعية المتسللة أو مجموعات الخلايا المقيمة في الجلد الأخرى. مع الاستخدام الواسع لأساليب النسخ المكاني والخلوي الواحد، ستستفيد الأبحاث المستقبلية كثيرا من قوة فك تعقيد إشارات التعبير وتوفير نظرة عامة أكثر دقة على ملف النسخ الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على جميع البيانات من عينات خزعة المثقب، التي تأخذ عينات من الجلد الكامل السمك. قد تقدم الدراسات المستقبلية التي تتضمن RNA-seq بشريط شريط الشريط نهجا تكميلا غير جراحي لتحديد نسخ البشرة السطحية، وقد تحقق توقيعات المجموعات الفرعية المحددة في بيئة طفيفة التوغل. إن الدمج المستقبلي لتسلسل الحمض النووي الريبي وبيانات النسخ المكانية في خلية واحدة سيعزز وضوح التواقيع الميتوكوندرية الخاصة بنوع الخلايا في جلد الزهايمر.

في الختام، فحصت هذه الدراسة التغاير النذري لمرض الزهايمر في 266 عينة، وحددت جينات الميتوكوندريا الرئيسية وتسلل الخلايا المناعية الفريد، مما ميزت المجموعات الفرعية. تحسن هذه النتائج فهم التباين الجزيئي لمرض الزهايمر وتبرز الإمكانات لتطوير طرق معالجة دقيقة تعتمد على ملفات جزيئية محددة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
سيبرسورت	جامعة ستانفورد	v0.1.0; فك الالتفاف الخلايا المناعية؛ https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	الموصل الحيوي	الإصدار 4.12.6؛ تحليل تخصيب GSEA وGO/KEGG؛ https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	الموصل الحيوي	v1.64.0; تجميع إجماعي غير خاضع للإشراف؛ https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	الموصل الحيوي	v1.46.0; تحليل التعبير الجيني التفاضلي؛ https://bioconductor.org/packages/DESeq2
النسخة الشاملة للتعبير الجيني (GEO)	NCBI	مستودع بيانات النسخ النصي العام؛ مجموعات البيانات GSE121212، GSE157194، GSE193309، GSE277961؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	كران	تصور البيانات؛ https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	كران	الرسم البياني والتصوير الشبكي؛ https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; تصور GSEA؛ https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا	قاعدة بيانات استهداف عامل النسخ البشري؛ http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	كران	بناء الشبكة وتصورها؛ https://igraph.org
ليما	الموصل الحيوي	إزالة دالة RetchEffect؛ https://bioconductor.org/packages/limma
ميتوكارتا 3.0	معهد برود	قاعدة بيانات بروتينات الميتوكوندريا المختارة؛ https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (مجموعات جينات هولمارك)	معهد برود	قاعدة بيانات مجموعة الجينات ل GSEA؛ https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org. Hs.eg.db	الموصل الحيوي	قاعدة بيانات تعليقات الجينوم البشري؛ https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	فريق R كور	بيئة الحوسبة الإحصائية؛ https://www.r-project.org
الوتر	EMBL	الإصدار 12.0؛ قاعدة بيانات تفاعل البروتين مع البروتين؛ https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	الموصل الحيوي	v3.44.0; تصحيح تأثير الدفعة؛ https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	كران	v1.73; تحليل شبكة التعبير المشترك للجينات المرجح; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

يكشف تحليل النسخ عن مجموعات فرعية مدفوعة بالميتوكوندريا في آفات التهاب الجلد التأتبي

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles