دراسة تأثيرات الثيموكينون على السمية العصبية الناتجة عن البيسفينول A، وإشارات Keap-1/NRF-2، والإجهاد التأكسدي، والسلوك لدى الفئران

Dilek Kuzay Aksoy; Halime Tozak Yıldız

doi:10.3791/70242

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

دراسة تأثيرات الثيموكينون على السمية العصبية الناتجة عن البيسفينول A، وإشارات Keap-1/NRF-2، والإجهاد التأكسدي، والسلوك لدى الفئران

255 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70242

⸱

مارس 24, 2026

Dilek Kuzay Aksoy¹ , Halime Tozak Yıldız²

¹Department of Physiology, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, ²Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University

في هذه المقالة

ملخص

هدفت هذه الدراسة إلى دراسة تأثيرات ثيموكينون على الإجهاد التأكسدي، ومسار إشارات Keap-1/Nrf-2، والسلوك في البلازما، والقشرة الدماغية، والحصين لدى الفئران المعرضة لبيسفينول A.

الملخص

التعرض المزمن للجرعة المنخفضة لبيسفينول أ (BPA)، وهو عامل تعطل بيئي واسع الاستخدام، أصبح مرتبطا بشكل متزايد بالسمية العصبية الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. ثيموكينون (TQ)، وهو مكون نشط بيولوجيا في نيجيلا ساتيفا، يظهر خصائص مضادة أكسدة قوية؛ ومع ذلك، لا تزال إمكاناتها الوقائية العصبية ضد السمية الناتجة عن BPA غير مفهومة بشكل كامل. نظرا للطبيعة الواسعة للتعرض ل BPA، فإن تحديد استراتيجيات الحماية العصبية الفعالة والمتاحة أصبح ذا أهمية متزايدة. بحثت هذه الدراسة في تأثيرات TQ على الإجهاد التأكسدي، وإشارات Keap-1/Nrf-2، والسلوك، والتغيرات النسيجية المرضية لدى الفئران المعرضة ل BPA. تم توزيع 24 فأر Wistar Albino ذكر بالغ عشوائيا إلى أربع مجموعات (n = 6 لكل مجموعة): ضابطة، BPA، BPA + 10 ملغ/كجم TQ (BPA+TQ I)، وBPA + 20 ملغ/كجم TQ (BPA+TQ II). تم إعطاء BPA (50 ميكروغرام/كغ) وTQ داخل المعدة لمدة 30 يوما. تسبب التعرض لمادة BPA في اضطرابات سلوكية كبيرة، وإجهاد تأكسدي، وتعطيل إشارات Keap-1/Nrf-2، وأضرار نسيجية واضحة في الحصين والقشرة الدماغية. أدى علاج TQ إلى تحسين كبير من النشاط الحركي والسلوك الشبيه بالاكتئاب، وخفض من أكسدة الدهون ومستويات أكسيد النيتريك، واستعادة القدرة المضادة للأكسدة المرتبطة بالجلوتاثيون، وتطبيع تعبير Keap-1 وNrf-2 (p < 0.001). كانت هذه التأثيرات الوقائية أكثر وضوحا عند الجرعة الأعلى من التي. وعند جمع هذه النتائج مجتمعة، تظهر أن الثيموكينون يخفف من السمية العصبية الناتجة عن BPA من خلال تعديل الإجهاد التأكسدي ومسار إشارات Keap-1/Nrf-2، مما يبرز إمكاناته كعامل حماية عصبية ضد التعرض البيئي ل BPA.

المقدمة

بيسفينول A (BPA) هو مركب صناعي يستخدم على نطاق واسع في البلاستيك وراتنجات الإيبوكسي، وغالبا ما يكتشف في مواد تغليف الأغذية، وأنظمة المياه، والأجهزة الطبية، والمنتجات المنزلية¹. أثار التعرض المستمر للبيئة مخاوف بشأن تأثيراته العصبية المحتملة، خاصة في ظروف منخفضة الجرعة المزمنة التي تعكس التعرض البشري الحقيقي.

على الرغم من أن الوكالات التنظيمية مثل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ووكالة حماية البيئة الأمريكية قد عرفت 50 ميكروغرام/كجم/يوم كمستوى غير ملحوظ من التأثيرات السلبية، تشير الأدلة التجريبية والوبائية الناشئة إلى أن التغيرات السلوكية والمعرفية قد تحدث عند جرعات أقل. وبالتالي، تم تقليل الاستهلاك اليومي الأوروبي المقبول إلى 4 ميكروغرام/كجم/يوم، مما يؤكد الحاجة إلى دراسة التأثيرات الميكانيكية للتعرض البيئي ل BPA ^1,2.

يعتبر الإجهاد التأكسدي آلية مركزية وراء السمية العصبية الناتجة عن BPA. يخل BPA بتوازن الأكسدة الاختزال الخلوية من خلال تقليل الدفاعات المضادة للأكسدة مثل الجلوتاثيون (GSH) وزيادة مؤشرات التكسيد الدهنية، بما في ذلك المالونديالديهايد (MDA)^3,4. ومع ذلك، لا تزال الآليات التنظيمية العليا التي تتحكم في استجابات مضادات الأكسدة تحت التعرض ل BPA غير موصوفة بشكل كاف.

يعد مسار بروتين ECH المرتبط ب 1 (Keap-1)/عامل نووي إريثرويد 2 (Nrf-2) المرتبط بالعامل النووي 2 (Nrf-2) آلية دفاع رئيسية لمضادات الأكسدة الداخلية. في ظروف الإجهاد التأكسدي، ينفصل Nrf-2 عن Keap-1، وينتقل إلى النواة، وينشط التعبير الجيني المعتمد على العناصر باستجابة مضادات الأكسدة⁵. على الرغم من دوره المعروف في الدفاع الخلوي، لم يتم التحقيق بشكل شامل في التعديل الخاص بإشارات Keap-1/Nrf-2 في الدماغ أثناء التعرض البيئي ل BPA بشكل شامل إلى جانب النتائج السلوكية.

ثيموكينون (TQ)، المكون النشط بيولوجيا الرئيسي في زيت بذور نيجيلا ساتيفا، هو بنزوكينون محبي للدهون قادر على عبور الحاجز الدموي الدماغي. يظهر TQ خصائص مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات ومضادة للاستماتة، جزئيا من خلال تنشيط إشارات Nrf-2 وتعزيز القدرة المضادة للأكسدة الداخلية^5,6. بينما أظهرت الدراسات السابقة التأثيرات الوقائية ل TQ في نماذج السمية العصبية المختلفة، فإن النهج المنهجي المتكامل لتقييم مؤشرات الإجهاد التأكسدي، وإشارات Keap-1/Nrf-2، والمعاملات السلوكية ضمن نفس نموذج التعرض ل BPA يفتقر^إلى ^5,6,7.

هنا، نصف بروتوكولا تجريبيا قابلا للتكرار لتقييم مؤشرات الإجهاد التأكسدي، وتعبير مسار Keap-1/Nrf-2، والتغيرات السلوكية في نموذج الفئران للتعرض البيئي ل BPA، وتقييم التأثيرات الواقية العصبية للثيموكينون عبر مناطق دماغية متعددة.

افترضنا أن التعرض لجرعة منخفضة ل BPA يسبب اضطرابات سلوكية من خلال خلل مسار إشارات Keap-1/Nrf-2 الناتج عن الإجهاد التأكسدي، وأن الثيموكينون يخفف من هذه التأثيرات من خلال استعادة توازن الأكسدة والاختزاز وتنشيط الاستجابات المضادة للأكسدة المعتمدة على Nrf-2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية المؤسسية المحلية (رقم الموافقة: 68429034/07).

الحيوانات وتصميم التجارب
تم الحصول على أربعة وعشرين ذكرا بالغا من فئران ويستار ألبينو (200-250 جم) من مختبر أبحاث الحيوانات التجريبية وتم إيواؤهم بشكل فردي تحت ظروف محكمة (دورة ضوء/ظلام 12 ساعة، 24 ± 2 درجة مئوية) مع إمكانية الوصول إلى الطعام القياسي وماء الصنبور. تم تأقلم الحيوانات مع ظروف المختبر قبل التجربة، التي استمرت 32 يوما.

تم توزيع الفئران عشوائيا على مجموعات تجريبية باستخدام طريقة عشوائية بسيطة مولدة بالحاسوب لتقليل تحيز الاختيار، مع تخصيص عدد متساو من الحيوانات لكل مجموعة (n = 6/مجموعة): ضابطة، BPA، BPA + 10 ملغ/كجم ثيموكينون (BPA + TQ I)، وBPA + 20 ملغ/كجم ثيموكينون (BPA + TQ II). تم تحديد حجم العينة من خلال تحليل طاقة مسبق باستخدام برنامج G*Power (الإصدار 3.1). استنادا إلى أحجام التأثير المبلغ عنها في دراسات سابقة ^5,6,7 التي قيمت التدخلات العصبية السامة العصبية الناتجة عن BPA ومضادات الأكسدة، خاصة في مقاييس النتائج الكيميائية الحيوية والسلوكية، تم افتراض قوة إحصائية تبلغ 0.80 لتحليل التحليل الباهظ في التحليل السطحي أحادي الاتجاه. في ظل هذه الظروف، كان من الضروري وجود ما لا يقل عن ستة حيوانات لكل مجموعة لاكتشاف فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات التجريب.

تم إعطاء BPA (50 ميكروغرام/كغ) وTQ (10 أو 20 ملغ/كغ) عن طريق المعدة عن طريق القاقة مرة واحدة يوميا لمدة 30 يوما. تم تجهيز جميع العلاجات حديثا وتقديمها بحجم إجمالي 1 مل/كجم. تم اختيار جرعة BPA المستخدمة في هذه الدراسة (50 ميكروغرام/كجم/يوم) بناء على تصنيفها كجرعة سلبية غير ملحوظة وجرعة مرجعية من قبل وكالة حماية البيئة الأمريكية وإدارة الغذاء والدواء الأمريكية. تم استخدام هذه الجرعة على نطاق واسع في الدراسات التجريبية لنمذجة التعرض البيئي للحمض النووي الحيوي ولتحقيق التغيرات السلوكية العصبية والكيميائية الحيوية المحتملة التي تحدث عند مستويات تعرض كانت تعتبر آمنة سابقا. ومن المهم أن تراكم الأدلة التجريبية يشير إلى أن التأثيرات العصبية والسلوكية السلبية قد تحدث عند أو أقل من هذه الجرعة، مما يدعم أهميتها في تقييم سمية BPA بجرعة منخفضة ^1,2. تم اختيار جرعات TQ (10 و20 ملغ/كغ) بناء على دراسات تجريبية سابقة أظهرت فعاليته الواقية العصبية ومضادات الأكسدة دون تحفيز السمية ^5,6,7. تم استخدام هذه الجرعات على نطاق واسع في نماذج القوارض المتعلقة بالسمية العصبية، والإجهاد التأكسدي، والالتهاب العصبي، وهي أقل بكثير من عتبات السمية المبلغ عنها عند التكرار في الاستخدام. لم تجر دراسة تجريبية لتحديد الجرعات؛ تم توجيه اختيار الجرعة بأسبقية الأدبيات وتحديد ملفات السلامة لضمان الفعالية والأهمية الانتقالية.

تم إعطاء BPA لمدة 30 يوما متتالية. تم إجراء تقييمات سلوكية في اليومين 31 و32 بعد التعرض الأخير. تم التضحية بالحيوانات في اليوم 32 بعد الانتهاء من جميع اختبارات السلوك. تم تصميم هذا الجدول الزمني للسماح بوقت كاف للتقييم السلوكي مع تقليل التأثيرات المربكة المحتملة للتعامل الحاد أو الضغط الإجرائي على التحليلات الكيميائية الحيوية والجزيئية والنسيجية اللاحقة. تم إعطاء ثيموكينون مرة واحدة يوميا مباشرة بعد تناول BPA عبر نفس المسار داخل المعدة. تم إجراء اختبارات سلوكية بعد الإعطاءات النهائية ل BPA وTQ. يتم تلخيص الجدول الزمني التجريبي في الشكل 1.

قياس وزن الجسم
تم قياس أوزان الجسم باستخدام توازن رقمي دقيق معاير (حساسية ±0.1 جم). تم وزن كل فأر بشكل فردي في الصباح قبل إعطاء العلاج، وتم تسجيل القياسات في الأيام 1 و10 و20 و32 في ظروف موحدة لتقليل التفاوت (الشكل 2).

التقييمات السلوكية
تم تقييم جميع المعايير السلوكية بواسطة مراقب واحد أعمى لتخصيص المجموعات لتقليل تحيز المراقبين والتفاوت بين المراقبين. تم تعويد الحيوانات على غرفة الاختبار لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل الاختبارات السلوكية لتقليل التوتر الناتج عن الجدة.

يتيح الاستخدام المشترك لاختبار الحقل المفتوح (OFT) واختبار السباحة القسرية (FST) تقييما شاملا للسمية السلوكية العصبية الناتجة عن BPA، حيث ثبت أن BPA يغير كل من التفاعل العاطفي والنشاط الحركي في القوارض²^،³. تم النظر في نتائج الحركة المشتقة من OFT أثناء تفسير عدم الحركة الناتج عن FST لتقليل التأثيرات المربكة المحتملة المرتبطة بتغير النشاط الحركي.

FST: تم تقييم السلوك الشبيه بالاكتئاب باستخدام اختبار السباحة القسرية في اليوم 32، وسبقته جلسة اختبار تمهيدية لمدة 15 دقيقة أجريت قبل 24 ساعة. تم وضع الفئران بشكل فردي في خزانات أسطوانية (قطر 35 سم، ارتفاع 50 سم) مملوءة بالماء (عمق 30 سم، 25 ± 1 درجة مئوية) وسمح لها بالسباحة لمدة 5 دقائق. تم تسجيل السلوكيات والسباحة والتسلق باستخدام كاميرا فيديو وتحليلها خارج الإنترنت لتقييم^اليأس السلوكي.

OFT: تم تقييم السلوك الشبيه بالقلق والنشاط الحركي التلقائي باستخدام اختبار الحقل المفتوح في اليوم 31. تم وضع كل فأر بشكل فردي في ساحة بيضاء من البلاستيك الزجاجي (90 سم × 35 سم) مقسمة إلى 24 مربعا متساويا وسمح له بالاستكشاف بحرية لمدة 5 دقائق. تم تسجيل الحركات باستخدام كاميرا فيديو. تم قياس الوقت الذي قضى في المناطق المركزية والطرفية وعدد المرات التي تعبر فيها جميع الأقدام الأربع كمؤشرات للسلوك المرتبط بالقلق والحركة⁸.

جمع عينات
في اليوم 32، تم تخدير الفئران بعمق باستخدام كيتامين عضلي (45 ملغ/كغ) وزيلازين (5 ملغ/كغ). تم تأكيد عمق التخدير الكافي من خلال غياب رد فعل سحب الدواسات. تم جمع الدم عن طريق ثقب القلب باستخدام حقنة معقمة، وتم الحصول على حوالي 3-5 مل من الدم من كل حيوان. تم الانتهاء من القتل الرحيم عن طريق النزيف تحت التخدير العميق. تم نقل عينات الدم إلى أنابيب تحتوي على مضادات التخثر وتم طردها بقوة 3000 × جرام لمدة 10-15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم جمع البلازما المفصولة وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى التحليل الكيميائي الحيوي.

تم تشريح الحصين ونصف الكرة المخية الأيسر بسرعة، ووزنهما، وتجميدهما في النيتروجين السائل، وتخزينهما عند درجة حرارة −80 درجة مئوية للتحليلات الكيميائية الحيوية اللاحقة، بينما تم تثبيت نصف الكرة الدماغية الأيمن بفورمالين مخفي 10٪ محايد لإجراء تقييمات نسيجية وكيميائية مناعية. لضمان الاتساق المنهجي وتقليل التباين بين العينات، تم تخصيص نصف الكرة الأيسر بشكل منهجي للقياسات الكيميائية الحيوية ونصف الكرة الأيمن للتحليلات الشكلية في جميع الحيوانات. ومن المهم أن تثبيت الفورمالين كان محدودا بشكل صارم على الأنسجة المخصصة للإجراءات النسيجة والكيميائية المناعية، ولم يستخدم أي نسيج ثابت في الفحوصات الكيميائية الحيوية القائمة على البروتين، مما منع تحلل البروتين المرتبط بالتثبيت. في التقييمات الكيميائية الحيوية، تم توحيد كميات محددة من نسيج الدماغ المجمد (عادة 50-100 ملغ لكل اختبار) باستخدام مخازن تجانس خاصة بالاختبار ونسب الأنسجة إلى المخزن الموحدة وفقا لمتطلبات كل معلم كيميائي حيوي. تم إجراء جميع التحليلات باستخدام كميات نسيجية متساوية داخل كل اختبار عبر مجموعات تجريبية.

تم تحديد التركيز الكلي للبروتين في الأنسجة المتجانسة باستخدام اختبار بروتين فلورومتري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس جميع المعايير الكيميائية الحيوية باستخدام تركيزات بروتين موحدة ومتساوية داخل كل اختبار لضمان قابلية المقارنة بين العينات والمجموعات التجريبية.

تقييم معلمات الإجهاد التأكسدي
تم تقييم تأكسد الدهون من خلال قياس مستويات MDA باستخدام طريقة المواد التفاعلية لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS) في عينات البلازما والأنسجة⁷. تم تحديد مستويات الثيول (RSH) وGSH المخفضة الطيفيا باستخدام اختبارات 5,5′-ديثيوبيس-(حمض 2-نيتروبنزويك) (DTNB)⁷. تم قياس المستويات الكلية لأكسيد النيتريك (NO) في البلازما والأنسجة المتجانسة باستخدام تفاعل جريس بعد تقليل النترات⁷. جميع المعايير الكيميائية الحيوية تعبر عنها كبروتين nmol/g أو نسيج ميكرومول/غ، كما هو موضح في الشكل 3 والشكل 4. تم إجراء جميع الفحوصات الكيميائية الحيوية بشكل مكرر، واستخدمت القيم المتوسطة للتحليل الإحصائي.

بالإضافة إلى تحليلات أنسجة الدماغ، أجريت تقديرات كيميائية حيوية في عينات الدم لتقييم الحالة التأكسدية الجهازية الناتجة عن التعرض ل BPA. تم تحديد مستويات تأكسد الدهون في البلازما باستخدام طريقة TBARS، وتم التعبير عن النتائج كمكافئ ل MDA. تم قياس مستويات الكبريتيريل المخفضة (RSH) باستخدام DTNB، وتم تقييم مستويات NO الإجمالية باستخدام تفاعل جريس بعد تقليل النترات، كما هو موضح سابقا⁷. تم تسجيل قيم الامتصاص مطيافيا عند 532 نانومتر (TBARS)، 412 نانومتر (RSH)، و540 نانومتر (NO). تم إجراء جميع الاختبارات بشكل مكرر وتحت ظروف موحدة.

BPA هو سموم بيئية منتشرة تدخل الدورة الدموية الجهازية وتؤثر على الأعضاء المتعددة؛ لذلك، توفر مؤشرات الإجهاد التأكسدي المتداولة معلومات مكملة تعكس اختلال الأكسدة الاختزالية الكلي ^1,2. يسمح تقييم المعايير الكيميائية الحيوية القائمة على الدم بتقييم العلاقة بين التغيرات التأكسدية المركزية والطرفية ويعزز الصلة الانتقالية للنتائج، حيث تستخدم هذه العلامات عادة في الدراسات البيئية والسريرية لمراقبة السمية المرتبطة بالتعرض.

تحليل البقع الغربية
تم إجراء تحليل البقعة الغربية لتحديد مستويات بروتينات Keap-1 وNrf-2 في نسيج الحصين. تم توحيد حوالي 50 ملغ من الأنسجة في 500 ميكرولتر من محلول RIPA الذي يحتوي على مزيج مثبط للبروتيياز. تم طرد الكميات المتجانسة بحرارة 14,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم جمع المواد الفائقة. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام اختبار قياس كمية البروتين الفلورومتري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وتم حساب التركيزات من منحنى معايرة قياسي. تم خلط كميات متساوية من البروتين (30 ميكروغرام) مع محلول Laemmli يحتوي على β-ميركابتوإيثانول، وتم تسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وفصلها على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪، ونقلها إلى أغشية PVDF عند 110 فولت لمدة 60-90 دقيقة. تم حجب الأغشية بنسبة 3٪ من BSA وحضنتها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد Keap-1 وNrf-2 (1:3000) و β-أكتين (1:1000)، تلاها الحضانة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المتقاربة مع HRP. تم تصور أشرطة البروتين بواسطة التوألؤ الكيميائي، وتم قياس شدة الأشرطة بواسطة تحليل كثافة وتطبيع إلى β-أكتين.

التحليل النسيجي المرضي
تم تثبيت عينات أنسجة الدماغ من نصف الكرة الأيمن في فورمالين مخزن 10٪ محايد لمدة 72 ساعة، وتم تجفيفها عبر سلسلة الإيثانول المصنفة، وإزالتها في الزيلين، وتم تضمينها في البرافين وفقا للإجراءات النسيجية القياسية⁹. تم تخصيص الأنسجة الطازجة للتحليلات الكيميائية الحيوية. تم الحصول على مقاطع إكليلية (5 ميكرومتر) عند مستويات قشرة الحصين وقشرة التورين بناء على أطلس دماغ الجرذ¹⁰. تم تركيب أربعة مقاطع متتالية لكل حيوان على شرائح زجاجية للتقييمات الأنسجة والكيميائية المناعية، مما يضمن سماكة مقطع متناسقة وتحديد موقع تشريحي. تم إزالة البارافين، وإعادة ترطيب، وصبغ المقاطع بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) وفقا لبروتوكولات التلوين الروتينية¹¹. تم إجراء الفحص النسيجي المرضي تحت المجهر الضوئي بواسطة مراقب مدرب واحد أعمى عن المجموعات التجريبية لتقليل التحيز والقضاء على التفاوت بين المراقبين.

التحليل الكيميائي المناعي النسجي
تم اختيار مناطق الاهتمام، بما في ذلك الحصين والقشرة الداخلية، بناء على قابليتها للسمية العصبية الناتجة عن BPA وأدوارها في التنظيم المعرفي والعاطفي ^1,2. تم إجراء تلوين كيميائي مناعي لجرعة Nrf-2 وKeap-1 على أقسام دماغية مدمجة بالبارافين. تم إزالة البارافين من الأقسام في الزيلين، وإعادة ترطيبها عبر سلسلة الإيثانول المتدرجة، وخضعت لاسترجاع المستضدات الناتج عن الحرارة في محلول السترات (pH 6.0). تم تدفئة نشاط البيروكسيداز الداخلي قبل الحضانة.

تم حضان الأقسام طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد Nrf-2 (1:100) وKeap-1 (1:200). تم إجراء الكشف باستخدام نظام كشف HRP بوليمري متوفر تجاريا وجاهز للاستخدام، يحتوي على أجسام مضادة ثانوية خاصة بأنواع محددة مرتبطة ببيروكسيداز الفجل الحار، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم رصد النشاط المناعي باستخدام 3,3′-ديامينوبينزيدين (DAB) ككروموجين، تلاها التلوين المضاد بالهيماتوكسيلين. تم تجفيف الأقسام وإزالتها وإزالة الغطاء من المناطق.

تمت معالجة الأقسام السلبية في الضابط بالتوازي دون الحاجة إلى حضانة الأجسام المضادة الأولية. للتحليل الكمي، تم تقييم ثلاثة أقسام غير متجاورة لكل حيوان. تم التقاط الصور تحت إعدادات تعريض متطابقة لجميع المجموعات. تم تحليل ستة عشر حقلا غير متداخل في كل قسم باستخدام برنامج ImageJ. تم تحديد المناطق ذات الاهتمام يدويا، وطرح التلوين الخلفي، وتم التعبير عن النشاط المناعي كقيمة رمادية متوسطة. تم حساب القيمة المتوسطة لكل حيوان واستخدامها في التحليل الإحصائي.

التقييم النسيجي المرضي
تم تقييم التغيرات النسيجة المرضية بشكل شبه كمي على المقاطع الملونة ب H&E. تم فحص عشرة حقول غير متداخلة مختارة عشوائيا لكل قسم، وتم تقييم المعايير المرضية بشكل مستقل. تم تقييم شدة الضرر في الحصين والقشرة الداخلية باستخدام مقياس من أربع نقاط يعتمد على نسبة الخلايا المتأثرة: الدرجة 0 (<5٪)، الدرجة 1 (≤ ثلث)، الدرجة 2 (ثلث إلى ثلثين)، والنتيجة 3 (> ثلثين). تم استخدام متوسط الدرجات لكل حيوان في التحليل الإحصائي.

التحليل الإحصائي
تم تحليل البيانات باستخدام برنامج SPSS (الإصدار 29.0) وتم تقديمها كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم تحديد حجم العينة بناء على دراسات سابقة وتحليل القوة، مما يشير إلى أن ستة حيوانات لكل مجموعة توفر >80٪ من القوة لاكتشاف الفروق البيولوجية ذات الصلة. تم تقييم توزيع البيانات الطبيعي باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. تم تقييم تجانس التباين باستخدام اختبار ليفين. أجريت مقارنات جماعية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاها اختبار توكي بعد الاختبار. تم تحديد الدلالة الإحصائية عند p < 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وزن الجسم
لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في وزن الجسم بين المجموعات في اليومين الأول والثاني والثلاثين من الدراسة (F(3,20)=2.750، p > 0.05؛ الشكل 2).

نتائج اختبار السلوك
كشف تحليل اختبارات المجال المفتوح أن التعرض ل BPA قلل بشكل ملحوظ من النشاط الحركي، كما يتضح من انخفاض عدد المعابر مقارنة بمجموعة الضابطين (p < 0.001). أدى العلاج بجرعة 10 ملغ/كغ و20 ملغ/كغ من زيادة عدد الت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

قيمت الدراسة الحالية تأثيرات BPA، وهو مكون هيكلي في بلاستيك البولي كربونات يعتبره USEPA آمنا بجرعة 50 ميكروغرام/كجم ^1,2، على الإجهاد التأكسدي، وإشارات Keap-1/Nrf-2، والسلوك، والتغيرات النسيجية المرضية في دماغ الفئران. بالإضافة إلى ذلك، تم دراسة التأثيرات الوقائية العصبية المحتملة ل TQ، وهو مركب طبيعي وله خصائص مضادة للأكسدة موثقة جيدا، بجرعتين مختلفتين (10 ملغ/كغ و20 ملغ/كغ)^5,6,7

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا المشروع مكتب تنسيق مشاريع البحث العلمي في الجامعة (رقم المشروع TIP. A4.24.003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)	Thermo Scientific	69-78-3
Benchtop centrifuge NF048	Nüve	43560
Beta_Actin	ThermoFisher Scientific, United States	7D2C10
Bisphenol A	Merck	239658
BSA solution	Proteintech, United States)	66201-1-Ig
Butylated hydroxytoluene	Sigma Aldrich	128-37-0
Dijital Homojenizatör	Daihan Scientific	https://www.artlaboratuvarcih azlari.com/urun/daihan-hg- 15d-dijital-homojenizator-set -a?srsltid=AfmBOorx_az06ulc HpSzKZsuP8-47Za4BkvLOM2 2Xhp00tgwWhJ-86Vc
Hematoxylin–eosin	Bio Optica	W01030708
Hydrochloric acid	Merck	7647-01-0
Image J software program	NIH; Washington, U.S.A.	https://imagej.net/ij/
Immunohistochemical staining kit	Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: anti-polyvalent	HRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472	Germany	https://www.leicabiosystems. com/histology-equipment/mic rotomes/histocore-autocut/
Light microscope	Nikon, Eclipse	Ni-U, 940728
N-(1-Naphthyl)ethylenediamine	Thermo Scientific	1465-25-4
Nano Microplate Reader	BMG LABTECH	SPECTROstar Nano
phosphate-buffered saline	Merck	P4417
Primary antibodies Keap-1	Proteintech	Cat No. 10503-2-AP, 1:200
Primary antibodies Nrf-2	Proteintech	Cat No. 16396-1-AP, 1/100
Qubit Protein BR Assay Kit	ThermoFisher Scientific-INVITROGEN	Q33211
sodium citrate	Merck	03-04-6132
Sodium Dodecyl Sulfate	Thermo Scientific	151-21-3
sodium hydroxide	Merck	1310-73-2
Sodium nitrate	Merck	7631-99-4
Streptavidin Peroxidase	Thermo Scientific	SHRP248-B
sulfanilamide	Thermo Scientific	63-74-1
thiobarbituric acid	Merck	504-17-6
TQ	CAYMAN	490-91-5
Tricarballylic acid, 99%	Thermo Scientific Chemicals	139360500
Trichloroacetic acid	Thermo Scientific Chemicals	76-03-9
Tris-HCl	Thermo Scientific	1185-53-1
Vanadium(III) chloride	Sigma Aldrich	7718-98-1
West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate and the iBright 750	Thermo Fisher Scientific system	https://www.clinxsci.com/product/mini _chemiluminescence_imaging_system ?gad_source=1&gad_campaignid= 16224184202&gbraid=0AAAAAoN6 UOOtoB8UD0deumBAMD8Xi-1l-&g clid=CjwKCAjwgeLHBhBuEiwA L5gNEXtK2CNSLS1GqllMuNgkrFYD aW7yK585njQjFja485Fkwj9lRUEKD BoCgLoQAvD_BwE
Zinc sulfate solution	Merck	7733-02-0

المراجع

Castillo, L. Y., et al. Juvenile exposure to BPA alters the estrous cycle and differentially increases anxiety-like behavior and brain gene expression in adult male and female rats. Toxics. 10, 513 (2022).
Fan, Y., et al. Preconception paternal bisphenol A exposure induces sex-specific anxiety and depression behaviors in adult rats. PLoS One. 13, e0192434 (2018).
Sevastre-Berghian, A. C., et al. Neurotoxicity of bisphenol A and the impact of melatonin administration on oxidative stress, ERK/NF-?B signaling pathway, and behavior in rats. Neurotoxicol Res. 40, 1882-1894 (2022).
Elswefy, S. E., et al. Inflammation, oxidative stress and apoptosis cascade implications in bisphenol A-induced liver fibrosis in male rats. Int J Exp Pathol. 97, 369-379 (2016).
Dong, J., et al. Thymoquinone prevents dopaminergic neurodegeneration by attenuating oxidative stress via the Nrf2/ARE pathway. Front Pharmacol. 14, 615598 (2021).
Fadishei, M., et al. Effects of Nigella sativa oil and thymoquinone against bisphenol A-induced metabolic disorder in rats. Phytother Res. 35, 2005-2024 (2021).
Kuzay, D., et al. Effects of thymoquinone in a rat model of reserpine-induced depression. Braz J Pharm Sci. 58, e19847 (2022).
Brocardo, P. S., et al. Anxiety- and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders: Protective effects of voluntary physical exercise. Neuropharmacology. 62, 1607-1618 (2012).
Bancroft, J. D., Gamble, M. . Theory and Practice of Histological Techniques. , (2013).
Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2022).
Klopfleisch, R. Multiparametric and semiquantitative scoring systems for the evaluation of mouse model histopathology. BMC Vet Res. 9, 123 (2013).
Helli, B., et al. The protective effects of syringic acid on bisphenol A-induced neurotoxicity possibly through AMPK/PGC-1?/FNDC5 and CREB/BDNF signaling pathways. Mol Neurobiol. 61, 7767-7784 (2024).
Lotfi, M., et al. Thymoquinone improved nonylphenol-induced memory deficit and neurotoxicity through its antioxidant and neuroprotective effects. Mol Neurobiol. 59, 3600-3616 (2022).
Hatipoglu, D., et al. Neuroprotective role of Nigella sativa seed oil in mitigating bisphenol A-induced neurodegeneration. Sci Rep. 15, 22477 (2025).
Kobayashi, K., et al. Effects of bisphenol A on oxidative stress in the rat brain. Antioxidants (Basel). 9, 240 (2020).
Elbakry, M., et al. Nattokinase attenuates bisphenol A- or gamma irradiation-mediated hepatic and neural toxicity by activation of Nrf2 and suppression of inflammatory mediators in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 29, 75086-75100 (2022).
Tekin, S., et al. Molecular insights into the antioxidative and anti-inflammatory effects of p-coumaric acid against bisphenol A-induced testicular injury: In vivo and in silico studies. Reprod Toxicol. 125, 108579 (2024).
Sahu, C., et al. Zinc-deficient diet increases the toxicity of bisphenol A in rat testis. J Biochem Mol Toxicol. 34, e22549 (2020).
Hua, D., et al. Tetramethyl bisphenol A inhibits Leydig cell function in late puberty by inducing ferroptosis. Ecotoxicol Environ Saf. 236, 113515 (2022).
Okoh, O. S., et al. Thymoquinone inhibits neuroinflammatory mediators and vasoconstriction injury via NF-?B-dependent NeuN/GFAP/Ki-67 pathways in hypertensive dams and F1 male pups exposed to bisphenol A analogues. Toxicol Appl Pharmacol. 494, 117162 (2025).
Abdel-Wahab, W. M. Thymoquinone attenuates toxicity and oxidative stress induced by bisphenol A in the liver of male rats. Pak J Biol Sci. 17, 1152-1160 (2014).
Abu-Elfotuh, K., et al. Protective effects of thymoquinone and/or thymol against monosodium glutamate-induced ADHD-like behavior in rats: Modulation of Nrf2/HO-1, TLR4/NF-?B/NLRP3/caspase-1 and Wnt/?-catenin pathways. Biomed Pharmacother. 155, 113799 (2022).
Qadri, M., et al. Thymoquinone ameliorates carfilzomib-induced renal impairment by modulating oxidative stress markers, inflammatory/apoptotic mediators, and augmenting Nrf2 in rats. Int J Mol Sci. 24, 10621 (2023).
Patisaul, H. B., Bateman, H. L. Neonatal exposure to endocrine-active compounds or an ER? agonist increases adult anxiety and aggression in gonadally intact male rats. Horm Behav. 53, 580-588 (2008).
Singh, S. P., et al. Evaluation of p21 expression and related autism-like behavior in bisphenol A-exposed offspring of Wistar albino rats. Birth Defects Res. 114, 536-550 (2022).
Elkader, H. T. E., et al. Perinatal bisphenol A exposure has age- and dose-dependent associations with thyroid allostasis and anxiogenic-depressive-like behaviors in male rats. Physiol Behav. 288, 114732 (2025).
Morin, A., et al. Adult male rats show resilience to adolescent bisphenol A effects on hormonal and behavioral responses, while co-exposure with hop extracts supports synergistic actions. Front Toxicol. 3, 639820 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Keap 1 Nrf 2