تأثيرات على جودة الحمض النووي الريبي لراكبات PBMC تحت أوقات حفظ بالتبريد المختلفة وطرق المعالجة لدى مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا المتقدم

ملخص

تقارن هذه الدراسة بين كاشف العزل الثلاثي (TRIzol) والمحلول الكلاسيكي (FBS + DMSO) لأقراص PBMC الخاصة بالمرضى بحفظ NSCLC بالتجميد. يحافظ TRIzol على سلامة مرضية للحمض النووي الريبي لمدة تصل إلى 6 أشهر، مما يجعله موصى به للحفاظ عالي الجودة على RNA.

الملخص

تستخدم خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المحفوظة بالتبريد (PBMCs) على نطاق واسع في تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq)، وتؤثر جودة الحمض النووي الريبي الخاصة بها مباشرة على نتائج الاختبار. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي الحفظ بالتجميد بسهولة إلى تدهور الحمض النووي الريبي في ال PBMCs، ولا تزال مسألة كيفية تحسين جودة الحمض النووي الريبي أثناء الحفظ بالتبريد طويل الأمد غير محلولة. تم استخدام اختبارات PBMCS من عينات دم جديدة مأخوذة من مرضى مصابين بسرطان الرئة غير صغير الخلايا المتقدم (NSCLC) كعوامل تحكم. تمت مقارنة فعالية حفظ الحمض النووي الريبي لعينات PBMC بين محلول الحفظ بالتبريد الكلاسيكي للخلايا (90٪ مصل البقري الجنيني [FBS] + 10٪ ثنائي ميثيل كبريتسيد [DMSO]) وكاشف استخراج الحمض النووي الريبي المشترك (TRIzol) عند -80 درجة مئوية لمدة 1 و3 أشهر و6 أشهر. تم تقييم تركيز الحمض النووي الريبي، ونقائه، وسلامته (كما يقاس برقم سلامة الحمض النووي الريبي [RIN]) باستخدام مقياس طيفي متعدد العينات من الأشعة فوق البنفسجية-Vis ومحلل كهربائي ميكروسائل آلي لتوفير أساس نظري للحفاظ على عينات RNA عالية الجودة. أظهرت هذه الدراسة أن تركيز ونقاء وسلامة الحمض النووي الريبي في ال PBMCs تنخفض مع طول مدة الحفظ بالتجميد. بينما لم تؤثر الطريقتان على تركيز الحمض النووي الريبي، إلا أنهما أثرتا على نقاء وسلامة الحمض الريبي. ظلت سلامة الحمض النووي الريبي لأجهزة PBMC التي تم حفظها بالتجميد مع TRIzol لمدة 6 أشهر مرضية. تشير نتائجنا إلى أن ترايزول يساهم في الحفظ بالتبريد الفعال ويحافظ على جودة عالية من الحمض النووي الريبي.

المقدمة

يلعب تسلسل RNA ل PBMC لدى مرضى NSCLC دورا حاسما في تقييم فعالية العلاج المناعي. سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) هو ورم خبيث شائع في جميع أنحاء العالم، ويتم تشخيص حوالي 70٪ من المرضى في مرحلة متقدمة مع توقعات ضعيفة ^1,2. لقد أحدث العلاج المناعي ثورة في نموذج العلاج ل NSCLC، مقدما استراتيجيات علاجية مبتكرة^3،4. في علاج مثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICI)، يمكن لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لخلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) التي يتم الحصول عليها من مرضى NSCLC مراقبة التغيرات الديناميكية للفوائد السريرية ....

البروتوكول

جميع الإجراءات التي تشمل عينات أنسجة بشرية وعينات سريرية في هذه الدراسة أجريت وفقا للإرشادات المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جيلين للسرطان (رقم الموافقة الأخلاقية 202507-002-01). تم الحصول على موافقة كتابية مستنيرة من جميع المشاركين أو من أوصيائهم القانونيين قبل جمع العينات. تم جمع عينات دم محيطية (10 مل لكل مريض) من 19 مريضا مصابا بسرطان الرئة غير صغير الخلايا المتقدم (NSCLC) في مستشفى جيلين للسرطان، مما أسفر عن ما مجموعه 133 عينة RNA. لضمان سلامة المختبر، تم إجراء جميع العمليات المتعلقة بالمواد الكيميائية الخطرة في خزانة السلامة البيولوجية.

تم توفير معلومات مفصلة عن الأدوات و....

النتائج

تأثيرات أوقات الحفظ بالتبريد المختلفة وطرق المعالجة على تركيز الحمض النووي الريبي في عينات PBMC
تأثير أوقات الحفظ بالتجميد المختلفة: كانت عينات PBMC الجديدة من مرضى NSCLC المتقدمين هي المجموعة الضابطة. تمت معالجة العينات إما ب TRIzol أو 90٪ FBS + 10٪ DMSO وتم تخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة شهر واحد وثلاثة و6 أشهر؛ تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي لقياس تركيز الحمض النووي الريبي. بالنسبة للعينات المعالجة بالتريزول، كانت تركيزات الحمض النووي الريبي عبر المجموعات ا.......

المناقشة

تؤثر العديد من العوامل على جودة الحمض النووي الريبي في العينات البيولوجية، بما في ذلك المتغيرات ما قبل التحليل، وظروف النقل، ومدة المعالجة في درجة الحرارة المحيطة، ونخر الأنسجة، ودرجة الحرارة ومنتجات التجميد، وحجم العدد الكبير، بالإضافة إلى مدة التخزين، كل عوامل تؤثر بشكل كبير على جودة الحمض النووي^{الريبي 21}. بالنسبة للعينات المتطابقة، يمكن أن تؤثر التغيرات في وقت الحفظ بالتبريد وطرق المعالجة بشكل كبير على جودة الحمض النووي الريبي. سلطت الدراسات السابقة الضوء على ا.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
المحلل الحيوي Agilent 2100	أجيلينت	G2939B	اكتشاف سلامة الحمض النووي الريبي، وتقييم جودة الحمض النووي الريبي عن طريق توليد رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN)
مجموعة النانو Agilent RNA 6000	أجيلينت	5067-1511	بالتعاون مع المحلل الحيوي Agilent 2100، يوفر كواشف وشرائح مخصصة لسلامة الحمض النووي الريبي
الطرد المركزي	إبندورف	5424R	لاستخراج الحمض النووي الريبي
الطرد المركزي	إبندورف	5810R	لاستخراج PBMC
الكلوروفورم	شركة مجموعة الأدوية الوطنية الصينية	20191031	لاستخلاص الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة تريزول، تستخدم لفصل الطور المائي المحتوي على الحمض النووي الريبي عن الشوائب العضوية التي تحتوي على الشوائب
ثنائي ميثيل كبريتات	دينغقوه تشانغشنغ بكين	DH105-2	كحل لحفظ العينات بالتبريد لأنظمة PBMC، مما يتيح تخزينا طويل الأمد للعينات عند -80 و°G؛ C
تيوب	كورنينغ	MCT-150-C	لتخزين العينات، وخلط الكواشف، والطرد المركزي، وعمليات تجريبية أخرى
الإيثانول	شاندونغ ليركانغ	25071901A	IIn استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة تريزول، المستخدمة لغسل الرواسب الريبية لإزالة البقايا
مصل الأبقار الجنيني	إكسبيوميد	C04001-500	كحل للحفظ بالتجميد لأجهزة PBMC، تمكين التخزين طويل الأمد ل
حل فصل فيكول	شركة بكين دينغغو تشانغشنغ للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	CC0161	لعزل وتنقية PBMC عبر الطرد المركزي بتدرج الكثافة
GeneTouch (Plus) Thermal Cycler	بيور	TC-EA-48DA	لإزالة الطبيعة الحرارية للحمض النووي الريبي (70 & deg; C لمدة دقيقتين)، تليها الكشف بواسطة المحلل الحيوي
إيزوبوبانول	شركة مجموعة الأدوية الوطنية الصينية	20210929	في استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة تريزول، المستخدمة في ترسيب الحمض النووي الريبي
مطياف نانوسدروب 8000	شركة جين	ND-8000	بالنسبة لتركيز الحمض النووي الريبي (بناء على الامتصاص عند 260 نانومتر) والنقاء (بناء على نسبة A260/A280) باستخدام طريقة الامتصاص بالأشعة فوق البنفسجية
أنابيب PCR	كورنينغ	PCR-02-C	لإزالة الطبيعة الحرارية للحمض النووي الريبي (70 & deg; C لمدة دقيقتين)، تليها الكشف بواسطة المحلل الحيوي
محلول ملحي مخزن بالفوسفات&nb;	نظام بروسيل	PB180327	للتحليل المباشر والحفاظ على PBMCs، أو الحمض النووي الريبي الكلي اللاحق
كاشف العزل الثلاثي	أدسين	ADS60154	للتحليل المباشر والحفاظ على PBMCs، أو الحمض النووي الريبي الكلي اللاحق