مقالة بحثية

تأثيرات على جودة الحمض النووي الريبي لراكبات PBMC تحت أوقات حفظ بالتبريد المختلفة وطرق المعالجة لدى مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا المتقدم

242 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70261

⸱

أبريل 21, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biobank, Jilin Cancer Hospital, 2Medical Oncology Translational Research Lab, Jilin Cancer Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقارن هذه الدراسة بين كاشف العزل الثلاثي (TRIzol) والمحلول الكلاسيكي (FBS + DMSO) لأقراص PBMC الخاصة بالمرضى بحفظ NSCLC بالتجميد. يحافظ TRIzol على سلامة مرضية للحمض النووي الريبي لمدة تصل إلى 6 أشهر، مما يجعله موصى به للحفاظ عالي الجودة على RNA.

الملخص

تستخدم خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المحفوظة بالتبريد (PBMCs) على نطاق واسع في تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq)، وتؤثر جودة الحمض النووي الريبي الخاصة بها مباشرة على نتائج الاختبار. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي الحفظ بالتجميد بسهولة إلى تدهور الحمض النووي الريبي في ال PBMCs، ولا تزال مسألة كيفية تحسين جودة الحمض النووي الريبي أثناء الحفظ بالتبريد طويل الأمد غير محلولة. تم استخدام اختبارات PBMCS من عينات دم جديدة مأخوذة من مرضى مصابين بسرطان الرئة غير صغير الخلايا المتقدم (NSCLC) كعوامل تحكم. تمت مقارنة فعالية حفظ الحمض النووي الريبي لعينات PBMC بين محلول الحفظ بالتبريد الكلاسيكي للخلايا (90٪ مصل البقري الجنيني [FBS] + 10٪ ثنائي ميثيل كبريتسيد [DMSO]) وكاشف استخراج الحمض النووي الريبي المشترك (TRIzol) عند -80 درجة مئوية لمدة 1 و3 أشهر و6 أشهر. تم تقييم تركيز الحمض النووي الريبي، ونقائه، وسلامته (كما يقاس برقم سلامة الحمض النووي الريبي [RIN]) باستخدام مقياس طيفي متعدد العينات من الأشعة فوق البنفسجية-Vis ومحلل كهربائي ميكروسائل آلي لتوفير أساس نظري للحفاظ على عينات RNA عالية الجودة. أظهرت هذه الدراسة أن تركيز ونقاء وسلامة الحمض النووي الريبي في ال PBMCs تنخفض مع طول مدة الحفظ بالتجميد. بينما لم تؤثر الطريقتان على تركيز الحمض النووي الريبي، إلا أنهما أثرتا على نقاء وسلامة الحمض الريبي. ظلت سلامة الحمض النووي الريبي لأجهزة PBMC التي تم حفظها بالتجميد مع TRIzol لمدة 6 أشهر مرضية. تشير نتائجنا إلى أن ترايزول يساهم في الحفظ بالتبريد الفعال ويحافظ على جودة عالية من الحمض النووي الريبي.

المقدمة

يلعب تسلسل RNA ل PBMC لدى مرضى NSCLC دورا حاسما في تقييم فعالية العلاج المناعي. سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) هو ورم خبيث شائع في جميع أنحاء العالم، ويتم تشخيص حوالي 70٪ من المرضى في مرحلة متقدمة مع توقعات ضعيفة 1,2. لقد أحدث العلاج المناعي ثورة في نموذج العلاج ل NSCLC، مقدما استراتيجيات علاجية مبتكرة3،4. في علاج مثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICI)، يمكن لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لخلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) التي يتم الحصول عليها من مرضى NSCLC مراقبة التغيرات الديناميكية للفوائد السريرية للعلاج المناعي5. تشمل مصادر العينات ل RNA-seq أنسجة الورم وPBMCs 6,7، حيث تعمل PBMCs كعينة حيوية في كل من التجارب السريرية والبحث العلمي الأساسي8. يمثل الحفظ بالتبريد الطريقة الأساسية لتخزين العينات على المدى الطويل، حيث يحافظ على الخلايا والأنسجة في حالة سكونية مع الحفاظ على إمكاناتها وخصائصها البيولوجية. وبالتالي، أصبح الحفظ بالتجميد لأجهزة PBMC نهجا ممكنا ومعتمدا على نطاق واسع. يسهل PBMC المحفوظ بالتبريد التحليل الدفعي للعينات، ويقلل من التفاوت داخل المختبر وبين المختبرات، ويحسن استخدام الموارد 8,9. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات أن استخدام وسط RPMI-1640 مجمد مع 40٪ مصل العجل الجنيني (FCS) و20٪ ثنائي ميثيل كبريتوكسيد (DMSO) لحفظ PBMC بالتبريد يظهر أن نسب الخلايا التائية وB التي تعبر عن مزيج CD39 وCD73 ظلت مستقرة نسبيا خلال ستة أشهر من التخزين10. قارنت إحدى الدراسات ثلاث مجموعات حفظ تجميد تجارية وعاملين واقيين بالتبريد (90٪ RPMI-10٪ DMSO، 90٪ بلازما-10٪ DMSO)، وكشفت عن قدرة خلايا متشابهة (81.0٪) ومعدلات استرداد مماثلة (73.7٪) عبر الطرق المختلفة. ومع ذلك، أظهرت جميع العينات المحفوظة بالتجميد قابلية بقاء أقل بكثير مقارنة بالعينات الطازجة5. أظهرت أبحاث إضافية أن PBMC المعلق يترسب في كاشف TRIzol ويقوم بتجميده فورا عند -80 درجة مئوية. بعد يوم إلى يومين، لاحظوا أن قيمة RIN لعينات الدم الكاملة 11 كانت أعلى من قيمة RIN لعينات الدم الكاملة11.

قارن تحقيق آخر عينات الكريات البيضاء التي عولجت ب TRIzol وRNAlater وكواشف أخرى، وأظهرت أن جميع الطرق حققت قيم عدد سلامة RNA (RIN) >7. تم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام محلل كهربائي ميكروفلويد آلي، وتم حساب RIN كميا لجودة الحمض النووي الريبي. اعتبرت العينات التي تحتوي على RIN ≥7 مناسبة لتحليل RNA-seq12. ومن الجدير بالذكر أن مجموعة الكريات البيضاء + RNAlater أظهرت إنتاجا أقل بكثير من إنتاج RNA مقارنة بمجموعة الكريات البيضاء + TRIzol12. ومع ذلك، تركز الأبحاث الحالية حول حفظ PBMC بالتجميد بشكل رئيسي على قدرة الخلايا على بقاء الخلايا وتحليل النمط الظاهري للخلايا المناعية بعد الذوبان؛ تم تخصيص اهتمام محدود للتقييم المنهجي وطويل الأمد لجودة الحمض النووي الريبي تحت ظروف حفظ مختلفة. علاوة على ذلك، لا تزال البروتوكولات الموحدة لحفظ عينات PBMC بالتبريد للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي غير متطورة 13,14,15. هذه الفجوة ذات صلة خاصة بالعلاج المناعي من NSCLC، حيث يكون الحمض النووي الريبي عالي الجودة من PBMCs المجمعة طوليا ضروريا لاكتشاف المؤشرات الحيوية الموثوقة ومراقبة استجابة العلاج.

في هذه الدراسة، نفترض أن اختيار طريقة الحفظ بالتبريد يؤثر بشكل كبير على سلامة وجودة الحمض النووي الريبي المستخرج من PBMCs، ويمكن لبروتوكول محسن الحفاظ على ملاءمة الحمض النووي الريبي للاختبارات الحساسة مثل RNA-seq. لمعالجة ذلك، تم استخدام PBMCs المعزولة حديثا من عينات دم مأخوذة من مرضى NSCLC المتقدمين كعناصر تحكم. تمت مقارنة فعالية حفظ الحمض النووي الريبي لعينات PBMC بين طريقتي علاج (90٪ FBS + 10٪ DMSO وTRIzol) عند -80 درجة مئوية لمدة 1 و3 و6 أشهر (الشكل 1). تم تقييم تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء وسلامة (كما يقيس بواسطة RIN) باستخدام مطياف UV-Vis متعدد العينات ومحلل كهربائي ميكروفلويدي آلي. تهدف هذه الدراسة إلى توفير أساس نظري لحفظ عينات RNA عالية الجودة وتعزيز البحث الانتقالي وحفظ العينات في الطب الدقيق للأورام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الإجراءات التي تشمل عينات أنسجة بشرية وعينات سريرية في هذه الدراسة أجريت وفقا للإرشادات المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جيلين للسرطان (رقم الموافقة الأخلاقية 202507-002-01). تم الحصول على موافقة كتابية مستنيرة من جميع المشاركين أو من أوصيائهم القانونيين قبل جمع العينات. تم جمع عينات دم محيطية (10 مل لكل مريض) من 19 مريضا مصابا بسرطان الرئة غير صغير الخلايا المتقدم (NSCLC) في مستشفى جيلين للسرطان، مما أسفر عن ما مجموعه 133 عينة RNA. لضمان سلامة المختبر، تم إجراء جميع العمليات المتعلقة بالمواد الكيميائية الخطرة في خزانة السلامة البيولوجية.

تم توفير معلومات مفصلة عن الأدوات والكواشف والمواد الاستهلاكية المستخدمة في التجربة في جدول المواد.

عزل PBMC
تمت معالجة عينات الدم الطرفية لعزل PBMC خلال ساعتين من الجمع. تم عزل وتطهير وحدات PBMC بواسطة الطرد المركزي بتدرج كثافة Ficoll-Paque عند 400 × جرام لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تعطيل الفرامل. بعد الطرد المركزي،تم استنشاق طبقة الخلايا اللمفاوية البيضاء الحليبية الوسيطة (التي تحتوي على PBMCs) بعناية. ومن المهم أننا قمنا بتوحيد تركيز مدخلات PBMC لكل عينة وكل مجموعة لضمان وجود أعداد خلايا متسقة عبر جميع الظروف التجريبية، وبالتالي تقليل التفاوت الناتج عن إدخال الخلية والمعالجة. هذا يضمن أن الفروقات الملحوظة تعكس تأثيرات حقيقية لطرق الحفظ المختلفة بدلا من التغيرات التقنية. لكل مريض، تم تقسيم أنابيب PBMC معزولة إلى 7 أنابيب: استخدم أنبوب واحد لاستخراج RNA فوري، وتم تقييم التركيز والنقاء والنزاهة. أما الأنابيب الستة المتبقية فقد تم حفظها بالتجميد بمعدل تبريد -1 درجة مئوية/دقيقة: ثلاثة تم معالجتها ب 1 مل من 90٪ FBS + 10٪ DMSO، والثلاثة الأخرى ب 1 مل من تريزول، تلاها تخزين عند -80 °م. تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي وتقييم الجودة بعد شهر وثلاثة و6 أشهر من التخزين المجمد.

استخراج الحمض النووي الريبي
تمت إزالة العينات من التخزين بدرجة -80 درجة مئوية وذوبت عند 4 درجات مئوية حتى تم إذابتها بالكامل17. تم غسل العينات المحفوظة بمحلول حفظ 90٪ من FBS + 10٪ DMSO أو TRIzol مرة واحدة باستخدام PBS، ثم تم طرد المركزي عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم التخلص من المادة الفائقة للاحتفاظ بحبيبات الخلية. تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام ترايزول. على وجه التحديد، أضيف كاشف ترايزول إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على العينة المعالجة، وخلط عن طريق الانعكاس، وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لضمان التحلل الكامل. بعد ذلك، أضيف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم، وخلطه جيدا بالرج، وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي عند 2400 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، تم سحب الطور المائي العلوي بعناية ونقله إلى أنبوب إبندورف جديد. ثم يضاف الأيزوبروبانول (0.5 مل)، ويخلط جيدا، ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5–10 دقائق. بعد الطرد المركزي عند 2400 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، تم التخلص من المادة الفائقة، تاركة الحمض النووي الريبي ترسب في أسفل الأنبوب.

تم إعادة تعليق الراسب في 75٪ إيثانول (1 مل) مع هز لطيف، تلاها الطرد المركزي عند 1600 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم التخلص من المادة الفائقة، وتركت رصاصة RNA لتجف في الهواء عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5–10 دقائق. وأخيرا، تم إذابة عينات RNA في مياه معالجة ب DEPC بسعة 50 ميكرولتر وحضنتها في حمام ماء بدرجة حرارة 55–60 درجة مئوية لمدة 5–10 دقائقو18 دقيقة. اكتشاف تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي. تم قياس تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مطياف UV-Vis متعدد العينات (نطاق القياس: 2.5–3000 نانوغرام/ميكرولتر). تم تحديد تركيز الحمض النووي الريبي بناء على قيمة الامتصاص عند 260 نانومتر، بينما تم تقييم نقاء الحمض النووي الريبي باستخدام نسبة A260/A280. تم إطلاق برنامج القياس؛ تم النقر على "حمض النووي" على الواجهة الرئيسية. تم غسل منصة الكشف مرتين بماء مقطر مزدوج، ثم تم نقل 1.5 ميكرولتر من عينة RNA عليها. تم اختيار RNA-40 لنوع العينة، وتم النقر على "القياس"، وتم تسجيل قيم التركيز ونقاء A260/280. تشير نسبة A260/A280 بين 1.9 و2.1 إلى نقاء RNA عالي، بينما تشير القيم الأقل من 1.8 إلى تلوث البروتين، والقيم التي تزيد عن 2.2 إلى احتمال تحلل RNA أو بقايا إيزوثيوسيانات19.

كشف سلامة الحمض النووي الريبي
تم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) باستخدام جهاز تحليل حيوي ومجموعة كشف إلكترونية ميكروفلويدية دقيقة. يتراوح عدد RIN بين 1 و10، حيث يشير 1 إلى RNA متدهور بشدة و10 يشير إلى RNA سليم. للتحليل، تم وضع 1.2 ميكرولتر من RNA في أنبوب PCR، وتم تحديثه حراريا عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين باستخدام جهاز تدوير حراري، ثم وضع فورا على الثلج. بعد ذلك، أضيف 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المغير إلى آبار الكشف في الشريحة للتحليل20. تم إطلاق البرنامج، وتم اختيار "الاختبارات"، و"RNA" من القائمة المنسدلة. تم اختيار البرنامج "Eucaryote Total RNA Nano Series II.xsy" وفقا للمادة المستخدمة في الكاشف. تم الضغط على "ابدأ" لبدء الكشف. بعد حوالي 10 دقائق، تم التحقق من رقم الذروة وارتفاع قمة السلم للتأكد من طبيعتها.

الطرق الإحصائية
تم إجراء اختبارات طبيعية لجميع البيانات. تم التعبير عن البيانات الموزعة عادة كمتوسط ± انحراف معياري (SD)، بينما تم التعبير عن البيانات غير الموزعة بشكل طبيعي كمتوسط (النطاق الربعي، IQR). تم تحليل المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار t المزدوج للبيانات الموزعة بشكل طبيعي واختبار العينات غير المعلمية للبيانات غير الموزعة بشكل طبيعي. للمقارنات بين ثلاث مجموعات أو أكثر، استخدم تحليل التباين بمقاييس متكررة للبيانات الموزعة بشكل طبيعي، واستخدم اختبار العينات غير المتوافقة للبيانات غير الموزعة بشكل طبيعي. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام SPSS 19.0 وGraphPad Prism 9.*P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، ****P < 0.0001.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تأثيرات أوقات الحفظ بالتبريد المختلفة وطرق المعالجة على تركيز الحمض النووي الريبي في عينات PBMC
تأثير أوقات الحفظ بالتجميد المختلفة: كانت عينات PBMC الجديدة من مرضى NSCLC المتقدمين هي المجموعة الضابطة. تمت معالجة العينات إما ب TRIzol أو 90٪ FBS + 10٪ DMSO وتم تخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة شهر واحد وثلاثة و6 أشهر؛ تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي لقياس تركيز الحمض النووي الريبي. بالنسبة للعينات المعالجة بالتريزول، كانت تركيزات الحمض النووي الريبي عبر المجموعات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تؤثر العديد من العوامل على جودة الحمض النووي الريبي في العينات البيولوجية، بما في ذلك المتغيرات ما قبل التحليل، وظروف النقل، ومدة المعالجة في درجة الحرارة المحيطة، ونخر الأنسجة، ودرجة الحرارة ومنتجات التجميد، وحجم العدد الكبير، بالإضافة إلى مدة التخزين، كل عوامل تؤثر بشكل كبير على جودة الحمض النوويالريبي 21. بالنسبة للعينات المتطابقة، يمكن أن تؤثر التغيرات في وقت الحفظ بالتبريد وطرق المعالجة بشكل كبير على جودة الحمض النووي الريبي. سلطت الدراسات السابقة الضوء على ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نشكر المشاركين بامتنان على مساعدتهم في التجربة ودعمهم للصندوق. وقد دعمت هذه الدراسة المنح المقدمة من إدارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيلين (المنحة رقم YDZJ202501ZYTS691)، ولجنة الصحة في مقاطعة جيلين (المنحة رقم 2023jc064).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المحلل الحيوي Agilent 2100أجيلينتG2939Bاكتشاف سلامة الحمض النووي الريبي، وتقييم جودة الحمض النووي الريبي عن طريق توليد رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN)
مجموعة النانو Agilent RNA 6000أجيلينت5067-1511         بالتعاون مع المحلل الحيوي Agilent 2100، يوفر كواشف وشرائح مخصصة لسلامة الحمض النووي الريبي
الطرد المركزي                                                         إبندورف   5424Rلاستخراج الحمض النووي الريبي
الطرد المركزي                                           إبندورف   5810Rلاستخراج PBMC
الكلوروفورم                                  شركة مجموعة الأدوية الوطنية الصينية20191031لاستخلاص الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة تريزول، تستخدم لفصل الطور المائي المحتوي على الحمض النووي الريبي عن الشوائب العضوية التي تحتوي على الشوائب
ثنائي ميثيل كبريتاتدينغقوه تشانغشنغ بكينDH105-2كحل لحفظ العينات بالتبريد لأنظمة PBMC، مما يتيح تخزينا طويل الأمد للعينات عند -80 و°G؛ C
تيوبكورنينغMCT-150-Cلتخزين العينات، وخلط الكواشف، والطرد المركزي، وعمليات تجريبية أخرى
الإيثانولشاندونغ ليركانغ25071901AIIn استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة تريزول، المستخدمة لغسل الرواسب الريبية لإزالة البقايا
مصل الأبقار الجنينيإكسبيوميدC04001-500كحل للحفظ بالتجميد لأجهزة PBMC، تمكين التخزين طويل الأمد ل
حل فصل فيكولشركة بكين دينغغو تشانغشنغ للتكنولوجيا الحيوية المحدودةCC0161لعزل وتنقية PBMC عبر الطرد المركزي بتدرج الكثافة
GeneTouch (Plus) Thermal CyclerبيورTC-EA-48DAلإزالة الطبيعة الحرارية للحمض النووي الريبي (70 & deg; C لمدة دقيقتين)، تليها الكشف بواسطة المحلل الحيوي
إيزوبوبانولشركة مجموعة الأدوية الوطنية الصينية20210929في استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة تريزول، المستخدمة في ترسيب الحمض النووي الريبي
مطياف نانوسدروب 8000شركة جينND-8000بالنسبة لتركيز الحمض النووي الريبي (بناء على الامتصاص عند 260 نانومتر) والنقاء (بناء على نسبة A260/A280) باستخدام طريقة الامتصاص بالأشعة فوق البنفسجية
أنابيب PCRكورنينغPCR-02-Cلإزالة الطبيعة الحرارية للحمض النووي الريبي (70 & deg; C لمدة دقيقتين)، تليها الكشف بواسطة المحلل الحيوي
محلول ملحي مخزن بالفوسفات&nb;نظام بروسيلPB180327للتحليل المباشر والحفاظ على PBMCs، أو الحمض النووي الريبي الكلي اللاحق
كاشف العزل الثلاثي أدسينADS60154للتحليل المباشر والحفاظ على PBMCs، أو الحمض النووي الريبي الكلي اللاحق

المراجع

  1. Ettinger, D. S., et al. NCCN guidelines insights: Non-small cell lung cancer, version 1.2020. J Natl Compr Canc Netw. 17 (12), 1464-1472 (2019).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
  3. Reck, M., et al. Five-year outcomes with pembrolizumab versus chemotherapy for metastatic non-small-cell lung cancer with PD-L1 tumor proportion score ≥ 50. J Clin Oncol. 39 (21), 2339-2349 (2021).
  4. Kim, H., et al. Clonal expansion of resident memory T cells in the peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer during immune checkpoint inhibitor treatment. J Immunother Cancer. 11 (2), (2023).
  5. Juhl, M., Christensen, J. P., Pedersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Cryopreservation of peripheral blood mononuclear cells for use in proliferation assays: First step towards potency assays. J Immunol Methods. 488, 112897(2021).
  6. Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 289(2022).
  7. Fehlings, M., et al. Late-differentiated effector neoantigen-specific CD8+ T cells are enriched in the peripheral blood of non-small cell lung carcinoma patients responding to atezolizumab treatment. J Immunother Cancer. 7 (1), 249(2019).
  8. Gautam, A., et al. Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods. PLoS One. 14 (12), e0225137(2019).
  9. Tompa, A., Nilsson-Bowers, A., Faresjö, M. Subsets of CD4 (+), CD8 (+), and CD25 (hi) lymphocytes are in general not influenced by isolation and long-term cryopreservation. J Immunol. 201 (6), 1799-1809 (2018).
  10. Liang, X., et al. Recovery and functionality of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells using five different xeno-free cryoprotective solutions. Cryobiology. 86, 25-32 (2019).
  11. Turner, R. J., et al. Comparison of peripheral blood mononuclear cell isolation techniques and the impact of cryopreservation on human lymphocytes expressing CD39 and CD73. Purinergic Signal. 16 (3), 389-401 (2020).
  12. Schroeder, A., et al. The rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 3(2006).
  13. Li, X., et al. The effects of cryopreservation on the PBMC transcriptome profile. Front Immunol. 16, 1690316(2025).
  14. Bovinder Ylitalo, E., Vidman, L., Harlid, S., Van Guelpen, B. mRNA extracted from frozen buffy coat samples stored long term in tubes with no RNA preservative shows promise for downstream sequencing analyses. PLoS One. 20 (3), e0318834(2025).
  15. Browne, D. J., Miller, C. M., Doolan, D. L. Technical pitfalls when collecting, cryopreserving, thawing, and stimulating human T-cells. Front Immunol. 15, 1382192(2024).
  16. Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
  17. Trakunram, K., Champoochana, N., Chaniad, P., Thongsuksai, P., Raungrut, P. MicroRNA isolation by trizol-based method and its stability in stored serum and cDNA derivatives. Asian Pac J Cancer Prev. 20 (6), 1641-1647 (2019).
  18. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using Trizol (Tri Reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5439(2010).
  19. Stephenson, N. L., et al. Quality assessment of RNA in long-term storage: All our families' biorepository. PLoS One. 15 (12), e0242404(2020).
  20. Zhang, X., et al. Biobanking of fresh-frozen gastric cancer tissues: Impact of long-term storage and clinicopathological variables on RNA quality. Biopreserv Biobank. 17 (1), 58-63 (2019).
  21. Craciun, L., et al. Tumor banks: A quality control scheme proposal. Front Med (Lausanne). 6, 225(2019).
  22. Liu, X., et al. Comparison of six different pretreatment methods for blood RNA extraction. Biopreserv Biobank. 13 (1), 56-60 (2015).
  23. Li, X., et al. Importance of messenger RNA stability of toxin synthetase genes for monitoring toxic cyanobacterial blooms. Harmful Algae. 88, 101642(2019).
  24. Fan, X. J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA, and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
  25. Calleros-Basilio, L., et al. Quality assurance of samples and processes in the Spanish renal research network (redinren) biobank. Biopreserv Biobank. 14 (6), 499-510 (2016).
  26. Zhang, J. Y., Xu, Q. N., Liu, X. L., Li, C. T. Effects of peripheral blood different pretreatment methods and preservation time on RNA quality. Fa Yi Xue Za Zhi. 37 (6), 825-831 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TRIzol

مقالات ذات صلة