كشفت هذه الدراسة مستويات مرتفعة من HMGA1 وانخفاضا في تعبير HAND1 في سرطان الحنجرة، مما يشير إلى علاقة عكسية وارتباطات مهمة مع النقائل والمرحلة السريرية، مما يشير إلى أن كلاهما يساهمان في تقدم الورم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
كشفت هذه الدراسة مستويات مرتفعة من HMGA1 وانخفاضا في تعبير HAND1 في سرطان الحنجرة، مما يشير إلى علاقة عكسية وارتباطات مهمة مع النقائل والمرحلة السريرية، مما يشير إلى أن كلاهما يساهمان في تقدم الورم.
بحثت هذه الدراسة في ملفات التعبير لجينات HMGA1 وHAND1 في سرطان الخلايا الحرشفية الحنجري (LSCC) وكذلك في الأنسجة المخاطية الطبيعية المجاورة للحنجرة من خلال تطبيق الكيمياء المناعية النسيجية ومنهجيات RT-PCR. كان الهدف هو التحقيق في أدوارها المحتملة في بدء وتقدم وغزو وانتشار LSCC. تم اكتشاف كل من HMGA1 وHAND1 في الأنسجة السرطانية والأنسجة الطبيعية المجاورة. ومع ذلك، أظهر HMGA1 تعبيرا مرتفعا بشكل ملحوظ في أنسجة LSCC، بينما أظهر HAND1 مستويات تعبير منخفضة بشكل ملحوظ. ارتبط ارتفاع تعبير HMGA1 إيجابيا بانتشار العقد اللمفاوية (100.0٪ مقابل 50.0٪) والمرحلة السريرية المتقدمة (91.7٪ مقابل 44.4٪)، لكنه لم يكن مرتبطا بدرجة الورم النسيجية، أو النوع السريري، أو عمر المريض. في المقابل، كان انخفاض تعبير بروتين HAND1 مرتبطا بنقائل العقد اللمفاوية، والمرحلة السريرية، والدرجة المرضية، مما يشير إلى دور في تقدم الورم وانتشاره. علاوة على ذلك، لوحظ وجود ارتباط سلبي خطي بين تعبيرات HMGA1 وHAND1، مما يشير إلى وجود تفاعل تنظيمي محتمل قد يثبط فيه HMGA1 تعبير HAND1. تشير هذه النتائج إلى أن HMGA1 وHAND1 لهما وظائف تكميلية في تكوين مرض LSCC، حيث قد يسهل HMGA1 تطور الورم ويعمل HAND1 كمثبط. قد يقدم التفاعل بين هذين الجينين رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية التي تدفع تقدم وانتشار LSCC.
سرطان الحنجرة هو ثاني أكثر الورم الأولي الخبيث شيوعا في الرأس والرقبة، بعد سرطان البلعوم الأنفي، ويشكل 26٪–30٪ من جميع أورام الرأس والرقبة حول العالم1. أكثر من 90٪ من سرطانات الحنجرة تصنف كسرطان الخلايا الحرشفية الحنجري (LSCC)2. العلاجات الأساسية لسرطان الحنجرة هي الجراحة والعلاج الإشعاعي. الانتكاس الموضعي وانتشار العقد اللمفاوية هما السببان الرئيسيان للوفاة لدى مرضى سرطان الحنجرة. لذلك، لا تزال الإدارة الفعالة للانتكاس والنقائل تحديا سريريا كبيرا. مع تقدم علم الأحياء الجزيئي، تم تحديد جينات مختلفة ذات تعبير غير طبيعي في سرطان الحنجرة. ومع ذلك، لا تزال الآليات الكامنة وراء غزو الأورام وانتشاره في سرطان الحنجرة غير واضحة وتظل مجالا يتطلب المزيد من البحث.
بروتينات المجموعة A عالية الحركة (HMGA) هي بروتينات غير مرتبطة بكروماتين الهيستون وتقع في نواة الخلية. يرتبط HMGA1 بالحمض النووي والبروتينات المرتبطة به، مما يسبب تغييرات هيكلية للكروماتين تنظم نسخ الجينات3. بصفته منظما نسخيا مرتبطا بالكروماتين، يعدل HMGA1 تعبير عدة جينات مرتبطة بالورم تشارك في التكاثر والانتشار. أظهرت دراسات سابقة أن HMGA1 يعبر عنه بشكل مفرط في مجموعة واسعة من سرطانات الإنسان، بما في ذلك الأورام الخبيثة في الغدة الدرقية، والقولون والمستقيم، والبنكرياس، وسرطان الرأس والرقبة 4,5,6,7، بالإضافة إلى أورام ظهارية وصلبة أخرى تم الإبلاغ عنها في الأدبيات. ينظم HMGA1 تكوين الأورام من خلال تعديل تعبير عدة جينات مستهدفة لاحقة المشاركة في التكاثروالانتشار.
المشتقات المعبر عن التاج القلبي والأعصاب (HAND) هي أعضاء في عائلة bHLH (الحلزون الأساسي–الحلزون–الحلزون)، بما في ذلك HAND1 وHAND2. يلعب HAND1، كعامل نسخ، دورا في تمايز التروفوبلاست وتطور القلب9. ومع ذلك، لا تزال آلية التعبير ل HAND1 في طبقة الخلايا خارج الجنين غير واضحة. تم التأكيد على أن HMGA1 يرتبط مباشرة بمحفز HAND1، مما يثبط نشاط HAND1 في الجسم الحي وفي المختبر10. HAND1، كبروتين مثبط، مرتبط بتنظيم تمايز الخلايا وتكوين السرطان. وجدت الدراسات أن تعبير HAND1 يتم إسكاته وفرط ميثيل في سرطان المعدةالبشرية 11، وسرطان البنكرياس12، وسرطان المبيض13، وسرطان الغدة الدرقية14. ومع ذلك، حسب علمنا، بحثت دراسات محدودة في تعبير HAND1 في أنسجة سرطان الحنجرة.
في هذه الدراسة، تم استخدام الكيمياء المناعية (طريقة الكشف ذات الخطوتين) وتفاعل البوليميراز العكسي (RT-PCR) للكشف عن تعبير بروتينات HMGA1 وHAND1 والmRNA في LSCC والأنسجة المخاطية الطبيعية المجاورة. تمكن الكيمياء المناعية النسيجية من تصور مواقع البروتينات داخل بنية الأنسجة، بينما تتيح RT-PCR الكشف الحساس عن التعبير الجيني على المستوى النسخي، مما يوفر رؤى مكملة لأنماط تعبير البروتين والmRNA. مقارنة ب PCR الكمي (qPCR)، الذي يوفر حساسية أعلى وقياسا دقيقا، وWestern Blotting الذي يتيح التحقق من مستوى البروتين لكنه يفتقر إلى السياق المكاني، وتسلسل RNA (RNA-seq)، الذي يوفر تحليل شامل للنسخ لكنه يتطلب تحليلا حسابيا متقدما، فإن الاستخدام المشترك للكيمياء المناعية وRT-PCR يمثل استراتيجية فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطبيق سريريا للتحقيق في المؤشرات الحيوية. هدفت الدراسة إلى استكشاف دور وارتباط هذين العاملين في حدوث وتطور وتقدم وانتشار LSCC. علاوة على ذلك، قد يوفر تقييم تعبير HMGA1 وHAND1 مؤشرات حيوية للتشخيص والتقييم التنبؤي في سرطان الحنجرة، مما قد يحسن تصنيف المخاطر ويساعد اتخاذ القرار السريري.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت مراجعة هذه الدراسة واعتمادها من قبل لجنة أخلاقيات البحث في مستشفى شيجياتشوانغ الشعبي (رقم الموافقة) YKLS 2026 رقم 041؛ 27 مارس 2026). أجريت الدراسة وفقا للوائح المراجعة الأخلاقية للأبحاث الطبية الحيوية التي تشمل البشر، ولوائح المراجعة الأخلاقية لعلوم الحياة والأبحاث الطبية التي تشمل البشر، وإعلان هلسنكي، والإرشادات الأخلاقية الدولية للأبحاث الصحية المتعلقة بالبشر. تم الحصول على عينات أنسجة بشرية من عينات جراحية مؤرشفة وفقا للمتطلبات الأخلاقية المؤسسية، مما يضمن إخفاء هوية وسرية بيانات المرضى. تم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من المشاركين، أو تم منح تنازل عن الموافقة من قبل لجنة الأخلاقيات لاستخدام عينات مؤرشفة مجهولة الهوية، حسب الاقتضاء.
المواد التجريبية
مصدر العينات
تم الحصول على ما مجموعه 42 حالة من أنسجة LSCC و25 حالة من أنسجة الغشاء المخاطي الحنجرية الطبيعية المجاورة من عينات استئصال جراحي ل LSCC في قسم جراحة الأنف والأذن والحنجرة-الرأس والرقبة في خبي بين فبراير 2011 وأغسطس 2012. من بين هذه الموارد، تم تأكيد 25 حالة من الغشاء المخاطي الطبيعي المجاور (مأخوذة من موقع > 1.0 سم من حافة السرطان) كمخاط التهابي أو طبيعي. تم تأكيد جميع عينات LSCC ال 42 مرضيا على أنها سرطان الخلايا الحرشفية. تم تخزين جميع الأنسجة عند -80 درجة مئوية. كان المرضى ال 42 ذكورا، ولم يكن هناك أي مرضى من الإناث. من بين حالات LSCC، كانت 15 حالة متمايزة بشكل جيد، و18 كانت متمايزة بشكل متوسط، و9 كانت ضعيفة التمايز بشكل جيد. ثمانية عشر حالة كان لديها نقائل في العقد اللمفاوية، بينما لم يكن لدى 24 حالة ذلك. استند التصنيف السريري إلى نظام تصنيف وتصنيف المرحلة في TNM (UICC، 2002)، حيث شهدت 20 حالة في المرحلتين الأولى والثانية، و22 حالة في المرحلتين الثالثة والرابعة. كان هناك 30 حالة من النوع فوق اللغوي، و11 حالة من النوع الحلقي، وحالة واحدة من النوع تحت اللغوي. كان نطاق عمر المرضى بين 40 و75 عاما، مع متوسط عمر 60 سنة. لم يتلق أي من المرضى العلاج الإشعاعي أو العلاج الكيميائي قبل الجراحة، وكانت البيانات السريرية كاملة.
الطرق والخطوات التجريبية
إجراء تلوين HE
تحضير الشرائح وتلوين الهيماتوكسيلين-إيوزين
تم نقع شرائح الزجاج للكيمياء المناعية أولا في حمض مركز لمدة 24 ساعة، تليها غسلها جيدا تحت ماء الصنبور الجاري لمدة لا تقل عن 10 دقائق لإزالة الحمض المتبقي، ثم الغمر في الماء المقطر لمدة 30 دقيقة مرتين مع تحريك لطيف لضمان الشطف الكامل. بعد نقع الشرائح في 95٪ إيثانول لمدة ساعتين، تجف الشرائح في فرن بدرجة حرارة 60 درجة مئوية، ثم تغمس في خليط APES: الأسيتون (1:49، فولت/فولت) لمدة دقيقة واحدة مع هز لطيف لضمان طبقة متجانسة، ثم شطفها بالأسيتون النقي. وأخيرا، تم تجفيفها بالهواء عند درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) لضمان التصاق الأنسجة بشكل صحيح أثناء إجراءات التلوين اللاحقة.
تم غمر أقسام الأنسجة المدمجة بالبارافين بشكل متسلسل في زيلين I وزيلين II لمدة 10 دقائق لكل منهما لإزالة البارافين، ثم إعادة ترطيب القطع عبر الإيثانول المصنف (100٪، 95٪، 80٪) لمدة 5–10 دقائق لكل منهما، ثم شطفها بماء مقطر لمدة دقيقتين. ثم خضعت الأقسام لتلوين الهيماتوكسيلين-إيوزين (HE) كما يلي: صبغ الهيماتوكسيلين لمدة 4 دقائق، وشطف تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 3 دقائق مع تدفق مستمر لإزالة البقعة الزائدة، والتمايز باستخدام حمض الهيدروكلوريك 1٪ في الإيثانول لمدة 30 ثانية، والغسل ثلاث مرات بماء الصنبور لإنهاء التمايز، وتلوين الإيوزين لمدة 10 ثوان. تم إجراء التجفيف الروتيني بدرجات منتظمة باستخدام 70٪ إيثانول، 80٪ إيثانول، 95٪ إيثانول، إيثانول لامائوي I، وإيثانول لامائي II لمدة 5 دقائق لكل منهما. بعد التجفيف، تم تركيب السلايد باستخدام بلسم محايد.
إجراء الكيمياء المناعية
تم قطع أجزاء البارافين بسماكة 4 ميكرومتر، ووضعها بشكل مسطح على شرائح مغطاة ب APES، ووضعها في فرن بدرجة حرارة 67 درجة مئوية طوال الليل، تلاها إزالة البارافين باستخدام الزيلين I و II لمدة 10 دقائق لكل منهما. تم إجراء الجفاف التدريجي باستخدام 100٪، 90٪، و70٪ كحول لمدة 5 دقائق لكل منها، تليها الغسل بماء الصنبور والماء المقطر لمدة 3 دقائق. لمنع نشاط البيروكسيداز الداخلي، تم حضن الشرائح بمحلول بيروكسيد الميثانول-الهيدروجين 3٪ محضر حديثا، لضمان تغطية كاملة لقسم الأنسجة في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة، تلتها ثلاث غسلات بالماء المقطر لمدة 5 دقائق في 0.01 مليون PBS.
تم استرجاع المستضدات عن طريق غمر شرائح في مخزن السيترات (pH 6.0) وتسخينها في قدر ضغط عند ~95–100 درجة مئوية لمدة 8 دقائق ل HMGA1 و10 دقائق ل HAND1 مع إغلاق الأغطية بإحكام للحفاظ على ظروف ضغط ثابتة. ثم تم تبريد الأقسام عند درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) وغسلها ثلاث مرات بحرارة 0.01 متر PBS لمدة 3 دقائق لكل منها تحت تحريك لطيف. تم تخفيف الأجسام المضادة الأولية ضد HMGA1 وHAND1 في مخفف الأجسام المضادة (1:150 و1:100 على التوالي) وخلطها بلطف عن طريق استخدام الماصات قبل تطبيقها بشكل متساو لتغطية كل جزء من الأنسجة. تم حضن الشرائح طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في غرفة رطبة. بعد الحضانة طوال الليل، أزيلت الشرائح من الغرفة المرطبة وتركت لتتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تم غسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 0.01 مليون PBS (5 دقائق لكل غسل) تحت تحريك خفيف لإزالة الأجسام المضادة غير المربوطة. تمت إزالة السائل الزائد، وأضيف جسم مضاد ثانوي (مضاد للأرانب/فأر بوليمر موسوم ب HRP) لتغطية أسطح أقسام الأنسجة بالكامل. تم إجراء حضانة إضافية عند 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة.
تم تطبيق محلول الركيزة من DAB باتجاه القطرات لتغطية الأنسجة، وتمت مراقبة تطور اللون تحت المجهر لمدة 1–3 دقائق حتى يظهر التلوين البني وتوقف فورا عن طريق الشطف بالماء المقطر بمجرد تحقيق شدة التلوين المثلى. تم إجراء إعادة صبغ بالهيماتوكسيلين، وتمايز كحول حمض الهيدروكلوريك، ومحلول الأمونيا لعكس اللون الأزرق. تبع ذلك تجفيف الكحول بدرجة روتينية، وشفافية الزيلين، وتركيب بلسم محايد للملاحظة تحت المجهر. تم استخدام PBS كأداة تحكم فارغة بدلا من الجسم المضاد الأساسي. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام أقسام نسيج سرطان الرأس والرقبة الحرشفية المؤكدة سابقا لسرطان الرأس والرقبة الحرشفية وأقسام أنسجة المشيمة الإيجابية ل-HAND1 كعناصر تحكم إيجابية لضمان جودة التلوين والتناسق.
تحديد النتائج
الكروموجين المستخدم في هذه التجربة هو نظام DAB-H2O2. بعد إعادة صبغ الهيماتوكسيلين، يلاحظ التلوين الإيجابي HMGA1 وHAND1 بشكل رئيسي في نواة الخلية، مع بعض التلوين السيتوبلازمي. للتقييم، تم تحديد المنطقة ذات أعلى كثافة للخلايا المصبوغة إيجابيا تحت تكبير منخفض (×40). تحت تكبير ×100، تم اختيار خمسة حقول ذات أعلى كثافة خلوية إيجابية، وتم عد 100 خلية في كل حقل. يستخدم متوسط نسبة الخلايا الموجبة من الحقول الخمسة كنتيجة لكل شريحة. كانت معايير التقييم كما يلي: لا توجد خلايا مصبوغة (-)، خلايا موجبة < 25٪ (+)، خلايا موجبة 25٪–50٪ (++)، وخلايا إيجابية > 50٪ (+++)، استنادا إلى طريقة تقييم النسبة شبه الكمية المستخدمة عادة في التحليلات الكيميائية المناعية. تم إجراء التقييم بشكل مستقل من قبل طبيبين شرعيين مؤهلين بطريقة مزدوجة التعمية 15,16,17. إذا اختلفت آراؤهم، يجب عليهم مناقشة والوصول إلى استنتاج.18.
طريقة RT-PCR
المقدمات
تم تصميم البرايمرات باستخدام برامج تصميم البرايمر المبنية على تسلسلات الجينات المستهدفة، مع التركيز على خصوصية البرايمر، وتوافق درجة حرارة الانصهار، وحجم المنتج المتوقع. يتم تلخيص تتابع البرايمر التفصيلي، وأحجام المنتجات، ودرجات حرارة التلدين في الجدول 1. تم تصنيع البادئات بتركيز 2 OD، مقسمة إلى أنبوبين، وتخفيفها إلى 10 بيومول/ميكرولتر باستخدام ماء معالج ب DEPC للتخزين عند -20 درجة مئوية. تم حساب درجة حرارة التلدين باستخدام الصيغة: Tm= 2(A + T) + 4(G + C)
معالجة RNase للمواد والمعدات التجريبية:
المواد البلاستيكية (مثل رؤوس الماصات، أنابيب EP): توضع المواد البلاستيكية في زجاجة كاشف معقمة ذات فم واسع، وتضاف مياه معالجة ب DEPC حتى تغمر القطع بالكامل، وتحتضن المواد طوال الليل في غطاء بخار عند درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية). ثم تم تعقيمها تحت الضغط لمدة 120 دقيقة وتجفيف عند 65 درجة مئوية.
العناصر الزجاجية: تم نقع الأواني الزجاجية طوال الليل في الحمض، وشطفها جيدا، وتجفيفها، ولفتها بورق الألمنيوم، وخبزت في فرن بدرجة حرارة 200 درجة مئوية لمدة 6 ساعات وتخزينها في مكان نظيف للاستخدام المستقبلي.
العناصر المعدنية (مثل المقص، الملقط): تم تنظيف القطع المعدنية وخبزها في فرن بدرجة حرارة 200 درجة مئوية لمدة 6 ساعات وتخزينها في مكان نظيف للاستخدام المستقبلي.
تحضير الحلول
محلول DEPC 0.1٪ (v/v): أضيف 1 مل DEPC إلى 1000 مل من الماء المقطر لتحقيق تركيز نهائي 0.1٪ (v/v)، ثم هز جيدا، وحضن عند 4 °م خلال الليل، وتعقيم عن طريق التعقيم الافتراضي، وتم تخزينه عند 4 °C.
محلول الإيثانول 75٪ (v/v): تم خلط 75 مل من الإيثانول المطلق مع 25 مل من الماء المعالج ب DEPC لتحقيق تركيز نهائي 75٪ (v/v)، وتم تخزينه عند 4 °C.
استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من الأنسجة
بعد استخراج الحمض الريبي، تم تقييم سلامة الحمض النووي قبل النسخ العكسي والتحليل اللاحق. تم وزن 80 ملغ من الأنسجة باستخدام ميزان إلكتروني، وقطعها إلى قطع صغيرة، ووضعها في جهاز تجانس زجاجي معالج مسبقا. تمت إضافة 1 مل لاستخلاص RNA مبرد مسبقا عند 4 درجات مئوية، وتم تجانس العينة على الجليد باستخدام طحن متكرر حتى يتم الحصول على ليزات منتظمة دون شظايا نسيجية مرئية، مما يمنع تكون الفقاعات. تم نقل الخليط المتجانس إلى أنبوب EP خال من RNase بسعة 1.5 مل وحضن على الثلج لمدة 5 دقائق. أضيف 400 ميكرولتر كلوروفورم إلى كل أنبوب، وتم الدوران بقوة لمدة 10–15 ثانية لضمان خلط الطور الكامل، تلاها الحضانة على الثلج لمدة 5 دقائق. تم طرد المركزي للأنابيب عند 4 درجات مئوية، 12,000 × g لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، تم استنشاق الطور المائي العلوي بعناية باستخدام ماصة خالية من RNase دون إزعاج طبقة الطور في أنبوب جديد. تمت إضافة حجم مماثل من الأيزوبروبانول، وخلطه بقلب الأنبوب بلطف 8-10 مرات حتى اختفت الطبقات، وتم حضنه عند -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 10 دقائق. تم طرد الخليط عند 4 درجات مئوية، 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق. تم التخلص من طبقة الفائق، وأضيف 400 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 75٪ لتعليق حبيبات RNA. تم طرد الخليط مرة أخرى عند 4 درجات مئوية، 12,000 × جرام لمدة 5 دقائق. تم التخلص من طبقة الفائق، وجفت حبيبة RNA قليلا. تم إذابة كرة RNA في مياه خالية من RNase وتخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام المستقبلي.
كشف سلامة الحمض النووي الريبي
لاكتشاف سلامة الحمض النووي الريبي، تم خلط 5 ميكرولتر من عينة RNA مع 5 ميكرولتر من حاجز التحميل الأزرق بروموفينول، وأجري الرحلان الكهربائي على هلام أغاروز بنسبة 2٪. كان يعتبر سلامة الحمض النووي الريبي مقبولا عندما كانت نطاقات 28S و18S و5S الواضحة مرئية دون تشويش واضح.
النسخ العكسي (RT) لتخليق cDNA
تمت إضافة 6 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مسبقا عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تم إضافة 25 ملليمتر MgCl2 (4.0 ميكرولتر)، dNTP (2.0 ميكرولتر)، AMV (0.7 ميكرولتر)، 10× مخزن AMV (2.0 ميكرولتر)، أوليغو(dT) (1.0 ميكرولتر)، RNasin (0.5 ميكرولتر) وماء منزوع الأيونات على الجليد على التوالي لتحقيق حجم تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولتر، تليه خلط لطيف وطرد مركزي قصير. كانت ظروف التفاعل 25 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، و42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، و98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تخزن عند 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. عندما يصل التفاعل إلى 4 درجات مئوية، يخرج المنتج من جهاز PCR، ويستخدم كقالب cDNA لتفاعل PCR التالي، ويخزن عند -20 درجة مئوية للاستخدام لاحقا.
تضخيم PCR
لكل تفاعل PCR، احتوى الخليط على قالب cDNA (1 ميكرولتر)، وبرايمر أمامي مخصص ل HMGA1 أو HAND1 أو GAPDH (1 ميكرولتر)، وبرايمر عكسي مخصص للجين المستهدف أو GAPDH (1 ميكرولتر)، وخليط رئيسي PCR (10 ميكرولتر)، وماء معالج ب DEPC (7 ميكرولتر)، ليصبح الحجم الإجمالي 20 ميكرولتر. تم إعداد تفاعلات منفصلة لكل جين مستهدف (HMGA1، HAND1) وجين التحكم الداخلي (GAPDH)، حيث يحتوي كل تفاعل على زوج البادئة الأمامي والعكسي الخاص بالجين.
كان حجم التفاعل الكلي 20 ميكرولتر. بعد خلط مكونات التفاعل بلطف والطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 5–10 ثوان بسرعة منخفضة، تم وضع الأنبوب في جهاز PCR مسخن مسبقا وتم تضخيمه وفقا لظروف التفاعل في الجدول 2.
تأكيد وتحليل المنتجات المضخمة ب PCR
تحضير الجل
تم وزن 2 جرام من الأجاروز ووضعه في قارورة مثلثة الشكل. تمت إضافة 2 مل من محلول الرحلان الكهربائي 50× TAE و100 مل من الماء المقطر (حضر جل أغاروز بنسبة 2٪)، ثم تسخينه في فرن ميكروويف مع دوران متقطع (فترات 15–20 ثانية) حتى يذوب الأغاروز بالكامل. بعد التبريد إلى حوالي 55 درجة مئوية، أضيف 10 ميكرولتر من محلول EB وخلطه جيدا. ثم يسكب الجل في صينية جل نظيفة بدرجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية)، ويغسل بالماء المقطر، ثم يدخل مشطا لإنشاء آبار عينات. كان سمك الجل 0.4 سم. وضعت الصينية على سطح مستو بدرجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة حتى يتصلب الجل تماما. تمت إزالة المشط بعناية.
تحميل العينات
تمت إضافة 4 ميكرولتر من كل عينة حمض نووي إلى آبار الهلام، وأضيف مؤشر DNA إلى البئر الأيسر.
الرحلان الكهربائي
تم وضع صينية الهلام المحملة في خزان الرحلان الكهربائي المملوء بمخزن الرحلان الكهربائي من نوع TAE، لضمان بقاء مستوى العزل حوالي 1 مم فوق سطح الهلام. كان أحد طرفي الآبار عند الكاثود (للسماح للحمض النووي بالهجرة نحو الأنود). كان نظام الرحلان الكهربائي متصلا بمصدر طاقة ويعمل بجهد 120 فولت و60 مللي أمبير لمدة تقارب 45 دقيقة، حتى انتقل مخزن التحميل إلى ما بعد خط منتصف الجلام، وبعد ذلك يتم إيقاف الطاقة.
ملاحظة النتائج والتصوير
بعد الرحلان الكهربائي، تمت إزالة الهلام بعناية، وتمت ملاحظة النتائج تحت جهاز الإضاءة فوق البنفسجية ومقارنتها مع مؤشر الحمض النووي لتحديد ما إذا كان الوزن الجزيئي للشظايا المضخمة يظهر في المواقع المتوقعة. تم استخدام نظام التصوير الهلامي لالتقاط الصور وحفظ النتائج على الكمبيوتر.
إعداد التحكم
تم استخدام الماء المقطر بدلا من cDNA كمادة تحكم سلبية.
التحليل شبه الكمي
تم تحليل نتائج الرحلان الكهربائي بجل الأغاروز وتسجيلها باستخدام نظام التصوير الهلامي. تم استخدام برنامج تحليل الصور لتحليل سطوع النطاقات. تم قياس قيم التوزيع الزائد المتكاملة المطلقة لنطاق تضخيم الجين المستهدف ونطاق تضخيم الجين الداخلي المقابل المقابل. تم التعبير عن النتائج كنسبة قيمة OD المتكاملة المطلقة للنطاق المستهدف إلى القيمة المتكاملة المطلقة لنطاق التحكم الداخلي المقابل.
أي أن التعبير النسبي = قيمة OD للجين المستهدف / قيمة OD للجين الداخلي.
التحليل الإحصائي
تم تنظيم جميع البيانات باستخدام إكسل وتحليلها باستخدام برامج إحصائية. تم التعبير عن المتغيرات المستمرة كمتوسط ± انحراف معياري (SD) ومقارنتها بين مجموعتين باستخدام اختبار t العينات المستقلة. تم تحليل المتغيرات التصنيفية الاسمية، بما في ذلك معدلات التعبير الإيجابية للمواد المناعية الكيميائية، باستخدام اختبار χ2 . تم تحليل المتغيرات التصنيفية الترتيبية، بما في ذلك الدرجة المرضية والمرحلة السريرية، باستخدام اختبار مجموع الرتبة (اختبار مان-ويتني U للمقارنات بين مجموعتين، حيثما كان ذلك ينطبق). تم تقييم الارتباط بين تعبير HMGA1 وHAND1 باستخدام تحليل الارتباط الخطي. كانت جميع الاختبارات ذات ذيلين؛ اعتبر P < 0.05 دلالة إحصائية، وP. < 0.01 ذات دلالة ذات دلالة عالية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
نتائج الكشف عن الهيستوكيميائية المناعية
تعرض صور تلوين هيماتوكسيلين-إيوزين (HE) التمثيلية التي توضح الشكل النسيجي للمخاطية الحنجرية الطبيعية المجاورة وLSCC بدرجات متفاوتة من التمايز (متوسط، وضعيف). تحديدا، يظهر الشكل 1A الغشاء المخاطي الحنجي الطبيعي المجاور، والشكل 1B يظهر LSCC المتمايز بشكل جيد، والشكل 1C يظهر LSCC متمايز بشكل متوسط،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
سرطان الحنجرة، أحد أكثر الأورام شيوعا في الرأس والرقبة، أظهر زيادة في الحدوث في السنوات الأخيرة، ويرجح أن ذلك مرتبط بعوامل بيئية ونمط حيات. مثل غيرها من الأورام الخبيثة، لا يزال عودته وانتشاره هما السببان الرئيسيان للوفاة. مع التقدم في علم الأحياء الجزيئي، تم تحديد العديد من العوامل المرتبطة بتطور سرطان الحنجرة، لكن آليات البداية والانتشار لم تفهم بالكامل بعد. أصبح HMGA1، كمنظم للنسخ، محورا بحثيا في السنوات الأخيرة بسبب دوره في تكوين الأورام وتطورها. وقد تم الإبلاغ عن أنه معبر عنه بقوة ف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يرغب المؤلفون في الشكر على دعم مؤسستهم وجميع الأفراد الذين ساهموا في هذه الدراسة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| آلة تضمين الأنسجة الأوتوماتيكية | ساكورا فينتيك، طوكيو، اليابان | Tissue-Tek TEC 5 | تضمين البارافين |
| ميكروتوم | لايكا مايكروسيستمز، فيتزلار، ألمانيا | RM2135 | التقسيم (4 ومو؛ m) |
| مجفف الشرائح | شركة شياوغان هونغي للأدوات الطبية المحدودة، الصين | CS-VI | تجفيف الشرائح |
| حاضنة التدفئة | شركة شنغهاي يانغغوانغ للأدوات التجريبية المحدودة، الصين | 303-4A | الحضانة المتحكم بها في درجة الحرارة |
| المجهر البصري | شركة أوليمبوس، طوكيو، اليابان | BX41 | الملاحظة النسيجة |
| نظام التقاط الصور | كيوماجينغ، كندا | QCapture Pro 7 | التصوير المجهري |
| المقعد النظيف | مصنع معدات أشباه الموصلات في بكين شيتشنغ، الصين | SW-CJ-1FD | مساحة عمل معقمة |
| الطرد المركزي المبرد | مصنع بكين لإصلاح الأجهزة الطبية، الصين | LXJ-64-01 | فصل الحمض النووي الريبي |
| جهاز الطرد المركزي على الطاولة | شركة شنغهاي بيتشينغ للتكنولوجيا، الصين | PQ-1600A | معالجة RNA/الحمض النووي |
| المحرك المغناطيسي | مصنع جيانغسو جينتان للأجهزة الطبية، الصين | HJ-3 | تحضير المحلول |
| الميني ميكسر | شنغهاي بنغ شركة s الصناعية، الصين | H-1 | خلط العينات |
| التوازن الإلكتروني | ميتلر توليدو، سويسرا | PB3002-S | وزن العينة |
| مضخم PCR | شركة إبندورف إيه جي، ألمانيا | ماسترسايكلر 5333 | تضخيم PCR |
| مصدر طاقة الرحلان الكهربائي | مصنع أدوات ليوي في بكين، الصين | DYY-6C | التحكم في الجهد |
| خزان الرحلان الكهربائي | مصنع أدوات ليوي في بكين، الصين | DYCZ-24DN | الرحلان الكهربائي الهلامي |
| فرن الميكروويف | معهد شنغهاي تشونغدا لأبحاث التطبيقات الطبية، الصين | WD800SL23 | تحضير الأجاروز |
| جهاز الترانسلمنيتور فوق البنفسجي | مصنع أدوات ليوي في بكين، الصين | WD-9403B | تصور الحمض النووي |
| نظام تصوير الجل | شركة أنلاي المحدودة، الصين | ألفا إيميجر HP | توثيق الجل |
| الثلاجة (4 ودرجات؛ C) | هاير بيوميديكال، الصين | BC-165D | تخزين العينات |
| فريزر فائق الحرارة | هاير بيوميديكال، الصين | DW-86L388 | التخزين (-80 & درجة؛ C) |
| صندوق الثلج | شركة شنغهاي فوتشي للتكنولوجيا المحدودة، الصين | FZ-IB-20L | نقل العينات |
| أكياس التخزين المبردة | شركة شنغهاي ييلي للتكنولوجيا، الصين | YL-ULT-50 | حفظ العينات |
| أنابيب البحث | شركة إبندورف إيه جي، ألمانيا | ريسيرش بلس | التعامل مع السوائل |
| كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (تريزول) | إنفيتروجين (ثيرمو فيشر ساينتيفيك)، الولايات المتحدة الأمريكية | 15596026 | استخراج الحمض النووي الريبي |
| مجموعة النسخ العكسي | شركة تاكارا بيو، اليابان | RR037A | تخليق cDNA |
| PCR Master Mix | شركة تاكارا بيو، اليابان | RR820A | تضخيم PCR |
| dNTP Mix | شركة تاكارا بيو، اليابان | 4030 (نموذجي) | مكون PCR |
| مثبط RNase (RNasin) | بروميغا، الولايات المتحدة الأمريكية | N2111 | حماية الحمض النووي الريبي |
| تمهيد أوليغو(dT) | شركة تاكارا بيو، اليابان | 3806 (نموذجي) | مبراير تخليق cDNA |
| أغاروز | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | A9539 | تحضير الجل |
| مخزن TAE (50&0 مرة؛) | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | TAE50X-1L (نموذجي) | مخزن الرحلان الكهربائي |
| علامة الحمض النووي (السلم) | شركة تاكارا بيو، اليابان | DL2000 (3421A) | مرجع الحجم |
| بروميد إيثيديوم (EtBr) | بيو-راد، الولايات المتحدة الأمريكية | 1610433 | تصور الحمض النووي |
| مخزن PBS | جيبكو (ثيرمو فيشر ساينتفيك)، الولايات المتحدة الأمريكية | 10010023 | مخزن الغسيل |
| مياه معالجة من قبل DEPC | إنفيتروجين، الولايات المتحدة الأمريكية | AM9916 | حماية الحمض النووي الريبي |
| الكلوروفورم | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | C2432 | استخراج الحمض النووي الريبي |
| إيزوبوبانول | ميرك، ألمانيا | 109634 | ترسيبات الحمض النووي الريبي |
| الإيثانول (المطلق) | ميرك، ألمانيا | 100983 | الجفاف |
| الميثانول | ميرك، ألمانيا | 106009 | حجب بيروكسيداز |
| بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | H1009 | حجب البيروكسيداز الداخلي |
| زيلين | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | 534056 | إزالة البارافرافينية |
| مخزن استرجاع مستضدات السيترات | أبكام، المملكة المتحدة | ab93678 | استرجاع المستضدات |
| مخفف الأجسام المضادة | داكو، الدنمارك | S3022 | تخفيف الأجسام المضادة |
| الجسم المضاد الأساسي HMGA1 | أبكام، المملكة المتحدة | ab129153 | التخفيف 1:150 |
| الجسم المضاد الأساسي HAND1 | أبكام، المملكة المتحدة | ab200040 | التخفيف 1:100 |
| الأجسام المضادة الثانوية (متقاربة مع HRP) | داكو، الدنمارك | K5007 | نظام الكشف |
| مجموعة ركيزة DAB | داكو، الدنمارك | K3468 | الكشف الكروموجيني |
| صبغة الهيماتوكسيلين | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | H9627 | التلوين النووي |
| إيوسين ستين | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | E4009 | التلوين السيتوبلازمي |
| وسط تثبيت بلسام محايد | شركة سينوفارم للكاشف الكيميائي، الصين | 10004160 | تركيب الشريحة |
| بادئات HMGA1 | مركبة مخصصة (مثل IDT/Sangon) | لا يوجد | تضخيم الجينات |
| بادئات HAND1 | مركبة مخصصة (مثل IDT/Sangon) | لا يوجد | تضخيم الجينات |
| بادئات GAPDH (التحكم الداخلي) | تم تركيبه خصيصا | لا يوجد | جين التدبير المنزلي |
| APES (أمينوبروبيل تري إيثوكسيسيلان) | سيغما-ألدريتش | لا يوجد | طلاء الانزلاق |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخالية من RNase | إبندورف | لا يوجد | التعامل مع الحمض النووي الريبي |
| نصائح بيبيت خالية من RNase | إبندورف | لا يوجد | التعامل مع السوائل |
| صينية ومشط الصب بجل أغاروز | عام | لا يوجد | تحضير الجل |
| برنامج تصميم المبادئ | تقنيات الحمض النووي المتكاملة، الولايات المتحدة الأمريكية | أداة PrimerQuest | تصميم البرايمر |
| برنامج تحليل الصور | ميديا سايبرنيتيكس، الولايات المتحدة الأمريكية | إيميج-برو بلس 6.0 | قياس النطاق |
| برنامج التحليل الإحصائي | شركة آي بي إم، الولايات المتحدة الأمريكية | إصدار SPSS 13.0 | التحليل الإحصائي |