مقالة منهجية

رسم خرائط مناعة الرضع بأقل قدر ممكن من المدخلات: التحليل التكاملي للخلية الواحدة ومتعدد الأدوار

DOI:

10.3791/70279

⸱

أبريل 3, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول جمع وحفظ عينات الدم من المرضى الوليدين والأطفال وتطبيق الحمض النووي الريبي (scRNA)، والبروتيومكس، وقياس تدفق الخلايا الطيفية لتوصيف مجموعات الخلايا المناعية من هذه العينات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند الولادة، يواجه جهاز المناعة لحديثي الولادة فجأة بيئة مختلفة جذريا، غنية بالمحفزات الميكروبية والبيئية. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن المناعة في مرحلة العمر المبكر ليست فقط غير ناضجة، بل هي متكيفة بشكل فريد لتلبية المتطلبات المميزة لهذه النافذة التطورية. خلال هذه الفترة، يكون جهاز المناعة ديناميكيا للغاية، ويشهد تغيرات سريعة لاستيعاب تغير المشهد الخارجي. فهم هذا المشهد المناعي المعقد والمتطور يتطلب دراسة مباشرة لدى حديثي الولادة. ومع ذلك، فإن القيود الرئيسية في مثل هذه الدراسات هي انخفاض حجم الدم الكلي لدى المواليد (~100 مل/كغ)، مما يحد من الكمية التي يمكن جمعها بأمان للبحث، خاصة في الرضع ذوي الوزن المنخفض جدا عند الولادة (ELBW) أو الخدج جدا. في عملنا الأخير، نعالج هذا القيد من خلال إظهار كيفية إجراء التنميط المناعي عالي الأبعاد باستخدام كميات صغيرة جدا من دم حديثي الولادة. نقدم مجموعة من البروتوكولات المحسنة للعينات الطولية عبر الحياة المبكرة ونطبق تقنيات متقدمة، بما في ذلك قياس تدفق السيل، والبروتيوميات، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، لتعظيم المعلومات التي يتم الحصول عليها من أقل مدخلات. معا، تتيح هذه الطرق رؤية شاملة للتوقيعات النسخية والبروتيومية لخلايا المناعة المتداولة في حديثي الولادة، مما يقدم رؤى جديدة حول المسار الفريد لمناعة الحياة المبكرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحسين هذا البروتوكول لمعالجة عينات دم بحجم 100-250 ميكرولتر خلال 12 ساعة من الجمع، إما بتجميد أو استخدام فورا. عند الولادة، يدفع جهاز المناعة حديثي الولادة إلى بيئة مختلفة جذريا، مغنية بمحفزات ميكروبية وبيئية كانت غائبة سابقا في البيئة داخل الرحمالمحمية 1,2. يتطلب هذا التحول من الجهاز المناعي التكيف والاستجابة لمجموعة واسعة من المستضدات الجديدة، وهي عملية ضرورية للبقاء لكنها أيضا تطرح تحديات كبيرة 1,2. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن المناعة في المراحل المبكرة ليست مجرد غير ناضجة أو نسخة مصغرة من جهاز المناعة لدى البالغين. بدلا من ذلك، تم تصميمه بشكل فريد لتلبية الاحتياجات الخاصة لهذه الفترة التنموية الحرجة3،4. خلال هذه الفترة الوليدية، تنضج مكونات الجهاز المناعي، بما في ذلك أنواع مختلفة من خلايا التائية وخلايا B والخلايا النخاعية، وتطور خصائص ووظائف فريدة خاصة بالحياة المبكرة 5,6,7,8. على الرغم من أهميتها، لا تزال مناعة حديثي الولادة صعبة الدراسة مباشرة بسبب القيود الأخلاقية والعملية. من القيود الرئيسية حجم الدم الصغير لدى حديثي الولادة، حيث يبلغ متوسط ~100 مل/كجم 9,10. يصبح هذا التحدي أكثر وضوحا عند جمع الدم من الرضع الخدج جدا (المولودين قبل الأسبوع 30 من الحمل) والأطفال الذين يبلغون خدجا جدا (ELBW)، الذين يمكن أن يزن حتى 400 جرام مع 40 مل فقط من الدم المتداول. هذا يحد من كمية الدم التي يمكن جمعها بأمان، مما يبرز الحاجة إلى طرق تعظيم إنتاج البيانات من العينات القليلة. لمعالجة هذا التحدي، يوضح عملنا بروتوكولات محسنة للتنميط المناعي عالي الأبعاد باستخدام أحجام دم ضئيلة (100-250 ميكرولتر)، مثل تلك التي يتم الحصول عليها من الرضع المصابين ب ELBW.

مكنت التطورات الحديثة في جمع ومعالجة الدم من دراسة الاستجابات المناعية في الفئات التي كان جمع العينات فيها تقليديا صعبا. تم تطوير أجهزة الإبر الدقيقة مثل أنظمة Tasso وTouch Activated Phlebotomy في البداية لجمع الدم المنزلي بسهولة لدى البالغين. ومنذ ذلك الحين، تم تكييفها للاستخدام في الرضع، مما يسمح لمقدمي الرعاية الأساسيين والفرق السريرية بجمع عينات بأقل قدر من الانزعاج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامها في المنزل دونضغط الزيارات السريرية المتكررة، مما يسهل الامتثال وسهولة الوصول. يجب استخدام أنبوب دقيق من حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) مع الجهاز وشحنه ليلا إلى المختبر مع الالتزام ببروتوكولات المخاطر البيولوجية المناسبة. في صباح اليوم التالي، عند وصول العينات، يجب معالجتها باستخدام طرق تحليل خلايا الدم الحمراء (RBC) لالتقاط الخلايا المناعية المنتشرة6. ومن الجدير بالذكر أن أنابيب EDTA تتيح عزل الخلايا الحية، لكن اعتبارات الوقت مهمة. في الاختبارات الوظيفية مع التحفيز، يجب معالجة العينات خلال أقل من 4 ساعات ويفضل أقل من ساعتين من الجمع. بالنسبة للاختبارات الظاهرية غير الوظيفية المعروضة أدناه، يجب معالجة العينات خلال 12 ساعة للسماح بالشحن الليلي مع ضمان الاسترداد، حيث تقل حيوية الخلية مع مرور الوقت12. مقارنة بفصل الكثافة والتدرج التقليدي مع Ficoll، فإن التحلل أسرع وأقل استهلاكا للجهد ويعطي استرجاع أعلى13. ومع ذلك، قد يترك عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي عن طريق التحلل خلفه خلايا حبيبية ملوثة، مما يقلل من النقاء، لكنه قد يكون مفيدا للدراسات المهتمة بهذه الأنواع14. تسلط هذه المقايضات الضوء على كيفية توازن التكيفات المنهجية بين الجدوى والدقة عند دراسة عينات سريرية نادرة أو حساسة، مثل تلك الخاصة بحديثي الولادة. كما استفاد التعامل مع الخلايا المعزولة في المراحل النهائية من التحسينات المنهجية. يظل الحفظ بالتبريد باستخدام مصل الأبقار الجنيني (FBS) وثنائي ميثيل كسلفوكسيد (DMSO) نهجا قويا لخلايا المناعة، خاصة في دم الأجنة وحديثي الولادة، حيث تكون قدرة الخلايا على قيد الحياة وتعافيها أمران حاسمين. إلى جانب تحسين عملية جمع الدم، اعتمدنا أيضا تقنيات لاحقة تسمح باستخراج أكبر قدر من المعلومات من أحجام عينات صغيرة. نقدم مجموعة من البروتوكولات المحسنة التي تسهل أخذ العينات عبر الحياة المبكرة، مما يتيح فحصا تفصيليا لديناميكيات المناعة مع مرور الوقت. يعتمد نهجنا على تقنيات متقدمة مثل قياس تدفق الخلايا الطيفية، والبروتيوميات، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، والتي تقدم مجتمعة رؤية لا مثيل لها لتوقيعات البروتينية والنسخ لخلايا المناعة الدورية في الحياة المبكرة. بالإضافة إلى ذلك، يوفر القياس الخلوي الطيفي فرصا لاكتساب رؤية وظيفية مع أقل قدر ممكن من مدخلات الخلية.

على مر السنين، تم استخدام عدة تقنيات مثل العد الكامل للدم (CBCs) لتحليل الخلايا المناعية المشتقة من الدم15، بينما حللت تقنيات أخرى نسب الخلايا المناعية في عينات دم حديثي الولادة باستخدام مثيلة الحمض النووي16,17. بينما كانت هذه التقنيات مفيدة في معرفة نسب الخلايا المناعية المعروفة، لا تزال هناك قيود في قدرتنا على الحصول على رؤى معمقة للخلايا التي لا تحتوي على نظام متعدد الأوميكس. توفر CBCs قياسات واسعة فقط لأنواع خلايا الدم الرئيسية، مما يجعلها مفيدة لتحديد الحالة المناعية العامة في البيئة السريرية لكنها محدودة في قدرتها على تحديد الأنواع الفرعية أو الحالات الوظيفية. مؤخرا، بدأت الدراسات معالجة هذا القيد من خلال استخدام التغيرات النصية والاستيضية المشتقة من البلازما لدى الرضع في وقت مبكر من الأسبوع الأول من عمر18 سنة. تم تكييف البروتيوميات المعتمدة على مطيافية الكتلة لدراسة الملفات المناعيةفي عينات حديثي الولادة. هذا النهج قوي لقياس مجموعة واسعة من البروتينات بطريقة غير متحيزة ولتحديد العلامات الحيوية المحتملة. ومع ذلك، تشمل القيود الرئيسية الحاجة إلى إدخال بروتينات كبيرة نسبيا ونقص المعلومات المباشرة عن هوية الخلية، رغم احتواء البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان. يقدم اختبار البروتيوميات المستهدف (TMPA) بدائل للعينات منخفضة المدخلات. تستخدم هذه الطرق الكشف المستهدف القائم على الأجسام المضادة، مما يوفر تنميطا عالي الحساسية للعينات ذات المواد المحدودة. واحدة من هذه النماذج استخدمت بشكل خاص لتتبع مسارات تطور المناعة في الحياة المبكرة طوليا20.

تمكن القياس الخلوي التدفق من التحليل الكمي لبروتينات الخلايا المناعية على مستوى الخلية المفردة من خلال تمرير الخلايا الموسومة بالفلورية عبر شعاع ليزر مركز وقياس إشارات تشتت الضوء والفلورة الناتجة. في هذه التقنية، ترتبط الأجسام المضادة الموسومة بالفلورية ببروتينات سطحية أو داخل الخلية محددة. يتيح ذلك الكشف وقياس الأنواع الفرعية متعددة من الخلايا المناعية وخصائصها المميزة بناء على ملفات الفلورة الخاصة بها. توسع القياس الخلوي الطيفي لهذا النهج من خلال التقاط طيف الانبعاث الكامل لكل فلوروكروم، مما يتيح فكك خلط طيفي دقيق واكتشاف أكثر من 35 علامة في اختبار واحد 21,22,23. يتيح ذلك تحليل عدد أكبر بكثير من العلامات مقارنة بلوحات قياس التدفق الخلوي التقليدية، والتي تقتصر على ~8-12 علامت. مكملا لهذه التقنيات القياسية الخلوية، حول تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الدراسات المناعية من خلال تمكين التحليل النصي عالي الدقة وغير المتحيز من الحد الأدنى من المادة المدخلة24. على الرغم من التكاليف الأعلى والاعتماد على بقاء الخلية، يوفر scRNA-seq رؤى لا مثيل لها حول تباين المناعة في الحياة المبكرة مقارنة بالتسلسل الجماعي. تظهر هذه التطورات مجتمعة كيف يتم تكييف الابتكارات في جمع وحفظ وتحليل لتجاوز التحديات الفريدة في دراسة مناعة الأجنة وحديثي الولادة.

تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل الخلايا المناعية المحيطية المحجوزة بالتجميد المعزولة عبر تحليل الدم الأحمر المتسلسل (CRIC). ينبغي على الباحثين النظر في هذا البروتوكول إذا كانت دراساتهم تتطلب تحليل مناعي عالي الدقة من كميات صغيرة من الدم (100-500 ميكرولتر)، خاصة عندما يكون التحليل الطولي أمرا حاسما. الطريقة قابلة للتطبيق بشكل واسع على كل من المواليد الجدد والمبكرين، وهي متوافقة مع مجموعة واسعة من التحليلات اللاحقة، مما يجعلها مناسبة لأسئلة بحثية متنوعة في مناعة حديثي الولادة والأطفال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم ضمان موافقة الوالدين المستنيرة والامتثال الكامل للوائح الأخلاقية الوطنية ذات الصلة وفقا لمجلس مراجعة المؤسسات في جامعة ييل (IRB). كما هو محدد في بروتوكول IRB المعتمد، تم التواصل مع الوالدين من قبل فريق البحث خلال الأسبوع الأول بعد ولادة الطفل للحصول على الموافقة قبل التسجيل. لم تبدأ أي إجراءات دراسة تشمل المواد المشتقة من الإنسان قبل الموافقة الأخلاقية الموثقة.

1. جمع العينات، معالجتها، وتخزينها (الشكل 1)

  1. جمع الدم الداخلي
    1. جمع ومعالجة عينات الرضع بعد استلامها، وتخزينها عند 4 درجات مئوية، ومعالجتها خلال 12 ساعة من الجمع.
    2. اجمع ~250 ميكرولتر من الدم الكامل وخزنها في أنبوب جمع دم مضاد للتخثر EDTA. اقلب أنبوب جمع الدم 8 مرات لخلط مضاد التخثر.
    3. تابع معالجة الدم الكامل عن طريق تحلل الدم الأحمر كما هو موضح في القسم 1.3 (معالجة عينة الدم الكاملة).
    4. لجمع بقع الدم الجافة، استخدم اللانسيت المعقم لعمل ثقب على إصبع القدم أو الكعب المنظف.
      1. بدلا من ذلك، الماصة ~25-30 ميكرولتر من الدم من أنبوب EDTA على ورق الترشيح. المس ورقة الفلتر برفق على قطرة الدم.
    5. املأ دائرة واحدة على الأقل بدم يتدفق بحرية، قطرة واحدة لكل دائرة. دع بقعة الدم تجف. حافظ على ورق الفلتر مفتوحا حتى تجف بقع الدم تماما.
    6. ضع العلامة المناسبة مع وقت الجمع، وتاريخ المعالجة، ونقطة الزمن، وتحديد العينة.
    7. ضعها في كيس تخزين بلاستيكي شفاف بسحاب. تخزين بطاقات بقع الدم عند −20 درجة مئوية أو −80 درجة مئوية لاستقرار طويل الأمد حتى تكون جاهزة للتحليل البروتيومي.
  2. جمع الدم في العيادات الخارجية
    ملاحظة: بموافقة مجلس مراجعة المؤسسات في جامعة ييل، أتيحت لأولياء أمور المشاركين في العيادات الخارجية خيار جمع عينات دم في المنزل باستخدام جهاز جمع ذاتي بالإبر الدقيقة. يحصل هذا الجهاز على الدم الشعري من خلال مشقوق يطبق على الجلد. تلقى الآباء الذين اختاروا هذه الطريقة تدريبا داخليا باستخدام مجموعات العرض، وتم تزويدهم لاحقا بتعليمات مكتوبة مفصلة ومجموعات جمع للاستخدام المنزلي.
    1. اغسل اليدين وارتد القفازات قبل الاستخدام. اجمع جميع العناصر اللازمة، بما في ذلك المرآة إذا كان أحد الوالدين فقط هو من يقوم بجمع الدم.
    2. أزل الجهاز من حقيبة الأدوات ولف الغطاء من أنبوب متوافق.
    3. اضغط الأنبوب داخل الجهاز حتى يثبت بإحكام مع خطوط تعبئة متجهة للخارج.
    4. أزل حفاضة الطفل وامسكه منتصبا.
    5. اتبع تعليمات حزمة الحرارة لتفعيلها.
      ملاحظة: إذا لم تتوفر حقيبة تدفئة، استخدم طريقة تدفئة أخرى، مثل اليد.
    6. ضع الكمادة الحرارية على الموقع (الأرداف) لمدة 2-4 دقائق لتدفئة وزيادة تدفق الدم.
    7. نظف المنطقة باستخدام وسادة كحول واتركها تجف.
    8. أزل الغطاء الشفاف من الزر الأحمر. انزع اللسان عن الجهاز والصق بقوة على الجزء الكامل من أرداف الرضيع مع إبقائها منتصبة.
      ملاحظة: عدل وضعية الجسد حسب الحاجة للحفاظ على الأنبوب عموديا بالكامل لجمع الدم بشكل صحيح.
    9. اضغط الزر للأسفل مرة واحدة كاملة ثم حرر السرعة. اضبط المؤقت على 5 دقائق. راقب التعبئة بالأنبوب باستخدام المرآة حسب الحاجة.
    10. قد لا يظهر الدم خلال أول دقيقة إلى دقيقتين. أزل الجهاز بعد حد أقصى 5 دقائق أو قبل ذلك إذا امتلأ الدم بخط المؤشر العلوي قبل 5 دقائق.
    11. أزل الأنبوب من الجهاز مع لف خفيف واسحب للأسفل. قم بتثبيت الغطاء بسرعة بالكامل على الأنبوب. اقلب الأنبوب على الأقل 10 مرات، مع التأكد من أن الدم يلامس الغطاء مع كل انقلاب لمنع التجلط.
    12. أرسل عينات طوال الليل بعد الجمع.
  3. معالجة عينات الدم الكاملة
    1. معالجة عينات الدم في خزانة أمان بيولوجية.
    2. انقل بعناية 250 ميكرولتر من الدم إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل يحتوي على 10 مل من محلول تحلل الدم الأحمر 1x. اشطف أنبوب جمع الدم بسعة 10 مل من محلول تحلل الدم الحمراء حتى يفرغ. دع الخلايا تذوب في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
    3. بعد اكتمال التحلل، أضف ~30 مل من PBS عند RT للغسل والدوران عند 430 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق الفائق باستخدام الفراغ، دون إزعاج الحبيبات.
    4. استمر في نقل وشطف العينة كما هو موضح في الخطوة 1.3.2 حتى تظهر حبيبات الخلية خالية من خلايا الدم الحمراء المرئية. قم بالطرد المركزي عند 430 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم أزل المادة الفائقة بحذر دون إزعاج الحبيبة.
    5. لكل 250 ميكرولتر من الدم يتم جمعه، أعد تعليق الحبيبات الخلوية الناتجة في 2 مل من وسط تجميد (10٪ DMSO في FBS) وقسمها إلى مجمدين للحفظ.
    6. تحقق من بقاء الخلايا عن طريق عد الخلايا المعلقة في وسط التحميل باستخدام مقياس الدم باستخدام استبعاد تريبان بلو.
    7. انقل 1 مل من الخطوة 1.3.5 إلى كل مبرد. ضع العلامة المناسبة مع وقت الجمع، وتاريخ المعالجة، ونقطة الزمن، وتحديد العينة.
    8. تخزين التجميد (أو المبردات) بشكل متوسط عند -80 درجة مئوية في حاوية تجميد مع إيزوبروبانول. بعد 24 ساعة، انقل الكريوفيال إلى النيتروجين السائل حتى يكون جاهزا للتحليل.

2. TMPA من بقع الدم الجافة (DBS) (الشكل 2)

  1. في يوم المعالجة، أحضر ورق الترشيح إلى RT. باستخدام مثبب معدني بقطر 3 مم، قم بثقب 2-3 دوائر في ورق الفلتر حيث مر الدم، بأقرب شكل ممكن إلى نقطة الدم.
  2. التقط كل ثقب 3 مم باستخدام الملقط وأضفه إلى بئر من صفيحة بسعة 96 بئر أو أنبوب PCR منخفض الارتباط يحتوي على 20 ميكرولتر من مخزن التهوية (1x PBS، 1x مثبط بروتيز، 0.05٪ Tween 20). تأكد من تغطية الثقوب بواسطة مخزن إلوشن.
  3. أغلق الأنابيب أو غط اللوحة بتنورة بلاستيكية، وضعها على دوامة رقمية تدور بسرعة 600 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة عند التيار المستمر.
  4. في نهاية الحضانة، انقل اللوات بحذر إلى أنبوب جديد منخفض الارتباط أو صفيحة بسعة 96 بئرا. تخلص من الأنابيب أو الصفيحة التي تحتوي على ثقوب الفلتر.
  5. قم بقياس محتوى البروتين باستخدام اختبار BCA.
    1. خذ 2 ميكرولتر من كل عينة أو معيار BSA لعمل تخفيفات تسلسلية بنسبة 1:10 و1:100 في الماء. تحضير العينات والمعايير بشكل مكرر بإضافة 15 ميكرولتر من العينات المخففة أو المعيار إلى 200 ميكرولتر من محلول يعمل 1x. حضن العينات لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    2. اقرأ الإشارة على 562 نانومتر على قارئ لوحة. احسب تركيز البروتين النهائي بناء على معيار ميل BSA وخلفية مخزن الاستنساخ.
  6. اصنع أليكوات بحجم 30 ميكرولتر للعينات بمعدل 0.5-1 ملغ/مل في أنابيب دقيقة منخفضة الارتباط بحجم 1.5 مل. تجميد العينات عند -80 درجة مئوية ليتم تقديمها لاحقا ومعالجتها باستخدام خدمة TMPA.

3. قياس تدفق طيفي للدم المحلل من خلايا الدم الهلالي (الشكل 3)

  1. في يوم التجربة، قم بإذابة قارورة من خلايا الدم الحمراء المتحللة بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تبقى قطرة صغيرة من الجليد.
  2. أضف تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على 10 مل من RPMI الكامل المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (معد باستخدام 500 مل من RPMI 1640، و50 مل من FBS، و5.6 مل من البنسلين-ستريبتومايسين، و5.6 مل من مكمل الجلوتامين). الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أزل السوبرناتانت بعناية وتخلص منه.
  3. أعد تعليق الحبيبة بلطف في 3 مل من RPMI الكامل وحدد عدد الخلايا باستخدام الطريقة المناسبة.
  4. قم بتدوير الخلايا المعلقة عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق وتخلص من السوبرناتانت.
  5. اضبط تركيز الخلايا إلى 1 ×10 6 خلايا/مل في RPMI كامل. قم بتوزيع 100 ميكرولتر لكل بئر (0.1 × 10⁶ خلية) في صفيحة قاع V ذات 96 بئئر. الطرد المركزي عند 764 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وإزالة السوبرناتان.
  6. أضف 100 ميكرولتر من مخزون الصبغة الحية/الميتة في PBS بتخفيف بنسبة 1:2,000 مع كتلة Fc وكتلة وحيدة الخلية (تخفيف 1:100) إلى جميع العينات، باستثناء المادة غير المصبوغة. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  7. اغسله ب 100 ميكرولتر من PBS وجهاز طرد مركزي عند 764 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت بعناية.
    ملاحظة: من الضروري استخدام كتلة Fc وكتلة المونوسايت لمنع أي ارتباط غير محدد بالأجسام المضادة.
  8. أضف 100 ميكرولتر من الكوكتيل السطحي المخفف (تخفيف 1:200) في محلول FACS (500 مل من PBS، 2.5 جرام من ألبومين مصل البقر (BSA)، 2 ملليمول EDTA، pH 8.5) إلى جميع العينات، باستثناء الضابط غير المصبوغ. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  9. اغسله ب 100 ميكرولتر من مخزن FACS وجهاز الطرد المركزي عند 764 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت بعناية.
  10. تثبيت الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد لكل عينة. حضن لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
  11. غسل ب 100 ميكرولتر من مخزن FACS، والطرد المركزي عند 764 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية، وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من مخزن FACS.
  12. جهز خرز ألترا كومب كعناصر تحكم بلون واحد. صبغ خرزات التحكم أحادية اللون باستخدام نفس بروتوكول العينات، بما في ذلك التثبيت إذا كانت العينات ثابتة.
  13. تحضير ضوابط فلورية ناقص واحد (FMO) باستخدام نفس الإجراء المستخدم في العينات.
    ملاحظة: من المهم التعامل مع أدوات التحكم ذات اللون الواحد وFMO بنفس طريقة العينات. على سبيل المثال، إذا تم تثبيت العينات بعد التلوين، يجب تثبيت FMO وضوابط اللون الواحد أيضا.
  14. شغل العينات، وأدوات التحكم ذات اللون الواحد، وأدوات التحكم غير المصبوغة، وأجهزة التحكم FMO على جهاز قياس تدفق طيافي/تقليدي. حلل البيانات باستخدام البرامج.
  15. اضبط البوابات بناء على عناصر التحكم المناسبة في النمط النفسي وFMO. أولا، تقوم خلايا البوابة باختيار مجموعة الكريات البيضاء باستخدام مخطط التشتت الأمامي (FSC) مقابل التشتت الجانبي (SSC)، الذي يساعد في استبعاد الحطام واختيار الخلايا بناء على الحجم والدقة.
  16. بعد اختيار الكريات البيضاء (الكريات البيضاء)، تستخدم خلايا البوابة لاستبعاد الدوبلتات باستخدام رسم تخطيطي لمساحة التشتت الأمامية (FSC-A) مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H).
    ملاحظة: هذا يضمن اختيار الخلايا المفردة (المفردات)، حيث تعتبر الخلايا التي تقع على طول القطر كخلايا مفردة، بينما تستبعد الدوبلتات والكتل.
  17. خلايا بوابة للبقاء باستخدام صبغة قابلية للحياة لاستبعاد الخلايا الميتة، مما يضمن أن التحليل اللاحق يشمل الخلايا الحية فقط.
  18. بعد هذه الخطوات الأولية، تقوم بتوبيط المزيد من الخلايا الحية المفردة لعلامات نسب محددة لتصنيف مجموعات الخلايا المناعية المختلفة. قسم الخلايا الحية المفردة إلى خلايا ميلويد CD33+ وخلايا اللمفاوية CD33 بناء على تعبير CD33.
  19. داخل مجموعة CD33+ ، قم بتمييز الخلايا الأحادية CD14+ وتحديد خلايا CD11c+ الشجرية (DCs) كخلايا تعبر عن CD11c ولكن ليس CD14.
  20. داخل مجموعة الخلايا اللمفاوية CD33، تقوم ببوابة خلايا T CD3+ وبوابة فرعية لتحديد مجموعات خلايا T من CD4+ وCD8+ .
  21. بالإضافة إلى ذلك، حدد خلايا CD56+ القاتلة الطبيعية (NK) حسب تعبير CD56، وتحديد خلايا CD19+ B حسب تعبير CD19.

4. تحليل scRNA للدم المحلل في الدم الحمراء الحمراء (الشكل 4)

  1. إذابة قارورة واحدة من خلايا الدم الحمراء المحللة بالتبريد في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. أضف العينة إلى 10 مل من وسائط الخلايا التائية في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. الطرد المركزي عند 430 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  2. أضف 10 مل أخرى من 1x PBS إلى العينة. الطرد المركزي عند 430 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  3. عد الخلايا وقيم جدواها باستخدام تريبان بلو. إذا كانت صلاحية الصلاحية أقل من 70٪، تابع إزالة الخلايا الميتة باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة.
    1. إزالة الخلايا الميتة
      1. قم بتخفيف مخزن الربط 20 مرة باستخدام ماء معقم مقطر مرتين للحصول على محلول يعمل بمقدار 1x.
      2. علق حبيبة الخلية في 100 ميكرولتر من حبات إزالة الخلايا الميتة لكل 1 × 10إلى 7 خلايا إجمالية. اخلط جيدا واحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      3. أدخل عمود الفصل المغناطيسي في الحامل المغناطيسي المناسب. اشطف العمود ب 500 ميكرولتر من محلول الربط 1x لتوازن قبل الاستخدام.
      4. ارفع حجم الخلية إلى 500 ميكرولتر مع مخزن ربط 1x. قم بتطبيق تعليق الخلية على العمود وجمع التدفق في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.7 مل.
      5. اغسل مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الربط. اجمع التدفق في نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
      6. استخدم جهاز الطرد المركزي على حرارة 300 × جرام لمدة 10 دقائق. تخلص من السوبرناتانت.
    2. عد الخلايا وقيم مدى بقائها باستخدام تريبان بلو.
    3. أعد تعليق 20,000 خلية صالحة في 40 ميكرولتر من PBS مع 0.04٪ BSA في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.7 مل.
    4. أرسل الخلايا على الجليد فورا إلى منشأة النواة الجينومية لتوليد المكتبة وتسلسلة الأنظمة. اجمع نتائج التسلسل بصيغة مخرجات Cell Ranger.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جمعنا بطاقات DBS من 10 أطفال خدج جدا في ثلاث نقاط زمنية: أسبوع واحد (n = 12)، شهر واحد (n = 7)، وشهرين (n = 3) لتحليل البروتيومية TMPA6 (الشكل 2A). تم تحليل هذه العينات جنبا إلى جنب مع دم الحبل السري للرضع الكامل (TCB؛ n = 4) ودم البالغين الأصحاء (AB؛ n = 5). تم قياس التعبير البروتيني الطبيعي (NPX) ل 92 بروتينا مرتبطا بالمناعة باستخدام منصة TMPA (الشكل 2B). أظهرت التحليلات الإحصائية تعبيرا أعلى بشكل ملحوظ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب الحصول على بيانات مناعية عالية الجودة من كميات قليلة من دم حديثي الولادة والرضع تعديلات منهجية عبر عدة خطوات. في هذا البروتوكول، نصف أربع استراتيجيات تكميلية: (1) تحسين جمع الدم وحفظه بالتبريد للحفاظ على الخلايا الحية للاستخدام لاحقا، (2) تطبيق القياس الخلوي الطيفي للتدفق الطيفي لتصنيف المناعة متعددة المعلمات، (3) scRNA-seq لحل تباين المناعة بدقة عالية، و(4) TMPA. معا، تعظم هذه الأساليب إنتاجية البيانات مع معالجة التحديات التقنية الناتجة عن حجم العينات المحدود وتجمعات الخلايا الهشة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنهم لا يملكون تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر المرافق الأساسية التالية في ييل: مركز ييل لقياس تدفق الخلايا الداخلية؛ مركز ييل لتحليل الجينوم. نشكر مركز ييل للتحقيقات السريرية، ومكتب ييل لتطوير الأطباء والعلماء في الجامعة، وبرنامج تطوير علماء الرعاية الحرجة والإصابات للأطفال / NICHD. أجريت دراسات قياس التنفس بواسطة مركز الأيض الكيميائي في جامعة ييل. تم تمويل هذا العمل من خلال منح إلى: P01 AI179570 (L.K.)، R01AI171980 (L.K.)، R01DK129552 (L.K.)، R01HL163043 (L.K.)، مؤسسة التليف الكيسي (L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.)، جائزة هارتويل (N.N.B.)؛ K08DK133687 (O.O.)، كلية الطب بجامعة ييل، قسم طب الأطفال (O.O.); R01AI123204 (C.R.O). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدها ولا يعكس بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء الشكل 1 في BioRender. جاوون، ك. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 مليون EDTA، الرقم الهيدروجيني 8.0ثيرمو فيشر ساينتفيك 15575-038 
مخزن تحليل RBC واحد  إنفيتروجين 3177165 
مجموعة اختبار بروتين BCA  Abcam AB287853 
أنبوب دقيق BD Microtainer MAPفيشر ساينتفيك 22-253-270
بيل-آرت كريو-سيف -1° C Freeze Controller ميليبور سيغما  41122800 
مصل البقر الألبومين (BSA)سيغما-ألدريتش A9647-100G 
بريليانت ألترا فيوليت 496 ضد الإنسان CD3 ثيرمو فيشر ساينتفيك 364-0038-42 
بريليانت ألترا فيوليت 661 مضاد للبشر CD11c بي دي بي بايوساينس 612968 
Brilliant Vil750 Anti-Human CD14 BioLegend 367135 
فيوليت 570 ضد الإنسان CD8a BioLegend 301038 
فيوليت اللامعة 711 ضد الإنسان CD56 BioLegend 318336 
كوكتيل مثبط بروتياز خالي من EDTA من كومبليت، ميني، خالي من EDTAميليبور سيغما  11836170001 
مجموعة إزالة الخلايا الميتة  ميلتيني بيوتيك 130-090-101 
ثنائي ميثيل كسلفوكسيد (DMSO) ثيرمو فيشر ساينتفيك BP231-100 
دولبيكو' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS)، بدون كالسيوم، لا مغنيسيوم ثيرمو فيشر ساينتفيك 14190144 
مصل البقر الجنيني (FBS) Gibco A5256801 
فيشربراند ديجيتال فورتكس ميكسر ثيرمو فيشر ساينتفيك 02215418 
مخزن التثبيت  BioLegend 420801 
مكمل جلوتاماكسGibco 35050061 
MACS MultiStand ميلتيني بيوتيك 130-042-303 
أعمدة MS  ميلتيني بيوتيك 130-042-201 
الاسمالشركةرقم الكتالوج
OctoMACS Separator ميلتيني بيوتيك 130-042-109 
باسيفيك بلو ضد الإنسان CD4 BioLegend 344619 
البنسلين-ستريبتوميسين (10,000 U/mL)ثيرمو فيشر ساينتفيك 15140-122 
RB780 مضاد للبشر CD33 بكالوريوس العلوم الحيوية  755606 
ريرج 3 ملم ميتال بانشر  ريرج SDD231031PC-01 
RPMI 1640 متوسطGibco 11875-093 
سبارك يو في 387 ضد الإنسان CD19 BioLegend 302289 
مجموعات مجموعة Tassoتاسو لا يوجد
أنابيب الميكرو ذات غطاء البرغي الثيرمو ساينتيفكثيرمو فيشر ساينتفيك 14-755-287 
واتمان 309 بروتينسافرسايتيفا 41111700 
مجموعة قابلية للإصلاح من زومبي NIR  BioLegend 423105 
<قوي>برمجيات وحزم
أدوبي إليستريتور2024
bbknn1.5.1
فلوجو10.8.1
منشور جراف باد9.4.0
الاسمالنسخة
سكانبي1.9.1
سروبلت0.2.3
<اختبارات قوية>تجارية
خلية واحدة من الكروم 5' طقم10X جينومكسPN-1000263
أولينك  كشف أو لوحة الهدف 96 الالتهابيةأولينكhttps://olink.com/products/olink-target-96

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  2. Jain, N. The early-life education of the immune system: moms, microbes and (missed) opportunities. Gut Microbes. 12 (1), 1824564(2020).
  3. Konnikova, L., et al. Fetal and neonatal T cell immunity: unique features and challenges. Front Immunol. 11, 594939(2020).
  4. Pieren, D. K. J., Boer, M. C., De Wit, J. The adaptive immune system in early life: the shift makes it count. Front Immunol. 13, 1031924(2022).
  5. Brodsky, N. N., et al. Early-life human CD8+ T cells exhibit rapid, short-lived effector responses and a unique transcription factor landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (31), e2421106122(2025).
  6. Olaloye, O., et al. A single-cell atlas of circulating immune cells over the first 2 months of age in extremely premature infants. Sci Transl Med. 17, eadr0942(2025).
  7. Watson, N. B., et al. The gene regulatory basis of bystander activation in CD8+ T cells. Sci Immunol. 9 (92), eadf8776(2024).
  8. Maymí, V. I., et al. Neonatal CD8+ T cells resist exhaustion during chronic infection. J Immunol. 212 (5), 834-843 (2024).
  9. Kandasamy, R., Kollmann, T. R. Challenges in neonatal immunology. Front Immunol. 8, 1756(2017).
  10. Howie, S. R. Blood sample volumes in child health research: review of safe limits. Bull World Health Organ. 89 (1), 46-53 (2011).
  11. Gross, R., et al. Researching COVID to enhance recovery (RECOVER) pediatric study protocol: rationale, objectives and design. medRxiv. , (2023).
  12. Bourguignon, P., et al. Processing of blood samples influences PBMC viability and outcome of cell-mediated immune responses in antiretroviral therapy-naïve HIV-1-infected patients. J Immunol Methods. 414, 1-10 (2014).
  13. Urbansky, A., et al. Rapid and effective enrichment of mononuclear cells from blood using acoustophoresis. Sci Rep. 7 (1), 17161(2017).
  14. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: comparison of purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  15. Abebe, D. Diagnostic significance of complete blood cell count and hemogram-derived markers for neonatal sepsis. World J Clin Pediatr. 13 (2), 1-13 (2024).
  16. Martino, D., et al. DNA methylation signatures underpinning blood neutrophil to lymphocyte ratio during first week of human life. Nat Commun. 15, 8157(2024).
  17. Jones, M. J., et al. DNA methylation differences between cord and adult white blood cells reflect postnatal immune cell maturation. Commun Biol. 8, 237(2025).
  18. Lee, A. H., et al. Dynamic molecular changes during the first week of human life follow a robust developmental trajectory. Nat Commun. 10, 1092(2019).
  19. Mithal, L. B., et al. Evolution of the umbilical cord blood proteome across gestational development. Sci Rep. 15 (1), 2233(2025).
  20. Olin, A., et al. Stereotypic immune system development in newborn children. Cell. 174 (5), 1277-1292.e14 (2018).
  21. Spasic, M., et al. Spectral flow cytometry methods and pipelines for comprehensive immunoprofiling. Cancer Res Commun. 4 (3), 895-910 (2024).
  22. Park, L. M., Lannigan, J., Jaimes, M. C. OMIP-069: forty-color full spectrum flow cytometry panel. Cytometry A. 97 (10), 1044-1051 (2020).
  23. Sahir, F., et al. Development of a 43-color panel for comprehensive immune cell characterization. Cytometry A. , (2020).
  24. Tang, F., et al. mRNA-seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 6, 377-382 (2009).
  25. Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15(2018).
  26. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets. Cell Syst. 8 (4), 281-291.e9 (2019).
  27. Polanski, K., et al. BBKNN: fast batch alignment of single-cell transcriptomes. Bioinformatics. 36 (3), 964-965 (2020).
  28. Li, Y., et al. DMSO-free cryopreservation improves recovery and function of human T and NK cells. Cell Transplant. 31, 1-12 (2022).
  29. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  30. Wohnhaas, C., et al. RNA integrity in cryopreserved immune cells enables robust single-cell transcriptomics. Front Immunol. 10, 204(2019).
  31. Daae, L. N. W., et al. Comparison of haematological parameters in capillary and venous blood samples from hospitalized children. Scand J Clin Lab Invest. 51 (7), 651-654 (1991).
  32. Meites, S. Skin-puncture and blood-collecting technique for infants. Clin Chem. 34 (9), 1890-1894 (1988).
  33. Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots: preparing and processing. J Vis Exp. (97), e52619(2015).
  34. Waaijer, L. A., et al. Spectral flow cytometry panel for comprehensive immunophenotyping. Cytometry A. 107 (4), 226-232 (2025).
  35. Thieme-Ehlert, M. T., et al. OMIP-114: a 36-color spectral flow cytometry panel. Cytometry A. 107 (6), 364-371 (2025).
  36. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods. BMC Genomics. 22, 66(2021).
  37. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  38. Grandi, F. C., et al. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  39. Kim, N., et al. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة