مع تزايد الاهتمام بالعلاج المناعي داخل الأورام، أصبح اختيار نماذج أورام متاحة وعملية أمرا ضروريا. الأورام تحت الجلد سهلة الاكتشاف لكنها صعبة التصور والتلاعب بها. في هذا البروتوكول، نصف طرقا لتوليد أورام داخل الجلد توفر رؤية أفضل وسهولة الوصول إليها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع الورم داخل الجلد كنموذج قوي لدراسات العلاج المناعي داخل الأورام لسرطان الفأر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد إنشاء نماذج أورام فئران قابلة للتكرار أمرا ضروريا لتقييم بيولوجيا السرطان واستراتيجيات العلاج المناعي. يعالج العلاج المناعي داخل الورم الأورام الراسخة بمواد منعية تحفز المناعة لعكس كبت المناعة الموضعي وتحفيز المناعة المضادة للأورام الجهازية. تحدد معظم دراسات السرطان على الفئران وجود الأورام في المساحة تحت الجلد، وهو ما يواجه تحديات جوهرية في العلاج المناعي التجريبي داخل الورم بسبب عدم القدرة على تصور الحقن داخل الورم. يوفر الحقن داخل الجلد لخلايا الورم نهجا موثوقا لتوليد أورام مرئية تدعم الحقن داخل الورم بدقة وقابلة للتكرار ومراقبة حركية النمو والاستجابات العلاجية. هنا، نقدم منهجية قابلة للتكرار لاكتشاف وعلاج الأورام الجلدية باستخدام نموذج الميلانوما B16F10 في فئران C57BL/6 كمثال. يتم حقن تعليق خلايا الورم داخل الجلد، وبعد 7–10 أيام من زرع الورم، عندما تصل الأورام إلى ~60 مم3، يمكن حقن داخل الورم بعوامل منعية أو علاج فيزيائي مثل الحفر الكهربائي أو التسخين مباشرة. يتيح ذلك تقديم العلاجات بدقة وقياس نمو الورم باستخدام الكاليبرز، ويتجنب تحدي التغيرات الجوهرية الناتجة عن علاجات متعددة للأورام تحت الجلد التي لا يمكن رؤيتها. من خلال تقديم نظرة مفصلة على هذه التقنية، تهدف هذه المقالة إلى دعم قابلية التكرار وتطوير الأبحاث ما قبل السريرية في العلاج المناعي داخل الأورام.
المقدمة
تشكل نماذج أورام الفأر أداة لا غنى عنها في أبحاث السرطان. في نموذج فأر مثالي، سيكون من الممكن تحفيز أورام تشبه أورام الإنسان بشكل وثيق على المستويين الوراثيوالشكل 1. وهذا يمكن من تقييم وكفاءة الأساليب العلاجية الجديدة في مجالات مختلفة، بما في ذلك العلاج المناعي داخل الورم (ITIT). يعد ITIT مجالا ناشئا في علاج السرطان يتكون من إعطاء العوامل المحفزة للمناعة مباشرة في بيئة الورم الدقيقة (TME). يمكن لهذا التوصيل الموضعي أن يعزز تنشيط المناعة المحلية، ويعكس البيئة الدقيقة للورم المثبط للمناعة، ويحفز استجابات مناعية مضادة للأورام الجهازية، المعروفة بالتأثير التبدي2. ومع ذلك، تعتمد كفاءة ودقة وثبات الإعطاء داخل الورم على القدرة على تصور والتحكم في معايير الحقن في نماذج الأورام المختلفة.
تستخدم معظم دراسات السرطان قبل السريرية زرع الأورام تحت الجلد. ومع ذلك، فإن هذا النهج له قيود على العلاجات داخل الورم لأن الورم لا يمكن رؤيته مباشرة أثناء الحقن إلا إذا أجريت جراحة. تتطلب العديد من استراتيجيات العلاج المناعي داخل الأورام توصيل المواد الكيميائية بدقة إلى أورام الفئران الصغيرة وغالبا ما تتطلب تنفيذ هذه المهمة عدة مرات. بدون تأكيد بصري، تصبح دقة الحقن واحتباس المواد الكيميائية داخل الأورام تحت الجلد متغيرات ضعيفة السيطرة عليها. قد يؤدي ذلك إلى سوء تفسير أو تغيير البيانات التجريبية3.
يوفر زرع الورم داخل الجلد بديلا مباشرا وسهل الوصول وقابلا للرؤية وقابلا للتكرار لمراقبة الورم وقياسه وحقنه داخل الورم، مما يعزز الاتساق. علاوة على ذلك، أظهرت الدراسات أن الأورام المزروعة داخل الجلد، بدلا من الحقن تحت الجلد، تعزز المناعة وتثبط الورمفي خلايا الورم. الأورام المحقونة داخل الجلد تحفز حركة خلايا شجرية سريعة وقوية إلى العقد اللمفاوية، مما أدى إلى تنشيط مبكر وأكثر قوة لخلايا T السامة الخاصة بالورم4. تصف الدراسة الحالية بروتوكولا مفصلا وقابلا للتكرار لتحديد أورام الميلانوما B16F10 داخل الجلد في فئران C57BL/6 وإجراء العلاجات اللاحقة داخل الورم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات بموافقة والامتثال لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC)5. تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات في منشأة الحيوانات في دارتموث. كانت إناث فئران C57BL/6، في عمر 6–8 أسابيع، توضع تحت ظروف قياسية على حوامل مهواة مع الطعام والماء. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. حلاقة الفئران
ملاحظة: يجب على جميع الموظفين إكمال التدريب المؤسسي في التعامل مع الحيوانات الحية والتخدير قبل إجراء هذه الإجراءات.
- قبل الحقن داخل الجلد، احلق جانب كل فأر كما هو موضح أدناه؛ كان الجانب الأيمن يستخدم للحقن والإجراءات الموصوفة. احلق الفئران في اليوم السابق لحقن خلايا الورم.
- ضع الفأرة على سطح مستقر. امسك الفأر من جلد مؤخرة الرقبة بالإبهام والسبابة الأيسر، ثم أدخل الجانب الأيسر من الجسم بلطف في راحة اليد لتكشف الجانب الأيمن. استخدم إصبعي الخاتم و/أو الخنصر لإمساك الساق والذيل اليسرى، مع التأكد من أن الجانب الأيمن مكشوف بالكامل.
- احلق الفراء من الساق الخلفية حتى الأضلاع السفلية لخلق مساحة واضحة للحقن.
- يمكن حلق كلا الجانبين إذا احتجت الحاجة إلى مساحة تدريب إضافية.
ملاحظة: يمكن للمبتدئين تخدير الفئران عند تعلم الحلاقة والتخلص من الشعر.
2. تدرب على الحقن باستخدام الصبغة
ملاحظة: يمكن إجراء الممارسة على فئران حي (مخدرة) أو على الفئران المدمرة، وعلى أي من الجنسين. عادة ما يكون لدى ذكور الفئران جلد أكثر سمكا وأقل مرونة مقارنة بالإناث، مما يجعل العملية أكثر تحديا من الناحية التقنية. لهذا السبب، فإن التدريب على الذكور مفيد لتطوير الكفاءة.
- اخلط لون الطعام مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في أنبوب إيبندورف بسعة 1.5 مل حتى يبدو المحلول داكنا (تم استخدام لون الطعام الأزرق في هذه الدراسة).
- احصل على فئران تدريبية وتخديرها وفقا لإرشادات رعاية الحيوانات المؤسسية.
- ضع الفأر المخدر تحت مخروط أنف وميل الجسم لكشف الجانب الأيمن. تأكد من وجود تخدير كاف عن طريق قرص وسادة القدم بلطف وملاحظة عدم وجود استجابة.
- قم بتحميل 30 ميكرولتر من محلول الصبغة في حقنة أنسولين بسعة 0.3 مل باستخدام إبرة بوزن 29 جرام ونصف بوصة. أزل جميع فقاعات الهواء.
- باستخدام اليد غير المسيطرة، اضغط بلطف وقم بتمديد الساق/الجلد لتكوين سطح أملس ومشدود (تجنب رفع الجلد للأعلى). أدخل الإبرة بحافة إلى الأعلى في الجلد بزاوية موازية ضحلة للجلد. حافظ على الإبرة مرئية تحت السطح لتأكيد مكان الجلد.
ملاحظة: أثناء التدريب، اختبر أوضاع قبضة اليد المختلفة للحفاظ على توتر الجلد المستقر مع إبقاء الأصابع خالية من مسار الإبرة. أدخل الإبرة ~2 مم في الجلد. لتقليل التدفق العكسي، أدخل الإبرة ~3 مم، ثم اسحب قليلا لتكوين "جيب" قبل الحقن. هذا يساعد في الاحتفاظ بالصبغة في موقع الحقن. - قم بحقن كل محلول الصبغة البالغ 30 ميكرولتر ببطء حتى تتكون "فقاعة" صغيرة ومميزة تحت سطح الجلد
ملاحظة: غياب الفقاعات الظاهرة يشير إلى أن الحقن تم إعطاؤه تحت الجلد وليس عن طريق الجلد. الحفاظ على الميل في وضع للأعلى يساعد في ضمان دقة وضع الجلد ويمنع الحقن العميق جدا. - استمر في التدريب حتى تتكون فقاعات داخلية باستمرار. يمكن إجراء ما يصل إلى ست إلى ثماني حقن في كل جانب.
- بعد إكمال حقن الممارسة، قم بقتل الفئران وفقا لبروتوكولات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC)المعتمدة 5.
3. تحضير خلايا الورم للحقن
ملاحظة: قم بجميع الخطوات المتعلقة بالخلايا في غطاء معقم. كن واعيا بأن خطوط أورام الفئران المختلفة تنمو بشكل مختلف.
- إذابة خلايا الورم (B16F10 المستخدمة في هذه الدراسة) قبل عدة أيام من الحقن داخل الجلد.
- تصل خلايا الزراعة إلى التقاء بنسبة 70٪–80٪ مع الحفاظ على وسائط جديدة كافية
ملاحظة: تجنب التقاء 100٪، الذي يوقف التكاثر ويعيق نمو الأورام. - احصد وتحضير الخلايا بحجم 7 × 106 خلايا/مل إما في 1x PBS، أو RPMI خال من المصل، أو وسائط أخرى تستخدم لنمو الخلايا.
ملاحظة: نموذج الورم B16F10 المستخدم في المختبر يستخدم 2 × 105 خلية في 30 ميكرولتر. حجم الحقن البالغ 30 ميكرولتر مناسب، لكن يمكن تعديل عدد الخلايا حسب الحاجة لتحديد نموذج الورم المطلوب. تستقر الخلايا وتتجمع في أسفل الأنبوب، لذا لضمان ثبات تركيز الخلايا، قم بمزج الخلايا بلطف بشكل دوري لإبقائها معلقة. - حافظ على الخلايا على الثلاجة بعد المعالجة وتابع بسرعة في الحقن. التخزين المطول على الجليد يقلل من بقاء الخلايا، مما قد يقلل من عدد الخلايا الحية التي يتم توصيلها ويؤثر سلبا على تأسيس الورم6.
ملاحظة: يتم جمع الخلايا واستخدامها فورا في المختبر. تجرى الحقن خلال 20-60 دقيقة من معالجة الخلايا ووضعها على الثلج. استخدم شريكا عند العمل مع مجموعات كبيرة لتقليل الوقت على الجليد.
4. حقن داخل الجلد
- تخدير الفئران التجريبية.
ملاحظة: يستخدم المختبر التخدير باستخدام غاز الإيزوفلوران، لكن يمكن استخدام مخدرات قابلة للحقن. - بعد تحفيز التخدير، ضع الفأر تحت مخروط أنف ووضع الجسم ليكشف الجانب الأيمن بالكامل.
- اقلب نظام التعليق الخلوي بلطف لضمان خلط متساو.
- اسحب 30 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى حقنة بسعة 0.3 مل باستخدام إبرة 29 جيلون، 1/2 بوصة. أزل فقاعات الهواء.
- باستخدام اليد غير المسيطرة، قم بتمديد الساق/الجلد بلطف إلى الجانب ليصبح ناعما ومشدودا (لا ترفع اليد للأعلى). أدخل الإبرة بزاوية موازية ضحلة إلى الأدمة. يجب أن تبقى الإبرة مرئية تحت الجلد، مما يدل على أنها ليست عميقة جدا.
ملاحظة: يجب أن يكون عمق الإبرة ~2 مم داخل الجلد. لتجنب ارتداد الخلايا، أدخل الإبرة ~3 مم في الجلد، ثم اسحب الإبرة قليلا لتكوين "جيب" لحقن الخلايا فيه. وهذا يقلل بشكل كبير من التدفق العكسي. - قم بحقن كل 30 ميكرولتر من تعليق الخلية ببطء شديد حتى تتكون "فقاعة" صغيرة مرئية تحت الجلد. انتظر 5–10 ثوان قبل إزالة الإبرة.
ملاحظة: إزالة الإبرة بسرعة كبيرة قد تسبب خروج المحلول من الجلد بسبب الضغط. - كرر ذلك لكل فأرة. استبدل المحاقن بعد كل قفص (4–5 فئران) لمنع بهتان الإبر.
- راقب جميع الفئران حتى تتعافى تماما من التخدير.
- راقب الفئران بحثا عن تكون الأورام.
5. الحقن داخل الورم
ملاحظة: عادة ما تكون الأورام جاهزة للعلاج بعد 7–10 أيام من الزرع، بمجرد وصولها إلى الحجم المناسب. الحجم المناسب المستخدم في المختبر هو ~50 مم3 أو أكثر باستخدام الصيغة: الحجم = (الطول/2) * (العرض*العرض)7,8.
- جهز جميع حلول العلاج مسبقا (مثلا، تم استخدام 1x PBS في هذه الدراسة). احتفظ بالمحاليل على الثلج أو في درجة حرارة الغرفة حسب الحاجة للعلاج المحدد.
- تحفز التخدير وفقا لإرشادات المؤسسات.
- ضع الفأر تحت مخروط أنف للحفاظ على التخدير، وضعه بحيث يكون الورم مكشوفا.
- اسحب الحجم المطلوب (مثلا، 30 ميكرولتر المستخدم هنا) إلى حقنة أنسولين بسعة 0.3 مل باستخدام إبرة 29 جرام ونصف بوصة. أزل فقاعات الهواء.
ملاحظة: الحجم يختلف حسب المعالجة المختارة والظروف المثلى. - أدخل الإبرة أفقيا في الورم وتقدم نحو مركز كتلة الورم.
ملاحظة: تجنب الإدخال من الأعلى أو بزاوية حادة، لأن ذلك قد يؤدي إلى إدخال الحقن عميقا جدا أو في الأنسجة المحيطة. تم إعطاء العلاج الموصوف كحقنة واحدة. تعتمد الجرعات والتكرار كلها على العلاج المفضل والحالات المثلى. مع الأورام الصغيرة، تكون جرعة واحدة كافية لتوزيع العلاج، لكن مع الأورام الكبيرة، قد تكون هناك حاجة إلى عدة حقن لتوزيع العلاج بالتساوي عبر كتلة الورم. - حقن العلاج ببطء وثبات. توقف لمدة 10 ثوان قبل سحب الإبرة ببطء لتقليل التدفق العكسي أو التسرب. بعض الأورام لديها ضغط داخلي مرتفع، ويجب التأكد من عدم تسرب الحقن عبر فتحة الإبرة.
- كرر العملية لكل فأرة. استبدال الحقن بعد كل قفص يضم 4–5 فئران وعند تبديل مجموعات العلاج لمنع التلوث المتبادل.
- راقب الفئران بعد التخدير حتى تستعيد حركتها وتنفسها الطبيعي. استمر في المراقبة اليومية للاستجابة للعلاج والصحة العامة.
ملاحظة: كن واعيا بأن خطوط الخلايا المختلفة قد تسبب تقرحات الأورام في أوقات مختلفة. كل تجربة وكل بروتوكول IACUC يحتوي على نقاط نهاية ومعايير استبعاد محددة بوضوح. في المختبر، نقاط النهاية لتجارب الفئران هي 1500 مم3 ، وتقرحات تحدث مقبولة ولا تستبعد من الدراسة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عند ممارسة الحقن بالصبغة، يمكن التحقق من نجاح التوصيل داخل الجلد دون القتل الرحيم للفأر من خلال ملاحظة تكوين "فقاعة" مرئية في موقع الحقن. الحقن داخل الجلد الذي يتم بشكل صحيح ينتج "فقاعة" كبيرة ومحددة جيدا ومرتفعة (الشكل 1A–F). تشير الفقاعات الصغيرة أو المسطحة إلى أن الحقن قد يكون جزئيا تحت الجلد. إذا لم تتكون "فقاعة" وانتشرت الصبغة أو الخلايا تحت الجلد، فمن المحتمل أن يكون الحقن تحت الجلد (الشكل 1G–J).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعتمد نجاح هذا البروتوكول (الشكل 4) على الحفاظ على عمق حقن داخل الجلد ثابت ووضع دقيق للإبرة لضمان وصولها إلى الأدمة بدلا من الطبقة تحت الجلدية. إذا كانت زاوية الإبرة شديدة الانحدار أو ضغط الحقن مرتفعا جدا، فقد تترسب الصبغة أو خلايا الورم عبر الجلد إلى الفراغ تحت الجلد. بعد الحقن، يساعد التوقف المؤقت قبل سحب الإبرة ببطء في منع تسرب أو تكون أورام مزدوجة (مظهر "رجل الثلج") على الجانب. عند ممارسة الحقن والتعامل مع الفئران، حافظ دائما على قبضة آمنة تقلل من خطر غر...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.
شكر وتقدير
تعترف AS بمنحة تدريب علم المناعة، T32 AI007363. تشكر KSK بكل امتنان لمؤسسة شلمبرجير على دعمها لها من خلال برنامج هيئة التدريس من أجل المستقبل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Natural Centrifuge Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | 430825 | |
| Fluriso | Vet One | 13985-528-60 | isoflurane |
| Food Coloring | Durkee | for practice | |
| Insulin syringe 0.33 x 12.7 mm | Exel | 26018 | |
| Mini Arco | Wahl | 08787-450A | clippers to shave the mice |
| PBS, 1X w/o calcium & magnesium | Corning | 06325002 | pH 7.4 +/- 0.1 |
| RPMI 1640, 1x | Corning | 12225004 | |
| SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | anesthesia machine |
المراجع
- Zhang, W., Moore, L., Ji, P. Mouse models for cancer research. Chin J Cancer. 30 (3), 149-152 (2011).
- Silihe Kamga, K., Fiering, S. Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach. Front Immunol. 16, 1545000 (2025).
- Carlson, P. M., et al. Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model. J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).
- Bonnotte, B., et al. Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells. Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).
- Garber, J. C., et al. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).
- Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).
- Ho, G. W., et al. Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs. Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Chen, X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 632, 122559 (2023).
- Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges. Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
