مقالة منهجية

تقنية لتثبيت بروتينات الغشاء في الأقراص النانوية

DOI:

10.3791/70283

⸱

أبريل 30, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الدراسة إجراء إعادة تكوين بروتين الغشاء الحساس للحمض المرتبط ب TWIK قناة K+ 2 (المهمة 2) إلى أقراص نانوية. تم تأكيد نجاح التجميع بواسطة مجهر الإلكترون المجمد أحادي الجسيم، الذي أعطى متوسطات فئات ثنائية الأبعاد محددة جيدا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر العديد من بروتينات الغشاء استقرارا ضعيفا، وفقدان للنشاط، وتباينة في العينات عند استخراجها في بيئات قائمة على المغسلات، مما يشكل تحديات كبيرة لتحليل المجهر الإلكتروني الكريو-إلكترون عالي الدقة. تعالج تقنية القرص النانوي هذه القيود من خلال استخدام بروتينات السقالة الغشائية (MSPs) والفوسفوليبيدات لإعادة تكوين البروتينات المستهدفة إلى طبقة دهنية ثنائية شبيهة بالسكان الأصليين. في هذه الدراسة، تم التعبير عن قناة البوتاسيوم البشرية Task2 وذوبتها وتنقيتها في وجود منظفات مناسبة قبل تجميع القرص النانوي. يؤسس البروتوكول الناتج سير عمل قابل للتكرار لإعادة تشكيل القرص النانوي في المهمة 2، كما يتضح من خلال خطوات التحقق الرئيسية: تغيير واضح في حجم ملفات تعريف الكروماتوغرافيا الاستبعادية (SEC) يؤكد تكبير الجسيمات، والترحيل المشترك بين Task2 وMSP على SDS-PAGE، ومتوسطات فئات ثنائية الأبعاد محددة جيدا مع ميزات هيكلية ثانوية مرئية. تؤكد إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الأولية سلامة البروتين المدمج في القرص النانوي. من خلال تحسين نقاء العينة، والتجانس، وجودة الجسيمات، يوفر هذا النهج منصة قوية لدراسات هيكلية عالية الدقة للمهمة 2 ويوفر إطارا منهجيا قابلا للتطبيق على بروتينات الغشاء الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب بروتينات الغشاء دورا حيويا في نقل الإشارات الخلوية، ونقل المستقلبيات، والحفاظ على سلامة هيكل الخلية، والاستجابات المناعية. اضطراب تنظيم بروتينات الغشاء مرتبط بأمراض مختلفة، مما يجعلها أهدافا بارزة لتطوير الأدوية1. مكن ظهور المجهر الإلكتروني البارد (cryo-EM) من دراسات هيكلية لبروتينات الغشاء الكبيرة والديناميكية2. التحدي الرئيسي في الحصول على هياكل عالية الدقة يكمن في استخراج هذه البروتينات من طبقاتها الدهنية الثنائية الأصلية مع الحفاظ على تكوينها الأصلية ووظائفها الكيميائية الحيوية. علاوة على ذلك، فإن التكوين الديناميكي للغاية لبروتينات الغشاء وتعقيد فحص الأجسام المضادة يشكلان عقبات إضافية أمام اكتشاف الأدوية المستهدف 3,4. غالبا ما تستخدم الطرق التقليدية لاستخراج البروتينات الغشائية المنظفات لمحاكاة خصائص طبقة الدهون الثنائية الكارهة للماء. ومع ذلك، غالبا ما يؤدي هذا النهج إلى اضطراب استقرار بروتين الغشاء، مما يؤدي إلى التجمع أو التكتل الجزئي5. بالإضافة إلى ذلك، قد تزيل المنظفات جزيئات الدهون الأساسية التي تعتبر ضرورية لتثبيت تكوين البروتين، مما قد يغير تكوين البروتين أو حتى يضعف وظيفته، مما يحد من تطبيقها في فحص الأجسام المضادة والتطبيقات التالية الأخرى6.

تم تقديم تقنية الأقراص النانوية لأول مرة من قبل سليغار وزملاؤه7. عادة ما يتكون هذا الهيكل ذاتيا التجميع من مشتقات البروتين A1 (ApoA1)، وهي MSPs، مع الدهون الصناعية أو الطبيعية، مما يوفر بيئة مستقرة لبروتينات الغشاء 7,8,9. يشكل MSP بنية على شكل قرص من خلال إحاطة الحواف الكارهة للماء للطبقة الثنائية الدهنية. يتميز هذا الهيكل بسطح كاره للماء يتفاعل مع ذيول الدهون الأسيلية، مما يثبت بروتين الغشاء، وسطح محب للماء مواجه للخارج، مما يسمح للبروتين الغشائي بالبقاء قابلا للذوبان في المحاليل المائية10. تعمل الأقراص النانوية كمنصة متعددة الاستخدامات لدراسات البروتينات الغشائية. من خلال الحفاظ على بروتينات الغشاء النقية في بيئة دهنية شبه أصلية، تتغلب على قيود الطرق التقليدية القائمة على المنظفات وتحافظ على تكوين البروتينات ووظيفتها البيولوجية في المختبر. وبالتالي، أصبحت هذه الطريقة أداة قوية للدراسات الهيكلية لبروتينات الغشية. مقارنة ببيئات المنظفات التقليدية، توفر طبقة الدهون الثنائية في الأقراص النانوية دعما هيكليا لبروتينات الغشاء، مما يثبت شكلها الطبيعي — وهي خاصية حاسمة للبروتينات المعرضة للتعطيل، مثل مستقبلات بروتين G وقنوات الأيونات11. بالإضافة إلى ذلك، توفر الطبيعة الموحدة للغاية لجزيئات القرص النانوي بعد التجميع دعما أقوى للحصول على بيانات كريو-إيم-إي عالية الجودة وبيانات حركية موثوقة لرنين البلازمونات السطحية/التداخل الطبقي الحيوي12.

على مدار العقد الماضي، أصبحت تقنية الأقراص النانوية أداة قوية لدراسة بروتينات الغشاء في بيئات الدهون الطبيعية. على سبيل المثال، أنشأ فيليلا وزملاؤه13 إطارا منهجيا لتجميع الأقراص النانوية من خلال تحسين شروط إعادة التكوين والتحقق من جودة المكونات النهائية. على وجه التحديد، جمعوا بين كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) والمؤشرات الكمية (بما في ذلك كفاءة التجميع والتناظر الذروتي) لتقييم تجانس العينات بشكل موضوعي13. حاليا، أصبحت الأقراص النانوية منصة متعددة الاستخدامات. من خلال استخدام تقنية التجمد المغناطيسي الجريء الواحد للكشف عن البروتينات المعاد تشكيلها بواسطة القرص النانوي المجمعة، يمكن الحصول على هياكل عالية الدقة لبروتينات الغشاء، وتم إثبات قابليتها للتطبيق بشكل قوي. ميزة كثافة الحلقة المزدوجة في نطاق MSP هي الدليل البنيوي الحاسم على نجاح الربط 10,14,15. علاوة على ذلك، تعد الأقراص النانوية أداة قيمة لكل من التحليل الوظيفي لبروتينات الغشاء في بيئات الطبقة الثنائية الدهنية وتطبيقها في دراسات الرنين المغناطيسي النوويبالمحلول 16,17.

يصف هذا البروتوكول طريقة لتجميع بروتين غشاء Task2 البشري في أقراص نانوية. هيومان تاسك2 هو عضو مسجل بدرجة حموضة في عائلة قنوات المجال ذو المسامتين K+ (K 2P)18,19. مثل قنوات K2P الأخرى، المهمة 2 هي متجانسة متبادلة المجال، حيث تحتوي كل سلسلة بروتومر على أربعة حلزونات تمتد عبر الغشاء (TM1–TM4)، ولولب مسام عائد الدخول (PH1 وPH2)، ومرشحين انتقائيين (SF1 وSF2)، ولولبين خارجيين يشكل غطاء (CH1 وCH2). كان البروتين المستهدف صقلا مقطوعا من Task2 يفتقر إلى 166 حمض أميني C-terminal — وهي منطقة متوقعة أن تكون غير منظمة إلى حد كبير — والتي وجد أنها تحسن تعبير البروتين والاستقرار الكيميائي الحيوي. الوزن الجزيئي للمهمة الثانية المعاد تركيبها هو حوالي 72 كيلو دالتون مع علامة GFP. تم إذابته وتنقيته باستخدام مسحوق غسيل مسبقا. تم دمجها مع الدهون وMSP بنسبة ستوكيومترية محسوبة بدقة. بعد إزالة المنظفات باستخدام بيو-بيدز، تم تنقية العينة بشكل إضافي بواسطة الكروماتوغرافيا بإزالة الحجم (SEC) للحصول على تحضير مناسب للتجميد الكهرومغناطيسي. ثم تم توليد متوسطات فئات ثنائية الأبعاد (2D) من بيانات التجميد الكهرومغناطيسي الجريء الأحادي للتحقق من سلامة العينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير مخزون الدهون

  1. تحضير الدهون
    1. تحضير خلطات الدهون باستخدام ثلاثة فوسفوليبيدات: 1,2-ديولويل-إس-جليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين (DOPE)، 2-أوليولويل-1-بالميتويل جليسرو-3-فوسفوكولين (POPC)، و1-بالميتويل-2-أوليويل فوسفاتيديلسيرين (POPS).
    2. استخدم محاليل جاهزة مسبقا من هذه الدهون في الكلوروفورم، كل واحدة بتركيز 25 ملغ/مل.
      ملاحظة: يلزم استخدام معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع الكلوروفورم، ويجب إجراء جميع الإجراءات باستخدام غطاء بخار. خزن الكلوروفورم في خزانة كيميائية مخصصة.
    3. نظرا لتقلب الكلوروفورم، عند القياس باستخدام الحقنة الدقيقة، تحقق من أن حجم محلول الدهون يتطابق مع الحجم المسجل في البداية قبل كل استخدام. إذا حدث تبخر، أعد تعبئة المحلول بالكلوروفورم النقي إلى الحجم الأصلي وامزجه جيدا.
      ملاحظة: قبل كل قياس، اشطف الحقنة الدقيقة مرتين بالكلوروفورم.
    4. حضر خليط دهون بسعة 100 ميكرولتر بنسبة كتلة DOPE:POPC:POPS = 2:1:1. استنادا إلى هذه النسبة، اجمع بين 50 ميكرولتر من VDOPE، و25 ميكرولتر من VPOPC، و25 ميكرولتر من VPOPS. قس الحجم المقابل وفقا للرقم المحسوب. أضفه إلى أنبوب الاختبار الزجاجي وامزجه جيدا.
    5. ضع أنبوب الاختبار الزجاجي في حمام ماء لتقليل تطاير الكلوروفورم والحفاظ على درجة حرارة البيئة مستقرة.
  2. تحضير فيلم الدهون
    1. تبخر الكلوروفورم تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين حتى يتم إزالة كل السائل ويتكون طبقة شفافة متجانسة تشبه الهلام في أسفل أنبوب الاختبار.
      ملاحظة: تأكد من وجود طبقة دهنية جاف ومنتظمة ظاهرة في أسفل الأنبوب الزجاجي، دون بقايا قطرات سائلة. تجنب التدفق المفرط للنيتروجين، لأنه قد يسبب فقاعات ويمنع جفاف الكلوروفورم تماما.)
    2. أضف حوالي 2 مل من n-pentane بشكل قطري إلى أنبوب اختبار زجاجي. ثم تبخر المذيب باستخدام طريقة تجفيف النيتروجين الموضحة في 1.2.1 للحصول على طبقة دهنية جافة وشفافة. يتبخر n-Pentane في أنبوب اختبار زجاجي بسبب خامله الكيميائي وتوافقه مع المذيبات العضوية. يتجنب الزجاج خطر تسريب أو تحلل البلاستيك المرتبط بالعديد من مواد المختبرات البلاستيكية، مما يحافظ على نقاء الدهون أثناء تكوين الفيلم.
      ملاحظة: يجب تخزين n-Pentane في خزانة كاشف مخصصة، وعند استخدامه يتم التعامل معه بعناية داخل غطاء بخار مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    3. فك غطاء أنبوب الاختبار وضعه في جهاز تجفيف مفرغ. قم بإخراج المجفف وحافظ عليه تحت الفراغ لإزالة أي مذيبات متبقية. ضع جل السيليكا الذاتي المؤشر في أسفل المجفف لامتصاص الرطوبة.
      ملاحظة: تبخر الكلوروفورم المتبقي وn-بنتان حتى يصبح جافا في غطاء أبخرة.
  3. ترطيب الدهون وتحضير محلول المرق
    1. قم بإزالة طبقة الدهون من مجفف الفراغ وترطيبه بإضافة 250 ميكرولتر من محلول منخفض الملح الخالي من المغسلات (LSB) (الجدول التكميلي 1). وهذا ينتج تركيزا نهائيا للدهون يبلغ 10 ملغ/مل.
      ملاحظة: تم اختيار مخزن مؤقت قائم على أيونات البوتاسيوم لأن المهمة 2 هي قناة أيونات البوتاسيوم
    2. بعد إعادة تعليق الدهون، قسم الدهون بشكل متساو إلى أربعة أنابيب زجاجية وقم بتصويع التعليقات حتى تصبح صافية وشفافة، مما يشير إلى نجاح تكوين الليبوسوم (حوالي 1.5 ساعة). قم بأداء السونيك بسعة 60٪ باستخدام دورة تشغيل 4 ثوان و6 ثوان إيقاف.
    3. اجمع محلول الدهون المصفي وأجمع 1.5 مل في أنابيب طرد مركزية دقيقة فردية. قم فورا بغسل مساحة كل أنبوب بغاز النيتروجين وخزنها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. التعبير المفرط وتنقية MSP

  1. التعبير بدائي النواة ل MSP
    1. تحويل البلازميدات: استخدم بلازميد MSP1D1 الحامل لعلامة 7×His لتحويل الخلايا المؤهلة لشبكة الإشريكية القولونية BL21 (DE3). قم بتغليف خليط التحويل على ألواح أجار لوريا-بيرتاني (LB) تحتوي على الكاناميسين (50 ميكروغرام/مل) واحتضنه طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية للحصول على مستعمرات فردية.
    2. تضخيم الزرعة: اختر نسخة واحدة وتلقيحها في 5 مل من وسط LB يحتوي على الكاناميسين وحضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج. قم بتلقيح الثقافة الليلية في وسط LB السائل بنسبة 1:100، ثم ننمو عند 37 درجة مئوية مع الرج حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) إلى 2.0–3.0.
    3. تحفيز تعبير البروتين: تحفيز تعبير MSP بإضافة إيزوبروبيل β-d-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) إلى تركيز نهائي 0.5–1 مللي مول. استمر في زراعة الخلايا عند 16 درجة مئوية لمدة 16–20 ساعة مع الرج.
  2. اضطراب الخلايا
    1. جمع الحبيبات: قم بالطرد المركزي في زراعة البكتيريا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الفائقة واحتفظ بحبيبة الخلية.
    2. تحلل البكتيريا: أعد تعليق الحبيبات المستخرجة من 1 لتر من الزراعة في 100–150 مل من محلول التحلل (الجدول التكميلي 1). قم بتوحيد الشكل تماما حتى يتم تحقيق تعليق موحد بدون كتل ظاهرة. أضف PMSF إلى التعليق لتثبيط البروتيازات وتقليل الرغوة.
    3. الصوت: استخدم جهاز تعطيل للخلايا فوق الصوتية المبرد لتعطيل البكتيريا. اضبط القدرة على 35٪ وطبق دورات من 3 نبضات تليها 6 ثوان توقفات. لتجنب ارتفاع درجة الحرارة، اترك فترة راحة لمدة دقيقتين بعد كل 15 دقيقة من وقت السونيك التراكمي. استمر حتى يصبح الليزات صافيا ولونه بني فاتح.
    4. توضيح: قم بطرد مركزي بالمادة على 30,000 جرام لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية واجمع المادة الفائقة للخطوات التالية.
  3. تنقية MSP
    1. تحضير راتنج Ni-NTA: خذ 3–5 مل من راتنج Ni-NTA وقم بتعبئته في عمود جاذبية (الحجم: 26.4×134.8 مم). اغسل الراتنج بثلاثة أعمدة (CV) من الماء المقطر ووازنه بثلاثة أعمدة من مخزن الغسيل 1 (الجدول التكميلي 1).
    2. ارتباط MSP بالراتنج: بعد الطرد المركزي لتحليل الخلية، اخلط المادة الفائقة مع راتنج Ni-NTA المتساوي. أضف الإيميدازول إلى تركيز نهائي يبلغ 5 ملليموتر وحضن الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين مع تدوير لطيف في الظلام.
    3. الغسل لإزالة الشوائب: اغسل بشكل متسلسل باستخدام تدرجات من محلول الغسيل 1، ومخزن الغسيل 2 (الجدول التكميلي 1)، ومخزن الغسل 3 (الجدول التكميلي 1)، باستخدام ما لا يقل عن 50 مل من كل محلول مؤثر. راقب امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر (A 280) من تدفق التدفق واستمر في الغسل حتى تنخفض قيمة A280 إلى أقل من 0.01.
    4. المشرف: قم بإخراج البروتين المستهدف باستخدام محلول الإزالة (الجدول التكميلي 1) وجمع الكسور المشوهة. استمر في عملية التسهيل، وجمع الكسور حتى ينخفض A₈₀ من السحب إلى أقل من 0.01.
    5. مراقبة وتحليل العمليات: جمع عينات من مراحل التنقية الرئيسية — بما في ذلك الفائق، والترسبات، والجريان، وكسور الغسيل، وكسور التفريغ. قم بتحليلها بواسطة SDS-PAGE لتقييم كفاءة التنقية (الشكل التكميلي 1).
    6. الغسيل الكلوي لتبادل المخزن الكهربائي: انقل الإيلوات المجمع إلى أنبوب الغسيل وقم بتحطيمه مقابل مخزن الغسيل (الجدول التكميلي 1) عند 4 درجات مئوية مع تحريك لطيف طوال الليل.
    7. الترشيح الفائق والتركيز: تركيز المحلول المثول باستخدام جهاز الترشيح الفائق إلى تركيز نهائي MSP بين 2–5 ملغ/مل. MSP المنقى والمركز جاهز الآن للاستخدام في تجميع أقراص النانوية الغشائية البروتينية.

3. تفعيل الخرز البيولوجي

  1. الوزن
    1. وزن حوالي 250 ملغ من بيو-بيدز في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل باستخدام ميزان تحليلي.
  2. غسلات الميثانول
    1. أضف 25–30 مل من الميثانول إلى الأنبوب. قم بتدوير الخليط جيدا أو لف الدوران في الظلام، ثم حضن الخليط لمدة 20 دقيقة. تخلص من الفائق بحذر بعد الحضانة.
    2. كرر هذه الخطوة بغسل الميثانول ثلاث مرات إجمالا.
      ملاحظة: بسبب تقلب الميثانول، يجب إجراء هذا الإجراء باستخدام غطاء بخاري مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. اجمع الميثانول المستخدم وتعامله كسائل نفايات بيولوجية.
  3. المياه المائية
    1. أضف 25–30 مل ddH2O إلى الخرز. اهز أو لف الأنبوب لخلطه واحتضنه لمدة 20 دقيقة.
    2. تخلص من السوبرناتانت. كرر هذه الخطوة بالغسل المائي ثلاث مرات.
  4. التوازن مع LSB
    1. أضف 25–30 مل من LSB الخالي من المنظفات إلى الخرز. اهز أو لف الأنبوب على طاولة دوارة لخلطه واحتضنه لمدة 20 دقيقة.
    2. تخلص من السوبرناتانت. كرر خطوة التوازن في LSB ثلاث مرات لتعديل الخرزات بالكامل.
  5. الاقتباس والتخزين
    1. قسم الحبات الحيوية المنشطة بالتساوي إلى ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل. تأكد من بقاء الخرزات رطبة بكمية صغيرة من LSB.
    2. لف الأنابيب بورق ألمنيوم لحمايتها من الضوء وخزنها على الثلج للاستخدام الفوري.

4. تجميع القرص النانوي

  1. تحضير الدهون وMSP
    1. توضيح مخزون الدهون: استرجع قطعة واحدة من مخزون الدهون المحضر مسبقا وإذابته. فورا قم بطرد مركزي الأنبوب عند 7,000 × g لمدة 5 ثوان عند 4 درجات مئوية لجمع المحتويات في القاع.
    2. قم بإجراء التصوير فوق الصوتي في حمام ماء ومراقبة الوضوح ودرجة الحرارة كل 5–10 دقائق لمنع ارتفاع درجة الحرارة. قم بأداء السونيك عند سعة 60٪. قم بعمل أشعة فوق صوتية لمخزون الدهون حتى يصبح شفافا وشفافا.
    3. إذابة MSP: إذابة جزء واحد من محلول MSP المحضر في حمام ماء مثلج.
  2. جهز المخزن وفقا للنسبة الستوكيومترية.
    1. قم بقياس بروتين الغشاء: عزل بروتين الغشاء المنقى (المهمة 2)، الذي يذيب بنسبة 0.025٪ DDM/0.005٪ CHS، عن طريق كروماتوغرافيا الاستبعاد بالحجم (SEC). حقن حجم عينة 500 ميكرولتر بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة على عمود زيادة 6 (سيتيفا). اجمع ذروة التدفق عند 14.8 مل وركزها (الشكل 1). حدد تركيز البروتين باستخدام جهاز NanoDrop.
    2. احسب كمية ضرس البروتين: احسب الكمية المولية (n) لبروتين الغشاء المستهدف باستخدام الصيغة: n = C × V، حيث C هو التركيز الأضراسي وV هو الحجم.
    3. تحديد حجم MSP وحجم الدهون المطلوبة: احسب الأحجام المطلوبة من محاليل MSP ومخزون الدهون بناء على نسبة التوازن المولية للبروتين المستهدف: MSP : الدهون = 1 : 5 : 250.
    4. تحضير الخليط الرئيسي: بناء على نتائج الحساب، اجمع أحجام الدهون وMSP المقابلة لتحضير خليط رئيسي بسعة 300 ميكرولتر.
      ملاحظة: تأكد من وجود المنظف في هذا الخليط للحفاظ على تركيز مطابق لتركيز محلول البروتين، وبالتالي منع التجمع المبكر.
  3. إزالة المنظفات وتجميع القرص النانوي
    1. الحضانة الأولية باستخدام خليط إعادة التكوين: حضن الخليط الجاهز (الجدول التكميلي 1) على الثلج لمدة 10 دقائق. ثم أضف ببطء 50 ميكرولتر من الخليط إلى محلول البروتين المركز، وامزجه بلطف عن طريق استخدام الماصات لضمان التجانس.
    2. توازن خليط البروتين والدهون: ضع الخليط المدمج على الثلج لمدة ساعة واحدة. اقلب الأنبوب بلطف كل 15 دقيقة لخلط الأنبوب جيدا.
    3. الحضانة الأولى باستخدام الحبيبات الحيوية: قم بطرد مركزي مؤقت للخليط عند 7,000 × جرام لمدة 5 ثوان عند 4 درجات مئوية لجمع محلول البروتين في أسفل الأنبوب. خذ أليكوت واحد من الخرز البيولوجي المنشط مسبقا، واسحب ال LSB المتبقي، وأضف محلول البروتين إلى الخرزات، وحضن مع تدوير في الظلام لمدة ساعة لمنع تحلل البروتين المستهدف الناتج عن الضوء.
    4. الحضانة الثانية باستخدام الخرز البيولوجي: قم بطرد الخليط عند 7,000 × جرام لمدة 5 ثوان عند 4 درجات مئوية وانقل الفائق بعناية إلى أليكوت ثان من خرز بيولوجي (تم استنشاق LSB أيضا منه) وامزج جيدا عن طريق العكس اللطيف في الظلام لمدة 4–8 ساعات أو طوال الليل.
    5. الحضانة النهائية باستخدام الحبيبات الحيوية: استرجاع محلول البروتين بعد الحضانة الليلية، وطرد مركزه لفترة وجيزة، وانقل المادة الفائقة إلى الجزء الثالث والأخير من الحبيبات الحيوية المفعلة مسبقا. الحضانة مع دوران عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة ساعة واحدة.
    6. بعد عملية طرد مركزية قصيرة، انقل المادة الفائقة إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي دقيق نظيف عند 17,000 x جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة أي تجمعات.
      ملاحظة: تخلص من خرز بيولوجي مستهلك كنفايات بيولوجية.
    7. تنقية الأقراص النانوية: تنقية مركبات المهمة النانوية الديسكية 2 بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC): حقن حجم عينة 500 ميكرولتر بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة على عمود زيادة Superose 6 وجمع ذروة التدفق عند 15 مل (الشكل 2).
    8. تركيز المنتج النهائي: جمع الكسور القصوى من إخراج SEC وتركيزها في تركيز نهائي من القرص النانوي-Task2 بين 1.2–1.5 ملغ/مل، مناسب لتحضير عينات بالتجميد والكهرومغناطيسية.

5. تحقق من نجاح تجميع القرص النانوي

  1. تحليل SDS-PAGE: عينات Aliquot من الكسور المنقاة بواسطة SEC.
    1. تحليل العينات باستخدام 12٪ SDS-PAGE لتأكيد وجود مكونات رئيسية (مثل MSP وبروتين الغشاء المستهدف)، مما يشير إلى نجاح تجميع القرص النانوي (الشكل 3).
  2. تحضير وتحليل عينات Cryo-EM.
    1. تركيز العينة التي تم تجميعها بنجاح إلى تركيز نهائي بين 1.2–1.5 ملغ/مل لتحضير العينة بالتجميد والEM.
    2. ابدأ بتوصيل العينة بالطرد المركزي عند 17,000 x g و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إيداع قطرة بحجم 3 ميكرولتر على شبكات ذهبية كوانتيفويل R1.2/1.3 (300 شبكة، كربون ثقوب).
    3. حضن عند 4 درجات مئوية في رطوبة 100٪ لمدة 5 ثوان. قم بمسح الشبكة لمدة 4 ثوان في فيتروبوت مارك IV وقم بتجميد الغوص في الإيثان السائل مع الحفاظ على درجة حرارة النيتروجين السائل.
    4. جمع مجموعات أفلام فائقة الدقة باستخدام برنامج EPU على جهاز Titan Krios G4 Cryo-EM يعمل بجهد 300 كيلوفولت ومزود بكاشف إلكترونيات مباشر من Falcon G4i.
    5. اضبط زمن التعريض إلى 2.78 ثانية، وهو ما يعادل حجم بكسل 0.73 Å (165k ×) وجرعة تراكمية إجمالية تقارب 50 e⁻/Å2 لكل مكدس أفلام EER.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهر التحضير الناجح لمخزون الدهون من خلال تكوين محلول شفاف وشفاف بعد السونيكية. بالنسبة ل MSP، أسفرت كروماتوغرافيا النيكل عن منتج عالي النقاء بحوالي 3 ملغ/مل. تم تأكيد تجميع الأقراص النانوية بواسطة SEC، الذي أظهر ملف إزعاج مميز (الشكل 2). مقارنة بملف SEC في المهمة 2 الذي تم الحصول عليه قبل تجميع القرص النانوي (الشكل 1)، تتحول ذروة البروتين إلى حجم إزعاج أعلى (تصفيف لاحق) بعد التجميع. كما هو موضح في الشكل 2، يعرض ملف SEC قمتي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم الطريقة لإعادة تشكيل البروتينات الغشائية القابلة للذوبان في المغسلة إلى أقراص نانوية عبر إزالة المنظفات، مما يوفر بيئة ذات طبقة دهنية ثنائية أكثر طبيعية. يعتمد نجاح عملية التجميع هذه على عدة عوامل رئيسية. أبرزها النسبة الدقيقة بين بروتين الغشاء، MSP، والدهون. يمكن أن تؤدي النسب القياسية غير الصحيحة إلى تجمع البروتينات أو تجميعها غير الناجح. على سبيل المثال، أدت المحاولة الأولى لتجميع الأقراص النانوية بنسبة 1:2:50 إلى تجميع كامل للمهمة 2. لذلك، فإن تحسين نسبة القياس القياسي ضروري لتح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون موظفي مركز التجميد المغناطيسي في جامعة خنان، بالإضافة إلى البروفيسور وي وانغ، على دعمهم الخبير. تم توفير التمويل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32371261 المنح ل B.L. و 32301011 إلى R.Z.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الخرز البيولوجيبيو-رادي1523920
كوليستريل هيميسوكسيناتأناترايسالفصل 210
الكلوروفورمSinoreagentاستخدامه في غطاء بخار
رائعأفانتي850725P
الميثانولSinoreagent
ن-دوديسيل-بيتا-دي-مالتوزيدأناترايسD310
ن-بنتانأداماساستخدامه في غطاء بخار
POPCأفانتي850457P
بوبسأفانتي840034P
هيئة الأوراق المالية والبورصاتبيو-رادياتبع بروتوكول الشركة المصنعة للاستخدام الصحيح
أنابيب غسيل الكلى من جلد الأفعىالترمو68011
سوبروز  زيادة 6 10/300 GLسيتيفا29091596
أعمدة دوران الترشيح الفائق أميكون ألترا-15ميليبورUFC905008

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Dodd, R., Schofield, D. J., Wilkinson, T., Britton, Z. T. Generating therapeutic monoclonal antibodies to complex multi-spanning membrane targets: overcoming the antigen challenge and enabling discovery strategies. Methods. 180, 111-126 (2020).
  4. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. MAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  5. Kotov, V., et al. High-throughput stability screening for detergent-solubilized membrane proteins. Sci. Rep. 9 (1), 10379(2019).
  6. Barrera, N. P., Zhou, M., Robinson, C. V. The role of lipids in defining membrane protein interactions: insights from mass spectrometry. Trends Cell Biol. 23 (1), 1-8 (2013).
  7. Bayburt, T., Grinkova, Y., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2 (8), 853-856 (2002).
  8. Carlson, J. W., Jonas, A., Sligar, S. G. Imaging and manipulation of high-density lipoproteins. Biophys. J. 73 (3), 1184-1189 (1997).
  9. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).
  10. Vinogradova, O. Nanodiscs and solution nuclear magnetic resonance. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103067(2025).
  11. Popot, J. L. Amphipols, nanodiscs, and fluorinated surfactants: three nonconventional approaches to studying membrane proteins in aqueous solutions. Annu. Rev. Biochem. 79, 737-775 (2010).
  12. Li, S. Detergents and alternatives in cryo-EM studies of membrane proteins. Acta Biochim. Biophys. Sin. 54 (8), 1049-1056 (2022).
  13. Vilela, F., Sauvanet, C., Bezault, A., Volkmann, N., Hanein, D. Optimizing transmembrane protein assemblies in nanodiscs for structural studies: a comprehensive manual. Bio Protoc. 14 (21), e5099(2024).
  14. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid nanodiscs as a tool for high-resolution structure determination of membrane proteins by single-particle cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  15. Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. Nanodisc-reconstitution for single particle cryo-EM structure determination of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103072(2025).
  16. Yokogawa, M., Fukuda, M., Osawa, M. Nanodiscs for structural biology in a membranous environment. Chem. Pharm. Bull. 67 (4), 321-326 (2019).
  17. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  18. Enyedi, P., Czirják, G. Molecular background of leak K+ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol. Rev. 90 (2), 559-605 (2010).
  19. Reyes, R., et al. Cloning and expression of a novel pH-sensitive two pore domain K+ channel from human kidney. J. Biol. Chem. 273 (47), 30863-30869 (1998).
  20. Notti, R. Q., Walz, T. Native-like environments afford novel mechanistic insights into membrane proteins. Trends Biochem. Sci. 47 (7), 561-569 (2022).
  21. Pocanschi, C. L., Kleinschmidt, J. H. The thermodynamic stability of membrane proteins in micelles and lipid bilayers investigated with the ferrichrom receptor FhuA. J. Membr. Biol. 255 (4-5), 485-502 (2022).
  22. Hiotis, G., Notti, R. Q., Bao, H., Walz, T. Nanodiscs remain indispensable for cryo-EM studies of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 92, 103042(2025).
  23. Nakao, K., et al. Home is where the lipids are: a comparison of MSP and DDDG nanodiscs for membrane protein research. Soft Matter. 21 (33), 6596-6602 (2025).
  24. Dalal, V., et al. Lipid nanodisc scaffold and size alter the structure of a pentameric ligand-gated ion channel. Nat. Commun. 15 (1), 25(2024).
  25. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  26. Tao, X., Zhao, C., MacKinnon, R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120 (18), e2302325120(2023).
  27. Zhang, S., et al. One-step construction of circularized nanodiscs using SpyCatcher-SpyTag. Nat. Commun. 12 (1), 5451(2021).
  28. Ren, Q., et al. DeFrND: detergent-free reconstitution into native nanodiscs with designer membrane scaffold peptides. Nat. Commun. 16 (1), 7973(2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Task2 SDS PAGE

مقالات ذات صلة