تم تصميم هذا البروتوكول الدراسي للتحقيق بشكل منهجي في التأثيرات المحتملة لحماية الغضروط الغضروفية لمستخلص Fructus Xanthii في التهاب المفاصل العظمي من خلال تحليلات متعددة الأوميكس المتكاملة والتجارب في الجسم الحي .
مقالة بحثية
* These authors contributed equally
تم تصميم هذا البروتوكول الدراسي للتحقيق بشكل منهجي في التأثيرات المحتملة لحماية الغضروط الغضروفية لمستخلص Fructus Xanthii في التهاب المفاصل العظمي من خلال تحليلات متعددة الأوميكس المتكاملة والتجارب في الجسم الحي .
التهاب المفاصل العظمي (OA) هو اضطراب تدهور تدريجي في المفاصل حيث تخفف التدخلات الدوائية والجراحية الحالية أعراضه بشكل رئيسي بدلا من عكس التغيرات المرضية الأساسية، مما يبرز الحاجة الملحة إلى عوامل علاجية جديدة. كان هدف هذا البروتوكول إلى دراسة التأثيرات الوقائية المحتملة لمستخلص Fructus Xanthii ضد التهاب الفصول الدهنية. أولا، تم إجراء تحليل غير مستهدف باستخدام كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء مع مطيافية الكتلة المتتالية عالية الدقة (UHPLC-HRMS/MS) لتوصيف المكونات الكيميائية للمستخلص. ثم تم تطبيق استراتيجية متكاملة تجمع بين علم الأدوية الشبكي والتنقل النصي لتحديد المكونات الحيوية النشطة والأهداف المفترضة للمستخلص، تلاها تحليل متقاطع مع جينات غير منظمة مرتبطة بالتأكسج التأكسجي للحصول على الجينات المستهدفة الأساسية. تم إجراء تحليلات إثراء جينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) لتوضيح العمليات البيولوجية الرئيسية ومسارات الإشارة التي يعدل بواسطة المستخلص. للتحقق في الجسم الحي ، تم استخدام نماذج إصابة غضروف سمك الزرد ونماذج OA للفئران لتقييم التأثيرات الوقائية للغضروف الغضروفية للمستخلص الطبيعي. تم اعتماد تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لتحليل التغيرات النصية في الخلايا الغضروفية بعد العلاج، مع التركيز على المسارات المرتبطة بالأوكسيدات وملفات التعبير الجينية؛ تم إجراء اختبار العضلات المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) لاحقا للتحقق من مستويات التعبير للبروتينات/المستقبلات الرئيسية التي تم فحصها بواسطة RNA-seq، وذلك لتأكيد التأثيرات التنظيمية لمستخلص Fructus Xanthii على الأهداف الأساسية لالتهاب الفصم الدهوي. يوفر هذا البروتوكول المتكامل متعدد الأوميكس والتجريبي نهجا منهجيا لاستكشاف إمكانيات مستخلص فروكتوس زانثي كمرشح نباتي واعد لتدخل الأكسمان الدهني.
التهاب المفاصل العظمي (OA) هو اضطراب تنكسي في المفاصل يتميز بالتدهور التدريجي للغضروف المفصلي، وتصلب العظم تحت الغضروف، والالتهاب الزليلي، وتكوين العظام1. وفقا لدراسة العبء العالمي للأمراض (GBD)، ارتفع انتشار الالتهاب المفاصل بشكل مستمر عبر 204 دول وأقاليم من 1990 إلى 2020، ومن المتوقع أن يتسارع هذا الاتجاه جنبا إلى جنب مع التقدم في العمر الديموغرافي العالمي3. تشير التقديرات الحالية إلى أن أكثر من 250 مليون شخص حول العالم متأثرون، مما يضع ضغطا كبيرا على الرفاهية الفردية وأنظمة الرعاية الصحية والهياكل الاجتماعية والاقتصادية4. تركز العلاجات الحالية بشكل رئيسي على تخفيف الأعراض، مع الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (NSAIDs) وتكميلات اللزجة داخل المفصل مع حمض الهيالورونيك (HA) من أكثر التدخلات شيوعا. ومع ذلك، تقدم هذه الأساليب فوائد سريرية محدودة وترتبط بآثار جانبية كبيرة 5,6. وهذا يبرز الحاجة الملحة لأدوية التهاب المفاصل العظمي الفعالة المعدلة للمرض (DMOADs).
لطالما استخدم الطب الصيني التقليدي (TCM) في إدارة التهاب المفاصل الدهوي، مستندا إلى مفهوم "ثنائي العظم"، وهو نوع فرعي من "متلازمة الثنائي العظمي"7. في هذا الإطار، يعزى سبب التهاب المفيض بشكل أساسي إلى نقص في جوهر الكبد والكلى، ونقص الطاقة والدم، والغزو اللاحق بالرياح والبرد والرطوبة8. وبالتالي، تركز الاستراتيجيات العلاجية على إزالة رطوبة الرياح، وتفريق البرد، وإزالة العوامل الجانبية. تشتهر علاجات الطب الصيني الصيني بتأثيراتها متعددة الأهداف، وملفات الآثار الجانبية الإيجابية، وفعاليتها ذات الدلالة السريرية10. أظهرت تركيبات بارزة مثل كبسولة بوقي تونغلو (BQTL) وفوزي ديكوكشن (FZD) تأثيرات واضحة ضد الانسداد المفعيمي في الممارسة السريرية، بينما يخفف دو هوو جي شينغ تانغ (DHJST) أعراض التهاب المفاصل من خلال تثبيط مسار التهاب NLRP3، المدعوم بقرون من الاستخدام التجريبي. وبالمثل، يخفف خليط شينجينهوشوي (SHM) الألم وتحلل الغضاريف من خلال تقليل تنظيم الوسطاء الالتهابيين مثل IL-1β وTNF-α 11,12,13. على مستوى الأحاد، تم الإبلاغ عن مركبات مثل الإيكارين (السيانوسيد A، CyA) والإيريانين، المستخرجة من النباتات الطبية، على تعزيز تكاثر الخلايا الغضروفية، ومنع إفراز السيتوكين الالتهابي، والحفاظ على التوازن الداخلي للمفصل14,15. بشكل عام، يقدم طب الطب الصيني التقليدي نهجا علاجيا شاملا يتميز بخصائص مضادة للالتهابات، وحماية غضروفية، ومخففة للأعراض. ومع ذلك، فإن تعقيد آلياته وقضاياه المتعلقة بالتوحيد القياسي يتطلب بحثا مستمرا ودقيقا.
تم توثيق أن الثمار الناضجة المجففة لفركتوس زانثي (مركبات)، المعروفة باسم "كانغ-إر-زي"، تظهر مجموعة واسعة من الأنشطة الدوائية، بما في ذلك التأثيرات المضادة للميكروبات، ومضادة للالتهابات، ومضادة للأكسدة، ومسكنة الألم، ومضادة للأورم، وتأثيرات مناعيةمعدلة. الأحماض الفينولية المعزولة من فروكتوس زانثي تقلل بشكل فعال من فرط التنسج الزليلي في التهاب المفاصل الروماتويدي (RA)17. من بين هذه المواد، وجد حمض الكلوروجينيك (CGA)، وهو مشتق ممثل لحمض الكافويلكوينيك، يحفز تكاثر وتمايز الخلايا العظمية مع تثبيط تكوين العظم الورقي ب RANKL، وبالتالي الحفاظ على توازن الهيكل العظمي18. تظهر أحماض الفينول الأخرى التي تم تحديدها ضمن نفس المستخلص، مثل حمض النيوكلوروجينيك (5-CQA)، حمض الكريبتوكلوروجينيك (CCA)، وحمض البروتوكاتيشويك، خصائص مضادة للميكروبات ومضادات الالتهاب ومضادة للأورام ومضادات أكسدة 19,20,21. بالإضافة إلى الأحماض الفينوليكية، تساهم مجموعة متنوعة من المستقلبات الثانوية الموجودة في كانغ-إر-زي في هذه الأنشطة الحيوية 16,20,22,23,24,25. ومع ذلك، لا يزال الدور الدقيق والآليات الأساسية لمستخلص Fructus Xanthii في OA غير مستكشف إلى حد كبير.
الكروماتوغرافيا السائلة غير المستهدفة - مطيافية الكتلة المتتالية (LC-MS/MS) تتميز أيضات بقدرات خالية من الفرضيات، عالية الإنتاجية، وتغطية شاملة. يتيح الكشف المتزامن عن آلاف ميزات المستقلب، مما يوفر رؤية بانورامية لشبكات الأيض، ويسمح بالاكتشاف المنهجي لمؤشرات حيوية جديدة ومسارات أيضية شاذة دون تحديد مسبق للهدف26,27. بالاقتران مع تقنية مطيافية الكتلة عالية الدقة، يعد هذا النهج مناسبا للتحليل الشامل لأنواع مختلفة من العينات البيولوجية (مثل المصل، السائل الزليلي، البول، أنسجة الغضروف، وغيرها)، وقد أظهر مزايا كبيرة في أبحاث التهاب المفاصل العظمي (OA). من ناحية، يمكنه فحص شامل للمستقلبات التفاضلية المرتبطة ارتباطا وثيقا بالتقدم المرضي للدهكية الصبغية الصبغية (مثل فئات مختلفة من المستقلبات المحددة في السائل الزليلي والأنسجة الزليلية) وربط مسارات رئيسية، بما في ذلك استقلابية الطاقة، إصلاح الغضاريف، تكوين العظم، وأيض الدهون، مما يعمق فهم مسببات الالتهاب الدهني. من ناحية أخرى، يساعد دمج بيانات متعددة الأوميكس مثل النسخ والبروتيوميات في كشف دور إعادة البرمجة الأيضية في تنكس الغضاريف، والاستجابات الالتهابية، وتلف بنية المفاصل، مما يوفر أدلة حاسمة لتحديد العلامات الحيوية التشخيصية المبكرة، وتقييم تقدم المرض، وتطوير استراتيجيات تدخل أيضية مستهدفة (مثل تنظيم حمض الصفراء، التريبتوفان، أو أيض الأحماض الدهنية)، مع تسليط الضوء على إمكاناته الانتقالية في بحث في الطباعة الدقيقة للعلاج البصري والعلاج الشخصي.
تعد سمكة الزرد نموذجا ممتازا ككائن نموذجي بفضل العديد من المزايا: حيث يكون جينومها محفوظا بشكل كبير مع جينوم البشر، ويشترك في التشابه مع حوالي 70٪ من جينات ترميز البروتين البشري28,29. يظهر خصائص رئيسية تشمل التطور السريع، والتلقيح الصناعي، والأجنة الشفافة التي تتيح التصوير الصناعي المريح، والخصوبة العالية، وتكاليف صيانة منخفضة 30,31,32,33. في أبحاث الهيكل العظمي، تسمح سمكة الزرد برؤية واضحة لتكون العظام، وعمليات التمعدن، وقدرة التجدد، ويمكن استخدامها لمحاكاة الحالات المرضية مثل هشاشة العظام وتلف الغضاريف. ومع ذلك، في دراسة التهاب المفاصل العظمي (OA)، وهو اضطراب معقد في المفصل بأكمله يتميز بتدهور الغضروف المفصلي، والالتهاب الزليلي، وتغيرات في العظام تحت الغضروف، يظل تطبيق نموذج سمك الزرد محدودا نسبيا.
تقدم هذه المقالة بروتوكولا يدمج الأيض غير المستهدف المعتمد على UHPLC-HRMS/MS، وعلم الأدوية الشبكي، والتنقيب النصي، والتحقق التجريبي في الجسم الحي ، لاستكشاف إمكانات مستخلص Xanthium sibiricum كمرشح نباتي صالح للتدخل في الحمض الفصيلي. الهدف ليس فقط تحديد المكونات النشطة الحيوية والأهداف المحتملة والمسارات التنظيمية الأساسية لمستخلص Xanthium sibiricum المرتبط ب OA من خلال تكامل متعدد الأوميكس والتحليل الحسابي، بل أيضا التحقق من تأثيره الوقائي على الغضروفية الغضروفية من خلال نماذج في الجسم الحي وتوضيح آلياته التنظيمية على نسخ الخلايا الغضروفية بشكل أكبر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم إجراء جميع التجارب التي شملت عينات سريرية وفئران وفقا للبروتوكول الذي أقره لجنة مراجعة الأخلاقيات في مركز أبحاث التكنولوجيا الحيوية الطبية بمقاطعة شاندونغ. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. عزل وزراعة الخلايا الغضروفية المفصلية البشرية
تم الحصول على عينات غضروف مفصلية بشرية من مرضى خضعوا لجراحة تنظير أو تجميل مفصل كامل في المستشفى الأول التابع لجامعة شاندونغ الطبية الأولى. تم نقل شرائح الغضاريف إلى المختبر على الثلج خلال 30 دقيقة من الاستئصال الجراحي. تم غسل النسيج جيدا باستخدام محلول دولبيكو البارد بالفوسفات (DPBS؛ 3–5 غسلات)، ثم تم تقطيعه ناعما إلى شظايا بحجم حوالي 1 مم3 باستخدام مقص جراحي معقم. تم إجراء الهضم الإنزيمي المتسلسل، بدءا من الهضم المسبق باستخدام 0.25٪ تريبسين-إيدتا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تمت مراقبة عملية الهضم حتى أصبحت شظايا الغضاريف رقيقة، وصغيرة في الحجم، وشفافة، ثم تم جمع شظايا الغضاريف عن طريق الطرد المركزي (200 × جم، 5 دقائق) في درجة حرارة الغرفة. تبع ذلك عملية الهضم الليلية (8 ساعات، 37 درجة مئوية) مع كولاجناز من النوع الثاني بنسبة 0.2٪ تحت تحريك خفيف مستمر. تمت مراقبة عملية الهضم حتى تم إذابة جميع شظايا الغضروف المرئية بشكل كبير. تم جمع الخلايا المفرجة عن طريق الطرد المركزي (200 × جم، 5 دقائق) في درجة حرارة الغرفة، وأعيد تعليقها في DMEM كامل مع إضافة 10٪ من مصل البقر الجنيني، و100 وحدة وحدة ذروية/مل من البنسلين، و100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين، وزرعت في قوارير زراعة بحجم 75 سم2 . تم الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تم فصل الخلايا الغضروفية الملتصقة باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA، وتم زراعة الخلايا بنسبة 1:3 عندما وصلت الخلايا الملتصقة إلى التقاء 80٪ من سطح قارورة الزرعة.
2. تحضير مستخلص فروكتوس زانثي
تم جمع الثمار الناضجة المجففة من Xanthium strumarium L. (Fructus Xanthii) من تجمعات طبيعية في شمال الصين وتم التحقق منها من قبل أخصائي صيدلة كبير. تم إيداع العينة في المعشبة بجامعة شاندونغ الطبية الأولى. تم وضع 20 جراما من فروكتوس زانثي المطحون ناعما في كشتمان استخلاص، وتم استخراج سوكسهليت بشكل شامل باستخدام 95٪ إيثانول (حوالي 250 مل) حتى اكتمال سبع إلى ثماني دورات شفاط. تم ترشيح مستخلص الإيثانول، وتم تركيز المرشح حتى يصبح جافا تحت ضغط منخفض عند 45 درجة مئوية باستخدام مبخر دوار. تم إعادة تعليق البقايا الناتجة في 60 مل من الماء المقطر مرتين وتقسيمها تدريجيا مع 60 مل من أسيتات الإيثيل في قمع فصل. تم هز الخليط بقوة وترك لفصل الطور عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. ثم تم جمع الطبقة المائية، وتخصيصها بالليوفيل، وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى استخدام إضافي.
3. سير عمل موحد لاستقلاب LC-MS/MS غير المستهدفة
4. تحليل علم الأدوية الشبكي
5. تحديد أقصى تركيز متحمل (MTC) في سمك الزرد
تم توزيع يرقات سمك الزرد المعدلة وراثيا (Tg col2a1a:EGFP) بعد يومين من الإخصاب (2 DPF) بشكل عشوائي في صفائح مكونة من 6 آبار بكثافة 30 يرقة لكل بئر. تم تزويد كل بئر ب 3 مل من وسط التعرض يحتوي على مستخلص Fructus Xanthii المخفف بشكل متسلسل. كانت اليرقات الميتة أو الميت تخرج يوميا. تم تعريض اليرقات باستمرار عند 28 درجة مئوية لمدة 72 ساعة، وبعد ذلك تم تحديد الحد الأقصى للتركيز القابل للتحمل (MTC) كأعلى تركيز لا يتجاوز فيه معدل وفيات اليرقات 10٪.
6. تأسيس نموذج إصابة عظام سمك الزرد
تم توزيع يرقات سمك الزرد في TG col2a1a: بعد يومين من الإخصاب (2 DPF) إلى أربع مجموعات: ضابطة، نموذج، مجموعة تحكم إيجابية لكبريتات الكوندرويتين (CS)، وعلاج مستخلص Fructus Xanthii . تعرضت جميع المجموعات باستثناء مجموعة الضابط لالتهاب المكورات العنقودية الذهبية (OD600 = 0.8، 1 × 108 CFU/mL) لمدة 24 ساعة لتحفيز إصابة العظام. تم تأكيد نجاح إنشاء النموذج من خلال التحقق من انخفاض بنسبة لا تقل عن 50٪ في شدة الفلورية الخضراء الخاصة بالغضروف في منطقة الجمجمة والوجه مقارنة بالمجموعة الضابطة تحت مجهر التألق فوق التألق.
7. التقييم الكمي للفلورة الخاصة بالغضاريف في يرقات سمك الزرد
تعرضت اليرقات باستمرار لتركيزات متدرجة من مستخلص Fructus Xanthii أو 1,000 ميكروغرام/مل كبريتات الصوديوم كوندرويتين A (التحكم الإيجابي) عند 28 °م لمدة 72 ساعة. لاحقا، تم اختيار 10 يرقات عشوائيا من كل نسخة مكونة من 6 آبار (n = 30 لكل مجموعة). تم تخدير اليرقات المختارة باستخدام 0.016٪ تريكين ووضعت جانبيا على وسادات أغاروز منخفضة الذوبان بنسبة 1٪. تم التقاط صور الفلورة بتكبير 2× (الإثارة 488 نانومتر، الانبعاث 525/50 نانومتر) باستخدام ميكروسكوب ستيريو مزود بكاميرا فلورية. تم قياس شدة EGFP الخاصة بالغضروف في منطقة الجمجمة والوجه، بما في ذلك السيراتوهيال وغضروف ميكل، باستخدام برنامج تحليل الصور. تم إجراء تصحيح خلفية على قيم الكثافة المتكاملة، وتم تطبيع القيم المصححة إلى مجموعة الضابطين للتحليل الإحصائي لفعالية الحماية الغضروفية (غضروفية الواقية).
8. تحفيز الفتحة الصبغية في فئران C57BL/6J
تم إسكان ذكور فئران C57BL/6J (عمرها 6–8 أسابيع، وزنها 20–22 جرام) تحت ظروف خالية من الممرضات (SPF) محددة عند 22 °م ± 2 °م مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة. سمح للفئران بالتأقلم معها لمدة أسبوع واحد ثم تم توزيعها عشوائيا إلى ثلاث مجموعات (n = 8 لكل مجموعة) باستخدام جدول أرقام عشوائي: (1) ضابط عملية وهمية، (2) التهاب العضلات الدهنية الناجم عن ACLT (ACLT)، و(3) تدخل ACLT بالإضافة إلى مستخلص Fructus Xanthii (ACLT + Fructus Xanthii ). تم إجراء جميع الإجراءات الجراحية في ظروف معقمة وفقا لبروتوكول تم التحقق منه سابقا.
تم تخدير الفئران باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق (50 ملغ/كغ) (وفقا لبروتوكولات معتمدة مؤسسيا)، وأجري شق في الظرفية الوسطى لكشف كبسولة مفصل الركبة اليمنى. تم قطع الرباط الصليبي الأمامي تحت مجهر تشغيل لتحفيز عدم استقرار المفصل، ثم تم إغلاق كبسولة المفصل والجلد في طبقات باستخدام غرز ممتصة 6-0. خضعت الفئران التي أجريت عمليات صناعية لعمليات مماثلة لاستئصال المفصل دون قطع الأربطة. تم تقييم استقرار المفصل، وتم تأكيد نجاح التشكيل النموذجي من خلال إجراء اختبار الدرج أو من خلال تقييم درجة إصابة المفاصل في المقاطع النسيجة من فئران مجموعة النماذج.
تم إعطاء مسكنات الألم بعد العملية باستخدام البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ، حقن تحت الجلد) لمدة ثلاثة أيام متتالية. كانت الأدوية العلاجية تعطى مرة واحدة يوميا عن طريق القاعة. تلقت مجموعة مستخلص ACLT + Fructus Xanthii 100 ميكرولتر من مستخلص Fructus Xanthii بقوة 1,000 ميكروغرام/مل مخفف في محلول ملحي عادي، بينما تلقت المجموعتان الأخريان 100 ميكرولتر من محلول ملحي طبيعي كعنصر تحكم للمركبة. بعد 8 أسابيع من الجراحة، تم القتل الرحيم للفئران بالاختناق بثاني أكسيد الكربون 2 تلاه خلع عنقي الرحم، وتم استخلاص مفاصل الركبة للتحليل النسيجي.
9. التلوين النسيجي المرضي
10. تسلسل الحمض النووي الريبي (تسلسل RNA)
تم زرع الخلايا الغضروفية المفصلية البشرية الأولية (الممرات 2–3) في صفائح ذات 6 آبار بكثافة 5 × 10إلى 5 خلايا لكل بئر. تم حرمان الخلايا من المصل لمدة 24 ساعة ثم تم توزيعها إلى مجموعتين (n = 3 لكل مجموعة): (1) مجموعة الضابطة: عولجت الخلايا باستخدام المركبات فقط (0.1٪ DMSO); (2) مجموعة مستخلص Fructus Xanthii : تمت معالجة الخلايا بمستخلص 1000 ميكروغرام/مل Fructus Xanthii مذاب في DMSO.
تمت معالجة الخلايا لمدة 24 ساعة، وبعدها تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف ترايزول وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN ≥7.0) وتركيزه باستخدام محلل RNA. تم إعداد مكتبات cDNA الخاصة بالخيوط باستخدام مجموعة تحضير مكتبة تسلسل RNA وتم تسلسلها على منصة تسلسل الجيل التالي عالية الإنتاجية (NGS) في وضع النهاية المزدوجة 150 bp (PE150). تم إجراء مراقبة جودة ملفات FASTQ الخام باستخدام FastQC، تلاه تعديل المحول وجودة باستخدام Trimmomatic قبل التحليل النهائي.
11. معالجة بيانات تسلسل RNA
الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي تم تنظيمها بشكل أقل بواسطة مستخلص Fructus Xanthii (مقابل مجموعة الضابطة؛ p < 0.05 و logFC < −0.5) تم استخلاصها من مجموعة بيانات RNA-seq وتم تقاطعها مع أفضل 10 أهداف مركزية. تم تصور الأهداف الأساسية الناتجة المرتبطة بمستخلص Fructus Xanthii والتهاب المفاصل العظمي باستخدام حزمة ggvenn.
12. إليسا
تم زرع الخلايا الغضروفية المفصلية البشرية الأولية في الممرات 2–3 في صفائح ذات 6 آبار بكثافة 5 × 10إلى 5 خلايا لكل بئر. تم حضن الخلايا في وسط خال من المصل لمدة 24 ساعة لتحفيز السكون. تم تقسيم الخلايا لاحقا إلى ثلاث مجموعات (n = 3 لكل مجموعة):
(1) التحكم الفارغ: تم علاج الخلايا باستخدام المركبات (0.1٪ DMSO) فقط؛ (2) السيطرة الإيجابية: تم تحفيز التهاب الخلايا ب IL-1β، تلاها العلاج بالوكيلة (0.1٪ DMSO)؛ (3) مجموعة مستخلص Fructus Xanthii : تم تحفيز التهاب خلوي باستخدام IL-1β، تلاه العلاج بمستخلص Fructus Xanthii بسعة 1000 ميكروغرام/مل مذاب في DMSO بنسبة 0.1٪. تم جمع فائقات زراعة الخلايا بعد 24 ساعة من الحضانة وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم تحديد مستويات MMP1 وPGR في المواد الفائقة في الزراعة باستخدام مجموعات اختبار المقاومة المناعية المرتبطة بالإنزيمات (ELISA) المتوفرة تجاريا مخصصة لMMP1 وPGR البشري على التوالي. تم إجراء الفحوصات وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
13. التحليل الإحصائي
أجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برامج التحليل الإحصائي والرسوم البيانية، وتم تقديم البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم تقييم طبيعية البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك، وتم تقييم التماثل الجنسي باستخدام اختبار ليفين. تم إجراء مقارنات بين المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه أو الاتجاهين (ANOVA)، تلاها اختبارات توكي أو شيداك بعد الاختبار، حسب الحاجة. تم إجراء مقارنات زوجية باستخدام اختبار t للطالب ذو الذيلين. تم تحليل البيانات غير المعلمية باستخدام اختبار مان–ويتني يو. تم اعتبار قيمة P ثنائية الجانب < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تقييم الجودة والمشهد الأيضي لبيانات LC-MS/MS غير المستهدفة
أظهرت عينات مراقبة الجودة قابلية ممتازة للتكرار، كما يتضح من تداخل الكروماتوغرافيات TIC بشكل كبير في وضعي الأيونات الموجبة والسالبة، مع بقاء انحراف زمن الاحتفاظ أقل من 0.05 دقيقة عبر الدفعة التحليلية بأكملها. خضعت البيانات الخام لمعالجة مسبقة تعتمد على XCMS، والتي شملت اكتشاف الذروة، والتكامل، ومحاذاة زمن الاحتفاظ. تم توضيح المستقلبات المفترضة من خلال مطابقة الكتلة الدقيقة (≤5 جزء في المليون)، وأنماط النظائر، وأطياف ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
التهاب المفاصل الدهري هو اضطراب تنكسي شائع في المفاصل وأحد الأسباب الرئيسية للإعاقة في جميع أنحاء العالم36. منشأ المرض معقد ومتعدد العوامل، ويشمل تغييرات كيميائية حيوية وخلاوية وجزيئية عبر أنسجة المفاصل. كان يعتبر سابقا ظاهرة "تآكل وتمزق" بسيطة للغضروف المفصلي، لكنه أصبح الآن معروفا على نطاق واسع كمرض مزمن في كامل المفصل يتميز بتدهور الغضروف، والالتهاب الزليلي، وتكوين العظام، وإعادة تشكيل العظم تحت الغضروف
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يصرح المؤلفون بعدم وجود مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية قد تكون أثرت على العمل المبلغ عنه في هذه الورقة.
وقد تم دعم هذا البحث ماليا من منحة مشروع السطح التابع لصندوق الطبيعة لمقاطعة شاندونغ (رقم ZR2024MH088)، مشروع تكنولوجيا الطب الصيني التقليدي في مقاطعة شاندونغ (رقم 2020M070)، وصندوق الزراعة لأول مستشفى تابع لجامعة شاندونغ الطبية الأولى ومستشفى شاندونغ الإقليمي تشيانفوشان (رقم المنحة: QYPY2022NSFC0601)".
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | Biosharp, China | BL539A | pH 7.4، معقم |
| C57BL/6 Mice | Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, China | N/A | ذكر، 8-10 أسابيع، 20-25 جرام |
| Chondroitin sulfate | MCE, America | HY-B2162 | نقاء ≥98% |
| ClusterProfiler (R Package) | Bioconductor | وصول مجاني | مدمجة في R v4.2.2 |
| Collagenase, Type II, powder | Gibco, America | 17101015 | ≥125 U/mg |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | وصول مجاني (https://cytoscape.org/) | v3.9.1 (مع CytoHubba) |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | وصول مجاني | الإصدار 3.9.1 |
| DESeq2 (R Package) | Bioconductor | وصول مجاني | مدمجة في R v4.2.2 |
| DMEM، high glucose | Gibco, America | 11965092 | وسط معقم |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China | 10009218 | درجة تحليلية، 95% |
| Ethyl acetate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China | 10009418 | درجة تحليلية |
| Fetal bovine serum (FBS) | Cellmax, China | SA102.02 | معقم |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti2-U | مجهز بمرشح GFP (تحريك 488nm) &؛ كاميرا رقمية |
| GEO Database | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r | أداة تحليل GEO2R |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC, America | تجاري | الإصدار 9.5.1 |
| Hematoxylin-Eosin(HE) Stain Kit | Solarbio, China | G1120 | مجموعة جاهزة للاستخدام |
| HERB Database | الأكاديمية الصينية للعلوم | http://herb.ac.cn/ | V2.0 |
| Human MMP-1 ELISA Kit | Yamei Biotechnology, China | HJ088 | للبشر، لوحة 96-well |
| Human Progesterone Receptor (PR) ELISA Kit | Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., China | ml05997 | للبشر، لوحة 96-well |
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة (NIH) | وصول مجاني | الإصدار 1.53t |
| Light Microscope | Olympus, Japan | BX53 | عدسات 10×/20×؛ وكاميرا رقمية |
| Lyophilizer | Christ, Germany | Alpha 1-4 LDplus | نظام تجفيف بالتجميد |
| Modified Saffron-O And Fast Green Stain Kit | Solarbio, China | G1371 | للطلاء العظمي/الغضروف |
| Neutral Balsam | Solarbio, China | G8590 | وسط تثبيت |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, America | 15070063 | 100×؛، معقم |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sparkjade, China | CR0013-500ML | pH 7.2-7.4، معقم |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | وصول مجاني (https://www.r-project.org/) | v4.4.1 (مع ggvenn) |
| Serum-free Cell Freezing Medium | Biosharp, China | BL203B | معقم |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 25923 | سلالة قياسية |
| STRING Database | STRING Consortium | https://string-db.org/ | تحليل تفاعل البروتين |
| TCMID Database | Shaanxi Qinling Qiyao Collaborative Innovation Center | https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php | V3.0 |
| Tg(col2a1a:EGFP) Zebrafish | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | N/A | اليرقات (2 dpf)، سلالة AB |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher, America | 15596018CN | للمستخلص الكلي لـ RNA |
| Trypsin-EDTA (0.25%)، phenol red | Gibco, America | 25200056 | محلول معقم |
| Ultra-high Performance Liquid Chromatography (UHPLC) | Thermo Fisher, America | Q Exactive Focus | مقترن مع HRMS/MS |
| XCMS-online | معهد أبحاث Scripps | وصول مجاني | منصة على الويب |
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن