يتيح Bex-Plex التصور المتزامن لعلامات البروتين ونبرات الأحماض الريبونيكية لتحديد مكاني عميق للأنسجة السليمة

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لدمج التلوين البروتيني التكراري (IBEX) مع تقنية التهجين الميداني RNAscope لاستخدام النمط الظاهري العميق للأنسجة المجمدة الثابتة السليمة لتطبيقات التحليل المكاني عالي الدقة.

Abstract

هنا، نقدم بروتوكولا لتمكين التحليل المكاني المتزامن لعلامات البروتين وحمض الريبونوكلييك (RNA) بدقة خلية واحدة في الأنسجة السليمة. واحدة من القضايا الأساسية المتعلقة بسرطانات الأورام الصلبة هي عدم القدرة على التنبؤ باستجابة المرضى للتدخل العلاجي. يتطلب فك رموز هذه التعقيدات قياسا كميا للسلوكيات الخلوية والتفاعلات والأنماط الظاهرية داخل الأنسجة السليمة. على وجه التحديد، يوفر البروتيوم والترانسكريبتوم معلومات متداخلة لكنها غير مكررة يمكن أن تكون حاسمة لتصميم علاجات مناعية عقلانية. ومع ذلك، لا توجد حاليا طريقة مباشرة وفعالة من حيث التكلفة لتحليل ملف عميق لكل من الحالة النسخية والوظيفية لجميع الخلايا في البيئة الدقيقة للورم مع الاحتفاظ بمعلومات تحديد الموقع المكاني الحيوي. لهذا الغرض، نجحنا في دمج منصة IBEX (التبييض التكراري يوسع التعددية) مع HiPlex RNAscope لرؤية مؤشرات البروتين عالية البلكس ونصوص حمض الريبونوكليك عالي البلكس (RNA) ذات الدقة الخلوية الواحدة. يتضمن هذا النهج خطوة معدلة لاسترجاع أهداف RNA للحفاظ على الشكل النووي وتمكين محاذاة الصور بدقة عبر الدورات. يتيح لنا "Bex-Plex" إجراء بروتوكول IBEX غير معدل على الأنسجة المجمدة الثابتة يليه بروتوكول HiPlex RNAscope، حيث نستخدم استرجاع RNA معدل لضمان محاذاة المستوى النووي مع دورات IBEX. تم تحسين هذا البروتوكول للأنسجة المجمدة الثابتة ويتيح التحليل المكاني المتكامل للحالات الخلوية النسخية والوظيفية. لا توفر القدرة على التحليل على مستوى الخلية الواحدة بهذا الشكل فقط بئر عميق من المعلومات عن النسيج نفسه، بل يمكن أيضا تمكين التنبؤات حول التفاعلات الخلوية الدقيقة التي تدفع الاستجابة العلاجية، مما يوفر إطارا لدراسة علم الأحياء المكاني في بيئات الأورام الدقيقة والأنظمة ذات الصلة.

Introduction

منذ إدخالها في عام 2011، ظهرت العلاجات المناعية للسرطان التي تقلل من كبت الخلايا التائية السامة من خلال حجب جزيئات نقاط التفتيش المناعية المثبطة مثل PDL-1 وCTLA-4 كمعيار ذهبي لعلاج الأورام الصلبة¹. ومع ذلك، وعلى الرغم من الاستخدام الواسع النطاق لدى المرضى، تختلف الفعالية السريرية لهذه الأدوية بشكل كبير لأن العديد من سرطانات الأورام الصلبة إما تظهر بشكل جوهري مع هذه العلاجات أو تولد مقاومة لها^{في نهاية} المطاف 2. في كثير من الحالات، يعود ذلك إلى الطبيعة الشديدة جدا للورم الصلب، حتى بين نفس نوع السرطان^{من النوع الثالث}. الفهم الأعمق للعلاقات الخلوية التي تحدث في الأورام الصلبة هو المفتاح لتحسين أساليب العلاج. لذا، فإن تحديد الآليات والتفاعلات الدقيقة التي تتشكل وتدعم هذه المقاومة هو في طليعة أبحاث السرطان. هنا، نهدف إلى تطوير طريقة تمكن من التحليل المكاني المتكامل لتعبير البروتين والحمض النووي الريبي داخل الأنسجة السليمة لتوصيف هذه التفاعلات الخلوية المعقدة بشكل أفضل.

تتكون البيئة الدقيقة للورم (TME) من المكونات الخلوية والبنيوية غير السرطانية التي تشكل نمو الورم والاستجابة المناعية، بما في ذلك الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان، والخلايا المناعية المتسللة، والمكونات الوعائية، والمصفوفة خارج الخلية⁴. مؤخرا، أصبح واضحا أن تركيب وتنظيم ال TME يؤثر بشكل كبير على ما إذا كانت الأورام تسمح أو مقاومة لتسلل المناعة، وهو أحد العوامل الرئيسية التي تحدد الاستجابة للعلاج المناعي⁵. في العديد من أنواع السرطان، يرتبط نمط "صحراء المناعة"، الذي يتميز بانخفاض أعداد الخلايا التائية ووجود تجمعات نخاعية شديدة المثبط للمناعة، مع ضعف الاستجابة لعلاجات الحصار عند نقاط التفتيش^6،7. تحكم إشارات الكيموكين العديد من هذه الديناميكيات في التجنيد. على سبيل المثال، يجذب CXCL1 وCCL2 خلايا النخاع المثبطة للمناعة، بينما يجذب محور CXCR3-CXCL9/CXCl10 خلايا تائية سامة وتنظيمية إلى الورم⁸. وبالتالي، يمكن لبيئة الإشارات الخاصة بالمجال أن تؤثر بشكل فعال على النمط الظاهري والوظائف للخلية. على سبيل المثال، في مرضى سرطان القولون والمستقيم، يتحكم محور CCL5-CCR5 في الوظيفة القمعية للبلاعم المرتبطة بالورم (TAMs)، وحجب هذه الإشارة يميل TAM نحو نمط مضاد للأورام ويرتبط بتحسين الاستجابات السريرية⁹. علاوة على ذلك، يمكن أن تؤدي التفاعلات المباشرة بين الخلايا المناعية، والأرومات الليفية المرتبطة بالسرطان، و/أو الخلايا الورمية عبر ICAM وPDL-1 إلى إرهاق المناعة وتقليل المناعة المضادة للأورم¹⁰. تؤكد هذه النتائج معا على أهمية التحليلات المحلية لفهم كيف يؤثر TME على الفعالية العلاجية.

يظل التصوير المناعي الفلوري (IF) نهجا أساسيا لتصور تعبير البروتين وتفاعلات الخلايا بين الخلايا في الأنسجة. تطور المجال من تقنيات IF التقليدية بثلاثة أو أربعة ألوان إلى سير عمل التصوير عالي المحتوى التي تعتمد على التلوين والتصوير التكراري. في هذه الطرق، يتم توليد مجموعات بيانات كبيرة من خلال دورات متكررة من وضع علامات الأجسام المضادة، والتصوير، وتعطيل أو إزالة الفلوروفور بحيث يمكن صبغ وتصوير علامات إضافية¹¹. تم تقديم التبييض التكراري الممتد (IBEX) مؤخرا كمنصة تصوير تكراري سهلة الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة¹². متوافقا مع استخدام الأجسام المضادة التجارية والمجاهر التقليدية، يستخدم IBEX بوروهيدريد الليثيوم (LiBH₄) لتهدئة فلورة الأصباغ المستخدمة أكثر دون إتلاف حوابيت الأنسجة، مما يسمح بالحصول على ما يصل إلى 75 معاملة لنسيج واحد¹³. يتم محاذاة الصور المستخرجة من هذا التلوين الدوري باستخدام برنامج SimpleITK مفتوح المصدر لإنتاج مجموعات بيانات مركبة مناسبة للتحليلات المكانية عالية الأبعاد.

مكمل للنمذجة الظاهرية على مستوى البروتين، يمكن أن توفر طرق النسخ المكاني معلومات قيمة حول الحالة النمطية للخلايا داخل بيئتها الأصلية. ومن الجدير بالذكر أن التهجين الموضعي (ISH) هو تقنية شائعة لتحديد مواقع تسلسلات الحمض النووي النووي أو الحمض النووي الريبي في نسيج معين¹¹. RNAscope هو نهج ISH راسخ يستخدم مجسات ذات كيمياء Z فريدة لتضخيم نسخ RNA بدقة جزيء واحد بشكل خاص، وهو متوافق مع العديد من أنواع العينات المختلفة¹⁴. باعتبارها منصة معتمدة على نطاق واسع ومتاحة تجاريا من خلال تشخيصات الخلايا المتقدمة (ACD)، تقدم RNAscope مجسات مثبتة ضد مجموعة واسعة من الأهداف، مما يبسط تصميم التجارب لتطبيقات متنوعة.

يمكن الحصول على رؤية أكثر اكتمالا لهوية الخلية ووظائفها من خلال دمج كشف البروتين والحمض النووي الريبي داخل نفس النسيج. البروتينات المفرزة قصيرة العمر، مثل السيتوكينات والكيميائيات، تفتقر تقليديا إلى تلوين الأجسام المضادة الموثوق بواسطة IHC، لكن يمكن الحصول على معلومات عن تعبيرها من خلال قياس نسخ mRNA الخاصة بها. المحاولات السابقة للكشف المشترك عن الحمض النووي الريبي والبروتين، مثل IHC الكروموجيني التقليدي أو TSA-OPAL، كانت محدودة بسبب تضخيم الإشارة غير الخطي وبروتوكولات استرجاع المستضدات التي تستغرق وقتا للوقت¹⁵. مقارنة بهذه الأساليب، تتيح طريقة Bex-Plex الكشف المتزامن عن البروتينات عالية البلكس والحمض النووي الريبي مع الحفاظ على السياق المكاني والشكل النووي لتسجيل الصور بدقة.

هنا نقدم بروتوكول "Bex-Plex"، وهو بروتوكول يدمج منصتي IBEX وRNAscope لتوصيف متزامن وقابل للقياس للحالات النسخ والترجمة للخلايا داخل أنسجتها الأصلية. في Bex-Plex، تخضع الأنسجة المدمجة ب OCT الثابتة لبروتوكول IBEX القياسي يليه سير عمل HIPLEX معدل قليلا في RNAscope، حيث يتم استرجاع الهدف عند 60°C مع وقت حضانة ساعة واحدة مقارنة بفترة الحضانة الأصلية التي تبلغ 99°C لمدة 5 دقائق. هذا يحافظ على بنية النوى، مما يسمح بمحاذاة دقيقة للعلامات الخفية عند تسجيل الصور المنفصلة من دورات IF و ISH في دورة واحدة. هذا البروتوكول مناسب بشكل أفضل للدراسات التي تتطلب تحليلا مكانيا متزامنا لتعبير البروتين والحمض النووي الريبي في الأنسجة السليمة، خاصة عندما يكون توفر الأنسجة محدودا أو عندما يكون الحفاظ على البنية المكانية أمرا حاسما، مثل تحليل بيئة الأورام الدقيقة أو دراسات التحليل المناعي.

باستخدام كواشف متوفرة على نطاق واسع ومتوافقة مع معظم منصات التصوير، يمكن لأي باحث مدرب تقنيا وعلى دراية بالتصوير الفلوري والوصول إلى المجهر التقليدي بعمل بيكس-بليكس. البروتوكول المعروض هنا محسن للعينات المجمدة الثابتة. حاليا، تم التحقق من صحة البروتوكول في الأنسجة المجمدة الثابتة، وقد تكون هناك حاجة لمزيد من التحسين لتطبيقه على أنواع أخرى من العينات مثل FFPE أو العينات السريرية البشرية.

سيكون هذا السير عمليا ذا قيمة كبيرة لأي سياق يكون فيها الأنسجة محدودا أو ثمينا، مثل خزعات الأنسجة أو تجارب الحيوانات ذات حجم عينة محدود، وكذلك في التنمذة الظاهرية للخلايا التي قد يصعب استخراجها باستخدام تقنيات التفكك. يوفر Bex-Plex معلومات متزامنة وقابلة للقياس حول الملفات التعريفية النسخ والانتقالية للخلايا الفردية مع الحفاظ على سياقها المكاني، وهي بيانات تثبت بشكل فريد قادرة على الإجابة على أسئلة حول العلاقات والتداخل بين الخلايا في بيئتها الأصلية.

Protocol

تم اعتماد الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو (رقم البروتوكول S24049). تم استخدام الفئران الذكور والإناث في عمر 7-12 أسبوعا على خلفية جينية C57BL/6 وتحت ظروف خالية من مسببات الأمراض في هذه التجارب.

1. تحضير الأنسجة

1. قم بقتل الفئران التجريبية باستخدام تدابير أولية وثانوية معتمدة (مثل القتل الرحيم_بثاني أكسيد الكربون 2 وخلع عنق الرحم) وجمع الأنسجة ذات الاهتمام إلى وسائط مكملة.
2. جهز مخزونا جديدا من مثبت الأنسجة عن طريق تخفيف محلول مخزوني 4٪ من بارافورمالديهايد (PFA) إلى إما 0.5٪ أو 1٪ PFA في 1X PBS. استخدم 0.5٪ PFA للأنسجة ذات الحجم المنخفض مثل العقد اللمفاوية و1٪ PFA للأنسجة ذات الحجم العالي مثل الأورام..
   تحذير: البارافورمالديهايد قابل للاشتعال وسام إذا تم تناوله أو ابتلعه. تعامل مع معدات الحماية الشخصية المناسبة وتجنب ملامسة الجلد أو العينين.
3. انقل الأنسجة إلى صفيحة بسعة 24 بئر تحتوي على 2 مل من المثبت لكل بئر وحضن الحوض طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: أوقات الحضانة التي تزيد عن 16 ساعة قد تؤدي إلى مشاكل في التثبيت الزائد.
4. املأ آبار صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا ب 1X PBS وانقل الأنسجة من الصفيحة المثبتة.
   نقطة التوقف: إذا لزم الأمر، يمكن تخزين الأنسجة في 1X PBS عند 4°C لمدة تصل إلى 7 أيام.
5. قم بقص الدهون الزائدة أو الحطام من الأنسجة واحدا تلو الآخر باستخدام منظار التشريح والأدوات. أضف كمية صغيرة من 1X PBS مباشرة إلى النسيج لمنع جفاف الأنسجة أثناء التقليم.
6. حضر محلول سكروز بنسبة 30٪ بدون طاقة عن طريق تخفيف مسحوق السكروز في 1X PBS.
7. انقل الأنسجة إلى صفيحة بسعة 24 بئر تحتوي على 2 مل من السكروز 30٪ لكل بئر وحضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية لتجفيفها. الأنسجة تجفف بشكل كاف عندما تغوص في قاع الآبار.
8. املأ قوالب التجميد الموسومة بجهاز OCT وضع الأنسجة واحدة تلو الأخرى في القوالب. اتجاه الأنسجة يعتمد على الأصل، لكن توصيتنا القياسية هي أن تكون أكبر مساحة سطحية موازية لقاع الكريمولد. تأكد من أن الأنسجة مغمورة بالكامل في التصوير المقطعي السينمائي.
9. ضعها على الثلج الجاف لمدة 10 دقائق لتجميد وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

2. تقسيم الأنسجة

ملاحظة: يجب أن تكون جميع المواد المختبرية والمواد المستخدمة لهذا البروتوكول خالية من RNase. انتبه لمنع التلوث عند التعامل مع الزلاقات.

1. غطى شرائح المجهر الخالية من RNase بسعة 15 ميكرولتر من لاصق الكروم وتحتضن لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 60 درجة مئوية في الفرن. يمكن تخزين شرائح الطلاء بالكروم ألوم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة تصل إلى شهر قبل الاستخدام.
2. أخرج الأنسجة المدمجة في OCT من الفريزر بدرجة -80 درجة مئوية وضعها في مبريد/تجميد -20 درجة مئوية لتستقر لمدة لا تقل عن 20 دقيقة.
3. تقطع الأنسجة على شرائح مغطاة بالكروم ألوم بسماكة 10–15 ميكرومتر.
4. تخزين الشرائح ذات الأقسام المقطوعة عند 4°C أو، إذا تم صبغها في نفس اليوم، دع الشرائح تتوازن مع RT. يمكن تخزين الشرائح المقسمة عند 4°C لمدة تصل إلى 5 أيام قبل الاستخدام.

3. صبغة البروتين

1. في حوض الغمس، انقع السلايد ليتم تلوينه في PBS 1X PBS الخالي من RNase لمدة 5 دقائق لإزالة الأشعة المقطعية الزائدة من الأنسجة.
2. استخدم قلم حاجز كاره للماء لرسم صناديق حول المناديل على الشريحة واتركها تجف لمدة دقيقتين.
3. جهز محلول حجب من كتلة مستقبلات FC المضادة للفأر بحجم 10 ميكروغرام· مل⁻¹ في PBS 1X خالية من RNase. أضف حاجز العزل إلى العينات على الشريحة، باستخدام كمية كافية لتكوين فقاعة تغطي الأنسجة بالكامل (100–150 ميكرولتر^·مقطع-1).
   ملاحظة: أحيانا يكون من الضروري إضافة FBS أو BSA (عادة 1–2٪) إلى الحاجز الحاجب للأنسجة و/أو العلامات الصعبة.
4. حضن الشرائح عند RT في صندوق تلوين رطب لمدة ساعة، ثم اغسلها تماما في حوض غمر مليء ب PBS 1X PBS الخالي من RNase لمدة 5 دقائق.
5. جهز محلول تلوين الأجسام المضادة الأساسي في PBS 1X خالي من RNase، مع التخطيط ل 100-200 ميكرولتر لكل قسم نسيج. تتراوح تخفيفات الأجسام المضادة القياسية بين 1:50-1:200، لكن ينصح بإجراء معيارات بصبغة واحدة لتحديد أفضل عامل تخفيف لجسم مضاد معين و/أو نوع نسيج معين. تقوم الدوامة والنبضة بتدوير الأجسام المضادة قبل استخدام الماصات لمنع التجمعات الفلورية.
6. أزل الشرائح من الغسيل وامتص السائل الزائد بلطف من زاوية علب العينات باستخدام منديل ماص لتجنب تخفيف محلول الأجسام المضادة.
7. طبق محلول الأجسام المضادة بنفس طريقة محلول المانع، لتكوين فقاعة فوق النسيج.
8. ضع السلايدات أفقيا في فرن بزاوية 37°C وحضن لمدة ساعة واحدة. بدلا من ذلك، ينزلق Incubate عند RT لمدة 3–4 ساعات في صندوق رطب. يمكن استخدام بروتوكولات IF القياسية المحسنة مسبقا للنسيج المطلوب. حافظ على الزحاليق في بيئة رطبة أثناء الحضانة لمنع الجفاف. (مثلا استخدم منشفة ورقية مبللة في أسفل صينية التلوين).
9. اغسل الشرائح بالغمر في PBS 1X PBS بدون RNase لمدة دقيقتين. كرر ذلك مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسولات. إذا لزم الأمر للوحة التلوين، حضر محلول تلوين أجسام مضادة ثانوي في PBS 1X الخالي من RNase خلال هذه الفترة. تتراوح تخفيفات الأجسام المضادة القياسية بين 1:500-1:1000، لكن ينصح بإجراء معيارات بصبغة واحدة لتحديد أفضل عامل تخفيف للأجسام المضادة و/أو نوع الأنسجة المعينة.
10. قم بإزالة أي فائض من PBS من الشرائح باستخدام مسح ماص وأضف 100–200 ميكرولتر من محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي إلى كل جزء من الأنسجة. ضع السلايدات أفقيا في فرن بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضن لمدة 30 دقيقة. بدلا من ذلك، يمكن صبغ الشرائح عند RT لمدة ساعة إلى ساعتين في صندوق رطب.
11. اغسل الشرائح بغمرها في 1X PBS بدون RNase لمدة دقيقتين. كرر ذلك مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسولات.
12. قم بتخفيف صبغة DAPI النووية إلى تركيز نهائي 0.2 ميكروغرام· مل⁻¹ في 1X PBS خالية من RNase وإضافة 100–200 ميكرولتر لكل قسم نسيج.
13. احتضن السلايدات لمدة 10 دقائق في RT في صندوق رطب، ثم اغسله مرة واحدة بالغمر في PBS 1X الخالي من RNase والغمس للأعلى والأسفل لفترة وجيزة.
14. امتص السائل الزائد عن الشرائح باستخدام مسح ماص وأضف 20–30 ميكرولتر من وسط تركيب مضاد التزحيب ذو القاعدة المائية إلى كل قسم. ضع غطاء غطاء على الشريحة بعناية، مع التأكد من تقليل الفقاعات، ودع وسط التثبيت يتجف لمدة 15–30 دقيقة.
15. تخيل الشرائح الملطخة. لشرح أكثر تفصيلا لاعتبارات تصميم اللوحات واكتساب الصور ل IBEX، راجع بروتوكولات IBEX المنشورة الأصلية^12,13.
    نقطة التوقف: تخزين الزلاجات المثبتة في الظلام عند درجة حرارة 4°C لمدة تصل إلى 3 أيام، مع التوصية بالمضي قدما فورا لضمان تقليل تدهور RNA.

4. تبييض الفلوروفور وتلوين البروتين التكراري

1. اغمر الشرائح في PBS 1X بدون RNase حتى ينزلق انزلاق الغطاء بسهولة دون أي قوة. اعتمادا على مدة تثبيت الغطاء قد يستغرق ذلك حتى 16 ساعة.
2. أثناء نقع الشرائح، حضر محلول LiBH₄ بحجم 1 ملغ·مل^⁻ لتر في محلول DI H₂O خال من RNase عن طريق الخلط بلطف حتى يذوب بالكامل وانتظر 10 دقائق حتى يبدأ التفعيل. يحدث التنشيط عندما تكون الفقاعات موجودة في المحلول وتستمر الحركة حتى 4 ساعات.
   تحذير: LiBH₄ تفاعلي مع الماء، تجنب التعرض المفرط للمسحوق للرطوبة وتخلص من النفايات بشكل صحيح.
3. اغسل الشرائح مرة واحدة لمدة دقيقتين في محلول PBS 1X الخالي من RNase لإزالة أي بقايا وسط تركيب، ثم قم بعمل ماصة بحجم 100–150 ميكرولتر من محلول LiBH₄ على كل نسيج. احتضن في صندوق رطب لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: اعتمادا على الفلوروفورات المستخدمة في التلوين، قد يحتاج وقت الحضانة إلى إطالة (وقد نوقش مطولا في أوراق طرق IBEX)^12,13.
4. اغسل الشرائح مرة واحدة بالغمر في PBS 1X الخالي من RNase وغمس الأعلى والأسفل لفترة وجيزة.
5. تابع تلوين الشرائح بعلامات بروتين إضافية باتباع الخطوات 3.5-3.15. ليس من الضروري إعادة صبغ الصبغة النووية لأنها لا تبيض ب LiBH₄. كرر صبغة البروتين إذا لزم الأمر.
   نقطة التوقف: يمكن تخزين الشرائح المثبتة عند 4°C طوال الليل قبل تبييض آخر دورة بروتين/IBEX والانتقال إلى RNA.
6. انتقل فورا إلى RNAscope HiPlex بعد تبييض الفلوريدات من الدورة النهائية. على الرغم من أنه تم إجراء ما يصل إلى ست دورات من IBEX القياسي دون فقدان الأنسجة أو الحوامت، إلا أننا لا نوصي بتجاوز ثلاث دورات من تلوين البروتين لهذا البروتوكول بسبب احتمال انخفاض جودة نسخ الحمض النووي الريبي على مدى فترات أطول.

5. تحضير شرائح RNAscope HiPlex

1. اغمر الشرائح بالكامل في PBS 1X الخالي من RNase حتى ينزلق غطاء الغطاء بسهولة دون أي قوة. اعتمادا على مدة تثبيت الغطاء قد يستغرق ذلك حتى 16 ساعة. اغسل مرة واحدة لمدة دقيقتين في PBS 1X بدون RNase لإزالة أي بقايا متوسطة متراكبة.
2. حضر 200 مل من 50٪ إيثانول، و200 مل من 70٪ إيثانول، و400 مل من 100٪ إيثانول.
3. شغل فرن التهجين واضبطه على 60°C. قم بتخفيف مادة استرجاع الأهداف 10X إلى مخزون يعمل 1X في DI_H2O الخالي من RNase وقم بتسخينها مسبقا بوضعه في الفرن حتى الخطوة 5.8.
   ملاحظة: الفشل في تسخين كاشف استرجاع الهدف إلى 60°C سيؤثر على تسجيل الصور في المراحل المنفصلة بعد المجرى الآن. يجب أن يبقى كاشف الاسترجاع عند 60°م طوال مدة خطوة الاسترجاع.
4. اغمر الشرائح في 50٪ إيثانول. حضانة لمدة 5 دقائق في RT.
5. أزيل الشرائح من 50٪ إيثانول واغمره في 70٪ إيثانول. حضانة لمدة 5 دقائق في RT.
6. أزل الشرائح من الإيثانول بنسبة 70٪ واغمره في 100٪ إيثانول. حضن لمدة 5 دقائق عند RT وكرر العملية مع إيثانول طازج 100٪.
7. أزل الشرائح من الإيثانول بنسبة 100٪ واتركه يجف على RT لمدة 5 دقائق.
8. أضف 100–150 ميكرولتر من كاشف استرجاع الأهداف 1X بزاوية 60°C إلى كل قسم من النسيج وضع الشرائح في فرن التهجين. حضن عند 60°C لمدة ساعة واحدة.
9. قم بإزالة الشرائح وشطفها بالغمر في ماء DI الخالي من RNase لمدة 15 ثانية. في هذا الوقت، قم بتغيير درجة الحرارة المضبوطة على الفرن إلى 40°C.
10. انقل الشرائح إلى 100٪ إيثانول وحضن لمدة 5 دقائق، ثم جففها على RT لمدة لا تقل عن 5 دقائق.
11. ضع بروتياز III على الشرائح، 1–2 قطرة لكل قسم من الأنسجة. ضع الشرائح في فرن التهجين واحتضنها عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
12. اغمر الزلاجات في DI H₂O الخالي من RNase وغسل الشرائح بغمس للأعلى والأسفل لفترة وجيزة. كرر ذلك بالماء المقطر الطازج ليصبح المجموع غسلتين فقط.

6. تحضير كاشف RNAscope وتهجين المجس

1. جهز مخزون مسبار HIPLEX ومخفف مسبار HEPLEX من RNAscope عن طريق تسخينها إلى 40°C لمدة 10 دقائق في فرن أو حمام ماء.
2. لفترات قصيرة تدحرج نبضي على جميع أسهم المجسات 50X. جهز خليط مجسات عامل عن طريق تخفيف كل مسبار هدف فريد إلى 1X باستخدام مخفف مسبار RNAscope. خطط لاستخدام 50–100 ميكرولتر من خليط المجس لكل نسيج وخلطه جيدا عن طريق الدوامة قبل الاستخدام. يمكن لبروتوكول RNAscope HiPlex استيعاب ما يصل إلى 3 دورات من 4 مجسات (12 مجبارا إجمالا يرمز إليها T1-12). للحصول على إرشادات حول تصميم المجسات، يرجى مراجعة بروتوكول RNAscope^{الأصلي المنشور رقم 14}.
3. ضع كواشف RNAscope HiPlex Amp 1–3 وHiPlex Fluoro T1-T4 عند RT للتوازن.
4. خذ شرائح معالجة بروتياز III واستخدم الماصة 50–100 ميكرولتر من خليط المجس على كل قسم من الأنسجة. ضعها أفقيا في فرن التهجين واحتضنها لمدة ساعتين عند درجة حرارة 40°م.
5. اغسل الشرائح بالغمس الكامل في مخزن غسيل 1X لمدة دقيقتين. كرر ذلك مع محلول جديد ليصبح المجموع غسلتين فقط.
   نقطة التوقف: يمكن تخزين الشرائح في مخزن SSC 5X في RT طوال الليل، كما هو موضح في بروتوكول RNAscope من ACD. إذا تم استخدام هذه النقطة المؤقتة، لاحظ أن غسلتين لمدة دقيقتين في مخزن غسيل 1X سيكون مطلوبا في صباح اليوم التالي.

7. تضخيم المجسات

ملاحظة: تأكد من أن جميع المواد الكيميائية متوازنة مع RT قبل تطبيقها على الشرائح.

1. أضف 1–2 قطرة من كاشف HiPlex Amp1 إلى الشرائح وحضن في فرن التهجين عند 40°C لمدة 30 دقيقة. اغسل السلايدات بالغمس الكامل في محلول غسيل 1X لمدة دقيقتين. كرر العملية ليصبح المجموع غسلتين.
2. أضف 1–2 قطرة من كاشف HiPlex Amp2 إلى الشرائح وحضن في فرن التهجين عند 40°C لمدة 30 دقيقة. اغسل السلايدات بالغمس الكامل في محلول غسيل 1X لمدة دقيقتين. كرر العملية ليصبح المجموع غسلتين.
3. أضف 1–2 قطرة من كاشف HiPlex Amp3 إلى الشرائح وحضن في فرن التهجين عند 40°C لمدة 30 دقيقة. اغسل السلايدات بالغمس الكامل في محلول غسيل 1X لمدة دقيقتين. كرر العملية ليصبح المجموع غسلتين.
4. أضف 1–2 قطرة من كاشف HiPlex Fluoro T1-T4 إلى الشرائح وحضنها في فرن التهجين عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اغسل السلايدات بالغمس الكامل في محلول غسيل 1X لمدة دقيقتين. كرر العملية ليصبح المجموع غسلتين.
5. أضف 3–4 قطرات من كاشف HiPlex DAPI إلى كل قسم من الأنسجة واحتضن لمدة دقيقة واحدة عند التغذية الطبيعية.
6. قم بإزالة ال DAPI عن طريق امتصاص السائل من الشرائح باستخدام مسح ماص. أضف فورا 100 ميكرولتر من وسط تثبيت مضاد التلاشي ذو القاعدة المائية (يمكن أن يكون نفسه المستخدم أثناء خطوات التلوين في IBEX) إلى كل قسم. ضع غطاء غطاء على الشريحة بعناية، مع التأكد من تقليل الفقاعات، ودع وسط التثبيت يجف لمدة 15–30 دقيقة.
7. تابع إلى التصوير.
   نقطة التوقف: يمكن تخزين الشرائح المثبتة في الظلام عند درجة حرارة 4°C لمدة تصل إلى 3 أيام، لكننا نوصي بالمضي قدما بسرعة لضمان أقل قدر من تدهور الحمض النووي الريبي.

8. تقسيم الفلوروفورات والتهجين التكراري للحمض النووي الريبي

1. لإزالة انزلاقات الغطاء من الشرائح، انقع في مخزن SSC 4X لمدة لا تقل عن 30 دقيقة عند RT. اغسل مرة واحدة بغمر الشرائح بالكامل في مخزن SSC جديد 4X وغمس للأعلى والأسفل لفترة وجيزة.
2. افتح أمبولة جديدة من محلول القطع واصنع مخزونا يعمل بنسبة 10٪ عن طريق تخفيفه باستخدام 4X SSC buffer.
3. ضع الشرائح في صندوق رطب وأضف 3–4 قطرات من محلول القطع بنسبة 10٪. حضن الشرائح عند RT لمدة 15 دقيقة، ثم اغمر الشرائح بالكامل في PBST بنسبة 0.5٪ لمدة دقيقتين. كرر ذلك مع PBST طازج ليصبح المجموع غسلتين.
4. للمضي قدما في دورة التصوير الثانية من لوحة RNAscope، قم بموازنة كاشف HiPlex Fluoro T5-T8 مع RT.
5. شغل فرن التهجين واضبط درجة الحرارة على 40°C.
6. أضف مادة HiPlex Fluoro T5-T8 إلى الشرائح وحضنها في فرن التهجين عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اغسل السلايدات بالغمس الكامل في محلول غسيل 1X لمدة دقيقتين. كرر العملية ليصبح المجموع غسلتين.
7. امتص السائل الزائد من الشرائح بحذر. أضف فورا 100 ميكرولتر من وسط التثبيت لكل قسم ووضع غطاء غطاء على الشريحة بعناية. اترك وسط التركيب يجف لمدة 15–30 دقيقة ثم تابع التصوير.
8. كرر الخطوات 8.1–8.7 باستخدام كاشف HiPlex Fluoro T9-T12 ليصبح مجموع 3 دورات RNAscope إذا كان ذلك مناسبا. لاحظ أنه بينما يمكن إجراء 3 دورات مع بروتوكول RNAscope HiPlex، فإن الوقت الإضافي المطلوب لتلوين البروتين بهذا البروتوكول قد يؤثر على جودة الحمض الريبي. لذلك، قد لا تكون 3 دورات ممكنة دائما حسب السجلات المحددة المستهدفة.

9. معالجة الصور

1. يعالج الملفات الخام من كل جولة بشكل فردي ويؤدي معالجة الصور باستخدام معلمات متسقة، بما في ذلك إعدادات طرح الخلفية، فلاتر التنعيم، ونوع تحويل التسجيل.. يجب تسمية القنوات بحرف فاصل متسق (مثلا: Cycle 1: CD45 AF532، حيث ":" يميز بين الدورة والعلامة/الفلور).
2. شغل برنامج SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) وانقر على امتدادات Imaris > SimpleITK > تسجيل Affine لمجموعة z-stack باستخدام القناة المشتركة.
3. رفع ملف صورة واحد من كل دورة من دورات التعدد وأدخل حرف الفاصل لجميع القنوات المسماة (مثل ":").
4. اختر القناة المستخدمة لتسجيل الصورة والصورة الثابتة التي سيتم محاذاة جميع الصور الأخرى معها. يوصى باستخدام DAPI كعلامة ائتمانية، رغم أنه يمكن استخدام أي قناة مسماة مشتركة بين جميع الدورات.
5. انقر على "تسجيل" ثم "إعادة العينة وحفظ الصورة المدمجة".
6. تابع إلى البحث التالي مع برنامجك المفضل. لمزيد من المعلومات حول معالجة الصور والتسجيل، يرجى الرجوع إلى بروتوكول IBEX^{الأصلي 12,13}.

Results

الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل Bex-Plex.
تخضع الأنسجة المجمدة الثابتة المقسمة على شرائح مغطاة بالكروم لما يصل إلى 3 دورات من IBEX القياسي تليها حتى ثلاث دورات من RNAScope HiPlex حيث يتم تنفيذ خطوة السحب الأولية عند 60°C لمدة ساعة واحدة. ثم يتم تسجيل الصور من دورات منفصلة ومحاذاتها باستخدام علامة ائتمانية (مثل DAPI) لإنشاء مجموعة بيانات متعددة الأجزاء للتحليل اللاحق. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

استخدمنا البروتوكول الموضح أعلاه لتحليل بيئة الورم الدقيقة (TME) لنموذج سرطان الغدة القنوتي في البنكرياس (PDAC) في الفأر (الشكل 1). خط ورم معزول من Kras^LSL-G12D/+؛ Trp53^ل/+; Pdx1-Cre; فئران Rosa26^YFP/YFP (KPCY)، التي تتطور تلقائيا لسرطان البنكرياس وتعيد تلخيص العديد من السمات الرئيسية ل PDAC البشري، تم حقنها تحت الجلد في جانب فئران C57BL/6⁷. ثم تم علاج الفئران الحاملة للأورم بالعلاج المناعي المركب الذي يتكون من مضاد ^{باركنسون-1} (200 ميكروغرام•^فأر-1، RMP1-14) ومضاد CTLA-4 (عشيق 200 ميكروغرام ^فأر-1، 9H10) في اليوم العاشر بعد الزرع واستمر كل 3 أيام حتى نهاية التجربة. تم إعطاء مضاد CD40 المضاد للانعدام (i.p.، 100 ميكروغرام ^فأر-1، FGK45) كجرعة واحدة في اليوم الثالث عشر بعد الانغراس. معا، نطلق على هذا اسم "FPC"، كما نشر سابقا7,16. تم جمع ثلاثة أورام من كل مجموعة تجريبية بعد 16 يوما من الزرع، وتم تركيب مقاطع مجمدة على شرائح مغطاة بالكروم لجهاز Bex-Plex.

الشكل 2: نتائج IBEX التمثيلية + RNAscope (Bex-Plex).
(أ) يظهر التلوين المشترك بين IBEX وRNAscope في أقسام أورام سرطان الغدة في قنوات البنكرياس (PDAC) الكشف المشترك عن أهداف البروتين والحمض النووي الريبي ومحاذاة قنوات الفلورة. شريط المقياس، 10 ميكرومتر. (B) قياس حجرات المناعة لخلايا T (CD3+ CD11b-)، والبلاعم (CD11b+ CD68+)، والنخاع (CD11b+ CD68- Ly6G +/-) بناء على شدة قنوات البروتين. تظهر الرسوم البيانية متوسط كثافة الخلايا لكل نوع خلية حسب مجموعة العلاج، n=3 أورام. (ج) قياس الخلايا المعبرة عن النسخ Pdl1 وIl10 في أقسام المناعة التي تم تحديدها سابقا بواسطة البروتين. تظهر الرسوم البيانية متوسط كثافة الخلايا حسب مجموعة العلاج، n=3 أورام. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم إجراء دورة واحدة من تلوين البروتين على ثلاثة أورام معالجة ب FPC وثلاثة أورام معالجة بالنظائر لتقييم التأثيرات على خلايا النسب النخاعية بين مجموعات العلاج. تم الحصول على سبعة معلمات، رغم أننا نركز هنا على ثلاث مؤشرات مهمة: CD11b، Ly6G، وCD68 (الشكل 2A). بعد التقاط الصورة، تم تبييض الفلوروفورات الناتجة عن صبغة البروتين وأجريت جولة واحدة من RNAscope باستخدام مجسات ضد Il10 و Pdl1 (الشكل 2A). ثم تم محاذاة الصور المنفصلة باستخدام DAPI كورقة ائتمانية (الشكل 2A). كشفت شدة الفلورة الكمية المتوسطة ل CD11b وCD68 وLy6G وCD3 عن اتجاه نحو تقليل عدد البلاعم والخلايا النخاعية في الأورام المعالجة ب FPC مقارنة بالضوابط (الشكل 2B). أجريت مقارنات كمية عبر جميع العينات، وتم تقديم البيانات كقيم متوسطة. علاوة على ذلك، أظهر عدد الخلايا التي تعبر عن Pdl1 أو Il10 أو مزيج من كلا النسخ في كل من أقسام البلاعم والنخاع اتجاها تناهيدا تنازليا مع علاج FPC مقارنة بالضابطين (الشكل 2C). تشير هذه النتائج إلى انخفاض محتمل في أعداد الخلايا المثبطة للمناعة بعد العلاج، بما يتوافق مع الاستجابات البيولوجية المتوقعة.

الشكل 3: تحسين شروط استرجاع الأهداف للحفاظ على الطاقة النووية.
(أ) صورة تمثيلية للنسيج بعد استرجاع هدف RT تظهر تورما نوويا وشكل غير واضح. تشير أمثلة الأحجام النووية إلى خطوط صفراء. شريط الميزان، 40 ميكرومتر. (B) صورة تمثيلية للنسيج بعد استرجاع الهدف المعدل تظهر تحسنا في شكل النواة مع تعديل ظروف درجة الحرارة. أمثلة على حجم النواة تشير إليها الخطوط الصفراء. شريط الميزان، 40 ميكرومتر. (C) متوسط حجم النواة الذي يحدده تقسيم المؤشر القائم على DAPI على الأنسجة التي خضعت لاسترجاع هدف RT (غير دافئ مسبقا)، أو استرجاع هدف مسبق تسخين 60°C، أو تحت ظروف IF القياسية بدون استرجاع الهدف. تشير أشرطة الرسوم البيانية إلى المتوسط، وأشرطة الخطأ تظهر الانحراف المعياري. P < 0.0001 حسب ANOVA أحادي الاتجاه العادي (تشير النجمة إلى عتبة الدلالة الإحصائية)؛ n = 1639 خلية لكل حالة. (د) خرائط حرارية تمثل درجات الارتباط بين ثلاث صور قبل وبعد محاذاة الصورة. تظهر درجات الارتباط للتسجيل الناجح والتسجيل الذي فشل في التوافق بسبب اختلافات على المستوى النووي.

ومن المهم أنه عندما تم إجراء Bex-Plex دون الاسترجاع المعدل للهدف الموصوف، بدت النوى متضخمة بحواف غير واضحة مقارنة بالنوى من نسيج تم فيه استرجاع الهدف المعدل بشكل صحيح (الشكلان 3A و B). أدى استخدام جهاز استعادة الهدف في درجة حرارة الغرفة إلى زيادة بنسبة 33٪ في متوسط حجم النواة بناء على تلوين DAPI مقارنة بالاسترجاع المستهدف الذي تم باستخدام كاشف تم تدفئته مسبقا إلى 60°C (الشكل 3C). تم الحصول على قياسات حجم النوى من حقول تمثيلية عبر العينات باستخدام التجزئة المعتمدة على DAPI. علاوة على ذلك، عندما تم تنفيذ هذه الخطوة عند 60°C باستخدام كاشف استرجاع مسبق التسخين، لم يختلف متوسط حجم النواة بشكل ملحوظ عن متوسط حجم النواة بعد التلوين القياسي (الشكل 3C). نظرا لأن DAPI هو المعامل الأكثر فعالية للاستخدام كمرجع لمحاذاة الصور، فإن هذه المقارنة (الشكل 3) تبرز الأهمية الحاسمة لمعلمات الاسترجاع المعدلة للحفاظ على الشكل النووي. يتم الإشارة إلى تسجيل الصورة الصحيح بدرجة ارتباط محاذاة قريبة من 1، مما يشير إلى التشابه بين صور الدورات المختلفة (الشكل 3D، قبل مقابل نجاح).

يشير نجاح تنفيذ البروتوكول إلى الحفاظ على مورفولوجيا النواة، وإشارة RNA قوية ومحددة، ومحاذاة دقيقة لقنوات البروتين والحمض النووي الريبي. على النقيض من ذلك، قد تشمل النتائج غير المثالية تشوها نوويا، إشارة RNA ضعيفة أو منتشرة، وعدم محاذاة بين دورات التصوير (الشكل 3D، قبل مقابل الفشل). كما هو موضح في الشكل 3C، يجب الاحتفاظ بالشكل النووي طوال البروتوكول، وسيكون واضحا نوعيا وكمي. قبل تنفيذ Bex-Plex، يجب على المستخدمين تحديد الحقيقة الأساسية لأنسجة اهتمامهم من خلال تلوين منفصل للبروتين والحمض النووي الريبي. هذا لا يضمن فقط تحسين صبغة البروتين والحمض النووي الريبي للأنسجة المستهدفة، بل يوفر أيضا أنماطا مكانية ذات صلة يجب الاحتفاظ بها عند دمجها في Bex-Plex. على سبيل المثال، يتزامن CD11b مع كل من CD68 وLy6G ويظهر تلوينا موضعيا في غشاء الخلية (الشكل 2A). وهذا متوقع، حيث أن CD11b هو علامة خلوية نخاعي شاملة، وCD68 وLy6G هما علامات لمجموعات البلاعم والنيوتروفيل الميلويدية. يتميز الكشف الناجح عن الحمض النووي الريبي بإشارات مميزة مميزة موضعية في الخلايا الفردية، بينما قد تظهر النتائج غير المثالية على شكل تلوين ضعيف أو منتشر. يجب أن تظهر إشارة مسبار الحمض النووي الريبي تمركزا داخل وحول النواة، حسب وظيفة النسخ. يمكن تضمين علامات البروتين البنيوي مثل الفيمنتين لتحسين دقة الخلايا لتحديد موقع النسخ عن طريق كشف أغشية الخلايا في الأنسجة المعقدة. من المتوقع أن تظهر العينات السلبية أو الضابطة تلوينا خلفية ضئيلا وعدم وجود إشارة مسبار غير محددة، مما يؤكد خصوصية اكتشاف البروتين والحمض النووي الريبي.

Discussion

يدمج سير عمل Bex-Plex منصة تلوين البروتينات التكرارية، IBEX، مع التهجين الميداني RNAscope لتمكين الكشف المتزامن عن البروتينات ونصوص الحمض النووي الريبي بدقة خلية واحدة. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير طريقة قابلة للتكرار للتحليل المكاني المتكامل لتعبير البروتين والحمض النووي الريبي داخل الأنسجة السليمة. لقد واجهت القدرة على قياس تعبير البروتين والحمض النووي الريبي في نفس النسيج تحديات تقنية سابقا: تكاليف عالية، خطوات استرجاع مستضدات معقدة، سعة محدودة للمتعدد، قيود الدقة (غير خلية واحدة)، تضخيم الإشارة غير الخطي، وخطوط أنابيب معلوماتية حيوية واسعة للمعالجة لاحقا ^17,18,19. مقارنة بالأساليب الحالية مثل التلبيس المناعي الفلوريسينسي، وتلوين OPAL/TSA، ومنصات النسخ المكاني، يتيح Bex-Plex الكشف المتزامن القابل للتكرار والكمي وعالي البليكس مع الحفاظ على السياق المكاني والشكل النووي لمحاذاة صورة دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء Bex-Plex في بيئة مختبرية قياسية ويولد بيانات بدقة خلية واحدة يسهل معالجتها. سيكون الاستفادة من هذا البروتوكول لفهم شامل لتفاعلات الخلية والخلية ضمن سياقات الأنسجة المتنوعة، مثل البيئة الدقيقة للورم، أمرا ضروريا لتطوير علاجات مناعية أكثر فعالية وتحسين نتائج المرضى عبر حالات المرض.

تجرى طريقتنا على أنسجة ثابتة مدمجة في OCT وتتبع سير عمل IBEX القياسي دون تعديل، يتبعه بروتوكول RNAscope HiPlex معدل قليلا. الفرق الرئيسي هو خطوة الاسترداد بين الهدف في بداية سير عمل تهجين RNA: بدلا من 99°C التي يبديها المصنع لمدة 5 دقائق، يتم الاسترجاع عند 60°C لمدة ساعة واحدة. يحافظ هذا التعديل على بنية النواة، وهو أمر ضروري لمحاذاة الصورة بدقة بين دورات البروتين والحمض النووي الريبي. تشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول الحفاظ على درجة حرارة استرجاع مستهدفة ثابتة، وتبييض فلوروفور فعال باستخدام LiBH₄، وتقليل تحلل الحمض النووي الريبي من خلال معالجة سريعة واستخدام كواشف خالية من الRNase. من المهم جدا التأكد من استخدام كواشف استرجاع الأهداف المسخنة مسبقا عند 60°C; عدم القيام بذلك يمكن أن يسبب تورما نوويا حتى مع تعديل خطوة الحضانة.

بينما ثبت أن 15 دقيقة من الحضانة باستخدام LiBH₄ كافية لتعطيل العديد من الفلوروفورات الشائعة، ينصح بالتحقق من هذه العملية بشكل فردي لكل دورة بروتين قبل تنفيذ بروتوكول Bex-Plex بالكامل. في المنشورات الأولية ل IBEX، من المعروف جيدا أن ليس كل الفلوروفورات المتوافقة مع IBEX قابلة للتبييض بنفس الدرجة¹². بالإضافة إلى ذلك، لاحظ مختبرنا أن بعض العلامات الهيكلية عالية الوفرة مثل الفيمنتين قد تتطلب وقتا أطول لتبييض الاستخدام. تأكيد أن تركيبات الفلوروفور والعلامة المستخدمة ستمنع بشكل كاف من التبييض تسريب الإشارة المتبقية إلى دورات البروتين والحمض النووي الريبي اللاحقة. تحتوي صفحة مجتمع IBEX على موارد ممتازة لتصميم اللوحات المتوافقة مع IBEX، وهي مصممة خصيصا لتقليل العبء على المستخدمين الجدد من خلال تحديد فعالية الأجسام المضادة وتبييض الفلور^{بمقدار 20}. علاوة على ذلك، يجب ألا يؤثر التلوين والتبييض التكراري على جودة نسخ الحمض النووي الريبي، ومع ذلك من المهم إكمال دورات البروتين بأسرع وقت ممكن واستخدام كواشف خالية من الحمض النووي لتقليل أي تحلل قد يحدث مع مرور الوقت. الفشل في ذلك سيؤثر على تهجين المجسات ويؤدي إلى انخفاض الإشارة لأي دورات RNAscope يتم تنفيذها، خاصة للنسخ ذات الوفرة المنخفضة. تشمل المشاكل الشائعة التي تواجهها خلال البروتوكول ضعف إشارة RNA، وتبييض الفلورفور غير الكامل، وعدم المحاذاة بين دورات التصوير، ويمكن التخفيف من ذلك من خلال تحسين ظروف التلوين ومعايير التصوير.

من الضروري تحديد الوقت بين إجراء صبغة البروتينات وتهجين مسبار الحمض النووي الريبي إلى أقل من 5 أيام. عند إجراء Bex-Plex على عدة شرائح، ينصح بشدة بمعالجة شريحة واحدة في كل مرة لتقليل التغير في تحلل الحمض النووي الريبي. وبالمثل، حدد الوقت بين تهجين المجسات والتصوير. بينما نجحنا في تصوير حتى 3 أيام بعد التضخيم، لا ينصح بالتخزين لفترة أطول. إذا انخفضت الإشارة بعد عدة دورات من التلوين أو التهجين، فقد يكون من الضروري زيادة السرعة طوال البروتوكول. من الناحية المثالية، نوصي بالعمل بأسرع ما يمكن، حيث أن التأخيرات تقلل من سلامة الحمض النووي الريبي وقد تقلل من التضخيم. تشمل الأساليب الأخرى تقليل عدد دورات البروتين التي يتم تنفيذها بسهولة أكبر مع قيود الجدول الزمني للبروتوكول أو تغيير تصميم لوحة مسبار الحمض النووي الريبي لتشمل أهدافا ذات وفرة أعلى. قبل دمج IBEX وRNAscope، تحقق من صحة الأجسام المضادة ولوحات المجسات لكل دورة بشكل منفصل لتحديد جودة الإشارة المتوقعة لكل دورة. في حالة حدوث انتفاخ نووي بعد استرجاع الهدف، من الممكن أن يكون كاشف استرجاع الهدف قد لم يكن قد تم تسخينه مسبقا بشكل صحيح. تأكد من أن مادة الاستخراج لا تسمح لها بالبرد بمجرد تخفيفها وتسخينها مسبقا إلى 60^°C، وأن درجة الحرارة تبقى ثابتة خلال فترة الحضانة التي تستمر ساعة واحدة على الانزلاق. وأخيرا، إذا فشل تسجيل الصورة ومحاذاتها في غياب التورم النووي، فهذا يعني وجود عدم تطابق في معلمات التقاط الصورة مثل عمق البت، حجم الفوكسل، أو موضع Z عبر الدورات. في حال حدوث مثل هذه الأخطاء، قد يكون من الضروري تكرار البروتوكول مع تعديلات على هذه الإعدادات لتكون متسقة. تعد هذه الاستراتيجيات ضرورية لضمان قابلية تكرار المشاكل والاتساق عبر التجارب.

تمكن البيانات التي تولدها Bex-Plex رؤية معمقة للمشهد المكاني للأنسجة على مستوى لم يكن متاحا من قبل. ومع ذلك، فإن القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن العدد الكلي لدورات البروتين التكرارية الممكنة أقل من عدد دورات البروتين التكراري الممكنة (IBEX) وحده بسبب تدهور تدريجي للحمض النووي الريبي مع مرور الوقت. على الرغم من إجراء ما يصل إلى 6 دورات من IBEX القياسي، لا نوصي بتجاوز 3 دورات من صبغة البروتين لبيكس-بليكس. ومع ذلك، فإن البروتوكول يستوعب الحد الأقصى لعدد دورات RNAscope وهذا المستوى من عمق التعدد المتعدد كاف لمعظم التطبيقات.

تشمل القيود الإضافية التغير بين أنواع الأنسجة وإمكانية حدوث التوهج الذاتي أو التلوين التي قد تؤثر على تفسير الإشارة. الأنسجة الأكثر هشاشة يمكنها تحمل دورات أقل، وأنواع الأنسجة المختلفة لها خصائص فريدة تؤثر على الصبغ. يمكن تقييم هذه القيود عبر صبغات بروتينية أو RNA ذات دورة واحدة ومعالجتها قبل استخدام Bex-Plex. التقسيم على شرائح مغطاة بالكروم الألوم سيحسن بشكل كبير التصاق الأنسجة وسلامة الهيكل، لكن التألق الذاتي يثبت اعتبارا لجميع تقنيات الفلورية المناعية. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم التحقق من صحة البروتوكول حاليا في عينات FFPE أو العينات السريرية البشرية، وسيتطلب المزيد من التحسين لمثل هذه التطبيقات. ومع ذلك، نظرا لأن IBEX و RNAscope يتم إجراؤهما بشكل رئيسي على أنسجة مدمجة بالبارافين المثبت في الفورمالين (FFPE)، فمن الممكن أن يتوسع Bex-Plex ليشمل هذه الأنواع من العينات. سيتطلب التنفيذ الناجح المزيد من التحسين لاسترجاع المستضدات وربما خطوات استرجاع الأهداف للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي.

بشكل عام، يقدم Bex-Plex طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة ومتاحة على نطاق واسع للتحليلات المكانية عالية المجموعة. هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص لتطبيقات مثل تحليل بيئة الأورام الدقيقة، وتحليل الخلايا المناعية، ورسم الخرائط المكانية لتفاعلات الإشارات. تعزز هذه الرؤية المتكاملة القدرة على استجواب آليات تنظيم المناعة، وتباين الأورام، والاستجابة العلاجية عبر مجموعة واسعة من النماذج التجريبية. سيكون Bex-Plex ذا قيمة كبيرة في السياقات التي يكون من الضروري فيها دراسة التداخل الذي يحدث بين الخلايا في الأنسجة السليمة، مثل البيئة الدقيقة للورم أو في أنسجة أخرى أثناء الالتهاب والتوازن الداخلي. على وجه الخصوص، فإن القدرة على تحليل الديناميكيات المكانية لإشارات السيتوكين من خلال البحث عن نسخ جزيئات قصيرة العمر بالتزامن مع مؤشرات البروتين الظاهرية ستوفر فهما أعمق للتفاعلات الخلوية عبر حالات المرض. قد تشمل التحسينات المستقبلية زيادة سعة التعدديات، والاندماج مع خطوط تحليل الصور الآلي، والتكيف مع عينات الخزعة السريرية من خلال توسيع سير العمل ليشمل أنسجة FFPE.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023