Method Article

نموذج إصابة نقص الأكسجين وإعادة الأكسجين في أمراض القلب البشرية التي تتجمع ذاتيا

DOI:

10.3791/70310

⸱

March 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العضويات القلبية البشرية ذاتية التجميع (hCOs) هي نظام ناشئ لنمذجة تطور القلب البشري والأمراض. هنا، يتم توفير منهجية لتوليد وإصابة hCOs مع إعادة الأكسجين بسبب نقص الأكسجين وتفاصيل النتائج النسيجية والوظيفية المتوقعة بعد الإصابة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدون إعادة تنشيط الأوعية الدموية السريعة، يؤدي مرض القلب الإقفاري إلى فقدان لا رجعة فيه في خلايا عضلة القلب، وتكوين ندب، وانخفاض وظائف القلب. القدرة على نمذجة إصابات نقص الأكسجين وإعادة الأكسجين وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة في الأنسجة البشرية هي حاجة غير ملباة. العضويات القلبية البشرية (hCOs) هي نظام نموذجي ناشئ، لكن بدء العمل مع hCOs قد يكون تحديا بسبب حجمها الصغير، واحتياجاتها لزراعة التعليق، وتفاوتها في كفاءة التمايز. يقدم هذا البروتوكول دليلا سهل الاستخدام لتوليد وصيانة hCOs المشتقة ذاتيا من iPSC البشرية؛ طرق معالجة وتحليل HCOs نسيجيا؛ ونهج لإصابة HC مع نقص الأكسجين وإعادة الأكسجين يحاكي التليف واستماتة المبرمج الذي يرى مع نقص التروية/إعادة تروية الدم البشري. يوفر هذا البروتوكول إرشادات لاستخدام HCOs كتكمل لنماذج حيوانية لإصابة نقص التروية-إعادة التروية، ويمكن استخدامه لتحديد واختبار العوامل التي قد تعزز تعافي عضلة القلب البشرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد مرض القلب الإقفاري سببا رئيسيا للمراضة والوفيات على مستوى العالم، حيث يؤثر على ما لا يقل عن 20.5 مليون شخص في الولايات المتحدة وحدها 1,2,3. بدون تدفق كاف، يؤدي نقص الأكسجين المطول إلى موت خلايا عضلة القلب وخلل في وظائف عضلة القلب. يتم علاج نقص التروية العضلي القلبي بشكل أساسي من خلال إعادة التنشيط الوعائي عبر التدخل الجلدي أو العلاج التخثري أو ترقيع الشريان التاجي. ومع ذلك، فإن إعادة التدفئة الوعائية هي سلاح ذو حدين ويمكن أن تسبب إصابات إضافية من خلال إطلاق نوع الأكسجين التفاعلي 4,5. بينما كانت استراتيجيات إعادة التروية ناجحة للغاية، كانت الطرق للحد من فقدان ال CM أثناء الإصابات الإقفاري أو بعد إعادة التروية أكثر صعوبة. على الرغم من أن العديد من المحاولات لإنقاذ الأنسجة المحتمة أثبتت فعاليتها في نماذج حيوانية لإعادة تروية نقص التروية، إلا أن هذه العلاجات نفسها لم تحقق إلى حد كبير فائدة كبيرة في التجارب البشرية، مما يثير الحاجة إلى نماذج بشرية لتقييم العلاجات التي توفر أو تجدد الرحم 6,7,8,9,10,11,12.

تشمل المنصات البشرية المستخدمة لنمذجة إصابات القلب الأنسجة الأولية والأنظمة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (hiPSC)13,14. نظرا لأن الأنسجة الأولية مقيدة بتوافر العينات، برزت أنظمة hiPSC كمنصة بشرية مهيمنة لنمذجة أمراض القلب، مع مزايا واضحة تتمثل في كونها قابلة للتعامل وراثيا وقابلة للتوسع 15,16,17,18,19. تزرع الخلايا القلبية التقليدية المشتقة من hiPSC ثنائية الأبعاد (hiPSC-CM) محدودة بسبب عدم نضج الخلايا العضلية الناتجة، وغياب بنية نسيج معقدة، وعدم القدرة على إنتاج التنوع الخلوي الكامل الموجود في قلب الإنسان15,20. لمعالجة هذه النواقص، أصبحت الأنسجة القلبية ثلاثية الأبعاد الهندسية (EHTs) تعتمد بشكل متزايدعلى شكل 20,21,22,23,24,25,26. تشمل طرق EHT خلط خلايا القلب المتمايزة مسبقا في الكرويدات24 أو زرع خلايا قلبية متمايزة في سقالات أو قوالب 21,22,27. على الرغم من أن EHTs يمكنها نمذجة التفاعلات الخلوية غير النمطية بشكل أفضل وتتمتع بنضج نسبي أكثر من الثقافات ثنائية الأبعاد، إلا أن متطلبات السقالات أو المفاعلات الحيوية المخصصة لإنشاء والحفاظ على EHTs تحدحاليا من قابليتها للتوسع.

العضويات القلبية ذاتية التجميع (hCOs)، أو الكارديويدات، هي نظام نموذجي بشري جديد وقوي في المختبرات 20،25،26،29. للهيدروجين عدة مزايا. أولا، يمكن أن تشمل عدة أنواع من الخلايا، بما في ذلك الخلايا البطانية، والأرومات الليفية، والخلايا فوق القلبية، دون الحاجة إلى بروتوكولات تمايز متخصصة متعددة 26,29,30. ثانيا، يحدث معظم التمايز بينهما في زراعة التعليق ثلاثي الأبعاد، مما يلغي متطلبات القوالب المتخصصة أو مصفوفة الأنسجة 25,26,29,30. أخيرا، تمتلك hCOs شكل كروي نمطي مع تجويف مركزي، مما يتيح التحليلات الشكلية (مورفولوجيا). لذا، فإن hCOs تتمتع بقابلية توسع مشابهة لأنظمة الزراعة ثنائية الأبعاد مع الاحتفاظ ببعض تعقيد الأنسجة في EHTs. تم استخدام HC في اختبارات سمية الأدوية، ونمذجة الأمراض الخاصة بالمرضى، ونمذجة جوانب تطور القلب 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. ورغم أن الهيدروجين الواعدة، إلا أن لهيدروجين الكربون عدة قيود مقارنة ب EHTs، منها عدم القدرة على قياس القوة الخارجة مباشرة. علاوة على ذلك، لا توجد مجموعة من الخلايا المناعية الأصلية في نماذج hCO الوصفة، رغم أنه من الممكن ملء hCOs ببلاعميات. ومع ذلك، فإن hCOs هي نظام نموذجي بشري ناشئ وسريع التطور 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

حتى الآن، كان نمذجة إصابات القلب باستخدام hCOs محدودا. تم وصف نموذج إصابات التبريد، لكن الإصابات متغيرة للغاية، والحاجة إلى إصابة hCOs بشكل فردي تحد من قابلية التوسع29. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا سهل الاستخدام لتوليد وإصابة hCOs القابلة للتجميع الذاتي المصابة بإصابة نقص الأكسجين (H/R). مقارنة بالبروتوكولات الأخرى لتوليد hCOs، يستخدم هذا البروتوكول وسط تمايز مبسط ويدمج استراتيجية التمايز المتوسط ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد التي وصفها هوفباور وآخرون. يمكن إجراء بروتوكول إصابة H/R في أي وقت بعد بدء الضرب، والذي يحدث عادة حول اليوم التمايز 8 (D8) إلى D11. يمكن تعديل مدة H/R بين 6 ساعات و24 ساعة لتحقيق مستوى الإصابة المطلوب، الذي يتراوح من فقدان CM البسيط إلى شبه الكامل. بالإضافة إلى ذلك، يطور hCOs عادة نواة كولاجينية مع خلايا فيمنتين+ بعد إصابة H/R وتتزداد شدتها مع مدة H/R. هذا النموذج عالي الإنتاجية والقابل للتوسع لفيروس H/R قد يلبي الحاجة إلى نماذج بشرية لتطوير واختبار طرق علاجية جديدة لتعزيز تعافي أو تجدد CM بعد الإصابة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن تتبع جميع إجراءات التعامل مع خطوط الخلايا البشرية بروتوكولات السلامة البيولوجية المحلية. أجريت جميع التجارب باستخدام خط الخلايا iPSC DU11، المستخرج من الأرومات الليفية الذكورية السليمة حديثي الولادة في منشأة iPSC الأساسية في جامعة ديوك.

1. توليد HCOs

ملاحظة: يصف هذا القسم بروتوكولا معياريا لتوليد hCOs من iPSCs (الشكل 1). يجب تنفيذ جميع الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول في غطاء تدفق طبقي لضمان التعقيم. راجع الجدول 1 للحصول على وصفات وسائط التمايز.

اليومتركيز المخزونتركيز العملعامل التخفيفبيس ميديا
D010 مللي مولار CHIR9902110 ميكرومولار CHIR990211:1000RPMI-1640، 2٪ B27 ناقص الأنسولين
حمض الأسكوربيك 100 ملغ/ملحمض الأسكوربيك 50 ميكروغرام/مل1:2000
10 ملغ/مل أكتيفين A60 نانوغرام/مل أكتيفين A1:167
D15 مللي مولار IWP25 ميكرومولار IWP21:1000RPMI-1640، 2٪ B27 ناقص الأنسولين
حمض الأسكوربيك 100 ملغ/ملحمض الأسكوربيك 50 ميكروغرام/مل1:2000
D25 مللي مولار IWP25 ميكرومولار IWP21:1000RPMI-1640، 2٪ B27 ناقص الأنسولين
حمض الأسكوربيك 100 ملغ/ملحمض الأسكوربيك 50 ميكروغرام/مل1:2000
10 مللي مولار ثيازوفين2 ميكرومولار ثيازوفين1:5000
D35 مللي مولار IWP25 ميكرومولار IWP21:1000RPMI-1640، 2٪ B27 ناقص الأنسولين
حمض الأسكوربيك 100 ملغ/ملحمض الأسكوربيك 50 ميكروغرام/مل1:2000
D45 مللي ميال IWP25 ميكرومولار IWP21:1000RPMI-1640، 2٪ B27 ناقص الأنسولين
D6+لا يوجدلا يوجدRPMI-1640، 2٪ B27 بالإضافة إلى الأنسولين

الجدول 1: جدول وسائط التفاضل. تركيزات المخزون، تركيزات العمل، وعامل التخفيف لكل عامل تمايز خلال أيام التمايز من 0 إلى 6. جهز جميع الحلول الصالحة طازجة عند التغذية.

figure-protocol-1
الشكل 1: مخطط تمايز التمايز في hCO. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. صيانة iPSC
    1. غط بالكامل قاع كل بئر من صفيحة ب 12 بئر مع مصفوفة غشاء قاعدة بنسبة 1:100، مخففة في وسط بارد DMEM/F12. حضانة الألواح المعالجة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بالبلمرة. إذا لم تستخدم فورا، يمكن إغلاق الألواح بطبقة من الفيلم وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين وحضانها لمدة لا تقل عن 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. اليوم الثالث من التمايز (D-3): طلاء iPSCs للتمييز اللاحق
    1. جهز صفائح مغطاة بمصفوفة الغشاء القاعدي كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
    2. استنشاق وسائط الصيانة من زراعة iPSC وإضافة محلول منفصل كاف لتغطية الخلايا بالكامل (~500 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة بسعة 12 بئر أو 1 مل لكل بئر من صفيحة ذات 6 آبار). حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. أضف حجم متساو من وسائط صيانة iPSC لكل بئر واضغط بلطف على اللوح للمساعدة في فصل الخلايا. أمال الصفيحة نحوك وقم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل عبر قاع البئر لفصل الخلايا الملتصقة أكثر، لا تزيد عن ثلاث مرات. استخدم ماصة لنقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
    4. الخلايا الحبيبية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي متأرجح. استنشاق الخلايا الفائقة وأعد تعليق الخلايا بلطف في 1 مل من وسط صيانة iPSC.
    5. نقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل. أضف 10 ميكرولتر من تريبان بلو مع الماصة للخلط. أضف 10 ميكرولتر من خليط iPSC/Trypan الأزرق إلى مقياس الدم وعد الخلايا الحية.
    6. قم بتخفيف تعليق الخلية إلى تركيز نهائي يتراوح بين 100,000-200,000 خلية/مل في وسط صيانة iPSC باستخدام مثبط ROCK (ROCKi). أضف 1 مل/بئر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة ذات 12 بئر مغطاة بمصفوفة الغشاء القاعدي.
      ملاحظة: تعتمد كثافة الطلاء قبل التمايز على معدل نمو خط خلوي معين. قد تحتاج كثافة الطلاء إلى تعديل لكل خط iPSC. قد يحتاج تركيز ROCKi إلى تعديل حسب العلامة التجارية أو التركيبة المستخدمة.
  3. التمايز D-2: تبادل الوسائط لإزالة ROCKi
    1. استبدل الوسائط ب 1 مل من وسائط صيانة iPSC طازجة، بدون ROCKi. يجب أن تبدأ الخلايا في تكوين مستعمرات صغيرة. يجب أن تبدو المستعمرات مسطحة (الشكل 2A). إذا بدت الخلايا وكأنها مرصوفة أو نحيفة أو ممدودة، فهذا علامة على التمايز التلقائي، وقد تتأثر كفاءة التمايز.
  4. التمايز D-1: الاستمرار في حضانة الخلايا دون علاج.
  5. التمايز D0: بداية التمايز وتحفيز الأديم المتوسط
    1. باستخدام المجهر، تحقق من كثافة الخلايا لضمان التقاء 70٪-90٪ (الشكل 2B) عند التمايز. إذا كانت تحت التلاصق، قم بتغذية الخلايا بوسائط صيانة iPSC وانتظر 24 ساعة. إذا كانت الخلايا متقاربة جدا، قم بتقسيم الخلايا كما في الخطوة 1.2
    2. جهز 12 مل لكل صفيحة بسعة 12 بئر من وسط الحث D0 المتوسط (10 ميكرومولار CHIR99021، 50 ميكروغرام/مل حمض الأسكوربك، 60 نانوغرام/مل أكتيفين A في RPMI-1640 مع 2٪ مكمل B27 ناقص الأنسولين (RB-)).
    3. قم بإزالة الوسائط الموجودة واستبدله ب 1 مل/بئر من وسط الحث D0 الميزوديرم. لاحظ وقت تبادل وسائل الإعلام.
  6. التمايز D1: مواصفة الأدم المتوسط القلبي
    1. بعد 24 ساعة بالضبط من إضافة وسط الحث المتوسط D0، يتم التبادل وسط D1 لمواصفات الميزوديرم القلبي (5 ميكروغرام IWP2، 50 ميكروغرام/ملتر حمض الأسكوربيك في RB).
  7. التمايز D2: تكوين hCO
    1. أضف كمية كافية من كاشف تفكك الخلايا لتغطية الخلايا وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الشكل 2C). أضف حجما متساويا من وسط الأديرم القلبي D2 إلى كل بئر واستخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل لتحرير الخلايا الملتصقة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
    2. الخلايا الحبيبية عن طريق الطرد المركزي عند حرارة 300 x g لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليقها في 1 مل من وسط مواصفات الوسط القلبي D2 (5 ميكرومولار IWP2، 50 ميكروغرام/ملليتر حمض الأسكوربيك في RB-).
    3. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وأضف إليه 10 ميكرولتر من تريبان بلو. عد الخلايا بأي طريقة مفضلة. تخفيف الخلايا إلى تركيز 100,000 خلية/مل في وسط محدد الميسوديريم القلبي D2، مع 2 ميكرومولار ثيازوفين. استخدم 10 مل من تعليق الخلية لكل لوحة تثبيت منخفضة جدا بسعة 96 بئئر.
    4. انقل تعليق الخلية إلى خزان كاشف بحجم مناسب واستخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 100 ميكرولتر إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر منخفضة الارتفاع، للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10,000 خلية/بئر.
    5. لتحفيز تكوين hCO في زراعة التعليق، تستخدم ألواح الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، سيكون هناك كتلة كبيرة من الخلايا (الشكل 2D) - إذا لم تكن هذه الحبيبة محصورة، كرر الطرد المركزي.
      ملاحظة: ليست كل الخلايا ستندمج في HCO الذي سيظهر كحبيبات خلوية محدودة، مع رؤية الخلايا الفردية على المجهر الساطع. بعض الحطام أحادي الخلية في الصفيحة المحيطة ب hCO هو طبيعي.
  8. التمايز D3: إضافة وسائط لتخفيف ROCKi
    1. حضر 10 مل من وسط D3 (5 ميكرومولار IWP2، 50 ميكروغرام/ملتر حمض الأسكوربيك ب RB-) لكل لوحة. باستخدام ماصحة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من وسائط D3 إلى كل بئر، دون إزالة أي وسط.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، ستكون hCOs قد تكثفت لتصبح كرويا داكنا ومحددا جيدا. لن تكون الخلايا الفردية مرئية (الشكل 2E).
  9. التمايز D4: التبديل إلى وسائط D4
    1. قم بإزالة 100 ميكرولتر من وسائط D3 واستبدالها ب 100 ميكرولتر من وسائط D4 (5 ميكرومولار IWP2 بوحدة RB-). لتقليل خطر الشفط، قم بإمالة اللوح نحوك بزاوية تقارب 45° واثبت ماصة متعددة القنوات بزاوية تقارب 90° بالنسبة لجدار الجانب للوحة. ضع الماصة متعددة القنوات بإحكام على الجدار الجانبي للبئر واسحب ببطء 100 ميكرولتر من الوسط، مع فحص رؤوس الماصة بشكل متقطع بحثا عن hCOs المستمشقة.
      ملاحظة: الهيدروكروكاتير موجودة في زراعة التعليق، واستنشاق الهيدروكرومونات أثناء إزالة الوسائط أمر شائع. لتقليل خطر الشفط، قم بإمالة اللوح نحوك بزاوية تقارب 45° وثبت الماصة متعددة القنوات بزاوية تقارب 90° بالنسبة للجدار الجانبي للوحة. ضع الماصة متعددة القنوات بثبات على الجدار الجانبي للبئر واسحب ببطء 100 ميكرولتر من الوسط، مع فحص رؤوس الماصات بشكل متقطع بحثا عن hCOها المستنشق.
    2. استبدلها ب 100 ميكرولتر من وسائط D4.
  10. التفاضل D6: وسائط صيانة hCO
    1. إزالة 100 ميكرولتر من وسط D4 واستبدالها ب 100 ميكرولتر من وسائط D6+ (RPMI-1640 مع 2٪ مكمل B27 (RB+)).
  11. التفاضل D8
    1. استمر في تبادل الوسائط كل يومين بإزالة 100 ميكرولتر واستبداله ب 100 ميكرولتر من وسائط D6+ الطازجة. يجب أن تنمو hCOs بشكل أكبر، وتحافظ على حواف ناعمة، وتبدأ في الضرب حول D6-11 إذا تم تمايزها بنجاح (الشكل 2F). ستظل hCOs تظهر ككرويدات داكنة ومحددة جيدا، ولن تكون الخلايا الفردية مرئية.

figure-protocol-2
الشكل 2: الجدول الزمني لتمايز hCO. الجدول الزمني لتمايز العضويات. (أ) مستعمرات iPSC قبل يوم واحد من بدء التمايز (D-1). لاحظ مستعمرات مميزة ذات مسطحة المظهر. (ب) iPSCs في يوم بدء التمايز (D0) عند ~90٪ من التلاكم. (C) العضوي عند التمايز D2 مباشرة بعد تكوين العضوي في صفيحة ارتباط منخفضة جدا ببئر 96. يشير السهم إلى مثال على بلورات IWP2 على شكل إبرة. (D) الأعضاء عند التمايز D3. لاحظ انضغاطا كبيرا في العضوية بسبب تكوين الوصلة بين الخلية؛ بعض الحطام الخلوي غير المدمج أمر طبيعي في هذه المرحلة. (ه) العضوية عند التمايز D10. (F) يشير السهم إلى مستعمرة iPSC ذات خلايا طويلة ونحيلة ذات مظهر مرصوف، مما يشير إلى تمايز تلقائي محتمل. شريط المقياس = 1000 ميكرومتر للألواح A-E، شريط المقياس = 400 ميكرومتر لللوحة F. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. جمع وتثبيت hCOs لتلطيخ المناعة

  1. باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر مع قطع الطرف، انقل hCOs إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.7 مل. بعد نقل جميع الهيدرومات، انتظر حتى تغوص الهيدرومترات إلى قاع الأنبوب وقم بإزالة الوسائط الزائدة بلطف. اغسل hCOs مرة واحدة باستخدام PBS، وانتظر بضع ثوان حتى تغوص hCOs إلى قاع الأنبوب، وأزل PBS الزائد برفق.
  2. أصلح hCOs بنسبة 4٪ PFA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قد تتطلب بعض الأجسام المضادة تثبيت الأسيتون أو الميثانول لتحقيق أفضل أداء ممكن. راجع إرشادات الشركة المصنعة.

3. التلطيع المناعي الكامل

  1. انقل العدد المطلوب من HCها الثابتة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.7 مل. أزل المحلول المثبت واغسل بمحلول PBS يحتوي على 0.1٪ Tween-20 (PBS-T).
    1. لغسل الهيدروجين الكربونية، أزل أكبر قدر ممكن من المثبت الزائد. كن حذرا من عدم إزعاج الهيدروك الكربونية في أسفل الأنبوب. أضف ~1 مل من PBS-T وانتظر بضع ثوان حتى تغوص hCOs إلى قاع الأنبوب قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  2. تخفيف الجسم المضاد الأساسي إلى تركيز مطلوب في محلول التلوين (10٪ مصل العجول لحديثي الولادة، 1٪ DMSO في 0.1٪ PBS-T). أضف 50-100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل أنبوب طرد مركزي دقيق (أو حجم كاف لتغطية جميع كربونات hCOs في كل أنبوب).
  3. احتضن لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية على جهاز هزاز/روكر. قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية الزائدة ثم قم بثلاث غسلات لمدة ساعة واحدة في PBS-T في درجة حرارة الغرفة. قم بغسل نهائي طوال الليل في PBS-T عند 4 درجات مئوية للتأكد من إزالة أي أجسام مضادة زائدة.
  4. قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية إلى تركيز مطلوب في محلول التلوين وإضافة 50-100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل أنبوب طرد مركزي دقيق (أو حجم كاف لتغطية جميع hCOs في كل أنبوب).
  5. حضن hCOs مع الجسم المضاد الثانوي لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية على منصة اهتزاز. قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة ثم قم بثلاث غسلات لمدة ساعة واحدة في PBS-T في درجة حرارة الغرفة. قم بغسل نهائي طوال الليل في PBS-T عند 4 درجات مئوية للتأكد من إزالة جميع الأجسام المضادة الزائدة.
  6. للتصوير بالكامل، قم بنقل hCOs باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر مع قطع طرفها إلى شريحة زجاجية مشحونة بشحنة موجبة. أزل فائض PBS-T وأضف بضع قطرات من وسائط التثبيت لتغطية الهيدروجينات. ضع غطاء بحذر لتسطيح الهيدروجينات.
    ملاحظة: للحفاظ على البنية ثلاثية الأبعاد ل hCO، استخدم حشية مطاطية أو شريط مزدوج الوجه حول حواف الشريحة لرفع ارتفاع انزلاق الغطاء. استخدام وسط تثبيت شفاف يمكن أن يكون مفيدا لتحسين التصوير عبر hCO، خاصة إذا لم يتم تسوية hCO.

4. التقسيم والتضمين

  1. بعد التثبيت، غط الهيدروكرسيد الكربونية بالسكروز بنسبة 30٪ طوال الليلة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية للحماية من التبريد. باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر مع قطع الطرف، انقل العدد المطلوب من hCOها إلى قالب بلاستيكي بحجم 12 مم × 12 مم. قم بإزالة محلول السكروز الزائد بعناية، مع الانتباه لعدم استنشاق الهيدروكوز الكربونية.
    ملاحظة: من المفيد استخدام الماصة بنسبة 30٪ من السكروز صعودا وهبوطا في طرف الماصة قبل النقل لمنع التصاق كربون الماء بجانب الطرف.
  2. أضف قطرة صغيرة من OCT، فقط بما يكفي لتغطية الهيدروجينات. باستخدام زوج من الملقط الدقيق أو طرف الماصة، أعد وضع hCOs بلطف في OCT بحيث لا تتجمع hCOs معا ولا تكون هناك أي hCOها بالقرب من حواف القالب. تأكد من أن جميع كربونات hCOها قريبة قدر الإمكان من قاع القالب بهدف تعظيم عدد hCOها الموجودة في مقطع واحد من التجميد.
  3. جمد هذه الطبقة الأولى من OCT بوضع القالب في مبرد من الستايروفوم مع طبقة من الثلج الجاف في الأسفل. انتظر بضع دقائق حتى يتصلب ال OCT ثم انقل القالب من الثلج الجاف إلى سطح الطاولة. أضف المزيد من OCT حتى يمتلئ القالب. انتظر حتى تذوب الطبقة الأولى من OCT تماما قبل العودة إلى الثلج الجاف.
  4. تخزين الهيدروك المجمدة والمدمجة عند -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للتقسيم.
  5. عندما تكون جاهزا للتقسيم، قم بمحاذاة كتلة hCO بأفضل شكل ممكن وابدأ بقص البلوك. ضع قسما بشكل دوري على شريحة مشحونة وفحص كل قسم بصريا بحثا عن hCO. عند رؤية hCO، تغير إلى مقاطع بحجم 6 ميكرومتر.
    ملاحظة: معدل فقدان كربونات HC أثناء التضمين والتقسيم لا يقل عن 10٪. خطط وفقا لذلك.

5. أقسام TUNEL والأنسجة التي تلوين المناعة

  1. استخدم قلم عنق الرحم لرسم حدود كارهة للماء حول أجزاء الأنسجة التي تحتاج إلى صبغ. أغسل شرائح مرة واحدة في PBS 0.1٪ Tween (PBS-T) لإذابة OCT.
  2. أضف محلول حاجز (10٪ مصل لحديثي العجل، 1٪ DMSO، في PBS-T) لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. حضر محلول الأجسام المضادة الأولية. ابدأ بالتركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة للفلورة المناعية، لكن قد يحتاج التركيز إلى تعديل تجريبي.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إجراء تلوين TUNEL في هذا الوقت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. أزل حاجز الحماية من الشريحة. أضف كمية كافية من محلول الأجسام المضادة الأولية لتغطية أقسام hCO. حضن الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو 3 ساعات عند 37 درجة مئوية. اغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في جرة كوبلين مملوءة ب PBS-T في درجة حرارة الغرفة.
  5. تحضير محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي في محلول حاجز، بما في ذلك DAPI أو علامة نووية أخرى. أضف كمية كافية من محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي لتغطية مناطق hCO. احتضن الحماية من الضوء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل السلايدات ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في جرة كوبلين مملوءة ب PBS-T في درجة حرارة الغرفة. تركيب الغطاء مع الوسط المطلوب للتركيب.

6. قياس التداخل النووي باستخدام CardioCount

ملاحظة: CardioCount هو طريقة تعتمد على التعلم العميق لتقييم نوى CM من صور المجهر40. تم تطوير CardioCount في الأصل لتقييم دورة CM، ويؤدي أداء جيدا مع عدة صبغات نووية، بما في ذلك TUNEL40.

  1. لاستخدام CardioCount، قم بتحميل حزمة CardioCount من GitHub أو استيرادها إلى Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git، https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/، https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). يعمل CardioCount الإصدار 1 على بيئة بايثون 3.
  2. تصدير الصور للقياس كملفات .tif فردية بحجم 512 × 512 بكسل مع قنوات حمراء وزرقاء وخضراء مدمجة، حيث تكون القناة الحمراء علامة نووية CM، والأزرق علامة نووية عامة، والأخضر علامة نووية دورية (أي Ki67) أو علامة الاستماتة (مثل TUNEL). أنشئ مجلد أب في Google Drive لهذه التجربة وارفع ملفات tiff المدمجة كمجلد فرعي.
    ملاحظة: تم تدريب كارديو كاونت على البقع النووية التي تملأ النواة. علامات الدراجة التي تكون أكثر تميزا، مثل أورورا B أو PH3، قد لا تكون متوافقة مع كارديوكونت.
  3. افتح دفتر CardioCount في Google CoLab. شغل Cell 1.1 للتحقق من الوصول إلى وحدة معالجة الرسوميات (GPU). شغل Cell 1.2 لتوصيل CoLab Notebook ب Google Drive.
  4. شغل Cell 1.3 لتحميل CardioCount والتبعيات في Google Colab. قم بتعديل ملف kfile لقراءة اسم المسار إلى حيث تم حفظ مجلد PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries عند تحميله.
  5. في الخلية 2.0، قم بتحرير base_folder لقراءة اسم المسار إلى المجلد الأب الذي يحتوي على المجلد الفرعي للصور المراد تحليله. شغل Cell 2.0 لربط هذا المجلد ب CoLab.
  6. في الخلية 2.1.1، تحرير orig_image_folder لمطابقة اسم المجلد الذي يحتوي على صور للتحليل. عدل channel_to_remove لقراءة اللون الأخضر وتعديل new_image_folder لتسمية المجلد الفرعي تحت base_folder حيث سيتم حفظ جميع الصور التي أزيلت القناة الخضراء (الأحمر/الأزرق). كرر هذه الخطوة لإزالة القناة الحمراء، مع التأكد من تعديل new_image_folder لتمييز المجلد الفرعي الذي يحتوي على صور مع إزالة القناة الحمراء (الأخضر/الأزرق).
  7. في Cell 2.1.2، قم بقص الصور إلى 512 × 512 صورة للصور الحمراء/الزرقاء. تأكد من تطابق uncropped_image_folder الاسم new_image_folder الذي تم إنشاؤه في الخطوة 6.6. للصور الحمراء/الزرقاء. اسم destination_image_folder لتحديد المجلد الفرعي الذي سيتم فيه القص وسيتم حفظ الصور الحمراء/الزرقاء. كرر هذه الخطوة لقص الصور الخضراء/الزرقاء. وأخيرا، كرر هذه الخطوة لقص الtiffs الأصلية ذات القنوات الثلاث والمدمجة الموجودة في base_folder.
  8. شغل Cell 2.2 لتوليد خرائط الاحتمالات. اسم data_specific_folder الصور الحمراء/الزرقاء والأخضر/الزرقاء التي تم إنشاؤها في destination_image_folder من خلية 2.1.2. بالنسبة ل model_dir، أدخل مسار الملف إلى مجلد يحتوي على نماذج التقسيم. لتقسيم النوى الحمراء، استخدم نموذج erg_rb_opt، وأدخل 200 لعصر الحقبة. أعد تسمية probmap_directory_name لتحديد المجلد الذي سيتم فيه حفظ خرائط الاحتمالات الحمراء/الزرقاء. كرر هذه الخطوة للصور الخضراء/الزرقاء. لتقسيم النوى الخضراء، استخدم نموذج edu_mouse_bg_opt، وأدخل 100 لعصر الإيبوك.
  9. في Cell 2.3.1، سيتم إنشاء خرائط الكائنات بناء على الخرائط الاحتمالية التي تم توليدها في الخطوة 6.8. سيتم تسمية input_folder على اسم destination_image_folder من الخلية 2.1.2 التي تحتوي على صور خرائط احتمالية حمراء/زرقاء مولدة في الخلية 2.1.2. حدد output_folder حيث سيتم تخزين الصور الحمراء/الزرقاء المحددة بالعتبة. حدد عتبة لمستوى الثقة في تقسيم النووي (النطاق من 0.0-1.0). شغل سيل 2.3.1. كرر هذه الخطوة للصور الخضراء/الزرقاء.
    ملاحظة: ستكون عتبات مستوى الثقة حول النوى معتمدة على مجموعة البيانات. ابدأ بعتبة 0.9 وعدلها أعلى إذا كانت متساهلة جدا، وأقل إذا كانت صارمة جدا، بناء على الفحص العشوائي لخرائط الاحتمالات.
  10. في الخلية 2.3.2، سيتم عد عدد الخلايا في خرائط الكائنات التي تم إنشاؤها في الخطوة 6.10 وتصديرها إلى ملف .csv. سيتم تسمية count_folder على اسم output_folder من الخلية 2.3.1 حيث تحفظ الصور الحمراء/الزرقاء المحددة بالعتبة. لاستبعاد الأجسام التي تلمس حدود الصورة، تأكد من أن ignore_border_cells يقرأ صحيح. إعادة تسمية csv_path إلى اسم المسار base_folder حيث تخزن جميع المجلدات الفرعية. عدل اسم csv ليعكس أعداد الكائنات الحمراء/الزرقاء. كرر هذه الخطوة للصور الزرقاء/الخضراء.
  11. في الخلية 2.4، سيتم عد النوى المزدوجة الإيجابية الخضراء/الحمراء. أعد تسمية img_folder إلى اسم المجلد الفرعي الذي تم إنشاؤه في الخطوة 6.8 والذي يحتوي على صور مقطوعة بثلاث قنوات. أعد تسمية childcell_folder إلى output_folder من الخلية 2.3.1 حيث تحفظ الصور الحمراء/الزرقاء المحددة بالعتبة. أعد تسمية parentcell_folder إلى output_folder من الخلية 2.3.1 حيث يتم حفظ صور خضراء/زرقاء محددة. إعادة تسمية dest_folder لتحديد المجلد الذي سيتم فيه حفظ خرائط الكائنات الإيجابية المزدوجة. إعادة تسمية csv_path لتعيين اسم المسار واسم الملف إلى base_folder حيث تخزن جميع المجلدات الفرعية وقم بتحرير اسم csv ليعكس أعداد الكائنات الإيجابية المزدوجة.
  12. تحقق من دقة التقسيم بمقارنة الأعداد الحمراء والخضراء والمزدوجة الإيجابية الناتجة لكل صورة مع الصورة الخام.
    1. إذا كان CardioCount يبالغ باستمرار في تقدير عدد النوى في الصورة مقارنة بما قد يعسبه المراجع الأعمى، كرر الخطوة 6.9 مع عتبة ثقة أعلى، وكرر الخطوات من 6.10 إلى 6.11. إذا قلل CardioCount من عدد النوى في الصورة مقارنة بما يعسبه المراجع الأعمى، كرر الخطوة 6.9 مع عتبة ثقة أقل، وكرر الخطوات 6.10-6.11.
  13. نجمع جميع الأعداد لكل hCO للنوى الحمراء، والخضراء، والنوى الموجبة المزدوجة. احسب نسبة النوى الدورية ك (نوى مزدوجة الموجبة / إجمالي نوى CM حمراء) × 100 لكل عضو.

7. إصابة نقص الأكسجين وإعادة الأكسجين

  1. جهز وسط نقص الأكسجين (119 ملليمولار NaCl، 12 ملليمولار KCl، 1.2 ملليمولار NaH2PO4، 1.3 ملليمولار MgSO4، 0.5 ملليمولارMgCl2، 0.9 ملليمولار CaCl2، 20 ملليمول لاكتات الصوديوم، و5 ملليمولار HEPES، الرقم الهيدروجيني = 6.4).
  2. إلى قارورة زراعة الخلايا، انقل 5 مل من وسط نقص الأكسجين لكل صفيحة hCO ببئر 96. ضع قارورة زراعة الخلايا داخل حجرة نقص الأكسجين، واغسل الغاز اللاأكسجي (5٪ ثاني أكسيد الكربون2، 95٪ نيتروجين2) لمدة 3 دقائق. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل بدء نقص الأكسجين.
  3. قم بإزالة جميع الوسائط من HCOs. ابدأ بإزالة ~150 ميكرولتر باستخدام ماصة متعددة القنوات من جميع الآبار. ثم استخدم ماصة بسعة 200 ميكرولتر لإزالة الوسائط المتبقية من الآبار الفردية بعناية، دون إزعاج الهيدروك الكربونية.
    ملاحظة: إزالة جميع الوسائط من جميع الآبار أمر بالغ الأهمية لتحقيق إصابة قابلة للتكرار.
  4. أضف 50 ميكرولتر من وسط نقص الأكسجين إلى كل بئر. ضع لوحة hCO في غرفة نقص الأكسجين واغسله بغاز منخفض الأكسجين (5٪ ثاني أكسيد الكربون2، 95٪ نيترن2) لمدة 3 دقائق. ضع غرفة نقص الأكسجين في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
  5. لبدء إعادة الأكسجين، إزالة hCOs من غرفة نقص الأكسجين، وتغذية 150 ميكرولتر من وسط RB+ المسخن مسبقا. اترك على الأقل 3 ساعات من إعادة الأكسجة عند 37 درجة مئوية قبل إجراء الفحوصات في اتجاه مجرى النهر.

8. اختبار إطلاق إنزيم اللاكتات للهيدروجيناز

  1. اجمع 20 ميكرولتر من الوسائط من آبار الهيدروك المصابة وغير المصابة في النقطة الزمنية المطلوبة بعد بدء إعادة التروية. تخفيف 1:10 في 180 ميكرولتر من مخزن LDH (200 ملليمويل Tris-HCl (درجة حموضة 7.3)، 10٪ جليسرول، 1٪ BSA). خزن عند -20 درجة مئوية حتى يكون جاهزا لإجراء الفحص. ترفع وتنزول عدة مرات لخلط الوسائط قبل الجمع
  2. إذابة الوسائط المجمدة. أضف 45 ميكرولتر من مخزن LDH إلى بئر واحد من جدار أسود، صفيحة ب 96 بئر في القاع الشفاف لكل عينة وسائط سيتم فحصها. أضف 5 ميكرولتر من الوسائط المخففة بنسبة 1:10 لكل بئر للحصول على تخفيف نهائي قدره 1:100. تحضير كاشف LDH عن طريق خلط 50 ميكرولتر من خليط إنزيمات LDH و0.25 ميكرولتر من ركيزة الريديكتاز لكل عينة سيتم اختبارها.
  3. أضف 50 ميكرولتر من كاشف LDH إلى كل بئر يحتوي على وسط مخفف بنسبة 1:100. حضن في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، لمدة 60 دقيقة. اختبار إشارة التوهج الحيوي على قارئ لوحة متوافق.

9. تصوير الكالسيوم

  1. حضر محلول صبغة الكالسيوم باستخدام RPMI-1640 خالي من الفينول الأحمر RPMI-1640، 0.04٪ بلورونيك، و5 ميكرومولار Cal520-AM. حماية العينات من الضوء.
  2. إزالة 100 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر مخصص لتصوير الكالسيوم. أضف 100 ميكرولتر من محلول صبغة الكالسيوم وحضن على حرارة 37 درجة مئوية، محميا من الضوء، لمدة 30 دقيقة.
  3. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر باستخدام صبغة الكالسيوم واستبدله ب 100 ميكرولتر من RPMI-1640 الخالي من الفينول الأحمر الخالي من الفينول. حضن لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية للسماح بغسل الصبغة.
  4. باستخدام مجهر مزود بقدرات التصوير والبث المستمر، ضع لوحة التثبيت فائقة الارتفاع ذات 96 بئر في وضع العمل. مع هدف 10x، حدد قاعدة hCO وراقب التغيرات العابرة Cal520.
  5. التقط تسجيلات لمدة 30 ثانية لعابرات الكالسيوم في درجة حرارة الغرفة. إذا استخدمت المجهر الكونفوكلي، فلن يكون من الممكن التصوير عبر كامل الحمض الكربوني (hCO). اختر مستوى بؤري بالقرب من قاعدة hCO، حيث تظهر حدود الخلايا أثناء انتقالات الكالسيوم.

10. تحليل الكالسيوم العابر (الشكل 3)

  1. يمكن إجراء تحليل عابر الكالسيوم باستخدام مجموعة متنوعة من برامج تحليل الذروة. فيما يلي تعليمات للتحليل باستخدام إضافة Spiky ImageJرقم 41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. أضف خمس مناطق ذات اهتمام بحجم 2 × 2 بكسل (ROIs) إلى مدير العائد على الاستثمار عبر الخلايا المرئية في كل hCO. احرص على عدم تداخل العائد على المؤشرات مع نوى الخلايا أو حدود الخلايا، لأن حركة hCO قد تؤثر على التحليل العابر.
  3. تحت تحليل قياسات > المجموعة، اختر متوسط شدة الرمادي. في مدير العائد على الاستثمار، اختر مقياس متعدد لالتقاط متوسط شدة الرمادي في جميع العائد على العائد وجميع إطارات التسجيل.
  4. احفظ ملف .csv يحتوي على متوسط شدة الرمادي لجميع العائد على الاستثمار. احفظ جميع مواقع العائد على الاستثمار لكل صورة للرجوع إليها لاحقا.
  5. في جدول بيانات جديد، أضف عمودا للوقت(اتقات). احسب الوقت عند كل إطار بقسمة ال 30 ثوث على إجمالي عدد الإطارات، ثم الضرب في عدد الإطارات. احفظ هذا ك.csv محرر.
  6. افتح ملف .csv المعدل في فيجي وافتح إضافة Spiky. تحت خيارات التحليل، اختر معلمات التحليل المطلوبة.
  7. وقت الرسم على المحور X، ومتوسط شدة الرمادي للعائد على الاستثمار #1 على المحور Y. اختر تحليل القمم، وتأكد من التعليق الصحيح للخط الأساسي، وبداية ونهاية الذروة، وسعة الذروة. إذا تم تحديد عدد خاطئ من القمم، قم بتغيير المعلمات في خيارات التحليل، بما في ذلك الحد الأدنى لسعة القمة من القاعدة الأساسية، وابدأ عتبة الذروة حتى ينجح تحديد القمة.
  8. احفظ جميع الملفات الوسيطة. يمكن حساب النبضات في الدقيقة (bpm) بقسمة 60 على متوسط الفترة من الذروة إلى القمة لكل عائد استثمار.
  9. كرر التحليل أعلاه لجميع العائد على الاستثمار لكل hCO.

figure-protocol-3
الشكل 3: تحليل عابر الكالسيوم. (أ) يشير المربع الأحمر إلى الزر الذي يفتح القائمة المنسدلة لاختيار معلمات التحليل. (ب) يشير المربع الأحمر إلى الزر الذي يحدد الوقت (أو الزمن) مقابل متوسط شدة الرمادي من عائد عائد (ROI) داخل hCO غير مصاب ممثل. (ج) يشير المربع الأحمر إلى زر اختيار تحليل الذروة. (د) تحليل ممثل لأثر وذروة الكالسيوم العابر من HCO غير مصاب. المثلثات الحمراء تشير إلى الحد الأقصى للذروة، والمربعات الوردية تمثل أقصى ميل لأعلى ونزول الذروة، والمربع الأخضر يشير إلى بداية الذروة، والمربع الأزرق يشير إلى خط الأساس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اتباع البروتوكول أعلاه يجب أن ينتج عنه مستويات hCOs متكونا جيدا تبدأ في الضرب بين أيام التمايز 7-12 (D7-12). مع نضوج hCOها بعد اليوم 25، من الممكن أن لا تكون الانقباضات التلقائية مرئية دون تصحيح كهربائي. يمكن أن تحدث إصابة H/R في أي وقت بعد بدء تأثير HCOs - عادة ما نجري الإصابة على hCOs بعمر 15 يوما (D15) أو بعدها.

تأكيد الإصابة
مثل احتشاء عضلة القلب البشرية، تؤدي إصابة H/R لفيروس H/R في HCO إلى موت الخلايا. سريريا، يمكن تقييم مدى تلف عضلة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هنا بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد وإصابة HCOs الذاتية التجمع مع H/R. تتميز أمراض القلب الإكغرمية بإعادة تشكيل فسيولوجية مرضية، بما في ذلك موت خلايا عضلة القلب، وإعادة تشكيل الخلايا الليفية، والخلل الكهربائي، والتدهور الوظيفي. تلاحظ هذه الاضطرابات في نظام نموذج hCO، بما في ذلك زيادة مستويات TUNEL+ CMs، وزيادة في إطلاق LDH، وزيادة في مساحة نسيج Vimentin+ ، وتغيرات في التعامل مع الكالسيوم مما يؤدي إلى فقدان التزامن الوظيفي. من المهم أن HCOs لا تظهر دليلا على تجدد الأ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يدعم هذا العمل HL157277 R01 (RK)، وAHA 24PRE1186062 (LP)، وF30 HL175908-01 (LP)، وبرنامج تدريب العلماء الطبيين في جامعة ديوك T32 5T32GM145449-03 (LP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
محلول أكوتازسيغما-ألدرتشA6964-500ML
الجسم المضاد التروبونين T المضاد للقلبأبكامEPR20266
مكمل B-27 (50X)، خالي من المصلجيبكو17504044
مكمل B-27، بدون الإنسولينجيبكوA1895602
قارئ الألواح BioTek Synergy Neo2BioTek
Cal-520، AMAAT Bioquest21131
كارديوكاونت V1مختبر كاراPMID: 38984052
خط الخلية (Homo sapiens، ذكر) - خط DU11 iPSCنواة الخلايا الجذعية بجامعة ديوك
شرائح المجهر المشحون، الزجاج الأبيضVWR89500-496
CHIR 99021توكريس4423
CloneRتقنيات الخلايا الستيمية5888
ألواح كورنينغ الدقيقة ذات التثبيت الشفاف المنخفض جدا بسعة 96 بئرفيشر7007
خزانات الأنابيب القابلة للتخلص من مرة واحدةVWR89094-678
DMEM/F-12، HEPESجيبكو11330057
مجهر إيفوس الفلوريEVOS
مصفوفة الغشاء القاعدة من جيلتريكس ذات عامل نمو منخفض، خالية من LDEV، مؤهلة للخلايا الجذعيةجيبكوA1413302
نشط الإنسان بروتين مؤتلفشركة بيبروتيك إنك/لايف تكنولوجيز120-14E-50UG
IWP-2تقنيات الخلايا الستيمية72124
حمض L-أسكوربك (ACS البلورية/معتمدة)فيشر ساينتيفكA61-100
فأر مضاد فيمنتينDSHBAMF-17b
mTeSR Plusتقنيات الخلايا الستيمية100-0276
ألواح زراعة الخلايا متعددة الجيار – 12 بئرVWR10062-894
بلورونيك F-127سيغما-ألدرتشP2443
ReLeSRتقنيات الخلايا الستيمية100-0483
RPMI 1640 متوسطجيبكو11875119
RPMI 1640 متوسط، بدون فينول أحمرجيبكو11835-030
ثيازوفينتقنيات الخلايا الستيمية72254
مركب O.C.T. من Tissue-Tekساكورا فينتيك الولايات المتحدة الأمريكية (VWR)25608-930
المجهر الكونفوكال القرصي الدوار زايسزايس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bozkurt, B., et al. Heart failure epidemiology and outcomes statistics: A report of the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 29 (10), 1412-1451 (2023).
  2. Groenewegen, A., Rutten, F. H., Mosterd, A., Hoes, A. W. Epidemiology of heart failure. Eur J Heart Fail. 22 (8), 1342-1356 (2020).
  3. Ss, M., et al. 2025 heart disease and stroke statistics: A report of us and global data from the american heart association. Circulation. 151 (8), e41-e660 (2025).
  4. Sebastião, M. J., et al. Bioreactor-based 3d human myocardial ischemia/reperfusion in vitro model: A novel tool to unveil key paracrine factors upon acute myocardial infarction. Transl Res. 215, 57-74 (2020).
  5. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. Human tissue-engineered model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Tissue Eng Part A. 25 (9-10), 711-724 (2019).
  6. Frangogiannis, N. G. Why animal model studies are lost in translation. J Cardiovasc Aging. 2 (2), 22(2022).
  7. Forrest, M. J., et al. Torcetrapib-induced blood pressure elevation is independent of cetp inhibition and is accompanied by increased circulating levels of aldosterone. Br J Pharmacol. 154 (7), 1465-1473 (2008).
  8. Barter, P. J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. New Engl J Med. 357 (21), 2109-2122 (2007).
  9. Wilensky, R. L., et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase a2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development. Nat Med. 14 (10), 1059-1066 (2008).
  10. Investigators, T. S. Darapladib for preventing ischemic events in stable coronary heart disease. New Engl J Med. 370 (18), 1702-1711 (2014).
  11. Debenedittis, P., et al. Coupled myovascular expansion directs cardiac growth and regeneration. Development. 149 (18), dev200654(2022).
  12. Hojo, Y., et al. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am College Cardiol. 35 (4), 968-973 (2000).
  13. Lodrini, A. M., et al. Modeling cardiac injury using human cardiac slices to test therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Eur Heart J. 44 (Supplement_2), ehad655.730(2023).
  14. Arstall, M. A., et al. Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia. J Mol Cell Cardiol. 30 (5), 1019-1025 (1998).
  15. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: At the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev. Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  16. Narsinh, N., Narsinh, K. H., Wu, J. C. Derivation of human induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling. Circ Res. 108 (9), 1146-1156 (2011).
  17. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  18. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  19. Lyra-Leite, D. M., et al. A review of protocols for human ipsc culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 3 (3), 101560(2022).
  20. Hofbauer, P., Jahnel, S. M., Mendjan, S. In vitro models of the human heart. Development. 148 (16), dev199672(2021).
  21. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun. 8 (1), 1825(2017).
  22. Baar, K., et al. Self-organization of rat cardiac cells into contractile 3-d cardiac tissue. Faseb J. 19 (2), 275-277 (2005).
  23. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  24. Kahn-Krell, A., et al. A three-dimensional culture system for generating cardiac spheroids composed of cardiomyocytes, endothelial cells, smooth-muscle cells, and cardiac fibroblasts derived from human induced-pluripotent stem cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 908848(2022).
  25. Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells. J Vis Exp. (175), e63097(2021).
  26. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  27. Jackman, C. P., et al. Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation. Biomaterials. 159, 48-58 (2018).
  28. Deluca, S., et al. Engineered cardiac tissues as a platform for crispr-based mitogen discovery. Adv Healthc Mater. 14 (1), e2402201(2025).
  29. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  30. Schmidt, C., et al. Multi-chamber cardioids unravel human heart development and cardiac defects. Biorxiv. , (2022).
  31. Hoang, P., et al. Engineering spatial-organized cardiac organoids for developmental toxicity testing. Stem Cell Rep. 16 (5), 1228-1244 (2021).
  32. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nat Biomed Eng. 4 (4), 446-462 (2020).
  33. Abdallah, H., Toomey, K., O'riordan, A. C., Davidson, A., Marks, L. A. Familial occurrence of discrete subaortic membrane. Pediatr Cardiol. 15 (4), 198-200 (1994).
  34. Lin, H., McBride, K. L., Garg, V., Zhao, M. T. Decoding genetics of congenital heart disease using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). Front Cell Dev Biol. 9, 630069(2021).
  35. Keung, W., et al. Human cardiac ventricular-like organoid chambers and tissue strips from pluripotent stem cells as a two-tiered assay for inotropic responses. Clin Pharmacol Ther. 106 (2), 402-414 (2019).
  36. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3d bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).
  37. Marini, V., et al. Long-term culture of patient-derived cardiac organoids recapitulated duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy and disease progression. Front Cell Dev Biol. 10, 878311(2022).
  38. Mills, R. J., et al. Drug screening in human psc-cardiac organoids identifies pro-proliferative compounds acting via the mevalonate pathway. Cell Stem Cell. 24 (6), 895-907.e6 (2019).
  39. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), E8372-E8381 (2017).
  40. Karpurapu, A., et al. Deep learning resolves myocardial dynamics in the failing human heart. JACC Basic Transl Sci. 9 (5), 674-686 (2024).
  41. Pasqualin, C., et al. Spiky: An imagej plugin for data analysis of functional cardiac and cardiomyocyte studies. J Imaging. 8 (4), 95(2022).
  42. Kuppe, C., et al. Spatial multi-omic map of human myocardial infarction. Nature. 608, 7924(2022).
  43. Karra, R., et al. Vegfaa instructs cardiac muscle hyperplasia in adult zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (35), 8805-8810 (2018).
  44. Ab, A., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. J CliniInvest. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  45. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. Elife. 6, e25605(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hypoxia ReoxygenationCardiac OrganoidsHuman CardioidsIschemia ReperfusioniPSC Derived OrganoidsSuspension CultureCryosectioningFluorescence MicroscopyScar FormationCardiomyocyte Apoptosis

Related Articles