يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس إنتاج أكسيد النيتريك في زراعات خلايا ظهارية في القصبة الهوائية في الفأر التي تم تمايزها عند واجهة سائل الهواء

129 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70311

⸱

يوليو 3, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس إنتاج أكسيد النيتريك (NO) في الثقافات الطهارية في مجرى الهواء المميز عند واجهة الهواء والسائل (ALI) عن طريق قياس النيتريت في الإفرازات القمية باستخدام اختبار كيميائي متلألئ قائم على ثلاثي الإيوديد.

الملخص

توفر الزراعة الظهارية في مجرى الهواء التي تمايزها عند واجهة الهواء-السائل (ALI) نموذجا فسيولوجيا ذا صلة لدراسة إشارات أكسيد النيتريك (NO) في الخلايا المهدبة. هنا، نصف بروتوكولا لقياس إنتاج NO عن طريق قياس النتريت (NO₂⁻)، وهو ناتج أكسدة مستقر ل NO، في عينات مأخوذة من خلايا ظهارة القنابة الهوائية الممزوجة ب ALI. يتم جمع وتحليل الغسولات القمية، والوسطات القاعدية، ومحللات الخلايا باستخدام اختبار تلألؤ كيميائي قائم على ثلاثي اليوديد مرتبط بمحلل أكسيد النيتريك (NOA). عند الحقن في وعاء التفاعل، يتم تقليل النيتريت كيميائيا إلى NO، والذي يتم اكتشافه بواسطة التلميض الكيميائي القائم على الأوزون. يتم قياس شدة الإشارة وتحويلها إلى بيكومولات للنيتريت باستخدام منحنى معايرة قياسي، ويتم تطبيع القيم إلى إجمالي محتوى البروتين الخلوي. يتم التحقق من أداء الاختبار باستخدام التعديل الدوائي لمستويات NO. عند العلاج بمثبط NO المتبرع ديثيلينيتريامين نونووات (DETA-NONOate) ومثبط NO سينثاز N(ω)-نيترو-إل-أرجينين ميثيل إستر (L-NAME)، لاحظنا فروقا كبيرة في مستويات النتريت عبر الحالات. تلاحظ الإشارة الأكثر قوة وقابلية للتكرار في الغسولات القمة، والتي تتوافق مع كمية NO المنبعثة من ظهارة مجرى الهواء. تكتشف هذه الطريقة بشكل موثوق NO في عينات من ظهارة مجرى الهواء المتمايزة بواسطة ALI، مما يوفر منصة دقيقة في المختبر لقياس إنتاج NO ونمذجة الأمراض المرتبطة بعدم الأيض غير الطبيعي.

المقدمة

من سمات عدة أمراض مجرى الهواء، بما في ذلك الربو، ومرض انسداد الرئة المزمن (COPD)، والتليف الكيسي (CF) وخلل الحركة الهدبي الأولي (PCD)، هو التوازن الداخلي المتغير لأكسيد النيتريك (NO) الذي يمكن قياسه كتغيرات في مستويات NO عند الزفير، والتي يمكن أن تختلف بشكل كبير في هذه الأمراض، حيث ترتفع في مرض الانسداد الرئوي المزمن والربو 1,2، بينما تنخفض بشكل كبير في CF وPCD3. 4. تظهر هذه الأمراض عادة تشوهات في الأهداب الحركية الظهارية في مجرى الهواء الهوائي، وهي العوامل الرئيسية لتنظيف المخاط الهدب5. نظرا لأن NO ومسارات الإشارة اللاحقة الخاصة به هما منظمان حاسمان لحركة الهدب، فإن فهم كيفية تغير إنتاج NO والإشارات في هذه السياقات أمر ضروري لتوضيح آليات خلل الوظائف المخاطية الهدبية. وبالتالي، فإن طريقة تتيح الكشف الدقيق عن إنتاج وإطلاق NO في ظهارة مجرى الهواء توفر أداة قيمة لتحليل تنظيم ودور هذا الجزيء الفسيولوجي. تعد هذه الأساليب مفيدة بشكل خاص في البيئات التجريبية حيث يكون القياس المباشر ل NO تحديا بسبب عمره النصفي القصير وسرعة تفاعله.

ينظم NO تكوين وأهداب مجرى الهواء ووظائفها من خلال التأثير على قطبية الخلايا المهدبة والضرب المنسق للأهدابالمتحركة 6,7,8. ومع ذلك، لا تزال الآليات التي تحافظ على عدم وجود توازن داخلي في الممرات الهوائية غير مفهومة بشكل كامل. توفر الزراعة الظهارية في مجرى الهواء المميزة عند واجهة الهواء والسائل (ALI) نظاما مفيدا في المختبر للتحقيق في هذه الآليات. حاليا، يستخدم هذا النموذج على نطاق واسع لدراسة تأثير الإصابات البيئية على ظهارة مجرى الهواء 9,10,11 ولتوضيح الفيزيولوجيا المرضية لأمراض مجرى الهواء12. مقارنة بالثقافات المغمورة التقليدية13،14، تعيد الظهارة المتمايزة ب ALI إنتاج بنية ووظيفة مجرى الهواء الأصلي بدقة أكبر، بما في ذلك استقطاب الظهارة، والتمايز المخاطي الهدبي، والتبادل الواقعي بين الغاز والسائل، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص لدراسة إطلاق NO القمي، والإشارات، والوظائف الهدبية ذات الصلة. لذلك فهذا النظام مناسب جدا للتجارب التي تهدف إلى قياس المستقلبات المشتقة من NO المنبعثة إلى تجويف مجرى الهواء، خاصة في ظروف التمايز الطلائي أو التلاعب الدوائي.

القياس الدقيق لتركيز NO أمر ضروري، حيث أن مستويات NO الزائدة والمنخفضة يمكن أن تؤثر على وظيفة الهدب. حاليا، الطرق المعتمدة على المجسات الفلورية (مثل الديامينوفلورسينات، DAFs) المتاحة للكشف عن NO هي شبه كمية فقط وتقتصر على حساسية الرقم الهيدروجيني والاعتماد على الأكسجين ونقص النوعية، حيث يمكنها التفاعل مع المؤكسدات الخلوية ومضادات الأكسدة، مما يؤدي إلى قياسات شبه كمية15. بالإضافة إلى ذلك، تتيح أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية (مثل الأقطاب الأمبيرومترية غير الحساسة) الكشف في الوقت الحقيقي ل NO16، لكنها قد تكون صعبة التنفيذ في الأنظمة البيولوجية المعقدة بسبب عدم وجود عمر نصفي قصير، والتداخل الناتج عن تلوث الأنواع النشطة بالأكسدة والاختزال على سطح القطب، والتحديات في الحفاظ على استقرار المعايرة17. تم أيضا وصف طرق بديلة تعتمد على التلوين الكيميائي، بما في ذلك الكشف المباشر عن NO بطور الغاز والاختبارات الاختزالية التي تستهدف أنواعا مختلفة من أكسيد النيتروجين، لكن تطبيقها على زراعة ظهارة الممرات الهوائية لا يزال غير مستكشف. تسلط هذه القيود الضوء على الحاجة إلى طرق كمية حساسة يمكنها اكتشاف مستويات منخفضة من الأنواع المشتقة من NO بشكل موثوق في عينات بيولوجية صغيرة الحجم. لتجاوز هذه القيود، أنشأنا بروتوكولا لقياس NO في الإفرازات القمية التي تم جمعها من ظهارة مجرى الهواء المتمايزة بواسطة ALI باستخدام محلل أكسيد النيتريك (NOA). يعد NOA كاشفا يعتمد على الإضاءة الكيميائية عالي الحساسية ويستخدم تقليديا لقياس NO من المستقلبات في العينات الكيميائية، وقد تم تكييفه مؤخرا لتحليل العينات البيولوجية، بما في ذلك الدم والأنسجة المتجانسة ومكونات زراعة الخلايا 7,18,19. NO هو جزيء إشارات تفاعلي للغاية يتأكسد بسرعة إلى نيتريت في الأنسجة تحت ظروف مستويات أكسجين طبيعية، مع عمر نصف قصير للغاية. لذا، فإن النتريت كمنتج نهائي لأكسدة لا توجد مؤشر على إجمالي إنتاج NO في الأنظمة البيولوجية 20,21,22. تسمح هذه الطريقة الحساسة والقابلة للتكرار للضوء الكيميائي بالكشف عن النيتريت/NO عند مستويات البيكومولار23,24، مما يجعلها مثالية لقياس التغيرات الصغيرة في العينات البيولوجية منخفضة الحجم مثل تلك المشتقة من مزارع ALI في MTEC. ومع ذلك، فإن هذا النهج مناسب بشكل أفضل للظروف التي يعكس فيها تراكم النيتريت إنتاج NO حديثا وقد يتأثر بعوامل مثل التعامل مع العينة، وتلوث النيتريت في الخلفية، وحالة التمايز الظهاري. لذلك، هناك حاجة إلى ضوابط مناسبة وتصميم تجريبي دقيق لضمان تفسير دقيق للنتائج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع إجراءات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ماريلاند (بروتوكول # AUP–00004632).

ملاحظة: يتطلب البروتوكول حوالي يومين لعزل خلايا القنبة الهوائية (MTEC)، تليها 7–10 أيام للتوسع، 5–6 أيام للتكاثر في الإدخال عبر البئر، 21 يوما للتمايز (الوقت اللازم لاكتساب عدد كاف من الخلايا متعددة الأهداب)، 24 ساعة من العلاج الدوائي ويوم إضافي لجمع العينات، معايرة NOA. الحقن وجمع البيانات.

1. إعداد الوسائط والحلول

ملاحظة: راجع الجدول 1 لمزيد من التفاصيل حول مكونات الوسائط.

  1. وسائط هام F–12
    1. جهز المحلول داخل غطاء تدفق طبقي معقم. أضف 5 مل من مضادات حيوية 100× البنسلين/ستريبتوميسين و0.5 مل من أمفوتيريسين B (فطريزون) إلى 500 مل من وسط F12 من Ham's في زجاجة معقمة.
    2. اخلط عن طريق قلب الزجاجة بلطف 5–10 مرات لضمان الخلط الكامل. قم بتعقيم المحلول باستخدام فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر تحت ظروف معقمة، وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
      تحذير: البنسلين/الستربتوميسين والأمفوتيرسين B هما عاملان مضادان للميكروبات قد يسببان تهيجا أو ردود فعل تحسسية. تعامل مع استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر.
  2. محلول برونازي
    1. أضف 15 ملغ من البروناز إلى 10 مل من وسط Ham's F12 المعقم في أنبوب معقم للحصول على محلول برونازي بنسبة 0.15٪. اخلط بعكس أو استخدام الأنابيب بلطف حتى يذوب البرونازي بالكامل. حضر طازجا مباشرة قبل الاستخدام.
  3. حل DNase I
    1. أضف 5 ملغ من DNase البنكرياس الخام I إلى 9 مل من وسط Ham's F12 و1 ملغ من محلول ألبومين مصل البقر (BSA) بوزن 10 ملغ/مل في أنبوب معقم للحصول على محلول DNase I بقوة 0.5 ملغ/مل.
    2. اخلط بلطف عن طريق الرش صعودا وهبوطا حتى يذوب DNase I بالكامل، مع تجنب تكون الفقاعات. بعد الذوبان الكامل، قم بتقسيم المحلول إلى أنابيب طرد مركزية دقيقة معقمة بحجم 1 مل وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  4. وسط F12 من Ham مع مصل البقر الجنيني (FBS)
    1. حضر المحلول في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء تدفق صفائحي معقم. أضف 10 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) إلى 40 مل من وسط F12 الخاص بهام مع مضادات حيوية في أنبوب مخروطي معقم للحصول على 20٪ FBS في وسط F12.
    2. اخلط بلطف عن طريق قلب الأنبوب 5–10 مرات حتى يصبح المحلول متجانسا. قم بتعقيم المحلول باستخدام فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر تحت ظروف معقمة، وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  5. وسائط التوسعة MTEC
    1. جهز وسط التمدد MTEC في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء تدفق طبقي معقم عن طريق دمج المكونات المدرجة في الجدول 1 في زجاجة معقمة.
    2. اخلط جيدا عن طريق تدوير أو عكس الحاوية بلطف حتى تندمج جميع المكونات بالكامل. تعقيم المحلول باستخدام مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر في ظروف معقمة.
    3. أضف مثبط ROCK Y–27632 (محلول مخزون 5 ملليمول) إلى تركيز نهائي 10 ميكرومول، ومثبط نوتش γ–سيكرتازي DAPT (محلول مخزون 10 ملليمول) إلى تركيز نهائي 5 ميكرومولار مباشرة قبل الاستخدام، وامزجه بلطف عن طريق الانعكاس.
  6. وسائط انتشار MTEC
    1. جهز وسط انتشار MTEC في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء تدفق سطحي معقم عن طريق دمج المكونات المدرجة في الجدول 1.
    2. اخلط جيدا عن طريق الانقلاب اللطيف أو الدوران حتى تندمج جميع المكونات بالكامل. قم بتعقيم الوسط باستخدام فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر في ظروف معقمة.
    3. قبل الاستخدام مباشرة، أضف مثبط الصخور Y–27632 (محلول مخزون 5 ملمولار) إلى تركيز نهائي 10 ميكرومولار وحمض الريتينويك (محلول مخزون 5 ميكرومول) إلى تركيز نهائي 0.05 ميكرومول. اخلط بلطف عن طريق العكس قبل الاستخدام.
  7. وسائط التمايز MTEC
    1. تحضير وسط التمايز MTEC في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء تدفق رقائي معقم عن طريق دمج المكونات المدرجة في الجدول 1 في حاوية معقمة.
    2. اخلط جيدا عن طريق الانقلاب اللطيف أو الدوران حتى تندمج جميع المكونات بالكامل. قم بتعقيم الوسط باستخدام فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر في ظروف معقمة.
    3. قبل الاستخدام مباشرة، أضف حمض الريتينويك إلى تركيز نهائي 0.05 ميكرومولار وامزجه بلطف عن طريق الانعكاس.

2. عزل خلايا القهوة الهوائية للفئران (MTEC)

  1. قتل ثلاثة فئران بالغة (عمرها 8–20 أسبوعا) عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO 2) في غرفة القتل الرحيم المعتمدة وفقا لإرشادات IACUC المؤسسية. تأكيد الوفاة قبل جمع الأنسجة.
  2. ضع الحيوان من الظهر (الصدر مواجه للأعلى) على سطح معقم. باستخدام ملقط نظيف، ارفع الجلد بلطف وافتحه بمقص جراحي من الشفة السفلية إلى البطن لكشف القصبة الهوائية.
  3. حرك الغدد اللعابية جانبا وقم بإزالة النسيج الضام وعضلة القصبة الهوائية لكشف حلقات الغضروف. قم بتشريح طول القصبة الهوائية بالكامل وضعه في طبق بتري يحتوي على هامز F12 المتوسط المعقم. اجمع ثلاث قصبات في طبق واحد.
  4. انقل الطبق إلى غطاء تدفق طبقي وضع القصبة الهوائية على طبق آخر يحتوي على لحم هامز F12 الطازج المتوسط. قم بإزالة أي نسيج خارج القصبة الهوائية واقطع القصبة الهوائية طوليا عبر التلومين.
  5. انقل جميع القصبات الهوائية إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل يحتوي على محلول بروناز معقم بقوة 10 مل بنسبة 0.15٪. الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 16–18 ساعة.

3. عزل الخلايا والتوسع الأولي

  1. في اليوم التالي، قلب الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة 10–15 مرة لإزالة الخلايا الطهارية وحضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. أوقف تفاعل النبرة بإضافة 10 مل من وسط هام يحتوي على 20٪ FBS وامزجه بعكس 10–15 مرة.
  2. أضف 10 مل من أنابيب Ham's F12 مع FBS إلى ثلاثة أنابيب بسعة 15 مل. باستخدام ماصة باستور، يتم نقل نسيج القصبة الهوائية بشكل متسلسل من أنبوب 50 مل إلى الأنبوب الأول والثاني والثالث بحجم 15 مل، ثم قلب 10–15 مرة في كل أنبوب لتحريك خلايا القهوة الظهارية. تخلص من النسيج بعد النقل النهائي.
  3. اجمع الوسائط الكاملة من الأنابيب المخروطية الثلاثة بسعة 15 مل مع الوسط في أنبوب 50 مل. الطرد المركزي عند 360 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الفائقة بحذر وأضف 0.5 مل من محلول DNase I بتركيز 0.5 ملغ/مل. حضن الزراعة على الثلج لمدة 5 دقائق.
  4. الطرد المركزي عند 360 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق حبيبة الخلية في وسط تمدد MTEC بمقدار 7–10 مل.

4. التوسع والتمايز في MTEC

  1. جهز قارورة زراعة خلايا مغطاة بالكولاجين باستخدام 10 مل من الكولاجين I (ذيل الجرذ) عند 50 ميكروغرام/مل، وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 16–18 ساعة. استنشق محلول الكولاجين من قارورة T75 واغسل القارورة ثلاث مرات باستخدام PBS (1×). دع القارورة تجف تماما.
  2. يتم زرع تعليق الخلية المكون من 7–10 مل من وسط تمدد MTEC الذي يحتوي على الخلايا في قارورة مغطاة بالكولاجين. ضع القارورة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2. استبدل وسط التمدد كل يومين أو ثلاثة وراقب عدد الخلايا حتى تصل نسبة التقاء 70٪.
  3. عند التقاء بنسبة 70٪، أضف 1 مل من محلول أكوتاز وحضن لمدة 10–15 دقيقة عند 37 درجة مئوية لفصل طبقة الخلية الأحادية. أعد تعليق الخلايا في وسط تكاثر MTEC بحجم 10 مل. الطرد المركزي عند 1057 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. تخلص من الفائق، وأعد تعليق الخلايا في وسط التكاثر، وعد الخلايا.
  5. البذور 2 × 105 خلايا بحجم 0.5 مل لكل إدخال عبر (قطر غشاء 12 مم، حجم مسام غشاء 0.4 ميكرومتر) مطلية مسبقا بالكولاجين. أضف 1.5 مل وسط إلى الحجرة القاعدية لكل إدخال ووضع الأنبوب العرضي في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  6. غير الوسط في كل من الحجرة القمية والقاعدية في اليوم الثالث ودع الخلايا تصل إلى 100٪ من التلاصق، عادة في اليوم الخامس أو السادس. أضف إدخالا واحدا بدون خلايا كعنصر تحكم.
  7. عند التقارب، اغسل الخلايا في القمة بحجم 0.5 مل من وسط تمايز MTEC. ابدأ التفاعل بين الهواء والسائل (ALI) بإضافة 0.75 مل من وسط التمايز إلى الحجرة القاعدية فقط، مما يترك الخلايا في الحجرة القمية مكشوفة للهواء.
  8. كل يومين إلى ثلاثة، اغسل الخلايا في السطح القمي بوسط تمايز واستبدل الوسط القاعدي. اسمح للخلايا بالتمايز عند ALI لمدة 21 يوما.

5. وضع العلامات المناعية والتصوير لخلايا الظهارة المهدبة

  1. في اليوم 7 و14 و21 في ALI، ثبت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهايد (PFA).
  2. إجراء تصنيف مناعي للخلايا التي تحتوي على أجسام مضادة ل-FoxJ1 للكشف عن FoxJ1، وهو عامل نسخ ضروري لتكوين الأهداب المتحرك25,26، والأجسام المضادة α-tubulin المضادة للأسيتيلة للكشف عن α–tubulin الأسيتيلي، وهو علامة هيكلية للأهداب المتحركة وفقا للبروتوكولات المنشورة 27,28,29.
    تحذير: PFA مادة كيميائية خطيرة، لذا ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات نيتريل ومعطف مختبر على الأقل) عند تثبيت الخلايا.
  3. التقاط صور للخلايا المميزة بالمناعة باستخدام المجهر الكونفوكالي باستخدام هدف 40× أو 60×. اجمع مكدسات Z تمتد على عمق 10 ميكرومتر مع حجم كل خطوة 0.5 ميكرومتر.
  4. اضبط قدرة الليزر، وكسب الكاشف، وإعدادات التعريض لتجنب تشبع الإشارة والحفاظ على معاملات اكتساب مماثلة عبر العينات.
  5. قم بقياس الخلايا الإيجابية لفوكس جي 1 أو التوبولين الموجبة للأسيتيلات كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا (DAPI–إيجابية) لكل منطقة اهتمام (ROI) باستخدام إضافة عداد الخلايا في برنامج تصوير FIJI.
  6. في برنامج GraphPad Prism (الإصدار 10.0)، يقوم بإنشاء الرسوم البيانية وإجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t الطالب ذو الذهاب بعد تقييم توزيع البيانات للطبيعية باستخدام اختبار شابيرو-ويلك.

6. العلاج الدوائي لظهارة مجرى الهواء المتمايزة

  1. في اليوم الحادي والعشرين من ALI حضر وسط تمايز (3 مل للخلايا في ثلاث إدخالات) في أنبوب معقم في درجة حرارة الغرفة.
  2. أضف 7.5 ميكرولتر من ديثيلين تريامين–نونوات أو DETA/NO من محلول مخزن 100 ملليمول (معد في 10 ملليمولار NaOH) إلى وسط التمايز لتحقيق التركيز النهائي 250 ميكرومولار في 3 مل. اخلط بلطف عن طريق الانقلاب واستخدم فورا.
  3. أضف 750 ميكرولتر من المحلول النهائي إلى كل من الحجرات القاعدية الثلاث للخلايا المتمايزة وحضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  4. جهز 1 مللي مولار من Nω-Nitro-L-أرجينين ميثيل إستر (L–NAME) بإضافة 30 ميكرولتر من محلول L-NAME المخزن بحجم 100 ملليمتر (المحضر في DMSO) إلى وسط التمايز MTEC ليصبح الحجم الإجمالي 3 مل.
  5. أضف 750 ميكرولتر من المحلول النهائي إلى كل من الغرف القاعدية الثلاث وحضانة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  6. أضف 30 ميكرولتر من كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO) فقط (المجموعة غير المعالجة) إلى 3 مل من وسط القاعدة (1٪ v/v).
  7. أضف 750 ميكرولتر من المحلول النهائي في الحجرة القاعدية المكونة من ثلاثة إدخالات (غير معالجة).

7. جمع العينات

ملاحظة: لتحليل NOA من الضروري تجميع عينات الوسط، والغسل القمي، وعينات تحليل الخلايا من ثلاث إدخالات.

  1. في اليوم الثاني والعشرين من ALI، اجمع عينات من ظهارة مجرى الهواء المتمايزة بدءا من 750 ميكرولتر من الوسط القاعدي من كل من ثلاثة إدخالات لكل مجموعة تجريبية.
  2. اجمع وسط قاعدي محتضن في إدخالات بدون خلايا ليكون بمثابة تحكم فارغ يأخذ في الاعتبار احتمال تلوث النيتريت الخارجي.
  3. اجمع الوسط القاعدي من ثلاث إدخالات وخزنها فورا عند -20 درجة مئوية حتى الحقن في NOA.
  4. لجمع النتريت/NO الموجود في مخاط الظهارة القمة، أضف 50 ميكرولتر من محلول PBS المسخن مسبقا (1×) (معقم، مجمع ومجمد) فوق الخلايا في كل إدخال وحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خلال فترة حضانة الخلايا التي تحتوي على PBS لمدة 30 دقيقة لجمع الغسل القمي، يمكن أيضا إضافة PBS في الحجرة الأساسية للحفاظ على الترطيب على جانبي الخلايا.
  5. اجمع PBS الذي يحتوي على المخاط فوق الظهارة.
  6. تجميع غسلات PBS من ثلاث إدخالات للحصول على حوالي 150 ميكرولتر من مخاط/PBS القمي من كل حالة تجريبية، وهو ما يكفي لحقنتين في NOA.
  7. تخزين عينات الغسيل القمي عند -20 درجة مئوية حتى استخدام إضافي.
  8. كما خزن مخزن الغسيل PBS لاستخدامه كتحكم فارغ أثناء حقن NOA.
  9. اغسل الجانبين القمي والقاعدي للخلايا في ثلاث إدخالات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS المسخن مسبقا مرتين.
  10. أضف 500 ميكرولتر من محلول أكوتاز في القمة واحتضن لمدة 15–20 دقيقة حتى تنفصل الخلايا تماما عن الأغشية.
  11. بمجرد الفصل الكامل، أضف وسط RPMI-1640 الخالي من المصل إلى الخلايا (بنسبة 3:1 وسط إلى أكيوتاز).
  12. تجميع الخلايا المنفصلة من الثلاثة إدخالات في أنبوب واحد.
  13. قم بتدوير الخلايا على حرارة 3000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  14. أعد تعليق حبيبة الخلية في محلول تحلل بسعة 50 ميكرولتر (محلول RIPA + Halt 1× كوكتيل مثبط بروتياز) وحضن على الثلج لمدة 45 دقيقة.
  15. قم بتدوير الليزات عند 14,800 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية واجمع السوبرناتانت.
  16. استخدم 3 ميكرولتر من ليزات الخلايا الكاملة لتحديد تركيز البروتين من خلال اختبار حمض البيسينشونينيك (BCA).
  17. قم بتخفيف محلول اللايزات المتبقي بنسبة 1:1 في مخزن RIPA لصنع حجم كاف لحقنتين بحجم 50 ميكرولتر من NOA.
  18. تخزين المحللات عند -80 درجة مئوية حتى يتم حقنها في NOA عند -20 درجة مئوية.
  19. تخزين مخزن RIPA المستخدم لإعادة تعليق حبيبات الخلية عند -20 درجة مئوية ليستخدم كوحدة تحكم في التلوث لعينات الليزات.

8. معايرة NOA وحقن العينات

  1. تحضير كاشف ثلاثي اليوديد عن طريق إذابة 400 ملغ من يوديد البوتاسيوم و250 ملغ من اليود في 28 مل من حمض الخليك الجليدي و8 مل من الماء فائق النقي.
  2. قم بتحضير كاشف الثلاثي يوديد باستخدام غطاء بخار كيميائي باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، القفازات، وحماية العين).
    تحذير: اليود وحمض الخليك الجليدي خطير ويمكن أن يسبب تهيج وتآكلا للجلد والعينين.
  3. خزن في درجة حرارة الغرفة واستخدم خلال أسبوعين من التحضير.
  4. حضر محلول مخزون بحجم 1 ملليمتر من نتريت الصوديوم في ماء خال من النتريتات.
  5. احتفظ بمحلول المخزون عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. تحضير معايير عمل جديدة (0.125–4.0 ميكرومتر) في PBS مباشرة قبل الحقن.
    ملاحظة: لمعايرة NOA، استخدم PBS معقم ومغلف بإحكام لتقليل تلوث النيتريت.
  7. شغل غاز النيتروجين (N2) الحامل وابدأ تدفق الغاز عبر النظام.
  8. قم بتجميع وعاء تطهير الزجاج وأضف 4 مل من مادة التريوديد إلى الوعاء مع 20 ميكرولتر من مضاد الرغوة مخفف بنسبة 1:10.
  9. أغلق الحاجز الأنفي مثبتا بواسطة غطاء المسمار لضمان إغلاق الهواء.
  10. صب 10 مل من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) في مصيدة NaOH.
  11. على شاشة العرض لجهاز NOA (nCLD 88) اختر القياس، اختيار الغاز، والمدى.
  12. ضبط الجهاز على MR2:50.00، وهو ما يتوافق مع نطاق قياس يتراوح بين 0 و50 جزء في مليار من NO، واختر Fast لإعداد الفلتر.
  13. اضبط ضغط غاز النيتروجين حتى يستقر ضغط المفاعل بين 27–29 رطل لكل بوصة مربعة (186–200 كيلو باسكال).
  14. افتح برنامج مخطط eDAQ على الكمبيوتر المتصل ب NOA.
  15. اضبط نطاق الاستحواذ على 10/ثانية والجهد على 10 فولت.
  16. انتقل إلى إعدادات الإعداد > القناة، اختر القناة 1.
  17. اضبط مقياس العرض على 2:1 في برنامج NOA.
  18. ابدأ جمع البيانات على أداة NOA وفي البرنامج.
  19. راقب الوضع الأساسي حتى يستقر.
  20. حقن 10 ميكرولتر من PBS عبر الحاجز في وعاء التطهير باستخدام حقنة هاميلتون للتأكد من ثبات القاعدة.
  21. سجل إشارة الإضاءة الكيميائية لكل حقن.
  22. حقن 10 ميكرولتر من معيار النتريت 0.125 ميكرومولار في وعاء التطهير.
  23. كرر ذلك مرتين لكل معيار نيتريت، للحصول على قياسات مكررة سيتم قياسها لاحقا.
  24. ضع ملاحظة على كل حقن في تبويب التعليق (مثلا، 10 ميكرولتر 0.5 ميكرومولار نتريت).
  25. امسح الحقنة على نسيج خال من الوبر واشطفه 3–4 مرات بماء معقم خالي من النيتريت لإزالة التريوديد الزائد.
  26. كرر هذه الخطوة بعد كل حقنة.
  27. السماح للإشارة بالعودة إلى الوضع الأساسي بين الحقن (20–30 ثانية).
  28. افتح نافذة تحليل التدفق .
  29. راجع ارتفاع الذروة وقيم الوقت لكل حقنة في جدول التحليل.
  30. قم بتحديد كل قمة وضبط الاختيار لحساب المساحة تحت المنحنى (AUC).
  31. قم بتبديل الشاشة من S إلى C لتفعيل وضع المعايرة.
  32. أدخل كميات النيتريت المعروفة لكل معيار في عمود المبلغ .
  33. انقر على زر منحنى المعايرة لإنشاء المنحنى القياسي.
  34. تحقق من أن منحنى المعايرة يفي بمعايير القبول (R2 ≥ 0.99).
  35. إذابة العينات البيولوجية التي جمعت سابقا من مزارع ALI على الجليد.
  36. حقن 50 ميكرولتر من وسط خال من الخلايا الفارغة في وعاء التنقية.
  37. حقن 50 ميكرولتر من كل عينة وسط قاعدي في وعاء التطهير.
  38. سجل إشارة التوألؤ الكيميائي لكل حقنة.
  39. قم بإجراء حقن مكررة (50 ميكرولتر لكل عينة) لكل عينة.
    ملاحظة: حقن 50 ميكرولتر تؤدي إلى تكون فقاعات متكررة. للحد من هذه المشكلة، استبدل مادة التريوديد بمضاد الرغوة في وعاء التطهير بانتظام.
  40. ضع تعليقات على كل عينة في تبويب التعليقات قبل الحقن.
  41. حقن 50 ميكرولتر من PBS الخالي من الخلايا (فراغ قمي) في وعاء التنقية.
  42. حقن عينات الغسيل القمي (حقنتان بسعة 50 ميكرولتر لكل عينة) وتسجيل قمم الإشارة المقابلة.
  43. حقن مخزن RIPA مرتين، تليها عينات من الليزيات (حقنتان بسعة 50 ميكرولتر لكل عينة) وتسجيل ذروات الإشارة المقابلة.
    ملاحظة: دائما اسمح لأثر الإضاءة الكيميائية بأن يصل إلى خط الأساس ويستقر. انتظر 20–30 ثانية، ثم حقن العينة التالية.
  44. في نهاية حقن العينات، افتح نافذة تحليل التدفق .
  45. حدد كل قمة عينة لحساب المساحة تحت المنحنى (AUC).
  46. تحديد تركيزات النيتريت لكل عينة باستخدام منحنى المعايرة الناتج عن المحاليل القياسية.

9. جمع البيانات، وتطبيعه، وتحليلها

  1. تصدير البيانات، بما في ذلك ارتفاع الذروة (V)، المساحة تحت المنحنى (V.s)، والمساحة المتوسطة تحت المنحنى من دالة تحليل التدفق في برنامج eDAQ، إلى ملف Excel. الملف المصدر سيحدد ارتفاع (V) مقابل زمن (أو ث) لتتبع الإشارة لتجربة NOA بأكملها.
  2. حدد عدد البيكومولات (pmol) للنيتريت المحقون في NOA عن طريق ضرب تركيز النيتريت (μM) في حجم الحقن (μL).
  3. متوسط متوسط البيكومولات (pmol) للنيتريت المقاسة في الضوابط (وسائط خالية من الخلية، مخزن غسيل PBS أو مخزن RIPA).
  4. اطرح القيم المقابلة للتحكم من PMOL المقاسة في كل حقن عينة بسعة 50 ميكرولتر.
  5. تحديد إجمالي البيكومولات (pmol) للنيتريت في كل عينة عن طريق ضرب كمية ال pmol المقاسة في الجزء المحقون من العينة في حجم العينة الكلي المجمع. استخدم 750 ميكرولتر للوسط، و150 ميكرولتر للغسيل القمي، وحوالي 90–100 ميكرولتر للليزات.
  6. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للمحللات فقط، اضرب إجمالي النيتريت بي مول في 2 لأخذ عامل التخفيف في الاعتبار.
  7. تطبيع نسبة pmol للنيتريت التي تم الحصول عليها لكل عينة عن طريق قسمة هذه القيم على إجمالي كمية البروتين (μg) الموجودة في ليزات العينة المقابلة، والتي تم الحصول عليها سابقا من خلال اختبار BCA.
  8. متوسط مستويات النيتريت (pmol/μg) من الحقن المكررة لكل عينة.
  9. رسم مستويات النيتريت الطبيعية (pmol/μg من البروتين الكلي) لكل عينة باستخدام برنامج GraphPad Prism.
  10. تقييم توزيع البيانات للمعايير الطبيعية باستخدام اختبار شابيرو-ويلك.
  11. قم بإجراء تحليل إحصائي باستخدام اختبار t للطلاب ذي الذيلين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس مستويات أكسيد النيتريك (NO) في ثقافات خلايا القنابة الهوائية (MTEC) التي تمايزها عند واجهة الهواء والسائل (ALI). يتم عزل الخلايا الأولية وتمايزها وفقا للبروتوكولات المعتمدة27,28. خلال 21 يوما في ALI، تم تمايز الخلايا إلى ظهارة مجرى هوائي شبه طبقية تحتوي على خلايا مهدبة27,28. تم تقييم مستويات الأهداب من خلال وضع العلامات المناعية ل Foxj1 ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخلايا متعددة الأهداب داخل ظهارة مجرى الهواء ضرورية لتخليق NO والإشارات، والتي بدورها ضرورية لتنظيم ضربات الأهداب، وتنظيف المخاط الهدبي، وتوازن مجرى الهواء 6,7,8. NO جزيء شديد التفاعل وحتى التغيرات الصغيرة في مستويات NO مرتبطة بأمراض مجرى الهواء 1,2,3,4. لذلك، الحفاظ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور مارك تي. غلادوين (عميد وأستاذ كلية الطب بجامعة ماريلاند) على إرشاده في تصميم الدراسات. ونشكر أيضا مركز المجهر الكونفوكي في كلية الطب بجامعة ماريلاند (بالتيمور، ماريلاند) على الوصول إلى موارد المجهر الكونفوكلي. وقد دعم هذا العمل منحة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) رقم 5R01HL168775 للدكتورة باولا كورتي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248diluted 1:2000 for immunostaining
50 mL Centrifuge tube filter (0.22 µm)CellTreat229710For preparation of sterile solutions
500 mL Filter unitsThermoFisher Scientific566-0020For sterile media preparation
AccutaseSigmaA6964
Amphoterecin BThermoFisher Scientific15290026
Bovine Pituitary ExtractThermoFisher Scientific13028014
Bovine Serum AlbuminSigmaA7906
Cholera toxinSigmaC8052
Collagen IThermoFisher ScientificA1048301
Confocal MicroscopeNikonW1 Spinning disk Ti2 inverted microscope with Hamamatsu sCMOS camera
Corning Transwell insertsSigmaCLS3460
Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
DMEM/F-12 mediaThermoFisher Scientific11330032
DNAse ISigmaDN25
Fetal Bovine SerumSigmaF4135
Halt 1X Protease inhibitor cocktailThermoFisher Scientific1860932
Ham's F1-12 Nutrient mixThermoFisher Scientific11765054
Insulin solutionSigmaI0516
Isoproterenol hydrochlorideSigmaI6504
Keratinocyte Serum-free mediaThermoFisher Scientific17005042
Murine Epidermal growth factorSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333
Phosphate buffer saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
PronaseSigma10165921001
Retinoic acidSigmaR2625
Rho kinase inhibitor (Y-27632 hydrochloride)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
RIPA bufferSigmaR0278
RPMI-1640 mediaThermoFisher Scientific11875093
Sodium nitrite SigmaS2252
TransferrinSigmaT8158
α-Acetylated tubulin antibody (mouse)SigmaT6793diluted 1:200 for immunostaining
α-FoxJ1 antibody (mouse)ThermoFisher Scientific14-9965-80diluted 1:200 for immunostaining
α-mouseCy3 secondary antibodyThermoFisher ScientificA10521diluted 1:1000 for immunostaining
γ-secretase inhibitor IX (DAPT)SigmaD5942

المراجع

  1. Alcázar–Navarrete, B., Ruiz Rodríguez, O., Conde Baena, P, Romero Palacios, P. J., Agusti, A. Persistently elevated exhaled nitric oxide fraction is associated with increased risk of exacerbation in COPD. Eur Respir J. 2018;51(1):1701457.
  2. Krantz, C., Janson, C., Alving, K., Malinovschi, A. Nasal nitric oxide in relation to asthma characteristics in a longitudinal asthma cohort study. Nitric Oxide 2021;106:1–8.
  3. Thomas, S. R., Kharitonov, S. A., Scott, S. F., Hodson, M. E., Barnes, P. J. Nasal and exhaled nitric oxide is reduced in adult patients with cystic fibrosis and does not correlate with cystic fibrosis genotype. Chest 2000;117(4):1085–9.
  4. Shapiro, A. J. et al. Nasal nitric oxide measurement in primary ciliary dyskinesia. A technical paper on standardized testing protocols. Ann Am Thorac Soc. 2020;17(2):e1–e12 .
  5. Legendre, M., Zaragosi, L. E., Mitchison, H. M. Motile cilia and airway disease. Semin Cell Dev Biol. 2021;110:19–33.
  6. Li, D., Shirakami, G., Zhan, X., Johns, R. A. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide–cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(2):175–81.
  7. Rochon, E. R. et al. Cytoglobin regulates NO-dependent cilia motility and organ laterality during development. Nat Commun. 2023;14(1): 8333.
  8. Mikhailik, A. et al. nNOS regulates ciliated cell polarity, ciliary beat frequency, and directional flow in mouse trachea. Life Sci Alliance 2021;4(5):e202000981.
  9. Schamberger, A. C., Staab–Weijnitz, C. A., Mise–Racek, N., Eickelberg, O. Cigarette smoke alters primary human bronchial epithelial cell differentiation at the air–liquid interface. Sci Rep. 2015;5:8163.
  10. Gindele, J. A. et al. Intermittent exposure to whole cigarette smoke alters the differentiation of primary small airway epithelial cells in the air–liquid interface culture. Sci Rep. 2020;10(1):6257.
  11. Ghosh, B. et al. Effect of sub-chronic exposure to cigarette smoke, electronic cigarette and waterpipe on human lung epithelial barrier function. BMC Pulm Med. 2020;20(1):216.
  12. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. Air-liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: promises, challenges and future directions. Adv Nanobiomed Res. 2021;1(6):2000111.
  13. Bessa, M. J. et al. In vitro toxicity of industrially relevant engineered nanoparticles in human alveolar epithelial cells: Air-liquid interface versus submerged cultures. Nanomaterials (Basel) 2021;11(12):3225.
  14. Allouche, Y. et al. Comparison of submerged and air liquid interface exposure: limitations and differences in the toxicological effects evaluated in bronchial epithelial cells. Environ Res. 2025;279(Pt 2):121856.
  15. Li, J., LoBue, A., Heuser, S. K., Leo, F., Cortese-Krott, M. M. Using diaminofluoresceins (DAFs) in nitric oxide research. Nitric Oxide. 2021;115:44–54.
  16. Jiang S. et al. Real–time electrical detection of nitric oxide in biological systems with sub–nanomolar sensitivity. Nat Commun. 2013;4:2225. 
  17. Brown M. D, Schoenfisch M. H. Electrochemical nitric oxide sensors: Principles of design and characterization. Chem Rev. 2019;119(22):11551–75.
  18. Corti, P. et al. Globin X is a six-coordinate globin that reduces nitrite to nitric oxide in fish red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113(30):8538–43.
  19. Zhao, X. J. et al. Mechanisms for cellular NO oxidation and nitrite formation in lung epithelial cells. Free Radic Biol Med. 2013;61:428–37.
  20. Lundberg, J. O. Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2008;7(2):156–67.
  21. Rochon, E. R., Corti, P. Globins and nitric oxide homeostasis in fish embryonic development. Mar Genomics 2020;49:100721.
  22. Giordano, D., Verde, C., Corti, P. Nitric oxide production and regulation in the teleost cardiovascular system. Antioxidants (Basel) 2022;11(5):957.
  23. MacArthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S–nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;851(1–2):93–105.
  24. Basu, S., Ricart, K., Gladwin, M. T., Patel, R. P, Kim-Shapiro, D. B. Tri-iodide and vanadium chloride based chemiluminescent methods for quantification of nitrogen oxides. Nitric Oxide 2022;121: 11–19.
  25. Brody, S. L., Yan, X. H., Wuerffel, M. K., Song, S. K., Shapiro, S. D. Ciliogenesis and left-right axis defects in forkhead factor HFH-4-null mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(1): 45–51.
  26. Jain, R. et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010;43(6): 731–9.
  27. Eenjes, E. et al. A novel method for expansion and differentiation of mouse tracheal epithelial cells in culture. Sci Rep. 2018;8(1): 7349.
  28. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;283(6): L1315–21.
  29. Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. Br J Pharmacol 1996;118(6):1433–40. 
  30. Rochon, E. R., Corti, P., Gladwin, M. T. Hemoglobin α in Pulmonary Endothelium: Ironing Out Nitric Oxide Signaling. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;57(6):639–41.
  31. van Faassen, E. E. et al. Nitrite as regulator of hypoxic signaling in mammalian physiology. Med Res Rev. 2009;29(5):683–741. 

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

233 233
قياس إنتاج أكسيد النيتريك في زراعات خلايا ظهارية في القصبة الهوائية في الفأر التي تم تمايزها عند واجهة سائل الهواء
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.