Method Article

سير عمل لتصور ديناميكيات تكوين البروتين من خرائط التجميد الكهرومغناطيسي باستخدام إنزيم التسلجين الصناعي البشري

DOI:

10.3791/70312

⸱

March 20th, 2026

1Department of Biochemistry, Molecular Biology and Pharmacology, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تحليل التباين ثلاثي الأبعاد (3DVA) في CryoSPARC وتحسين التباين في Phenix لتحليل التباين التكويني في بيانات التجميد والEM. باستخدام إنزيم التصنيع البشري من الأسباراجين كمثال، يوضح كيفية توليد خرائط التغير، وتصور المكونات الرئيسية، وتحسين النماذج الذرية المقابلة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة سير عمل شامل لتحليل التغاير الشكلي في بيانات المجهر الإلكتروني التجميد للجسيم الواحد (cryo-EM) باستخدام تحليل التباين ثلاثي الأبعاد (3DVA) في CryoSPARC وتحسين التباين في Phenix. يصف البروتوكول كيفية حساب خرائط التغير على المكونات الرئيسية المستمدة من صور الجسيمات، وتصور أنماط التغير الهيكلي الرئيسية، وتحسين التجمعات المقابلة للنماذج الذرية مقابل أطر التباين الفردية. تشمل النتائج سلسلة من خرائط التغير ثلاثية الأبعاد، وهياكل ذرية متعددة النماذج متقنة تمثل حالات التكوين المنفصلة، وملفات تصور مناسبة للتحليل البنيوي المقارن وتوليد الأفلام. ينطبق هذا السير على نطاق واسع على إعادة بناء التجميد والEM في نطاق الدقة (عادة ~2.0-6.0 Å) حيث يمكن تفسير التغاير الشكلي بشكل مؤثر على مستويات العمود الفقري والسلاسل الجانبية. وهي مناسبة بشكل خاص لالتقاط الحركات المستمرة في المجال، وحركات ثني المفصل، وإعادة ترتيب محلية منسقة لا يمكن حلها بسهولة بالتصنيف المتقطع فقط. يتيح الاستخدام المشترك لخرائط التباين ومجموعات النماذج المحسنة المقارنة المباشرة للبنيوية القصوى التكوينية، ويدعم التحليلات الكمية مثل حسابات تقلب الجذر-المتوسط-التربيعي (RMSF)، ويوفر إطارا لربط السمات الهيكلية الديناميكية بالفرضيات الكيميائية الحيوية أو الوظيفية. يستخدم إنزيم التصنيع البشري (ASNS) كمثال لتوضيح التنفيذ العملي لسير العمل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد توصيف التغاير الشكلي في البنى الجزيئية الكبيرة جانبا متزايد الأهمية في تحليل المجهر الإلكتروني البارد للجسيم الواحد (cryo-EM). هدف هذا البروتوكول هو توفير سير عمل عملي لاستخراج وتصور وتحسين أنماط التباين الهيكلية السائدة مباشرة من مجموعات بيانات التجميد الكهرومغناطيسي باستخدام تحليل التباين ثلاثي الأبعاد (3DVA) في CryoSPARC1 مع تحسين التباين في فينكس2. تهدف هذه المقالة إلى إرشاد القراء في تحديد ما إذا كان هذا النهج الحاسوبي مناسبا لبياناتهم وفهم أنواع المخرجات التي تولدها سير العمل.

توفر التقنيات التجريبية التقليدية (مثل تبادل الهيدروجين-ديوتيريوم، مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (NMR)، مطيافية الكتلة) معلومات قيمة عن حركات البروتينات3،4،5 لكنها غالبا ما تكون محدودة بحجم الجزيئات أو متطلبات العينة أو تعقيد التجربة. مكنت التطورات في التجميد الكهرومغناطيسي تحديد البنية عالية الدقة للأنظمة الكبيرة وغير المتجانسة، مما سمح بتحليل التغيرات التشكيلية داخل تجمعات الجسيمات. تحليل التباين ثلاثي الأبعاد (3DVA)، المطبق في CryoSPARC1، يقوم بتفكيك مجموعات بيانات الجسيمات الكريو-EM إلى مكونات رئيسية تصف أنماط التغير الهيكلي السائدة والمستمرة من التباين الهيكلي. عند دمجها مع تحسين التباين في فينيكس2، ينتج هذا النهج نماذج ذرية تتوافق مع مواقع منفصلة على كل مكون رئيسي، مما يمكن من التصور والمقارنة بين التشكيلات البديلة المستمدة من البيانات التجريبية.

هذا البروتوكول مناسب بشكل أفضل لمجموعات بيانات التجميد الEM التي يعاد بناؤها بدقة قريبة من الذرية إلى متوسطة (عادة ~2-6 آنغستروم). عند الدقة الأعلى، يمكن لسير العمل التقاط إعادة ترتيب العمود الفقري ومحدودية تباين السلسلة الجانبية6، بينما في الدقة المنخفضة يكون أكثر ملاءمة لتحديد الحركات على مستوى المجال أو الهيكل الثانوي 2,7. الطريقة مناسبة لالتقاط أنماط الحركة السائدة والمستمرة التي توجد على نطاق واسع في مجموعة البيانات، مثل حركات المفصل، التنفس النطاقي، أو إعادة الترتيب المنسقة بين المجالات أو الوحدات الفرعية. تعد أعداد الجسيمات الكافية والتغطية الزاوية ضرورية، وقد يكون التفسير محدودا في المناطق المرنة أو الضعيفة حيث تظل مواقع السلاسل الجانبية غامضة. مقارنة باستراتيجيات التصنيف المركز8 أو استراتيجيات التصنيف الفرعي الواسعة، يمثل سير عمل تحسين التباين ثلاثي الأبعاد التغاير الشكلي كمسارات مستمرة بدلا من فئات منفصلة. وهذا يجعل الطريقة مفيدة بشكل خاص للتحليل الاستكشافي للإنزيمات والآلات الجزيئية والمجمعات متعددة المجالات التي من المتوقع أن تأخذ عينات من تشكيلات متعددة.

يستخدم إنزيم التصنيع البشري (ASNS) كمثال توضيحي لتوضيح تنفيذ البروتوكول. ASNS هو إنزيم أميدورانسفيراز معتمد على الجلوتامين يتكون من مجالين وظيفيين متصلين بنفق أمونيا داخل جزيئي 9,10. أشارت دراسات سابقة إلى أن التغيرات التكوينية التي تشمل بقايا مثل Arg-142 تساهم في تعديل هذا النفق6. في هذا المقال، يعمل ASNS فقط كنظام تمثيلي لإظهار كيف تولد 3DVA وتحسين التباين خرائط التغير، وتركيبات النماذج الذرية المحسنة، والتصورات. يتم تأجيل التفسير الميكانيكي التفصيلي إلى قسمي النتائج والنقاش. على الرغم من أن محاكاة الديناميكا الجزيئية (MD) غالبا ما تستخدم كنهج تكميلي لاستكشاف المناظر الطبيعية التشكيلية11، إلا أن الديناميكا الجزيئية ليست مطلوبة لهذا البروتوكول. قد تجرى المقارنات مع محاكاة MD كتحليل اختياري لاحق، لكن سير العمل الموضح هنا (الشكل 1) يركز حصريا على استخراج وتصور التغاير الشكلي من بيانات التجميد والEM.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على سير العمل. يتم إعادة بناء خريطة التباين-الكهرومغناطيسية التوافقية من بيانات الجسيمات الأحادية وتخضع لتحليل التباين ثلاثي الأبعاد (3DVA) لإنشاء خرائط تباين على المكونات الرئيسية. يستخدم تحسين التباين (Phenix.varref) النموذج الذري الإجماعي لتوليد نماذج ذرية مقابلة للتصور والمقارنة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير البيانات

  1. توليد خريطة EM بالإجماع
    1. استخدم المجهر الإلكتروني البارد للجسيم الواحد (cryo-EM) لتحديد البنية ثلاثية الأبعاد التوافقية للمجمع الجزيئي الكلي.
    2. تقوم بزجاج العينات على شبكات التبريد والصورة باستخدام مجهر إلكتروني عالي الجهد المزود بكاشف إلكتروني مباشر.
    3. معالجة الأفلام المجمعة لتصحيح الحركة الناتجة عن الحزمة، تقدير معلمات التصوير، واختيار صور الجسيمات.
    4. قم بتصنيف وتحسين الجسيمات بشكل تكراري لتوليد خريطة كهرومغناطيسية توافقية.
    5. قم بمعالجة البيانات باستخدام CryoSPARC (إصدار 4 أو أعلى)13، حيث سيتم تنفيذ تحليل التباين ثلاثي الأبعاد (3DVA).
  2. توليد نموذج إجماع
    1. ابن نموذجا ذريا وتحسينه وفقا لخريطة الإجماع. التحقق من جودة النموذج المحسن باستخدام المعايير القياسية
      ملاحظة: بالنسبة ل ASNS، تم تحديد البنية باستخدام استراتيجية اختيار الجسيمات القائمة على القالب. تم استخدام قالب مشتق من بنية الأشعة السينية لنظام ASNS البشري المعدل ب DON (PDB 6GQ3)9لاختيار جسيمات عالية الجودة بكفاءة في CryoSPARC13. خضعت هذه الجسيمات لجولات تكرارية من التصنيف ثنائي الأبعاد، وإعادة بناء Ab initio، وتحسين غير متجانس وغير منتظم مع فرض تماثل C2، مما أدى إلى خريطة توافق بحجم 3.5 Å. تم توليد النموذج الذري باستخدام البنية البلورية9 في خريطة EM، تلاها تحسين في الفضاء الحقيقي في فينيكس14,15 والتعديل اليدوي في Coot16، مما أنتج الهيكل النهائي المتفق عليه في ASNS كما هو موصوف6.

2. إجراء تحليل التباين ثلاثي الأبعاد (3DVA)

  1. استخدم مكدس الجسيمات والقناع (وليس خريطة مكررة نهائية) لتحسين نهائي
    ملاحظة: غالبا ما تستخدم نتائج مهمة تحسين غير موحدة في 3DVA.
  2. أنشئ وظيفة تقلب ثلاثي الأبعاد في CryoSPARC. مكدس الجسيمات الإدخال والقناع من مهمة التحسين غير الموحدة.
  3. اضبط عدد الأنماط التي يجب حلها: عدد المكونات الرئيسية (PCs) إلى 5.
    ملاحظة: نظرا لأن الهياكل الجزيئية الكبيرة موجودة في الفضاء ثلاثي الأبعاد، يطلب عادة ما يكون هناك ثلاثة أجهزة كمبيوتر على الأقل لوصف أنماط الحركة المكانية الرئيسية لديهم. لضمان عدم تجاهل الاختلافات الإضافية في التكوين الكوني التي قد تكون أصغر لكنها ذات صلة وظيفية، تم تضمين اثنين آخرين من التغيرات الهيكلية.
  4. اضبط دقة الفلتر إلى 4.0 أنجستغرام، ودقة Highpass إلى 20. اترك جميع المعايير الأخرى كافتراضية. ابدأ العمل.
    ملاحظة: تم ضبط "دقة الفلتر" 4.0 آنجروم لتتناسب مع الجودة العامة لمجموعة البيانات مع تجنب التكيف الزائد مع الضوضاء عالية التردد. نظرا لأن خريطة الإجماع النهائية تم تحديدها بدقة 3.5 آنغسترومتر، فإن تطبيق دقة مرشح أقل قليلا (4.0 أوغوتارو) ضمن تركيز تحليل التباين على الحركات الهيكلية الحقيقية بدلا من الضوضاء بالقرب من حد الدقة.
  5. احصل على مجموعة من أحجام التباين كمخرج (الشكل 2A)

3. أداء عرض التغيرات ثلاثية الأبعاد

  1. أنشئ وظيفة عرض التباين ثلاثي الأبعاد في CryoSPARC لعرض التغيرات التشكيلي المستمرة التي يحددها 3DVA.
  2. أدخل مكدس الجسيمات وأحجام التباين المولدة من وظيفة 3DVA.
  3. اختر وضع Simple كوضع إخراج (انظر أدناه).
  4. اضبط دقة الفلتر على 4.0 واضبط دقة Highpass إلى 20. اترك جميع المعلمات الأخرى عند قيمها الافتراضية. ابدأ العمل.
  5. احصل على 20 خريطة تباين كنتيجة (الإطار من 0 إلى 19) تتوافق مع 5 مكونات رئيسية (PC) من 0 إلى 4 (الشكل 2B)
    ملاحظة: يوفر "الوضع البسيط" في برنامج عرض التباين ثلاثي الأبعاد تصورا مباشرا للتغيرات الشكلية على طول كل مكون رئيسي. يولد هذا النمط مسارات خطية بين الحالات القصوى المحددة بواسطة 3DVA، مما يتيح تفسيرا واضحا ومباشرا للحركات داخل مجموعة الجسيمات.

4. تحضير البيانات للأفلام وتحسين المتغيرات ثلاثية الأبعاد في فينيكس

  1. حمل خرائط التباين 3DVA: حمل ملفات zip التي تحتوي على خرائط التغير لأجهزة الكمبيوتر من 0 إلى 4 (خمسة ملفات مضغوطة إجمالا) من CryoSPARC.
  2. تنظيم المجلدات: أنشئ مجلد أب (مثل 3DVA/). داخليا، أنشئ مجلد فرعي واحد لكل مكون رئيسي (comp0، comp1، comp2، comp3، comp4).
  3. انقل كل ملف مضغوط إلى المجلد المناسب وقم بفك المضغوط.
  4. تأكد من أن كل مجلد يحتوي على 20 خريطة تغيرية (الإطارات من 0 إلى 19) وكرر العملية ل comp1-comp4.
    ملاحظة: احتفظ بمجلدات منفصلة لكل مكون رئيسي لمنع خلط الإطارات بين أجهزة الكمبيوتر.

5. تحضير أفلام سريعة في UCSF Chimera (اختياري) 17

  1. افتح أداة سلسلة المجلدات: شغل Chimera، ثم انتقل إلى →أدوات بيانات الحجم → سلسلة المجلدات. ستفتح نافذة جديدة لسلسلة المجلدات .
  2. تحميل الخرائط: اضغط على فتح واختر 20 خريطة تمثل مكنا رئيسيا واحدا (مثل comp0).
  3. ضبط معايير التصور: افتح عارض الصوت، وحدد عتبة الكثافة المناسبة، وخصص لونا للخريطة.
    ملاحظة: في هذا المثال، تم استخدام اللون الأزرق السماوي (الشكل 3).
  4. حركة المعاينة: في نافذة سلسلة الحجم ، اضبط اتجاه التشغيل على التذبذب، ثم اضغط على تشغيل لعرض انتقال مستمر من الإطار 0 → 19 → 0.
  5. كرر ذلك للمكونات الإضافية: كرر الخطوات 5.2-5.4 للمكونات الرئيسية الأخرى حسب الحاجة.
  6. إنشاء ملف فيلم باستخدام إدخال سطر الأوامر: تصدير فيلم عن طريق فتح سطر أوامر Chimera وتشغيل ملف الترميز الإضافي 1.
    ملاحظة: سلسلة MRC المكونة من 20 إطارا لكل مكون (مثل compX_frame000-019.mrc) هي المدخلات لتعديل متغيرات فينيكس ثلاثية الأبعاد. حافظ على مجلدات المكونات منفصلة (comp0-comp4) لتجنب خلط الإطارات بين أجهزة الكمبيوتر.

6. توليد النماذج من خلال تحسين التقلب في فينكس

ملاحظة: يمكن تنفيذ Phenix.varref من أي دليل طالما تم تحديد المسارات الكاملة إلى خرائط الإدخال والنموذج. ومع ذلك، من أجل وضوح التنظيم، ينصح بإجراء التحسين في مجلد فرعي مخصص لكل جهاز كمبيوتر.

  1. انسخ ملف نموذج الإجماع النهائي المحسن إلى الدليل الفرعي المقابل لكل جهاز كمبيوتر.
  2. من داخل كل مجلد فرعي، قم بتشغيل Phenix.varref من سطر الأوامر باستخدام النحو التالي:
    phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
  3. اضبط الدقة على 4.0 أنغوستروم لتتوافق مع الدقة الفعالة لخرائط 3DVA
  4. اضبط nproc لعدد المعالجات المتاحة (20 في هذا المثال، لكن هذا قد يختلف حسب الموارد الحسابية المتاحة)
  5. اضبط models_per_map على 50 نموذجا (افتراضيا).
    ملاحظة: لكل خريطة، يتم توليد 50 نموذجا مع ضبط قيود حسب دقة بيانات 3DVA. يتم الاحتفاظ تلقائيا بالنموذج الأنسب لكل خريطة. يحتوي ملف الإخراج الناتج على 20 نموذجا محسرا يتوافق مع 20 خريطة تغيرية. يتكون الناتج من حزمة PDB تحتوي على 20 نموذجا محسنا، بالإضافة إلى ملفات خرائط فردية.
  6. لا تطبق زيادة حدة الخرائط أثناء تحسين التغيرات. استخدم خرائط التباين التي يولدها CryoSPARC (المصفاة عند 4.0 أنجستروم) مباشرة كمدخلات إلى phenix.varref.

7. التصور

  1. افتح حزمة PDB في ChimeraX18 لتحميل جميع الطرازات المحسنة العشرين في نفس الوقت.
  2. استخدم لوحة النماذج لعرض إطارات فردية أو نماذج محددة ذات اهتمام بشكل انتقائي للمقارنة والتحليل (الشكل 4). بدلا من ذلك، يمكن فتح كل نموذج محسن بشكل فردي في ChimeraX أو Chimera.

8. إعداد البيانات للتحليل

ملاحظة: تشغيل الصياغة أعلاه يولد حزمة PDB تحتوي على 20 نموذجا متغيرا وكل خريطة فردية. في معظم التحليلات، هناك حاجة إلى نموذجين فقط - يقابلان الإطار 0 والإطار 19، حيث يمثلان الحالتين التكويتيتين القصوتين على المكون الرئيسي المختار (PC).

  1. افتح حزمة PDB في ChimeraX، واختر النموذج 1.1 (الإطار 0) والنموذج 1.20 (الإطار 19)، واحفظ كل نموذج كملف PDB منفصل (الشكل 4).
  2. قم بتعديل ملفات PDB الناتجة لعزل البقايا ذات الاهتمام. يمكن القيام بذلك يدويا أو باستخدام Phenix.pdb.tools.
  3. قارن بين ملفي PDB المعدلين لتحديد التغيرات التشكيلية في العمود الفقري أو السلاسل الجانبية.
  4. لمقارنة نموذجي PDB، قم بتركيب الهياكل المعدلة باستخدام دالة MatchMaker في كيميرا.
    ملاحظة: من أجل محاذاة موثوقة، عادة ما يتطلب MatchMaker ما لا يقل عن 10-15 بقايا متداخلة. في حالتنا، تم تحليل 6 بقايا فقط؛ ومع ذلك، تم تحقيق تراكب ناجح من خلال الاستفادة من الطبيعة المتجانسة لشبكة ASNS - بينما بقيت 6 بقايا فقط في السلسلة A، بقيت السلسلة B سليمة وكانت مرجعا للمحاذاة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا القسم المخرجات التمثيلية الناتجة عن تحليل التباين ثلاثي الأبعاد (3DVA) وسير عمل تحسين التباين، ويقدم إرشادات حول تفسيرها. يستخدم مصطنح الأسباراجين البشري (ASNS) كمجموعة بيانات توضيحية لإظهار النتائج الناجحة، والشوائب الشائعة، والتحليلات المقارنة التي تمكنها البروتوكول. تم إيداع المجموعة الكاملة من خرائط التباين المشتقة من 3DVA والنماذج المنقحة المقابلة التي تم إنشاؤها من مجموعات بيانات ASNS في مستودع Zenodo العام. معلومات الوصول التفصيلية موفرة في الجدول التكميلي 1.

<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات البروتوكول الحرجة ونقاط اتخاذ القرار
يعتمد الاستخدام الفعال لهذا البروتوكول على عدة خطوات رئيسية في سير العمل. جودة تكديس الجسيمات والقناع المستخدم في التحسين النهائي للتجميد الكهرومغناطيسي أمر حاسم، حيث يعمل تحليل التغيرات ثلاثية الأبعاد (3DVA) مباشرة على هذه المدخلات بدلا من خريطة معالجة لاحقا. يجب أن يعكس اختيار عدد المكونات الرئيسية (PCs) حجم مجموعة البيانات والتعقيد المتوقع؛ قد يقلل عدد المكونات من التغير، بينما قد يؤدي عدد كبير جدا من المكونات إلى أنماط ته...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف لا يملك أي تعارض في المصالح ليعلن عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أشكر أعضاء مختبرات تاكاجي، تشو، فوس، تشابتال، ألكارو، وريتشاردز على مساهماتهم في النشر الذي يستند إليه هذا المقال. يشكر المؤلف بكل امتنان منشأة المجهر الإلكتروني بكلية الطب بجامعة إنديانا ومعهد NIH/NIGMS (S10 OD028723) على دعمهم لهذا العمل. تم توفير تمويل إضافي من كلية الطب بجامعة إنديانا (Y.T.)، جزئيا من قبل NIGMS (R01GM111695 إلى Y.T.)، والجمعية الأمريكية للسرطان (DBG-23-1038947-01-IBCD to Y.T.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARC v4.4+ستركتورا بيوتكنولوجيhttps://cryosparc.comبرامج معالجة التجميد والEM
فينيكس v1.24+اتحاد فينيكسhttps://phenix-online.orgبرمجيات تحسين التباين
كيميرا جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسيومصدر للحوسبة الحيوية، التصور، والمعلوماتية، جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسيوhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/برنامج التصور الجزيئي
جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو كيميرا إكسمصدر للحوسبة الحيوية، التصور، والمعلوماتية، جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسيوhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/برنامج التصور الجزيئي
CPPTRAJمجموعة برامج الديناميكا الجزيئية AMBERhttps://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/أدوات بايثون لحساب RMSF
Linux Workstation (نظام مبني داخلي قائم على GPU)
هيكل محطة العملسوبرميكروhttps://www.supermicro.comهيكل محطة العمل: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U خادم سوبر شاسيه 
وحدة المعالجة المركزيةإنتل https://www.intel.comالمعالج: XEON E5-2690V3 x2
المجلس الأمسوبرميكروhttps://www.supermicro.comاللوحة الأم: اللوحة الأم Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 X10DAI-O
الذاكرةحاسمhttps://www.crucial.comالذاكرة: مجموعة Crucial 64GB (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC مسجلة. ذاكرة الخادم ذات 288 دبوس CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
القرص الصلبويسترن ديجيتالhttps://www.westerndigital.comقرص HDD: قرص صلب مؤسسي بسعة 4 تيرابايت WD RE
وحدة تحكم RAIDمنطق LSIhttps://www.broadcom.comوحدة تحكم RAID: مجموعة LSI Logic MegaRAID SAS 9271-8i
وحدة معالجة الرسومياتNVIDIA https://www.nvidia.comبطاقة رسومات Quadro M6000 بذاكرة GDDR5 بسعة 24 جيجابايت

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  2. Afonine, P. V., et al. Conformational space exploration of cryo-EM structures by variability refinement. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1865 (4), 184133(2023).
  3. Schwartz, S. D. Protein Dynamics and Enzymatic Catalysis. J Phys Chem B. 127 (12), 2649-2660 (2023).
  4. Xu, D., Meisburger, S. P., Ando, N. Correlated Motions in Structural Biology. Biochemistry. 60 (30), 2331-2340 (2021).
  5. Gao, S., Klinman, J. P. Functional roles of enzyme dynamics in accelerating active site chemistry: Emerging techniques and changing concepts. Curr Opin Struct Biol. 75, 102434(2022).
  6. Coricello, A., et al. 3D variability analysis reveals a hidden conformational change controlling ammonia transport in human asparagine synthetase. Nat Commun. 15 (1), 10538(2024).
  7. Gobet, A., et al. Rhodamine6G and Hoechst33342 narrow BmrA conformational spectrum for a more efficient use of ATP. Nat Commun. 16 (1), 1745(2025).
  8. Barchet, C., et al. Focused classifications and refinements in high-resolution single particle cryo-EM analysis. J Struct Biol. 215 (4), 108015(2023).
  9. Zhu, W., et al. High-resolution crystal structure of human asparagine synthetase enables analysis of inhibitor binding and selectivity. Commun Biol. 2, 345(2019).
  10. Richards, N. G., Schuster, S. M. Mechanistic issues in asparagine synthetase catalysis. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 72, 145-198 (1998).
  11. Matsumoto, S., Ishida, S., Terayama, K., Okuno, Y. Quantitative analysis of protein dynamics using a deep learning technique combined with experimental cryo-EM density data and MD simulations. Biophys Physicobiol. 20 (2), e200022(2023).
  12. Vant, J. W., et al. Exploring cryo-electron microscopy with molecular dynamics. Biochem Soc Trans. 50 (1), 569-581 (2022).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Adams, P., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  15. Afonine, P. V., et al. New tools for the analysis and validation of cryo-EM maps and atomic models. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 9), 814-840 (2018).
  16. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004).
  17. Pettersen, E., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  19. Roe, D. R., Cheatham, T. E. 3rd PTRAJ and CPPTRAJ: Software for Processing and Analysis of Molecular Dynamics Trajectory Data. J Chem Theory Comput. 9 (7), 3084-3095 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Conformational DynamicsCryo EM Maps3D Variability AnalysisCryoSPARC WorkflowVariability RefinementPhenix SoftwareConformational HeterogeneityAtomic Model EnsemblesStructural ComparisonHuman Asparagine Synthetase
Video Coming Soon

Related Articles