مقالة منهجية

أخذ عينات الحمض النووي البيئي من أوعية مراقبة الحيتان لمراقبة الحيتانيات

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70334

⸱

أبريل 10, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول سير عمل موحد لجمع عينات الحمض النووي البيئي للحيتانيات (eDNA) من أوعية مراقبة الحيتان. تعطى أولوية للجدوى للباحثين والعلماء المواطنين المدربين، بينما تحدد الظروف البيئية، ووقت الترشيح، والعكارة، واللوجستيات على متن السفينة الحدود العملية لتطبيقها.

الملخص

يقدم الحمض النووي البيئي (eDNA) نهجا غير جراحي لمراقبة الحيتانيات، ومع ذلك يتطلب تطبيقه الواسع على منصات التشغيل سير عمل أخذ عينات موحدة وقابلة للتنفيذ. تصف هذه الدراسة بروتوكولا لجمع الحمض النووي للحيتان من أوعية الحيتان، صمم لتطبيقه من قبل الباحثين والعلماء المواطنين المدربين تحت ظروف بيئية ولوجستية محددة. يدمج هذا النهج جمع مياه البحر المستهدفة عبر البصمة الفلوكية، والترشيح على متن السفينة مع مرشحات ذاتية الحفظ، والتحليلات الجزيئية في المراحل النهائية لدعم توليد بيانات عملي في ظروف العالم الحقيقي. تم تنفيذ البروتوكول خلال حملات ميدانية منسقة أجريت في عام 2024 عبر ثلاث مناطق في شمال الأطلسي والبحر الأبيض المتوسط (آيسلندا، البرتغال، وإيطاليا)، شملت عدة أنواع من الحيتانيات. تم تقييم أداء الطريقة باستخدام اختبار PCR الكمي المطور حديثا خصيصا لأنواع معينة يستهدف الحمض النووي الميتوكوندري لحوت الأحدب (Megaptera novaeangliae)، مما أظهر معدلات كشف متسقة تحت ظروف بيئية ولوجستية متغيرة. من خلال توفير إرشادات عملية للتنفيذ الميداني ومكافحة التلوث، يدعم هذا البروتوكول المراقبة القابلة لإعادة إنتاج الحيتان المعتمدة على eDNA ويسهل المقارنة بين المناطق في دراسات التنوع البيولوجي البحري.

المقدمة

تعد الإدارة الفعالة للحفاظ على الحيوانات البحرية الضخمة، بما في ذلك الحيتانيات والأنواع واسعة النطاق الأخرى، أمرا ضروريا لحماية التنوع البيولوجي. بصفتها من أفضل المفترسين ومهندسي النظام البيئي، تساهم الحيتانيات في التنظيم الغذائي، ودورة المغذيات، والمرونة البيئية عبر أحواض المحيطات1. ومع ذلك، لا يزال توليد معرفة بيئية شاملة لهذه الأنواع عالية الحركة تحديا وغالبا ما يعتمد على برامج مراقبة كثيفة الموارد2. الأساليب التقليدية، مثل أخذ عينات الخزعة، والتعرف على الصور البصرية، والمراقبة الصوتية السلبية، والقياس عن بعد عبر الأقمار الصناعية، والمسح الجوي، قدمت رؤى حاسمة حول بيئة الحيتانيات 3,4,5,6,7، ومع ذلك، فإن هذه الطرق غالبا ما تكون مكلفة، أو تتطلب جهدا لوجستيا، أو مقيدة مكانيا، أو تدخلية، وخاضعة لرقابة أخلاقية وتنظيمية صارمة8. نتيجة لذلك، غالبا ما تكون وتيرة أخذ العينات، والتغطية الجغرافية، وفرص مشاركة أصحاب المصلحة محدودة، خاصة في دراسة الأنواع النادرة أو واسعة النطاق.

برز أخذ عينات الحمض النووي البيئي (eDNA، التعريف بأنه المادة الوراثية التي تتخلصها الكائنات الحية في بيئتها) كأداة قوية وغير غازية للكشف عن الأنواع المائية من عينات المياه 9,10. تمكن اختبارات PCR الكمية الخاصة بالنوع (qPCR) التي تستهدف شظايا الحمض النووي الميتوكوندرية الكشف الحساس والمحدد للغاية عن الأنواع البحرية، بما في ذلك الحيتانيات 11,12,14. بعيدا عن اكتشاف الوجود/الغياب، توفر قوة إشارة eDNA النسبية وتسلسلات الحمض النووي المستهدف معلومات قيمة تتعلق بالقرب، والوفرة النسبية، والأنماط الجينية على مستوى السكان 15,16,17,18,19. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تحتوي العينات البيئية التي جمعت بالقرب من الحيتان على حمض نووي من أنواع متزامنة في نفس النوع، بما في ذلك أنواع الفرائس، والكائنات المتعايشة، والطفيليات، مما يدعم الارتباطات البيئية الأوسع 20,21,22. وبشكل مجتمع، تظهر هذه التطورات إمكانات الأساليب القائمة على الحمض النووي الإلكتروني لتكملة الطرق التقليدية وتوسيع نطاق أبحاث الحيتانيات عبر الأنظمة البحرية23,24.

على الرغم من هذه المزايا، تواجه المراقبة القائمة على الحمض النووي الإلكتروني للحيوانات البحرية الضخمة تحديات مستمرة تتعلق بأخذ عينات تمثيلية، وتغطية مكانية، وقابلية التكرار المنهجية، خاصة في الأنظمة البحرية المفتوحة حيث يتم تخفيف الحمض النووي بسرعة25,26 والأنواع المستهدفة لها نطاقات واسعة وتوجد عند كثافات منخفضة. يتطلب معالجة هذه القيود أطر أخذ عينات قابلة للتوسع وقابلة للتنفيذ من الناحية التشغيلية يمكن تطبيقها عبر مقاييس مكانية وزمنية واسعة. أثبتت مبادرات العلم المواطني فعاليتها في توسيع جمع البيانات البيئية مع تعزيز مشاركة الجمهور في الحفاظ على البحار، مما يجعلها طريقا واعدا للمراقبة واسعة النطاق القائمة على الحمض النووي الإلكتروني 27,28,29,30. تمثل أوعية مراقبة الحيتان منصة غير مستغلة لكنها مناسبة جدا لأخذ عينات eDNA، حيث توفر وصولا منتظما إلى مواطن الحيتانيات عبر المواسم والمناطق 31,32,33. تدعم صناعة مراقبة الحيتان العالمية شبكات تشغيلية واسعةالنطاق 34، وقد أظهرت الدراسات السابقة إمكانية جمع الحمض النووي الحيتاني من منصات انتهازية أخرى، مثل السفن التجارية، العبارات35، ومن خلال أخذ عينات مستهدفة مدمجة مع التعرف الضوئي والملاحظات السلوكية36,37. أدى التوسع السريع في أبحاث الحمض النووي الإلكتروني إلى ابتكار منهجي كبير، لكن التباين البيولوجي عبر الأنظمة البحرية وتيرة التقدم التكنولوجي يعقد الجهود لتوحيد البروتوكولات وضمان المقارنة عبر الدراسات. لذلك، فإن المنهجيات الميدانية الموحدة والقابلة للتكيف ضرورية، خاصة لمبادرات المراقبة متعددة الجنسيات واسعة النطاق38.

يتأثر كشف eDNA بحجم المياه المصفاة، واستراتيجية الترشيح، ومواد الترشيح، وحجم المسام. عادة ما يؤدي ترشيح الأحجام الأكبر إلى زيادة إنتاجية الحمض النووي الإلكتروني واحتمالية الكشف عن أهداف الفقاريات، بما في ذلك الحيتانيات 39,40,41,42. أما في المياه المنتجة أو العكرة، فقد تقيد كفاءة الترشيح بسبب انسداد سريع للمرشح43.44، مما يستلزم موازنة بين الحجم القابل للتحقيق والجدوى التشغيلية45,46. لقد ثبت باستمرار أن أخذ العينات من آثار الفلوك — الاضطراب السطحي الناتج عن ضربة ذيل الحوت — يعزز قابلية اكتشاف الحمض النووي الوحشي الحيتاني، حيث أن المواد البيولوجية التي تساقط مؤخرا تتركز بالقرب من السطح 24,41,42,47,48. استخدام أنظمة التصفية المغلقة والمحافظة ذاتيا يقلل من خطوات التعامل مع مخاطر التلوث، مما يجعلها مناسبة جدا لتطبيقات علم المواطنين 38,42. بالإضافة إلى ذلك، فإن تضمين النسخ البيولوجية وضوابط الميدان الروتينية يقلل من فشل الكشف ويعزز موثوقية البيانات 49,50,51.

تطوير البروتوكول والتحقق من صحته
مشروعeWHALE 52 هو مبادرة عابرة للحدود تدمج الباحثين ومشغلي مراقبة الحيتان والعلماء المواطنين في جميع أنحاء أوروبا لمراقبة الحيوانات البحرية الضخمة باستخدام eDNA. استهدفت جهود أخذ العينات عدة أنواع من الحيتانيات عبر شمال الأطلسي والبحر الأبيض المتوسط، باستخدام بروتوكول أساسي مع تكيفات خاصة بالمنطقة لمراعاة الظروف البيئية واللوجستية المحلية.

هنا، نقدم بروتوكولا موحدا من البداية للنهاية لجمع الحمض النووي الحيتاني من سفن مراقبة الحيتان، تم تطويره من خلال تحليل 308 عينة من الحمض النووي الإلكتروني لمياه البحر، بما في ذلك نسختين لكل عينة و21 عينة ميدانية، تم جمعها خلال حملات ميدانية منسقة في عام 2024 في خليج سكالفاندي (آيسلندا)، جزر الأزور (البرتغال)، وبحر ليغوريا (إيطاليا). تدمج الطريقة جمع مياه البحر الموجهة عبر طباعة الفلوك، والترشيح على متن السفينة باستخدام مرشحات eDNA ذاتية الحفظ، والتحليلات الجزيئية في المراحل اللاحقة.

تم تصميم هذا البروتوكول ليتم تطبيقه في ظروف مراقبة الحيتان الواقعية من قبل باحثين مدربين وعلماء المواطنين، حيث يمكن إجراء الترشيح على متن السفينة في ظروف بحرية هادئة إلى معتدلة دون تعطيل أنشطة مراقبة الحيتان. يتطلب تنفيذها التنسيق مع المنظمات المشاركة (مثل مشغلي مراقبة الحيتان، المنظمات غير الربحية، المؤسسات البحثية) لتحديد استراتيجيات أخذ العينات وأهداف البحث. بينما يجب أن تبقى المعايير الأساسية ثابتة لضمان قابلية التكرار والمقارنة بين الدراسات، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات متوافقة مع البروتوكول في المواقع ذات العكارة العالية، أو حركة السفينة، أو قيود في الوقت أو المكان أو الأفراد. تشمل هذه التعديلات نوع المرشح، حجم المياه المصفاة الممكن، والمعدات المساعدة. يجب تطبيقها بشكل متسق في كل حملة أخذ عينات ويتم الإبلاغ عنها بشفافية. تقدم خطوات البروتوكول والمناقشات إرشادات تشغيلية مفصلة واعتبارات لوجستية لدعم جودة البيانات والشفافية والمقارنة الإقليمية.

تصميم اختبار qPCR
لتقييم أداء البروتوكول، تم تضخيم الحمض النووي eDNA لحيتان الأحدب (Megaptera novaeangliae)، وهو نوع مهاجر مدروس جيدا يصادف بانتظام في خليج سكالفاندي (آيسلندا)53 ويوجد موسميا في جزر الأزور54، من عينات جمعت في الميدان. تم تحسين سير عمل تحليل الحمض النووي واستخراجه وqPCR في البداية من خلال اختبار حلقة بين المختبرات شمل أربعة مختبرات مشاركة في مشروع eWHALE، مما حسن الاتساق والتطبيق عبر المؤسسات14.

للكشف بشكل موثوق عن وجود الحمض النووي eDNA للحيتان الأحدب، تم تصميم والتحقق من اختبار QPCR الخاص بنوع خاص بالنوع (MGB) (رابط الأخدود الصغير) يستهدف منطقة ND5 الميتوكوندري وفقا للإرشادات المعتمدة55 (الجدول 1). تم إنشاء بادئات أوليجونكليوتيدات ومسبار باستخدام برنامج لمحاذاة وتحليل تسلسل الحمض النووي56، بهدف تعظيم خصوصية النوع وكفاءة التضخيم (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S1). تم تقييم نوعية الاختبار في المختبر باستخدام الأنواع المستهدفة وغير المستهدفة (Balaenoptera acutorostrata، Delphinus delphis، Physeter macrocephalus، Homo sapiens). تم قياس تركيزات الحمض النووي المستخدمة لتوليد منحنيات qPCR القياسية من معيار DNA مشتق من الأنسجة 42,57,58,59,60. تم تحديد حد الكشف (LOD) للاختبار، الذي يعرف بأنه أدنى تركيز يعطي تضخيم إيجابي في 95٪ من النسخ العينة،11,61. تم تقييم اكتشافات الحمض النووي الحيوي للحوت الأحدب للعينات الميدانية من خلال تقدير نسبة التفاعلات الإيجابية وقوة الإشارة (أي عتبة الدورة، قيمة Ct) لكل عينة تتكرر عبر قياسات qPCR الثلاثية، لمراعاة تباين التضخيم وتحسين موثوقية الكشف 57,60,62. تم التحقق من اكتشافات الأنواع بعد ذلك بواسطة تسلسل سانجر ثنائي الاتجاه، تلاه تأكيد عبر تحليل BLAST63.

تعرض بيانات qPCR كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم تقييم الدلالة الإحصائية بين المجموعات باستخدام اختبار مان-ويتني U غير الممتري واختبار t ذو العينتين لويلش. اعتبرت الفروقات ذات دلالة كبيرة عند p < 0.05. تم إجراء جميع التحليلات باستخدام برنامج التحليل الإحصائي64.

البروتوكول

الأخلاقيات والامتثال التنظيمي
يجب أن تجرى جميع جهود الرصد للحيتانيات وأخذ عينات المياه اللاحقة وفقا للوائح الحياة البرية الوطنية والإقليمية. قم بأخذ عينات حصرية من السفن المصرح بها التي تعمل بموجب تصاريح مراقبة الحيتان أو تصاريح البحث الصحيحة. الحفاظ على مسافات الاقتراب الدنيا من النوع المستهدف كما هو محدد في اللوائح المحلية وتجنب أي مناورة مخصصة فقط لأغراض أخذ العينات. تم جمع عينات أنسجة الحيتان المستخدمة للتحقق من صحة الاختبارات بموجب تصاريح إقليمية ومشاركتها بين شركاء مشروع eWHALE تماشيا مع اللوائح الوطنية والمؤسسية.

ملاحظة: راجع الوثائق التالية قبل أي نشاط أخذ عينات واجمع المعدات اللازمة: جدول المواد، مجموعة عينات eDNA (الملف التكميلي 1 - الشكل الإضافي S2)، المواد المستخدمة لجمع عينات الحمض النووي البيئي (الشكل 1) ونظرة عامة على خطوات أخذ العينات وسير عمل الترشيح على متن السفينة (الشكل 2).

1. تحضير أخذ عينات eDNA

  1. إعداد مواد التوثيق الميداني، بما في ذلك أوراق البيانات الميدانية وبروتوكول الميداني المصفح (الملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3).
  2. جهز قفازات احتياطية، ومرشحات احتياطية (مرشح واحد لكل نسخة مكررة)، وقلم تحديد مقاوم للماء، وحاوية نفايات مخصصة (الشكل 1A).
    ملاحظة: استخدم مرشحات eDNA ذاتية الحفظ مغلقة (حجم المسام 1.2 ميكرومتر) لتقليل مخاطر التعامل والتلوث65,66.
  3. جهز دلاء أو أكثر صلبة، مناسبة لنوع السفينة وتكوينها على متن السفينة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S3).
    1. ضع علامة على الدلاء عند 10 لتر باستخدام قلم دائم. جهز عدة دلاء صغيرة إذا كان التعامل مع 10 لتر غير عملي.
    2. اربط حبلا بإحكام بالدلو إذا كان الوصول إلى الماء محدودا.
      ملاحظة: استخدم دلاء مغطاة لتقليل التسرب عندما تكون حركة الوعاء مفرطة (الشكل 1B).
    3. جهز حاوية ثانوية لحمض النووي الإلكتروني لدمج أحجام أصغر وصندوق نقل إضافي لضمان نقل الدلاء بدون تلوث إذا لزم الأمر (الشكل 1C).
  4. جهز مضخة مياه متنقلة أو مضخة ماء مفرغة (الشكل 1D). اشحن المضخة بالكامل قبل الصعود وافصل الكهرباء مباشرة قبل الاستخدام.
  5. حدد أدوار العينة، والترشيح، وتسجيل البيانات قبل المغادرة.
    تحذير: ارتد القفازات أثناء جميع التعامل مع المعدات وغير القفازات بين المهام.

figure-protocol-1
الشكل 1: مواد العمل الميداني المستخدمة لجمع عينات الحمض النووي البيئي. (أ) مجموعة أدوات تحتوي على مرشحات eDNA محفوظة ذاتيا، حاوية نفايات، زجاجة ضغط مع مبيض منزلي مخفف (1:10)، قفازات، ورقة بيانات ميدانية، وقلم مقاوم للماء؛ (ب) أمثلة على أنواع الدلاء لأخذ عينات eDNA؛ (ج) أمثلة على حاويات eDNA إضافية لنقل وتصفية الكميات الكبيرة وحاويات لنقل الدلاء على متن السفينة؛ (د) أمثلة على مضخات متنقلة لترشيح المياه. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-2
الشكل 2: مخطط مفاهيمي لأخذ عينات الحمض النووي البيئي على متن قوارب مراقبة الحيتان. تصف التوضيح الخطوات الموجهة، بما في ذلك جمع عينات المياه والترشيح على متن السفينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. تنظيف المعدات

  1. ارتد قفازات ذات استخدام واحد قبل التنظيف.
  2. حضر محلول مبيض عن طريق تخفيف مبيض المنزل (5-6٪ هيبوكلوريت الصوديوم) بنسبة 1:10 مع ماء منقى (~50 مل في كل رحلة).
  3. طبق المحلول عن طريق رش المحلول بالتساوي على جميع الأسطح على جميع الدلاء، والأغطية، والحاويات، وأنابيب المضخة. حافظ على وقت تلامس مبيض لا يقل عن 2-5 دقائق على جميع الأسطح.
  4. اشطف جيدا بماء الصنبور ثلاث مرات (الشكل 3).
  5. جفف المواد في الهواء في مكان آمن وخزنها في مكان آمن ونظيف قبل الصعود.

figure-protocol-3
الشكل 3: خطوات لمعدات التنظيف. (أ) تطبيق محلول التبييض المنزلي المخفف (1:10)؛ (ب) توزيع القفازات بالتساوي باستخدام قفازات خالية من الحمض النووي؛ (ج) الشطف جيدا ثلاث مرات بماء الصنبور؛ و(د) تكرار العملية لمواد إضافية إذا كان ذلك مناسبا (مثل حاويات eDNA). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. جمع عينات المياه

ملاحظة: امتثل لجميع لوائح السلامة على متن كل سفينة أو رصيف، بما في ذلك استخدام سترات النجاة أو بدلات الطفو عند الحاجة.

  1. أحضر جميع المواد إلى الطائرة قبل وصول الركاب وخزنها في مكان مخصص ونظيف.
  2. تنسيق أخذ العينات، التوقيت، وموقع السفينة مع طاقم السفينة.
  3. راقب أنماط الظهور على السطح لتوقع غوص الحيتان (الشكل 4). ارتد قفازات جديدة قبل التذوق.
  4. اجمع 20 لتر من ماء البحر في أقرب وقت ممكن (لا يزيد عن 10 دقائق من الفلاش) من البصمة بعد غوص الحوت، لتوليد نسختين من عينات بحجم 10 لتر.
  5. نقل المياه المجمعة إلى محطة ترشيح مخصصة على متن السفينة، باستخدام أغطية أو حاوية معقمة إضافية لتجنب الانسكاب.
  6. سجل هوية النوع، وإحداثيات GPS، والوقت، ومعرف النسخة العينة في ورقة البيانات.
  7. غير القفازات فور البلاغ.

figure-protocol-4
الشكل 4: تسلسل ظهور الحوت الأحدب. (أ) ضربة الحوت؛ (ب) تقوس الظهر ورفع ذيله قبل الغوص؛ (ج) نمط بصمة الفوك على السطح بعد غوص الحوت. نسبة الصورة: بعثات المحيط (A,B,C, 2024). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. ترشيح الحمض النووي الإلكتروني

  1. افتح كيس الفلتر وتعامل مع الفلتر فقط بجانب المخرج (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S4).
  2. أدخل المدخل في أنبوب التنفس ووصل أنبوب المضخة بالمخرج (الشكل 5A,B).
  3. اغمر السنوركل في عينة الماء دون غمر غلاف الفلتر (الشكل 5C).
  4. اضبط المضخة (انظر جدول المواد لأنواع المضخات) على معدل تدفق سريع وثابت.
  5. قم بتصفية 10 لتر باستمرار أثناء مراقبة استقرار التدفق (افحص فقاعات الهواء، التمزق، التمزق، أو فشل الختم).
    ملاحظة: توقف الترشيح بأقصى مدة تبلغ 45 دقيقة.
  6. اقلب الفلتر وشغل المضخة لمدة 30-60 ثانية لإزالة الماء المتبقي. تأكد من عدم وجود رطوبة ظاهرة في غلاف الفلتر.
  7. أغلق المضخة وافصل الأنبوب.
  8. تخلص من أنبوب التنفس في حاوية النفايات، وضع الفلتر في كيسه الأصلي، ووضع عليه علامة فورا.
  9. تخزين الفلاتر على متن الطائرة في حاوية مغلقة وصلبة أو في صندوق تبريد (إذا كانت درجة الحرارة > 20 درجة مئوية)، بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة ومناطق الركاب.
  10. غير القفازات وكرر الترشيح للنسخة الثانية.

figure-protocol-5
الشكل 5: خطوات إعداد إعداد الترشيح المدمج. (أ) توصيل مدخل الفلتر (الجزء الأبيض) بأنبوب التنفس (أنبوب التنفس)؛ (ب) توصيل أنبوب المضخة بمخرج الفلتر (الجزء الأصفر); و(ج) غمر جزء من أنبوب التنفس في عينة الماء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. الضوابط السلبية الميدانية وتقارير البيانات

  1. قم بتصفية جهاز تحكم سالب واحد بعد كل خمس عينات من فؤك بصمة.
  2. استخدم مياه خالية من الحمض النووي مباشرة بعد العودة إلى الشاطئ وقبل تنظيف المعدات.
  3. انقل جميع البيانات إلى جدول بيانات أخذ عينات eDNA الرقمية بعد كل رحلة (الملف التكميلي 4).

6. تخزين وشحن الفلتر

  1. احتفظ بفلاتر eDNA المحفوظة ذاتيا في حاوية آمنة وجافة في غرفة مظللة بدرجة حرارة محيطة—أو في ثلاجة إذا تجاوزت درجة الحرارة المحيطة 20 درجة مئوية—لمدة لا تزيد عن 3 أشهر قبل الشحن.
  2. افحص أكياس الفلتر بصريا بحثا عن الرطوبة قبل الشحن.
  3. قم بوضع العلامات وشحن المرشحات في حاويات معزولة مع أكياس ثلج إلى المختبر المخصص.

7. التحليل المخبري

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الإجراءات المخبرية في غرف مخصصة معقمة بالأشعة فوق البنفسجية مع تهوية كافية وطاولات عمل منفصلة لاختبارات PCR، باستخدام قفازات خالية من الحمض النووي وملابس واقية 55,67,68.

  1. تحلل الحمض النووي
    1. ضع علامة على أنبوب تفاعل بحجم 2 مل لكل فلتر.
    2. ضع الفلتر في قارورة إيرلنماير بسعة 200 مل وتخلص من الغطاء المطاطي (الشكل 6A).
    3. باستخدام ملقط خال من الحمض النووي، قم بطي الغشاء (ملف تكميلي 1-الشكل التكميلي S5) إلى مثلث وانقله إلى أنبوب تفاعل بحجم 2 مل، مع توجيه الطرف للأسفل (الشكل 6B-D).
    4. أضف 380 ميكرولتر من مخزن TES و20 ميكرولتر من بروتيناز K (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب تفاعل، مما ينتج 400 ميكرولتر من مخزن التحلل (الشكل 6E).
    5. الدوامة لفترة وجيزة وتحتضن عند 56 درجة مئوية لمدة ≥3 ساعات مع التحريك (الشكل 6F).
    6. أنابيب الطرد المركزي عند 18,626 × جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: اللائزات الشفاف إلى الفاتح يشير إلى نجاح الهضم.
      ملاحظة: قد يتوقف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة إذا تم تخزين الليزات عند -20 درجة مئوية.
  2. استخراج الحمض النووي
    1. يتم حضانة التحلل عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل الاستخلاص.
    2. كواشف استخراج الماصنة في ألواح الغسيل وألواح التفريغ، مع الأخذ في الاعتبار الضوابط السلبية وأخطاء التوصيل بالمصاصات69 (انظر الملف التكميلي 1 - الجدول التكميلي S1).
    3. أضف فارغا استخراجيا واحدا لكل لوحة باستخدام مخزن TES.
    4. انقل 300 ميكرولتر من اللايزات إلى كل بئر في صفيحة الربط. أضف 300 ميكرولتر من محلول المخزن الخفيف و300 ميكرولتر من كحول الأيزوبروبيل إلى كل بئر. استخدم عدة صفائح ربط إذا تجاوز حجم الليزات الكلي 300 ميكرولتر. دوامة وأضف 30 ميكرولتر جزيئات مغناطيسية لربط الأحماض النووية في كل بئر إلى أول لوح ربط (جدول المواد).
    5. غط لوحة الربط بغطاء القضيب.
    6. شغل برنامج امتصاص الحمض النووي الأولي للوحين ربط (إجمالي 400 ميكرولتر من اللاسيت؛ انظر جدول المواد والشكل 7) وبروتوكول الاستخراج الآلي على روبوت مختبر يعتمد على الخرزات المغناطيسية.
    7. تخلص من مواد الاستخراج في حاويات النفايات المخصصة.
    8. نقل الحمض النووي المائل إلى أنابيب تفاعل موسومة بحجم 1.5 مل وتخزينه عند −20 درجة مئوية.
      ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة. قد يتم تنفيذ خطوات إضافية لإزالة مثبطات المثبط في هذه المرحلة.
  3. qPCR
    1. إعداد وقياس معايير الحمض النووي للأنواع المستهدفة باستخدام مستخلصات الأنسجة واختبار dsDNA عالي الحساسية القائم على الفلورة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). توليد منحنى قياسي من ثماني نقاط عن طريق التخفيف التسلسلي (1:10) بدءا من 10 نانوغرام/ميكرولتر11,55. معايير Aliquot قبل qPCR لتقليل دورات التجمد والذوبان.
      ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة.
    2. جهز جميع تفاعلات qPCR ثلاث مرات باستخدام صفائح 96 بئر.
    3. أضف وحدة تحكم بدون قالب (ماء جزيئي) ووحدة فراغ استخراج لكل لوحة qPCR.
    4. جهز الخليط الرئيسي وفقا للملف التكميلي 1 - الجدول التكميلي S2 والشكل 8A.
    5. في غطاء تحميل الحمض النووي، أضف معايير الحمض النووي المعدة مسبقا و3 ميكرولتر من مستخلص الحمض النووي إلى كل بئر يحتوي على الخليط الرئيسي (الشكل 8B).
    6. أغلق اللوح بفيلم ختم (الشكل 8C).
    7. الطرد المركزي عند 3,500 × جرام لمدة 10 ثوان وتحميله في جهاز PCR الكمية في الوقت الحقيقي (الشكل 8D,E).
    8. أجر الاختبار في ظروف دورة مثالية محددة في الجدول 2، وسجل البيانات باستخدام برنامج الشركة المصنعة (جدول المواد)11.

figure-protocol-6
الشكل 6: سير العمل لتحليل الحمض النووي. (أ) إزالة الغطاء المطاطي من مرشح eDNA المحفوظ ذاتيا ووضعه في قارورة إيرلينماير؛ (ب) تعقيم زوجين من الملقط عن طريق الاشتعال ثلاث مرات؛ (ج) طي غشاء المرشح؛ (د) إدخالها في أنبوب بسعة 2 مل؛ (ه) أضف مخزن التحلل والبروتيناز K، و(و) حضن العينات عند 56 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-7
الشكل 7: المواد والمعدات المستخدمة في استخراج الحمض النووي. (أ) ربط وغسل وأطباق التنظيف والمستهلكات والكواشف لتحضير الاستخراج؛ و(ب) الروبوت المختبري القائم على الخرزات المغناطيسية المستخدم في معالجة العينات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-8
الشكل 8: سير العمل ل qPCR. (أ) تحضير الخليط الرئيسي في غرفة معقمة سابقا بالأشعة فوق البنفسجية (تحت غطاء عمل مخصص لتحضير الخلطات الرئيسية)؛ (ب) تحميل معايير الحمض النووي والمستخلصات والتحكم في محطة تحميل الحمض النووي وفقا للنمط المعروض؛ (ج) صفيحة ختم؛ (د) الطرد المركزي؛ (ه) تحميل إلى دورة حرارة PCR كمية في الوقت الحقيقي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

تم جمع ما مجموعه 154 عينة من بصمات الفلوك (308 مرشح eDNA) في عام 2024 باستخدام هذا البروتوكول المحسن، بما في ذلك 96 مرشحا في خليج سكالفاندي (آيسلندا؛ 9 عناصر تحكم ميدانية و76 نسخة من الحوت الأحدب) تم الحصول عليها من مارس إلى نوفمبر، و151 مرشحا في جزر الأزور (البرتغال؛ 12 محاطا و15 نسخة من الحوت الأحدب) تم الحصول عليها في يوليو، و61 مرشحا في بحر ليغوريا (إيطاليا؛ 4 أجهزة تحكم ميدانية) تم الحصول عليها من مايو إلى أكتوبر. جميع العينات شملت جمع ما يصل إلى 10 لترات من ماء البحر (نسختان لكل عينة بصمة فلوك) باستخدام مرشحات eDNA ذاتية الحفظ (الجدول 3). تم جمع نوعين من الضوابط السلبية أثناء العمل الميداني: المياه المنقاة التي تصفيت بعد تنظيف المعدات بالمبيض، ومياه البحر التي جمعت عند إعادة دخول الميناء(الميناء)42. تم ترشيح الأخير عمدا قبل تنظيف المبيض لتقييم احتمال التلوث المتبادل مع الحمض النووي الحيتاني أثناء أخذ العينات. تم شحن العينات من كل موقع أخذ عينات على دفعتين إلى وحدة أبحاث البيئة التطبيقية للحيوانات، قسم علم الحيوان، جامعة إنسبروك (النمسا) للمعالجة المخبرية.

أداء الاختبار والتحكم
تم تحليل مجموعة فرعية من 44 مرشحا (30 نسخة منها 2 من أدوات التحكم الميدانية من خليج سكالفاندي، آيسلندا و14 مرشحا بما في ذلك 1 جهاز تحكم ميداني من المياه المحيطة بجزيرة فايال وبيكو، جزر الأزور، البرتغال) للبحث عن الحمض النووي الحيوي للحوت الأحدب (الشكل 9). تم قياس الإشارة في تفاعلات qPCR ثلاثية التكرار. تم اعتبار العينة (أي مرشح eDNA) إيجابية، إذا تم تضخيم واحد من كل ثلاثة نسخ qPCR. تم حساب حد الكشف (LOD) للاختبار في هذه الدراسة على أنه 0.0001 نانوغرام/ميكرولتر (متوسط Ct ل LOD = 35.8). عبر 41 مرشحا تم تحليلها، أظهر 20 (49٪) تضخيمات، بينما أظهر 24 (58٪) عدم تضخيم. عدم الكشف (بدون قيمة Ct) غالبا ما يعكس غياب أو تركيزات منخفضة جدا للحمض النووي المستهدف. شملت عدم الكشف 5 من أصل 13 مرشحا من جزر الأزور (38٪) و19 من أصل 28 مرشحا من آيسلندا (68٪). تم فحص عينات الاستخراج الفانقية للكشف عن حمض نووي للفقاريات البحرية باستخدام اختبار MarVer3رقم 70 ولم تظهر أي تضخيم قابل للكشف، مما يشير إلى عدم وجود تلوث متبادل أثناء استخراج الحمض النووي. لم تنتج أدوات التحكم الميدانية (NC) وqPCR (NT) أي تضخيمات، مما أكد غياب التلوث أثناء العمل الميداني وفحص qPCR (الجدول 4).

من بين 20 مرشحا إيجابيا، أظهرت تسعة (22٪) قيمة Ct واحدة على الأقل أقل من حد الكشف في الاختبار (LOD؛ 0.0001 ng/μL)، وبالتالي تم تصنيفها كاكتشافات موثوقة. شملت هذه 4 من أصل 8 مرشحات من جزر الأزور (50٪) و5 من أصل 12 من آيسلندا (42٪). أنتجت 11 مرشحة إضافية (27٪) قيمة Ct واحدة أو أكثر فوق LOD، بما في ذلك 4 مرشحات من جزر الأزور (50٪) و7 من آيسلندا (58٪)، مما يشير إلى اكتشافات معقولة (الشكل 10). كشفت التحليلات المقارنة عن قيمة أقل قليلا من متوسط عتبة الدورة (Ct) لمرشحات جزر الأزور (34.7 ± 3.60؛ n = 8) مقارنة بمرشحات آيسلندا (36.9 ± 3.60؛ n = 10). أظهر اختبار مان-ويتني U أن هذا الفرق لم يكن ذا دلالة إحصائية (U = 199.0، p = 0.204). نظرا للعلاقة العكسية بين قيمة Ct وقوة إشارة الحمض النووي، تشير النتائج إلى تركيزات أعلى قليلا من الحمض النووي eDNA للحوت الأحدب المستهدف في مرشحات جزر الأزور (الشكل 11).

قيود الجدوى
كان عدد عينات البصمات الدقيقة في كل رحلة يختلف حسب مدة الرحلة وظروف الطقس. تم جمع حوالي عينتين إلى ثلاث عينات (مما ينتج حتى ستة مرشحات eDNA) خلال جولات استمرت 3 ساعات في جزر الأزور، وعينتين إلى أربع عينات خلال ~8 ساعات في إيطاليا (مما أدى إلى ثمانية مرشحات)، وعينتين إلى عينتين (أسفرت عن ما يصل إلى 4 مرشحات) خلال جولات استمرت 3.2 ساعات في آيسلندا. كان أداء الترشيح مرتفعا عموما في جزر الأزور وإيطاليا. في جزر الأزور، تم ترشيح 10 لترات من مياه البحر بشكل منتظم خلال 10-15 دقيقة، بينما في إيطاليا، تم تصفية نفس الحجم في حوالي 10 دقائق. في آيسلندا، تراوحت الأحجام المفلترة بين 4.5 إلى 10 لتر (المتوسط = 8.5 لتر)، مع متوسط وقت ترشيح ~40 دقيقة بسبب انسداد المرشح المتكرر، ويرجح أن يكون بسبب الجسيمات في المياه في منطقة الدراسة. تحديدا، تم ترشيح 10 لترات بنجاح ل 46 من أصل 98 مرشحا (47٪)، وتم الحصول على أحجام بين 7 لتر و10 لترات ل ل 31 مرشحا (32٪)، وتم الحصول على أحجام بين 4 لتر و7 لتر ل 21 مرشحا (21٪) (الملف التكميلي 1 - الجدول التكميلي S3).

يوصي البروتوكول بترشيح ضابط واحد سلبي الحقل بعد كل خمس عينات من البصمة النفطية. ومع ذلك، في ظل ظروف مراقبة الحيتان التشغيلية، لم يكن بالإمكان تحقيق ذلك بالكامل في دراسة الحالة الموصوفة بسبب القيود اللوجستية، بما في ذلك توفر المرشحات المحدودة، والوقت الزمني، وتأخيرات الشحن. وقد خفض ذلك نسب التحكم إلى العينة القابلة للتحقيق إلى 1:10.7 في آيسلندا (9/96)، و1:12.6 في جزر الأزور (12/151)، و1:15.3 في إيطاليا (4/61). على الرغم من هذه الانحرافات، لم تظهر أي ضوابط سلبية في الحقول أو المختبر تضخيما.

figure-results-1
الشكل 9: نظرة عامة على مواقع العينة. تمثل النقاط السوداء في الخريطة المواقع التي تم أخذ عينات منها من بصمة زعانف حوت أحدب في خليج سكالفاندي (آيسلندا) وفي جزر الأزور. يتم الإشارة إلى اسم مرشح eDNA بالقرب من منطقة أخذ العينات المقابلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 10: الاكتشافات من مجموعة فرعية من مرشحات eDNA من جزر الأزور وآيسلندا. qPCR متوسط قيم Ct وقوة إشارة الحمض النووي للكشف الإيجابي في جزر الأزور وآيسلندا (على الأقل نسخة واحدة إيجابية من PCR)، مع SD وLOD. تلون الأشرطة حسب قوة الإشارة بالنسبة لمستوى الرؤية (LOD): الأزرق الداكن = إشارة قوية (Ct ≤ 35.8) يشير إلى اكتشافات موثوقة، والأزرق الفاتح = إشارة ضعيفة (Ct > 35.8) يشير إلى اكتشافات معقولة. تمثل أشرطة خطأ SD التغير بين نسخ PCR. الخط الأحمر المتقطع يشير إلى LOD (Ct = 35.8). تظهر متوسط قيم Ct فوق كل شريط. الاختصارات: Ct = عتبة الدورة؛ SD = الانحراف المعياري؛ LOD = حد الكشف. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 11: قيم عتبة الدورة المتوسطة لاكتشافات الحمض النووي لحيتان الأحدب من جزر الأزور وآيسلندا. تشير الخطوط السوداء داخل مخططات الصناديق إلى الوسيط، والمربعات الحمراء تمثل متوسط قيم Ct (SD)، بينما تمثل الشوارب القيم الدنيا والقصوى لجزر الأزور وآيسلندا. أظهر اختبار مان-ويتني U أن هذا الفرق لم يكن ذا دلالة إحصائية (U = 199.0، p = 0.204). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: تسلسلات البادئة والمجسات لاختبار qPCR المستهدف ل ND5. تشمل هذه التسلسلات بادئات أمامية وعكسية، وتسلسلات مجسات MGB (5′-3′)، ودرجة حرارة التلدين المثالية، وحد الكشف (LOD). (*) يعرف LOD بأنه أدنى تركيز DNA (ng/μL) في DNA النوع المستهدف، حيث ≥95٪ من نسخ PCR أدت إلى تضخيم إيجابي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: ظروف الدورة المحسنة لاختبار qPCR للحوت الأحدب eDNA. هذه الإعدادات المحسنة ل qPCR هي 95°C لمدة 10 دقائق (تنشيط الإنزيم)، ثم 40 دورة عند 95°C لمدة 15 ثانية (إزالة الطابع) و60°C لمدة 90 ثانية (التلدين/التمديد). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: نظرة عامة على تكوين أخذ العينات الميدانية. نظرة عامة على مناطق أخذ العينات، الشركاء الميدانيين، أنواع السفن، الأنواع المستهدفة، فترات أخذ العينة، وتكرارات العينات عبر جزر الأزور وآيسلندا وإيطاليا. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 4: ملخص كشف qPCR للعينات البيئية والضوابط. تظهر الاكتشافات الإيجابية (المميزة باللون الأصفر)، ويقوم qPCR بتكرار قيم Ct، وتظهر نتائج الكشف؛ تم تصنيف العينات على أنها إيجابية عندما أظهر أحد نسخ qPCR على الأقل تضخيما. "لا يوجد أشعة مقطعية" تشير إلى عدم وجود تضخيم، والعناصر السلبية لم تظهر تضخيما، وسلسلة التخفيف القياسية M. novaeangliae المستخدمة لتعريف أداء التحليل وLOD مدرجة في أسفل الجدول. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الملف الإضافي 1: يحتوي على أشكال وجداول إضافية، توفر معلومات إضافية حول تطبيق البروتوكول، بما في ذلك مجموعة أخذ عينات الحمض النووي eDNA بتصميم البرايمر ، أنواع الأوعية التي تراقب الحيتان، خصائص مرشح eDNA المحفوظة ذاتيا، أحجام الكواشف لاستخراج الحمض النووي وتفاعلات qPCR، والتغيرات في معدلات الترشيح عبر مناطق أخذ العينات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: ورقة بيانات ميدانية مستخدمة أثناء أخذ عينات eDNA للحيتانيات. نموذج موحد لتسجيل بيانات وصفية للرحلات، وملاحظات الحيتانيات، ومعلومات العينات والتصفية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: بروتوكول ميداني خطوة بخطوة لأخذ عينات الحمض النووي eDNA للحيتان على متن سفن مراقبة الحيتان، بما في ذلك تنظيف المعدات، وجمع مياه البحر والترشيح على متن السفينة، وتقرير العينات، والتخزين. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: قالب جدول بيانات عينات eDNA للحيتانيات. نموذج موحد لتسجيل معلومات أخذ العينات بعد جمع العينات والترشيح على متن السفينة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

الجدوى التشغيلية والتنفيذ الميداني
البروتوكول المعروض هنا يساهم في سير عمل موحد للحمض النووي الإلكتروني يوازن بين حساسية الكشف والقيود الواقعية. من خلال دمج أخذ عينات كبيرة الحجم الموجهة بطباعة الفلوك، والترشيح المدمج باستخدام مرشحات مغلقة ذاتية الحفظ، وتدابير مكافحة التلوث الموحدة، يوفر البروتوكول إطارا قابلا للتكرار يمكن تطبيقه عبر المناطق وحملات العينة. يتماشى هذا النهج مع الاعتراف المتزايد بالحمض النووي الإلكتروني كمكمل اقتصادي وقابل للتوسع لتقنيات المراقبة البحرية التقليدية 9,10,22.

اعتمدت الدراسات السابقة حول الحمض النووي الإلكتروني للحيتانيات بشكل كبير على أخذ عينات مياه البحر المعتمدة على الترانسيكيت من سفن البحث الكبيرة أو أخذ عينات انتهازية صغيرة الحجم بالقرب من مشاهدات الحيتانيات. تتيح الطرق المعتمدة على الترانسيكت تغطية مكانية واسعة لكنها غالبا ما تلتقط إشارات DNA مخففة ومنفصلة زمنيا، مما يحد من اكتشاف الأنواع النادرة أو العابرة71، حتى عند حدوث العينة بالقرب من السطح، وعادة ما تتطلب أوعية وبنية تحتية متخصصة 25,37,72. وعلى العكس، فإن أخذ العينات بحجم صغير بالقرب من الحيتان المطروحة يحسن خصوصية المواجهة لكنه يظل عرضة للسلبيات الكاذبة بسبب محدودية حجم المياه وممارسات الترشيح غير المتسقة72,73. من خلال استهداف البصمات الزهرية بشكل صريح وتصفية كميات كبيرة على متن الحيتان، يزيد سير العمل المعروض هنا من احتمال التقاط الحمض النووي الحيوي منخفض التركيز للحيتان مع بقائه ممكنا تحت قيود الوقت والمكان النموذجية لعمليات مراقبة الحيتان. استخدام الفلاتر المغلقة المحافظة ذاتيا يقلل أكثر من مخاطر التعامل والتلوث، مما يلغي الحاجة إلى مخازن حفظ ميدانية ويبسط اللوجستيات في ظروف مقيدة على متن السفينة42,66.

لضمان قابلية المقارنة بين الدراسات المتقاطعة، يجب أن تبقى المعايير التالية ثابتة ضمن حملة أخذ العينات: جمع مياه البحر مباشرة من آثار الزهرة الحيتانية المرئية؛ نسختان بيولوجيتان بسعة 10 لتر لكل بصمة زبرة؛ استخدام مرشحات eDNA المحفوظة ذاتيا يسرع الترشيح الداخلي أثناء إجراءات مكافحة التلوث الموحدة، بما في ذلك التحكم السلبي في المجال المنتظم عند تردد أدنى محدد؛ وفحص qPCR الخاص بالنوع الذي يجرى في ثلاث نسخ مع ضوابط مناسبة. قد تختلف المعايير الأخرى دون المساس بالإطار المنهجي، بشرط تطبيق الإبلاغ عنها بشكل متسق وشفاف، بما في ذلك معدات جمع المياه والتعامل معها، حجم مسام المرشح، نوع المضخة وتكوين الأنابيب، مدة الترشيح والحجم المصفى الممكن تحقيقه تحت ظروف الانسداد، لوجستيات العينات على متن السفينة، وظروف التخزين قصيرة الأمد قبل الشحن. نظرا لأن العديد من خطوات المعالجة في دراسات eDNA لا تزال متغيرة، ينصح بشدة بالتقارير الصارمة لجميع خطوات أخذ العينات والتحليل.

تكون جدوى هذا البروتوكول في أعلى حالاتها تحت حالات البحر الهادئة إلى المتوسطة (≤ بوفورت 3)، مع عكارة منخفضة إلى متوسطة، عندما يسمح الوقت والمساحة على متن السفينة بمعالجة مرشحين eDNA لكل بصمة فلوك وحجم ماء مفلتر يبلغ 10 لترات لكل مرشح. عمليا، يمكن للعلماء المدربين أخذ عينات حتى بوفورت 3، لكن يجب على العلماء المواطنين العمل فقط في ظروف هادئة (بوفورت 1-2)، بسبب حركة السفن والاضطرابات، رغم أن جولات مراقبة الحيتان تقام أحيانا في بوفورت 3. يجب أن يبدأ الترشيح في أقرب وقت ممكن بعد جمع المياه لتقليل تحلل الحمض النووي 47,74. استراتيجيات أخذ العينات التي تقلل من تخفيف الحمض النووي السطحي الناتج عن المراوح، مثل أخذ العينات من الجانبين المعاكس والسفلى للسفينة، تدعم دقة الاستهداف والاكتشافات الموثوقة47. تجنب المناورة العكسية ومنع الحبال (المتصلة بدلاء) من ملامسة عينات مياه البحر يقلل أكثر من خطر التلوث، بما يتوافق مع أفضل الممارسات المائية للحمض النووي eDNA38. اعتمادا على تكوين السفينة واللوجستيات (مثل ارتفاع السفينة، الحركة، والمساحة المتاحة على متن السفينة)، يتم دعم استراتيجيتين لأخذ عينات إذا تم تطبيقهما بشكل متسق: (1) جمع وترشيح مستقلين لنسختين بسعة 10 لتر باستخدام دلوين منفصلين، أو (2) جمع عينة ماء واحدة بسعة 20 لتر تنقل إلى حاوية معقمة محكمة الإغلاق للنقل الآمن على متن السفينة، ثم تقسيمها لاحقا إلى نسختين بسعة 10 لتر للترشيح. يمثل حجم ترشيح 10 لترات لكل مرشح حلا وسطا عمليا بين احتمال الكشف وجهود الترشيح في ظروف مراقبة الحيتان.

الأحجام الأكبر تعزز احتمالية التقاط الحمض النووي الإلكتروني النادر أو منخفض التركيز، وتقلل السلبية الكاذبة الشائعة في دراسات الحيتانيات39,40,75، مع البقاء ممكنة عمليا عند اقترانها بمرشحات ذاتية الحفظ وأحجام مسام كبيرة42. قد تؤدي الأحمال الجزيئية المرتفعة، أو حركة السفينة، أو مساحة السطح المحدودة، أو قيود الوقت إلى تقليل كفاءة الترشيح والأحجام الممكنة، مما يحد من تطبيق البروتوكول. في مثل هذه الحالات، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات متوافقة مع البروتوكولات، مثل تقليل حجم المياه أو أحجام مسام المرشح البديلة، ويجب تطبيقها باستمرار ضمن حملات أخذ العينات للحفاظ على قابلية مقارنة البيانات. مدة الرحلة، توقيت لقاءات الحيتان، وقدرة الترشيح تحدد أعداد العينات القابلة للتحقيق. في جولات مراقبة الحيتان القياسية التي تستمر 3 ساعات، يمكن عادة إكمال واحدة إلى اثنتين من عينات بصمات الحيتان (وأحيانا ثلاث) دون تعطيل العمليات أو تجربة العلم المواطن. خلال الرحلات الاستكشافية الطويلة، تتناسب سعة أخذ العينات مع الجهد اليومي لمراقبة الحيتان (مثلا، ~8 ساعات يوميا في دراسة الحالة الخاصة بنا في إيطاليا). عمليا، يمكن تنفيذ أخذ عينات eDNA في جميع المواقع الثلاثة خلال ذروة النشاط السياحي.

نجاح تضخيم الحمض النووي الإلكتروني ومكافحة التلوث
قد تحتوي العينات البيئية، خاصة تلك التي جمعت في المياه الغنية بالمغذيات، على مثبطات PCR قادرة على كبح التضخيم وإنتاج سلبيات كاذبة76. على الرغم من عدم اكتشاف أي تثبيط في التحليلات السابقة من عينات آيسلندية ضمن نفس المشروع42، فإن إدراج خطوة إزالة المثبط ضمن نجاحا مستمرا في التضخيم (انظر جدول المواد) ويتماشى مع أفضل الممارسات لسير عمل الحمض النووي الإلكتروني المائي14,55.

يشير الأداء المتسق للكشف عن qPCR عبر المناطق إلى أن البروتوكول يلتقط بشكل موثوق الحمض النووي للحيتانيات تحت ظروف بيئية متنوعة. من المرجح أن تعكس التغيرات الطفيفة في الحمض النووي فروقا إقليمية في درجة الحرارة والعكارة والإنتاجية، والتي تؤثر على إطلاق الحمض النووي الإلكتروني وتحلله وتشتتالحمض النووي 75,76. حد الكشف للاختبار (0.0001 نانوغرام/ميكرولتر) يقع ضمن نطاق الحساسية المبلغ عنه لاختبارات الحيتانيات المعتمدة الأخرى التي تم تطويرها ضمن مشروع eWHALE 14,11,42. كانت معدلات الكشف متوافقة مع التحقيقات المنشورة سابقا القائمة على بصمات الفلوك، مما يؤكد تأثير سلوك النوع وتكرار الظهور على نجاح الكشف 41,42,47. تم استخدام معايير الحمض النووي المشتق من الأنسجة لقياس qPCR، مما يعكس ممارسة شائعة في أبحاث الحمض النووي الإلكتروني البحري 57,72,77,78,79. بينما قد يدخل هذا النهج تباين في القياس المطلق 11,61,80,81,82,83، خاصة للعينات البيئية منخفضة التركيز وغير المتجانسة 84,85، إلا أنه يعكس تعقيد العينات الحقيقي55,86. قد يحسن استخدام المعايير التركيبية قابلية التكرار الكمي وقابلية المقارنة بين الدراسات، وهو موصى به للتطبيقات المستقبلية11,87.

تشمل مصادر التلوث المحتملة نقل العينات المتقاطعة، بالإضافة إلى إدخال الحمض النووي البيئي البشري أو غير المستهدف أثناء خطوات التعامل، مما قد يؤدي إلى اكتشافات إيجابية كاذبة88. يعد السيطرة الصارمة على التلوث ضرورية في جميع مراحل المعالجة الميدانية والمختبرية، خاصة في ظل الظروف المقيدة النموذجية لعمليات العلم المواطني. التغييرات الروتينية للقفازات، واستخدام معدات خالية من الحمض النووي، وأنظمة الترشيح المغلقة، والتدريب الموحد، وإدراج الضوابط الميدانية والمختبرية بشكل روتيني، وتوثيق أحداث التلوث المحتملة، والتحقق من صحة الاختبارات وفقا للأطر المعتمدة كلها عوامل حاسمة لضمان موثوقية البيانات واكتشاف الأنواع 11,31,49,51,55,89. على الرغم من أن استخدام البلاستيك هو حد لا مفر منه في أخذ العينات الجزيئية الميدانية، إلا أنه تم تقليل الاستهلاك قدر الإمكان، وتم استخدام مواد ترشيح قابلة للتحلل جزئيا66.

القيود، قابلية التوسع والتداعيات المستقبلية
يظل انسداد المرشحات قيدا رئيسيا في البيئات العكرة أو المنتجة مثل خليج سكيالفندي (آيسلندا)، حيث من المرجح أن المواد العضوية المعلقة وكثافة العوالق قللت من كفاءة الترشيحبنسبة 43,90. تسجيل مدة الترشيح، ومؤشرات انسداد المرشح مثل انخفاض التدفق، وفقاعات الهواء المرئية في المرشح، أو إجهاد المضخة، وتقييد وقت الترشيح إلى حوالي 45 دقيقة لكل نسخة مكررة، يدعم التفسير والمقارنة في مرحلة لاحقة. استخدام جهاز عائم معقم لتعليق الفلتر أو أكياس الترشيح المغذية بالجاذبية قد يقلل من وقت التعامل أثناء الترشيح، رغم أن الأخير قد لا يكون متوافقا مع مرشحات eDNA المحفوظة ذاتيا والأحجام الكبيرة (≥1 لتر)91. قد تحسن مرشحات حجم المسام الأكبر (≥ 5 ميكرومتر) معدلات الترشيح بشكل أكبر، رغم أنه يجب تقييم كفاءة الكشف الخاصة بالتصنيف أثناء أخذ العينات التجريبية للحمض النووي للحيتان45,92.

تشمل الاعتبارات الرئيسية قبل أخذ العينات على نطاق كامل: إعطاء الأولوية للترشيح على متن السفينة على المعالجة المتأخرة، الحفاظ على أحجام المياه وتكوين المرشح الثابت، إجراء أخذ عينات تجريبية لتحسين الترشيح في الظروف المحلية، ومواءمة جهود أخذ العينات مع سعة السفينة ومدة الرحلة. يوصى بأدوات إدخال البيانات الرقمية التي تمكن من التسجيل الميداني المنظم من قبل العلماء المواطنين للتطبيقات المستقبلية93.

يظهر التطبيق الناجح لهذا السير من البداية إلى النهاية المتانة تحت القيود التشغيلية مع تسليط الضوء على القيود المتعلقة بالمكان، والزمان، والطقس، ومخاطر التلوث المتأصلة في سياقات علم المواطنين10,94. على الرغم من هذه القيود، تمثل أوعية مراقبة الحيتان منصة قوية وغير مستغلة لمراقبة حيتان eDNA عندما يتم توفير تدريب وإشراف موحد 31,32,42,95. دمج هذا السير مع أدوات مراقبة الحيتانيات المعروفة، مثل التعرف الضوئي، والصوتيات السلبية، وأخذ عينات الخزعة، يمكن أن يربط الاكتشافات الجينية بالبيانات السلوكية والديموغرافية. بينما تركز هذه الدراسة على الكشف القائم على qPCR الخاص بالنوع، قد تدمج التطبيقات المستقبلية ترميز الحمض النووي أو التحليلات الجينية السكانية، مما يوسع القيمة البيئية والحفظية لمراقبة الحمض النووي الإلكتروني للحيتانيات.

مع استمرار النهج المعتمدة على eDNA في الازدهار، يوفر هذا السير أساسا قابلا للتوسع لدمج المراقبة الجينية في برامج المراقبة البحرية والحفاظ عليها، خاصة في المناطق الساخنة للحيتانيات والنظم البيئية الحساسة.

الإفصاحات

بيلين غارسيا أوفيدي هي مؤسسة ومديرة تنفيذية لمنظمة أوشن ميشنز، وهي منظمة غير ربحية تركز على الحفاظ على المحيطات ومقرها هوسافيك، شمال شرق آيسلندا. تنسق أوشن ميشنز أخذ العينات من سفن مراقبة الحيتان في آيسلندا، وكذلك من سفن البعثة القطبية الشمالية. كما تمثل شركة نورث سايلينغ، وهي شركة مراقبة الحيتان في هوسافيك، ضمن مشروع eWHALE. لم تؤثر هذه الانتماءات على تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها.

شكر وتقدير

نود أن نشكر جميع الأشخاص المشاركين في العمل الميداني والعمل المختبري، وهم:

1) آيدان مابي، ماتيو توساتو، أنوك أدولف، جين لابورت، رومي نيروت وإيزابيل أوسترلي، الذين شاركوا في عينات جمعت في خليج سكالفاندي في آيسلندا؛ ii) دانيا تيسي، مايكل كوستا، ريتا نوربيرتو، مارلين شواندت، ريتا ليتاو، ريكاردو فينتورا، مارتين شوتن، جيادا فيسكونتيني، كاثارينا ليب، أنتوني لو فلوخ، فرانسيسكو نونيس، ريناتو كاردوسو، فوستين داريوس، مونيك شوتن، لورا بيت في جزر الأزور (البرتغال)؛ 3) ساندرا شالهارت، جانا روبرتسون في النمسا؛ و4) سابينا أيرولدي، ماريو جابوالدي، مارينا كوستا، مورغانا فيغي، نينو بيرانتونيو، روبرتو راينيري لجمع البيانات في محمية بيلاجوس (إيطاليا).

تم تمويل هذا البحث من قبل Biodiversa+، الشراكة الأوروبية للتنوع البيولوجي، ضمن دعوة BiodivProtect المشتركة لتقديم مقترحات بحثية ل2021-2022، بتمويل مشترك من المفوضية الأوروبية (GA رقم 101052342) والمنظمات الممولة: 1) المركز الأيسلندي للأبحاث (RANNÍS)، (منحة رقم 229030)، 2) وزارة الجامعات والبحوث (MUR)، من حساب FIRST وIGRUE الخاص المتعلق بالشراكة الأوروبية Biodiversa+ Call 2021 - مشروع eWHALE, 3) صندوق العلوم النمساوي (FWF) [doi: 10.55776/I6389] وصندوق النشر في جامعة إنسبروك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرشحات eDNA بديلة: SterivexTM / Waterraشركة ميرك ميليبور/ووترا بامبز المحدودةSVHVL10RC/NA0.45 وميكرو؛ حجم المسام. يتطلب تخزين تخزين الحمض النووي الإلكتروني (eDNA) 
AW1، AW2، مخازن الطاقة الكهربائيةQiagen   19081, 19072, 19077المحاليل الاحتياطية المستخدمة لتنقية الحمض النووي أثناء الاستخلاص
محلول المبيض (1:10)DM - Denk mit، Hygienereinigerمخصصتطهير السطح. جميع خطوات العمليات المخبرية
الدلاءمحلات القوارب، معدات الصيد، أمازونجامد. مطاط أو بلاستيك صلب (أكثر من 10 لتر). واحد أو أكثر حسب إعداد أخذ العينات واللوجستيات على متن السفينة
كاشف التنظيف، إكسبريس PCR إكسو ساب-IT75001.1.EAتحضير منتجات PCR لتسلسل سانجر
صندوق التبريدالإسكانحاوية صلبة معزولة أو كيس تبريد
قفازات قابلة للاستخدام مرة واحدة، بمقاسات كبيرة (L) ومتوسطة (M)،
خالية من البودرة		كيمبرلي-كلارك43431, 55090قفازات نيتريل أو لاتكس قابلة للاستخدام، صندوق بسعة 100 وحدة. المبلغ المطلوب: صندوق واحد لكل 10 - 15 رحلة
معايير الحمض النووي (3 & mu; ل) NAمخصصالتخفيف التسلسلي المشتق من نسيج الحمض النووي (8 نقاط، 10 نانوغرام /&ميكرو؛ L) من حوت الأحدب. المعايرة في qPCR
ملابس مختبرية آمنة للحمض النوويفالانو، PP-بشكل عام081-2900جميع خطوات العمليات المختبرية.
حاوية eDNAمتاجر الإسكان أو الأدواتNAمغلفة، متينة، شفافة (> 10 لتر). 
لوحة الاستلداد، غطاء القضيب، ألواح الغسيل، لوحة الربطتشياغن19581, 997004, 1031656, 302570البلاستيك المستخدم في استخراج الحمض النووي  
الإيثانول (8:10)تحمل، ACS ISO رنمختلفتعقيم على المقعد. جميع خطوات المختبر
أوراق بيانات الميدان
اختبار الحساسية العالية القائم على الفلورةثيرمو فيشر العلميس32851اختبار الحساسية عالية الكيوبت dsDNA (ثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، الولايات المتحدة الأمريكية)
جهاز طرد مركزي عالي السرعة (24,000 دورة في الدقيقة)Hettich Zentrifugen  يفصل المادة الفائقة التي تحتوي على الحمض النووي عن الحطام. تحلل الحمض النووي
أكياس الثلجمتاجر الإسكانتبريد العينات داخل حاوية الشحن
تمهيدات IPC للأمام والعكستقنيات الحمض النووي المتكاملةNAمنتج مخصص يستخدم لتضخيم الحمض النووي للنوع المستهدف
مجسات IPC PrimeTime qPCRتقنيات الحمض النووي المتكاملةNAمنتج مخصص يستخدم لتضخيم الحمض النووي للنوع المستهدف
غطاء تدفق لاميني  منتجات كيندرو لابراتشرVFS1206بيئة معقمة لتحضيرات الكواشف في تحضير qPCR
بروتوكول الحقل المصور المصفح&nb;مخصص
مخزن التحليلتشياغن79216مخزن تحليل DNeasy AL. بديل ل TES Buffer + Proteinase K
خرزة مغناطيسية – روبوت DNA قائم علىرأس كينغفيشر أبيكس 96 PCR5400910البرمجيات: BindIx PC 
الجسيمات المغناطيسية لارتباط الأحماض النووية (30 وميكرو؛ L)تشياغن67563جسيمات MagAttract (MagAttract Groups). يساعد ارتباط الحمض النووي بالخرزات المغناطيسية أثناء استخراج الحمض النووي
الماستر ميكس (5 & mu; L)EMM، لايف تكنولوجيز4396838مزيج تاكمان البيئي الرئيسي (2.0)
جهاز الطرد المركزي الصغير ذو الألواح الدوارة  لابنتC1000قم بتدوير قطرات السائل والتكثف الناتج عن PCR والألواح الدقيقة
مجموعة إزالة مثبط PCR OneStep-96أبحاث زيموD6035تنقية وإزالة الملوثات في مستخلصات eDNA  
لوحات PCRبيو-رادHSP9601هارد-شل 96-بئر
الماصات + الأطراف المصفحة المعقمةالبيبيت: BIOHIT، نصائح التصفية: Biozym Safe  نصائح الختم  الاحترافيةمختلفيمكن استخدام الماصات اليدوية أو الإلكترونية بأحجام قصوى مختلفة
جهاز الطرد المركزي الدوارة الصواحية NANAيزيل الفقاعات قبل qPCR 
إنزيم البروتيناز Kأفانتور VWRA4392.0010يهضم البروتينات للمساعدة في إطلاق الحمض النووي أثناء التحلل
الماء المنقىميلي كيوNAماء خال من RNase، يستخدم للتحكم السلبي ومحلول التنظيف 
أنابيب التفاعل (2 مل)إبندورف30120094تحلل الحمض النووي
دورة حرارة PCR كمية في الوقت الحقيقيAnalytikjenaNAمنصة QTower 3G. يضخم ويكمم الحمض النووي في الوقت الحقيقي
الحبالالقوارب، متاجر الأدوات، موانئ الصيدNAمادة قوية (مثل البولي إيثيلين أو الحبل المضفر). الطول على الأقل ضعف ارتفاع الوعاء
فيلم ختم (ختم الأغراض)، اللاصق، البصريبيو-رادMSB1001الميكروسيل 'ب'. ختم لوحة PRC قبل PCR
مرشحات eDNA المحفوظة ذاتياسميث-روت  11579-251.2 وميكرو؛ حجم المسام. الكمية لكل حملة أخذ عينات: حسب الحاجة
حاوية الشحنالمختبرات، الصيدليات، أمازونمختلفالستايروفوم معزول
برامج لمحاذاة وتحليل التسلسل البيولوجيتعديل السيرة الذاتيةالإصدار 7محرر وتحليل محاذاة التسلسل البيولوجي سهل الاستخدام لنظام Windows 95/98/NT
زجاجة ضغطالمختبرات والصيدلياتمختلفمملوء بالمبيض المنزلي (1:10)
برنامج التحليل الإحصائيR Studio Team. (2023)الإصدار 4.2.1
قفازات معقمة خالية من الحمض النوويسيمبيركير  الطبعة79712جميع الخطوات في العمليات المختبرية.
مخزن TESمنتج مخصص، يعادل مخزن تحليل DNeasy
حاوية النفايات السامةالتخلص الآمن من النفايات الخطرة. جميع الخطوات
مصباح UV سيريل إيرتعقيم الغطاء لتحضير qPCR
Vortex-genie 2 vortex mixer ثيرمو فيشر العلمي50728002يقوم بتجانس وخلط الكواشف. تحليل الحمض النووي، الاستخلاص
حاوية النفاياتمتاجر الإسكانحاوية صلبة صغيرة
مضخة المياه (التفريغ/الفراغ)إيكيلكامب؛ سولينست/سميث-روت 12.34.SB؛ 410/12099المضخات المحمولة
قلم التحديد المقاوم للماءمختلف

المراجع

  1. Hammerschlag, N., et al. Ecosystem function and services of aquatic predators in the Anthropocene. Trends Ecol Evol. 34 (4), 369-383 (2019).
  2. Sequeira, A. M. M., et al. Overhauling ocean spatial planning to improve marine megafauna conservation. Front Mar Sci. 6, 639(2019).
  3. Noren, D. P., Mocklin, J. A. Review of cetacean biopsy techniques: Factors contributing to successful sample collection and physiological and behavioral impacts. Mar Mamm Sci. 28 (1), 154-199 (2012).
  4. Evans, P. G. H., Hammond, P. S. Monitoring cetaceans in European waters. Mammal Rev. 34 (1-2), 131-156 (2004).
  5. Bittencourt, L., et al. Mapping cetacean sounds using a passive acoustic monitoring system towed by an autonomous Wave Glider in the Southwestern Atlantic Ocean. Deep Sea Res Part I. 142, 58-68 (2018).
  6. Balmer, B. C., et al. Advances in cetacean telemetry: A review of single-pin transmitter attachment techniques on small cetaceans and development of a new satellite-linked transmitter design. Mar Mamm Sci. 30 (2), 656-673 (2014).
  7. Angliss, R. P., et al. Comparing manned to unmanned aerial surveys for cetacean monitoring in the Arctic: Methods and operational results. J Unmanned Veh Syst. 6 (3), 109-127 (2018).
  8. Jahoda, M., et al. Mediterranean fin whale (Balaenoptera physalus) response to small vessels and biopsy sampling assessed through passive tracking and timing of respiration. Mar Mamm Sci. 19 (1), 96-110 (2003).
  9. Fu, M., Hemery, L., Sather, N. Cost efficiency of environmental DNA compared to conventional methods for biodiversity monitoring at marine energy sites. PNNL Rep. , PNNL-32310(2021).
  10. Sahu, A., et al. Environmental DNA (eDNA): Powerful technique for biodiversity conservation. J Nat Conserv. 71, 126325(2023).
  11. Klymus, K. E., et al. Development and testing of species-specific quantitative PCR assays for environmental DNA applications. J Vis Exp. (165), e61825(2020).
  12. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: The importance of primer specificity. PLoS ONE. 8 (3), e59520(2013).
  13. Wilcox Talbot, L. A., et al. Validated environmental DNA assay for detection of the rare Rice's whale (Balaenoptera ricei). Environ DNA. 7 (2), e70074(2025).
  14. Rodriguez, L. K., et al. Inter-laboratory ring test for environmental DNA extraction protocols: Implications for marine megafauna detection using novel qPCR assays. Metabarcoding Metagenomics. 9, e128235(2025).
  15. Adams, C. I., et al. Beyond biodiversity: Can environmental DNA cut it as a population genetics tool. Genes. 10 (3), 192(2019).
  16. Parsons, K. M., et al. Water everywhere: Environmental DNA can unlock population structure in elusive marine species. R Soc Open Sci. 5 (8), 180537(2018).
  17. Rourke, M. L., et al. Environmental DNA as a tool for assessing fish biomass: A review. Environ DNA. 4 (1), 9-33 (2022).
  18. Sard, N. M., et al. Comparison of fish detections using environmental DNA metabarcoding and traditional gears. Environ DNA. 1 (4), 368-384 (2019).
  19. Sigsgaard, E. E., et al. Population-level inferences from environmental DNA-Current status and future perspectives. Evol Appl. 13 (2), 245-262 (2020).
  20. Afonso, L., et al. Environmental DNA as a complementary tool for biodiversity monitoring. PLoS ONE. 19 (10), e0300992(2024).
  21. Silliman, K., et al. Evaluating prey availability for the Rice's whale based on environmental DNA. Ecol Evol. 16 (1), e72789(2026).
  22. Boyse, E., et al. Environmental DNA reveals fine-scale spatial and temporal variation of marine mammals and prey species. Environ DNA. 6 (4), e587(2024).
  23. Székely, D., Cammen, K. M., Olsen, M. T. Using environmental DNA to study marine mammals in the North Atlantic. NAMMCO Sci Publ. 12, (2021).
  24. Alter, S. E., et al. Using environmental DNA to detect whales and dolphins in the New York Bight. Front Conserv Sci. 3, 820377(2022).
  25. Parsons, K. M., et al. Environmental DNA for monitoring marine mammals: Challenges and opportunities. Front Mar Sci. 9, 987774(2022).
  26. Couton, M., Viard, F., Altermatt, F. Opportunities and inherent limits of using environmental DNA for population genetics. Environ DNA. 5 (5), 1048-1064 (2023).
  27. Leerhøi, F., et al. Exploring the potential of extreme citizen science with Danish high school students using environmental DNA for marine monitoring. Front Mar Sci. 11, 1347298(2024).
  28. Tøttrup, A. P., et al. Citizens in the lab: Performance and validation of eDNA results. Citiz Sci Theory Pract. 6 (1), (2021).
  29. Kelly, R., et al. Citizen science and marine conservation: A global review. Philos Trans R Soc B. 375 (1814), 20190461(2020).
  30. Church, E. K., et al. From citizen science experiences to stewardship action. Mar Policy. 173, 106537(2025).
  31. Barbaccia, E., et al. Combining citizen science, environmental DNA, and whale watching. Ocean Coast Manag. 269, 107827(2025).
  32. Barbaccia, E., et al. Willingness to engage in marine conservation through eDNA-informed citizen science. Sci Rep. 15 (1), 41983(2025).
  33. Broadhurst, H. A., et al. Citizen scientists' motivation to participate in environmental DNA (eDNA) surveys. Citiz Sci Theory Pract. 10 (1), (2025).
  34. O'Connor, S., et al. Whale Watching Worldwide. , Int Fund Anim Welfare. Yarmouth, MA. (2009).
  35. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  36. Foote, A. D., et al. Investigating the potential use of environmental DNA (eDNA) for genetic monitoring of marine mammals. PLoS ONE. 7 (8), e41781(2012).
  37. Baker, C. S., et al. Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales. Front Mar Sci. 5, 342201(2018).
  38. Takahashi, M., et al. Aquatic environmental DNA: A review. Sci Total Environ. 873, 162322(2023).
  39. Govindarajan, A. F., et al. Improved biodiversity detection using a large-volume environmental DNA sampler. Deep Sea Res Part I. 189, 103871(2022).
  40. Bessey, C., et al. Maximizing fish detection with environmental DNA metabarcoding. Environ DNA. 2 (4), 493-504 (2020).
  41. Robinson, C. V., et al. DNA from dives: Species detection of humpback whales from flukeprint environmental DNA. Environ DNA. 6 (2), e524(2024).
  42. Rodriguez, L. K., et al. Enhancing environmental DNA sampling efficiency for cetacean detection. Environ DNA. 7 (3), e70103(2025).
  43. Jackman, J. M., et al. Performance of eDNA filtration methods in a hyper-tidal estuary. Environ DNA. 7 (5), e70206(2025).
  44. Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Sci Rep. 8, 4682(2018).
  45. Liu, Q., et al. Optimization of pore size and filter material for better enrichment of environmental DNA. Front Environ Sci. 12, 1422269(2024).
  46. Li, J., et al. Effect of filtration method on environmental DNA capture efficiency. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  47. Robinson, C. V., et al. Temporal dynamics of flukeprint environmental DNA detection. Environ DNA. 7 (3), e70132(2025).
  48. Székely, D., et al. Environmental DNA captures the genetic diversity of bowhead whales. Environ DNA. 3 (1), 248-260 (2021).
  49. Bruce, K., et al. A practical guide to DNA-based methods for biodiversity assessment. Adv Books. 1, e68634(2021).
  50. Pogner, C. -E., et al. Airborne DNA: State of the art. Sci Total Environ. 957, 177439(2024).
  51. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for environmental DNA detection. Methods Ecol Evol. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  52. Combining environmental DNA sampling, whale watching and citizen science. , eWHALE Project. accessed (2025).
  53. Klotz, L., et al. Annual and monthly fluctuations in humpback whale presence. J Cetacean Res Manag. 16, 9-16 (2017).
  54. Peres dos Santos, R., et al. First humpback whale re-sighting. Polar Biol. 45 (3), 523-527 (2022).
  55. Thalinger, B., et al. Validation scale for environmental DNA assays. Environ DNA. 3 (4), 823-836 (2021).
  56. Hall, T. A. BioEdit. Nucleic Acids Symp Ser. 41, 95-98 (1999).
  57. Benoit, N. P., et al. Using qPCR of environmental DNA to estimate salmon biomass. Environ DNA. 5 (4), 683-696 (2023).
  58. Skovhus, T. L., et al. Real-time quantitative PCR for marine bacteria. Appl Environ Microbiol. 70 (4), 2373-2382 (2004).
  59. Godhe, A., et al. Quantification of diatom and dinoflagellate biomasses. Appl Environ Microbiol. 74 (23), 7174-7182 (2008).
  60. Baudry, T., et al. Influence of distance and seasonality in eDNA detection. Environ DNA. 5 (4), 733-749 (2023).
  61. Hunter, M. E., et al. Detection limits of PCR assays. Mol Ecol Resour. 17 (2), 221-229 (2017).
  62. Lee, J., et al. Species-specific eDNA assay for Ascidiella aspersa. Ecol Evol. 15 (11), e72453(2025).
  63. National Center for Biotechnology Information. BLAST. , accessed (2025).
  64. R Foundation. R. , (2023).
  65. susannat, eDNA sampling protocol: Smith-Root citizen scientist sampler. , protocols.io. (2024).
  66. Thomas, A., et al. Self-preserving eDNA filter. Methods Ecol Evol. 10, 1137-1145 (2019).
  67. Thalinger, B., et al. eDNA shedding of freshwater fish. Front Ecol Evol. 9, 623718(2021).
  68. Hymus, C. [PhD Thesis]. , Murdoch Univ. (2016).
  69. Rodriguez, L. K., Thalinger, B. DNA extraction - Qiagen BioSprint® 96 Workstation using the Biosprint 96 tissue protocol UIBK eWHALE. , protocols.io. (2024).
  70. Valsecchi, E., et al. Universal primers for marine mammals. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  71. Rota, A., Valsecchi, E. Floating Lab SOP. J Vis Exp. 222, e67366(2025).
  72. Robinson, C. V., et al. Limited cetacean detection by low-volume eDNA. Environ DNA. 5 (6), 1641-1651 (2023).
  73. Pinfield, R., et al. False-negative detections in killer whale presence. Environ DNA. 1 (4), 316-328 (2019).
  74. Strickler, K. M., et al. eDNA degradation. Biol Conserv. 183, 85-92 (2015).
  75. Rishan, S. T., et al. Applications of eDNA metabarcoding. Environ Adv. 12, 100370(2023).
  76. Schrader, C., et al. PCR inhibitors. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  77. Thomsen, P. F., et al. Detection of marine fish fauna. PLoS ONE. 7 (8), e41732(2012).
  78. Guri, G., et al. Detection sensitivity of qPCR and ddPCR. Ecol Evol. 14 (12), e70678(2024).
  79. Andruszkiewicz, E. A., et al. Persistence of marine fish eDNA. PLoS ONE. 12 (9), e0185043(2017).
  80. Venegas, V., Halberg, M. C. mtDNA copy number. Methods Mol Biol. 837, 327-335 (2012).
  81. Naue, J., et al. mtDNA copy number variation. Mitochondrion. 74, 101823(2024).
  82. Andreu, A. L., et al. mtDNA copy number. Mitochondrion. 9 (4), 242-246 (2009).
  83. Langlois, V. S., et al. Robust qPCR-based eDNA assays. Environ DNA. 3 (3), 519-527 (2021).
  84. Barnes, M. A., Turner, C. R. Ecology of environmental DNA. Conserv Genet. 17, 1-17 (2016).
  85. Mathieu, C., et al. Variability in eDNA data. Front Ecol Evol. 8, 466868(2020).
  86. Wilson, C. C., et al. Synthetic controls for eDNA. Methods Ecol Evol. 7 (1), 23-29 (2016).
  87. Lux, M. W., et al. Reproducibility in synthetic biology. Synth Biol. 8 (1), ysad014(2023).
  88. Sepulveda, A. J., et al. Contamination in eDNA studies. Front Ecol Evol. 8, 609973(2020).
  89. Minamoto, T., et al. An illustrated manual for environmental DNA research. Environ DNA. 3 (1), 8-13 (2021).
  90. Barnes, M. A., et al. Environmental conditions influence eDNA persistence. Environ Sci Technol. 48 (3), 1819-1827 (2014).
  91. Oka, S. I., et al. Gravity filtration of eDNA. MethodsX. 9, 101838(2022).
  92. Berran, M. S., et al. eDNA sampling strategies. Hydrobiologia. 852, 3485-3501 (2025).
  93. Esri. ArcGIS Survey123. , (2025).
  94. Ralson, M. J., et al. Translating eDNA into conservation action. Conserv Sci Pract. 7 (2), e70000(2025).
  95. Dela Cruz-Modino, R., Cosentino, M. Whale-watching industry value. Sustainability. 14 (20), 13471(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة