مقالة منهجية

الجراحة الستيريتاكسيكية في الفئران الرضيعة والرعاية بعد العملية

523 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70335

⸱

مارس 31, 2026

 , 
1Neurobiology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Research Triangle Park

في هذه المقالة

ملخص

تعد القدرة على التعبير عن ناقلات الفيروسات في الدماغ قبل البلوغ أساسية لدراسة آليات الخلايا والدوائر لتطور الدماغ. هنا، نصف بروتوكولا لإجراء جراحة الفيروسية المجسمة في الطفلة الفأر في الأيام 11 أو 12 بعد الولادة (P11-P12) ونوفر إرشادات للرعاية بعد العملية.

الملخص

فهم العمليات التطورية والخلوية والدوائر الكهربائية عبر فترة ما بعد الولادة أمر بالغ الأهمية لتوضيح تعقيدات تطور الدماغ وتأثيره على النضج السلوكي والاجتماعي. الانتقال من مرحلة الرضيع إلى البلوغ يتضمن تغييرات عصبية كبيرة في علم الأحياء، بما في ذلك تقليم التشابك العصبي والتخمير الميليني، وهما أساسيان للقدرات الإدراكية وتنظيم المشاعر والتفاعلات الاجتماعية. تمكن دراسة تطور الدماغ في فئران ما قبل البلوغ الباحثين من تحديد الفترات الحرجة التي تدعم نمو الدماغ الصحي ووضع تدخلات في الوقت المناسب لاضطرابات النمو العصبي. لتحليل وظائف الدماغ بدقة، كانت الجراحة المجسمة تقنية محورية في أبحاث علم الأعصاب، حيث توفر دقة لا مثيل لها في استهداف مناطق الدماغ ذات الاهتمام والسماح بتوصيل العوامل الفيروسية. على الرغم من أن عمليات التجسيس المجسم في الفئران البالغة تطبق على نطاق واسع في مختبرات علم الأعصاب، إلا أن هناك إرشادات محدودة جدا لإجراء جراحات التجسيد المجسم في الفئران قبل البلوغ، بالإضافة إلى رعاية حاسمة بعد العملية لضمان إمكانية إعادة إدخال الرضيع بنجاح إلى والدته وأزلائه. هنا، نصف بروتوكولا للجراحة الستيريتاكسية وحقن الفيروس في فئران الرضع (P11-P12)، مع تسليط الضوء على التخدير وتسليم المسكنات، والاعتبارات المتعلقة بالرعاية بعد العملية، والاختلافات عن الجراحة الستيريتاكسي لدى البالغين. يمكن تطبيق هذا البروتوكول في أي منطقة دماغية محل اهتمام من خلال تحديث الإحداثيات المستهدفة المطلوبة، ويمكن تعديله لاستهداف الدماغ في مراحل لاحقة من التطور بعد الولادة، مثل خلال فترة الصغر (P15-P30). بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول نقطة دخول لدراسة تطور الدماغ بعد الولادة ووظائفه.

المقدمة

تعد فترة الطفولة والمراهقة فترتا حاسمتين بعد الولادة لتطور الدماغ، وتتميز بالتطور المياليني، وتكوين المشابك العصبي، والتقليم المشبكي، مما يسهل تحسين الدائرة 1,2. ظهور السلوكيات الاجتماعية، بما في ذلك التزاوج، والعدوانية، واللعب الاجتماعي، يحدث خلال فترة ما قبل البلوغ (P28-40)3، ويتم تنظيمه بدقة بواسطة هرمونات الستيرويد المتداولة4،5. على الرغم من التقدم الكبير في الأدوات لتحليل الأسس الخلوية للسلوكيات الاجتماعية لدى البالغين، إلا أن القليل معروف عن الآليات العصبية التي تكمن وراء ظهور السلوكيات الاجتماعية عبر النمو بعد الولادة. تشمل أسباب نقص فهم الدوائر الاجتماعية المتطورة: 1) التحديات المرتبطة بإجراء العمليات الجراحية على الفئران الصغيرة، بما في ذلك أجهزة التصوير المجسم غير المصممة للفئران الصغيرة، 2) تحقيق توازن بين سلامة وفعالية المسكنات والتخدير أثناء الجراحة6، و3) قبول الرضع من قبل الأم بعد الجراحة. علاوة على ذلك، فإن الطرق الحالية المستخدمة لتوصيل البنى الجينية في نقاط زمنية مبكرة بعد الولادة، مثل التقميم الكهربائيللرحم 7، أو حقن الفيروسات داخل البطين في دماغ فأر حديثي الولادة (P0-P10)8، أوالتهجينات الجينية 9 لمحرك الريكومبيناز والخط المستجيب، ليست مثالية، لأنها تفتقر إلى الاستهداف الدقيق والتركيز على الاستهداف الجنيني أو P0.

هنا، نقدم بروتوكولا بسيطا للجراحة الستيريتاكسية في الفئران الصغيرة (P11-P12) ورعاية ما بعد العملية لدعم إعادة الدمج الناجحة مع الأم وأزواج الولادة. يستفيد هذا البروتوكول من البروتوكول الحالي للفئران البالغة10 ويتطلب فقط تغييرات طفيفة في إعداد الستيريوتاكسي. نقدم أيضا إرشادات مفصلة حول الرعاية بعد العملية وحول التخدير الناجح وتخفيف الألم لدى الفئران الرضع. اخترنا الفترة الزمنية P11-12 للجراحة حيث توجد فترة حضانة مدتها أسبوعان للتعبير الفيروسي، لذا يمكن اختبار الفئران في الجسم الحي بدءا من P24، قبل فترة ما قبل البلوغ (P28-40). ومع ذلك، يمكن استخدام نفس البروتوكول في الجراحة المجسمة في أوقات لاحقة. نركز على اللوزة الدماغية الوسطى النامية (MeA)، وهي تقسيم فرعي للوزة الدماغية يتميز بدوره في مجموعة متنوعة من السلوكيات الاجتماعية11,12. نحقق بشكل خاص في مجموعة فرعية MeA التي تعبر عن Foxp2 (MeAFoxp2)13، وهو عامل نسخ صندوق شوكة، حيث اكتشفنا سابقا أن هذه الخلايا مبرمجة بشكل فريد لمعالجة الإشارات الحسية الذكرية في الفئران الذكور خلال فترة النمو بعد الولادة14. بالإضافة إلى ذلك، يطلب من مجموعة MeAFoxp2 أن تعدل العدوانية الإقليمية في الذكور14 بشكل ثنائي الاتجاه. بشكل عام، يسمح البروتوكول الحالي لعلماء الأعصاب بتوصيل العوامل الفيروسية بدقة إلى مناطق دماغية مستهدفة في المراحل الرئيسية بعد الولادة من تطور الدماغ لدراسة الأسس الخلوية والدوائر للسلوكيات الاجتماعية والارتباطية عبر فترة المراهقة والبلوغ.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في NIEHS وكان متوافقا مع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لاستخدام ورعاية الحيوانات. تم استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، وقناع الوجه، والرداء، وشبكة الشعر، وأغطية الأحذية، طوال فترة الجراحة وأثناء وجود الحيوانات.

1. تحضير وتعديلات جهاز الستيريتاكسي للفأر (الشكل 1)

  1. جهز جهاز الستيريتاكسي مع ملحقات ستيريوتاكسيكية للفئران الرضيعة، بما في ذلك زوج من قضبان الأذن غير القابلة للنشوة، وحامل رأس تخدير غازي معدل، وقضيب الحنك للأطفال P12.
  2. قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية باستخدام معقم خرز زجاجي (250 درجة مئوية، 30 ثانية للأدوات الصغيرة ودقيقة واحدة للأدوات الكبيرة). ضع الأدوات المعقمة على ستائر معقمة بعد التعقيم. يجب أن تبقى الأدوات المعقمة في الحقل المعقم طوال فترة الجراحة.
  3. ضع درعا معقما آخر فوق وسادة تدفئة بدرجة حرارة ~37 درجةمئوية على جهاز الستيريوتاكسيك للحفاظ على حرارة الطفل تحت السيطرة طوال العملية الجراحية. راقب درجة حرارة وسادة التدفئة طوال فترة العملية.

2. تحضير الفئران جراحيا، وضع المجسمات المجسمة، التسوية والجمجمة

  1. قس وزن الجسم لتوفير الجرعة المناسبة من المسكن.
  2. ضع الفأر في غرفة تحفيز مملوءة بالإيزوفلوران بنسبة 3٪ بمعدل تدفق أكسجين 0.9 لتر/دقيقة. تحقق من أن تنفس الفأر قد انخفض إلى ~1 نفس في الثانية وأنه لا يوجد استجابة بعد اختبار رد فعل انسحاب الدواسات. قم بتحويل تدفق الإيزوفلوران/الأكسجين إلى الإطار الستيريوتاكسي وتقليل تركيز الإيزوفلوران إلى 2٪.
    ملاحظة: يجب تأكيد التخدير الكافي من خلال عدم وجود استجابة لرد فعل انسحاب الدواسات كل 5 دقائق طوال مدة الإجراء. راقب نمط تنفس الفأر بعناية طوال فترة العملية. قم بضبط تركيز الإيزوفلوران طوال فترة الجراحة بحيث يتم استخدام أقل نسبة للحفاظ على التخدير العميق وتجنب الجرعة الزائدة من التخدير.
  3. قم بتركيب الفأرة على جهاز الستيريوتاكسي المعدل مع ملحقات ستيريوتاكسيك للفئران الرضع. ضع قضبان أذن غير مثقوبة على جانب رأس الفأر وقم بمحاذاة مسطرة قضيب الأذن لتكون متساوية المسافة بين الجانبين بالنسبة لمسطرة الإطار الستيريوتاكسي. بالنسبة للأطفال P11، اضبط المسطرة الستيريوتاكسية على 5 مم.
    ملاحظة: عادة لا يكون لدى الرضع في P11 عيونهم مفتوحة بعد، لذلك لا حاجة لاستخدام مزلق للعين. بحلول الحلقة الثانية عشرة، يكون بعض الأطفال قد فتحوا أعينهم. إذا كانت عينا الرضيع مفتوحتين، يجب وضع مرهم العيون وإعادة تطبيقه حسب الحاجة طوال فترة الجراحة.
  4. حقن 5 ملغ/كجم من الميلوكسيكام عبر الطريق تحت الجلد (s.c.) داخل الكتف باستخدام حقنة بحجم 1 مل مع إبرة 27 جرام.
  5. قم بتخفيف 0.5٪ بوبيفاكائين (5 ملغ/مل) بالمحلول الملحي إلى 0.5 ملغ/مل (1:10) وحقن الحمام تحت جلد الرأس (أي 0.05 مل لطفل يزن 5 جرام).
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات من 2.6 إلى 3.15 باستخدام قفازات معقمة.
  6. قم بإجراء شق بطول 1.5 سم باستخدام مقص صغير على طول خط منتصف الرأس.
  7. استخدم مسحة قطنية معقمة لإزالة الأنسجة الرخوة بعناية من سطح الجمجمة باستخدام البيتادين.
  8. ضع شعيرات زجاجية مسحوبة (~0.8 مم طولا) في حامل ماصة زجاجية. ثبت الحامل على الذراع العمودي المجسم.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات من 2.9 إلى 3.10 تحت مجهر تشريح.
  9. تسوية الزاوية الأمامية الخلفية لسطح الجمجمة:
    1. حرك الشعيرات الدموية إلى نقطة التقاء الجيوب الظهرية (RCS) (الشكل 2) كما هو موضح في تشان وآخرون 15.
    2. تحت المجهر بتكبير 2x، قم بصفر إحداثيات X (الوسطية-الجانبية)، Y (الأمامي-الخلفية)، وZ (ظهرية-بطنية) عندما يكون الشعيرات الدموية تلمس الجمجمة في نقطة RCS قليلا باستخدام وحدة العرض الرقمية لجهاز الستيريوتاكسيك.
    3. حرك الشعيرات الدموية إلى لامبدا (عند Y = -7.30 مم) وخفض الشعيرات الشعرية لتلامس الجمجمة قليلا (الشكل 2).
    4. تحقق من قيمة إحداثيات Z واستوى الزاوية الأمامية-الخلفية في جهاز الستيريوتاكسي لتغيير زاوية ميل الرأس. كرر الخطوات من 2.9.1 إلى 2.9.3 حتى يصبح الفرق في قيمة إحداثي Z بين RCS و lambda هو <0.02 مم.
  10. تسوية الزاوية الوسطى الجانبية لسطح الجمجمة:
    1. انقل الشعيرات الدموية إلى نقطة RCS.
    2. صفر إحداثيات X (الوسطية-الجانبية) وY (الأمامية-الخلفية) عندما تلمس الشعيرات الدموية الجمجمة قليلا في نقطة RCS.
    3. لتسوية الرأس باستخدام إحداثيات MeA الخلفية (MeApd)، حرك الشعيرات الدموية إلى X = +2.50 مم، Y = -4.20 مم، وصفر Z (ظهري-بطني) عندما تلمس الشعيرات الدموية الجمجمة قليلا.
    4. حرك الشعيرات الدموية إلى X = -2.50 مم، Y = -4.20 مم في نصف الكرة الآخر وخفض الشعيرات الشعرية قليلا لتلامس الجمجمة.
    5. تحقق من قيمة Z واضبط المحور الوسطي-الجانبي في جهاز الستيريوتاكسي لتغيير زاوية ميل الرأس. كرر الخطوات من 2.10.1 إلى 2.10.4 حتى يصبح الفرق في قيمة Z بين نصفي الكرة الأيمن والأيسر <0.03 مم.
  11. قم بإزالة حامل الشعيرات الشعرية وركب مثقاب دقيق مع رأس مثقاب #75 في حامل مثقاب ستيريوتاكسي على الذراع العمودي المجسم.
  12. ضع رأس رأس الحفر فوق نقطة RCS، وصفر إحداثيات X (الوسطية-الجانبية) و Y (الأمامية-الخلفية). انتقل إلى X = ±2.03 مم، Y = -4.20 مم لاستهداف الميكانيكية الرضعية P11.
  13. احفر عملية فتح الجمجمة بقطر 0.5 مم.
  14. نظف سطح الجمجمة بعناية باستخدام محلول ملحي معقم باستخدام مناديل دقيقة وأعواد قطنية.
    ملاحظة: ضع محلول ملحي معقم بانتظام للحفاظ على ترطيب سطح الجمجمة.

3. حقن فيروسي

  1. املأ شعرا شعريا جديدا بزيت معدني باستخدام إبرة مرنة من نوع microfil.
  2. اربط وشد الشعيرات الدموية بحقن النانولتر.
  3. أزل المثقاب الصغير وركب حقن النانولتر على الذراع العمودي الستيريوتاكسي.
  4. سحب على الأقل ضعف كمية الفيروس المطلوبة للجراحة (هنا، 400 نانولتر) بمعدل 10 نانولتر/ثانية.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي فيروس AAV محل اهتمام في حقن الفيروس بعد موافقة المؤسسة. في هذا البروتوكول، استخدمنا AAV2-DIO-mCherry (BSL-1، 2.5 E+13 vg/mL، 3 ميكرولتر/أنبوب، مخزن عند -80 °م ثم نقل إلى ثلج للجراحة).
  5. حرك الشعيرات الدموية إلى نقطة RCS وصفر إحداثيات X و Y.
  6. انقل الشعيرات الدموية إلى منطقة الدماغ المستهدفة، هنا MeAPD (الإحداثيات: X = ±2.03 مم، Y = -4.20 مم، Z= -5.08 مم من RCS).
  7. خفض الشعيرات الدموية إلى سطح الجمجمة، ثم قم بصفرهم بصفر الإحداثي Z.
  8. اصنع مسارا عن طريق خفض الشعيرات الدموية إلى العمق المطلوب وسحب الشعيرات الدموية من الدماغ.
  9. حقن ~8 نانولتر من الفيروس للتأكد من أن الشعيرات الدموية لم تسد قبل إدخالها مرة أخرى إلى الدماغ. إذا انسدد، أضف محلول ملحي معقم إلى المساحات المهمة وامسح بلطف جوانب وأسفل الشعيرات الدموية لإزالة الانسداد.
  10. خفض الشعيرات الدموية مرة أخرى إلى العمق المطلوب وحقن الكمية الفيروسية المطلوبة (في هذه الحالة، 150 نانولتر من الفيروس) بمعدل 20 نانولتر/دقيقة.
  11. عند الانتهاء، انتظر 5 دقائق قبل سحب الشعيرات الدموية ببطء.
  12. إذا لزم الأمر، كرر الخطوات 3.4-3.11 لحقن الفيروس في نصف الكرة الخصي المقابل.
  13. أزل الشعيرات الدموية من حقنة النانولتر. تخلص من الشعيرات الدموية والأنابيب الفيروسية المستخدمة في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل مع 10٪ مبيض.
    ملاحظة: يجب على المختبرات الفردية اتباع جميع إرشادات التعامل مع النفايات، وإدارة التسربات، والامتثال للسلامة الحيوية من فرع المؤسسة البيولوجية والسلامة البيولوجية.
  14. خيط الجلد بخياطة 7-0 غير قابلة للامتصاص. حاولي رفع الشعر أثناء الخياطة حتى تبقى الغرز مخفية.
    ملاحظة: عادة ما تكفي 3-4 غرز. في أيدينا، خياطة 7-0 هي الأفضل لتجنب تمزق الغرز عند إعادة الطفل إلى القفص المنزلي.
  15. امسح منطقة الغرز بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين، ثم استخدم محلول ملحي باستخدام عشايش قطنية معقمة.
    ملاحظة: عادة ما تستغرق الجراحة بين ساعة وساعتين، حسب عدد الفيروسات المحقونة. عادة ما تتطلب الفيروسات ما لا يقل عن أسبوعين للتعبير الكامل.

4. الرعاية بعد العملية

  1. أخرج الطفل من الإطار الستيريوتاكسي وضعه في قفص نظيف فوق وسادة تدفئة. لمنع الجفاف، يوصى بحقن محلول ملحي معقم.
  2. راقب الطفل حتى يصبح قادرا على الحركة.
  3. بمجرد أن يتمكن الطفل من التحرك داخل القفص، ضع السد في قفص نظيف جديد لمدة ~2 دقيقة.
  4. ضع الرضيع في قفصه الأصلي بجانب رفاقه في الولادة. امسح جميع الأطفال بعناية بمواد العش والفراش من قفص منزلهم، ثم أعدهم إلى داخل العش. تابع لإعادة السد إلى القفص.
  5. راقب السد والرضع عن كثب. تأكد من أن السد يعود إلى العش ويعتني بالرضيع الجراحي لكنه لا يسحب الغرز.
  6. إذا لم تستقبل الأم بعد ساعة واحدة الطفل الجراحي، استخدم سد حاضن. إذا أظهرت الأم بالفعل قبولها للأطفال، استخدم هذا السد للولادات التالية (القبول بعد قبول الأطفال في الولادة الأولى كان بنسبة 100٪).
  7. بعد أربع وعشرين ساعة من الجراحة، فحص موقع الشق وإعطاء ميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، SC).
  8. بعد رعاية ناجحة بعد العملية، اترك الفأر الجراحي مع الأم والأبناء حتى يتم فطامه عند P21. قم بإزالة أي غرز ظاهرة خلال 10-14 يوما بعد الجراحة.
    ملاحظة: لا يتوقع وجود فروق كبيرة في تناول الطعام أو وزن الجسم أو سلوك الحركة لدى الفئران الجراحية مقارنة بمجموعة السيطرة من الأبناء العائلين.
    سيتم مراقبة الرضع يوميا لمدة يومين على الأقل بعد الجراحة ثم مرتين على الأقل أسبوعيا. معايير النهاية الإنسانية: إذا لم يكن الرضيع قادرا على المشي بعد ساعتين من الجراحة، فسيتم إعدامه بشكل إنساني. إذا أظهر الرضيع انخفاضا في وزن الجسم و/أو حركة الجسم بعد الجراحة، فسيتم إعدامه بطريقة إنسانية.

النتائج

سلامة مزيج الإيزوفلوران، البوبيفاكين، والميلوكسيكام في جراحات الرضع
سلامة استخدام التخدير والمسكنات في الفئران الصغار لا تزال غير واضحة6. لذلك، اختبرنا استخدام مزيج من التخدير ومسكنات الألم لدى الفئران الصغيرة لتحديد معدل البقاء. تم وضع الفئران الرضيعة عند P11 (وزن الجسم = 6.09 ± 0.90 جرام، وأقل وزن للجسم 3.9 جرام؛ n=13) في غرفة التحفيز للتخدير الأولي مع 3٪ إيزوفلوران في 0.9 لتر/دقيقة أكسجين. بمجرد تخدير الرضع وعدم استجابتهم لانعكاس سحب الدواسات، تم نقلهم إلى الجهاز الفراغي، وتم تقليل التخدير الإيزوفلوراني إلى 1.5-2٪ إيزوفلوران في 0.9 لتر/دقيقة من الأكسجين مع وسادة تدفئة (41.23 ± 2.28 درجة مئوية). بعد وضع الرضع في جهاز التجسيد، تم إعطاء مسكنات للعظام بين لوح الكتف (5 ملغ/كجم ميلوكسيكام) بالإضافة إلى تخدير موضعي يعطى تحت الجلد (0.05 ملغ/مل بوبيفاكين). بعد ثلاثين دقيقة، أزلنا الأطفال من جهاز الستيريتاكسي ووضعناهم في قفص نظيف. لاحظنا معدل بقاء بنسبة 100٪ (13/13) بعد 30 دقيقة من إعطاء المسكن. علاوة على ذلك، لم نلاحظ أي مضاعفات بعد 24 ساعة و72 ساعة بعد الجراحة، ولا حتى مرحلة البلوغ. تظهر هذه النتائج أن الجمع بين التخدير الموضعي ودواء مضاد للالتهابات غير ستيرويدي آمن للفئران الصغيرة ويقلل من الألم والانزعاج.

توصيل فيروسي دقيق ودقيق إلى منطقة الشرق الأوسط
لتأكيد دقة ودقة توصيل الفيروس خلال عمليات التصوير المجسم للرضع، قمنا بتوصيل AAV2-hSyn-DIO-mCherry بشكل ثنائي الجانب إلى جهاز MeApd لفئران الذكور Foxp2cre+/- عند P11 (الشكل 3A). ثم تم فطام الفئران عند P21. في P45، تم جمع أدمغة الفئران للتحليل المناعي النسجي وتحليل الصور كما وصفها سابقا مجموعتنا14 وأخرى16 (الشكل 3B,C). تم تخدير الفئران وتركيبها بجرعة 30 مل من 1× PBS، تلاها 30 مل من 4٪ PFA عند 10 مل/دقيقة. تم تثبيت الأدمغة بعد التثبيت طوال الليل عند 4 درجات مئوية في 4٪ من PFA، وحماية بالتبريد في 30٪ سكروز، وتم تركيبها في O.C.T.، وقطعت على عمق 50 ميكرومتر باستخدام جهاز تجميد (كريوستات). تمت معالجة كل قسم ثالث للكيمياء المناعية كما هو موضح سابقا14. تم حجب الأقسام العائمة الحرة في سيروم الحمار الطبيعي بنسبة 10٪، وحضنتها مع الجسم المضاد الأساسي طوال الليل، ثم غسلها، وحضنتها بالجسم المضاد الثانوي لمدة 4 ساعات، ثم غسلت مرة أخرى، وركبت على وسط يحتوي على DAPI قبل الانزلاق الداخلي. تم صبغ أقسام الدماغ بجسم مضاد Foxp2 وIgG من أليكسا فلور 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L).

لتأكيد كفاءة الهدف، حددنا التعبير المشترك لخلايا mCherry+ و Foxp2+ في MeA ولاحظنا تداخل 90.2٪ ± 2.1 عبر التجمعات، مما يشير إلى أن تعبير mCherry يقتصر على خلايا Foxp2+ بطريقة تعتمد على cre (الشكل 3D). تبرز هذه النتيجة الكفاءة العالية للحقن الفيروسي باستخدام هذا البروتوكول. علاوة على ذلك، قمنا بدراسة دقة حقن الفيروسات من خلال تحليل نسبة خلايا mCherry+ في MeApd مقارنة بنسبة mCherry الإجمالية عبر جميع المناطق. لاحظنا أن 93.7٪ ± 1.4 من خلايا mCherry+ كانت موجودة داخل MeApd، مما يشير إلى أن التعبير المكاني للفيروس محدود بمنطقتنا المعنية (الشكل 3E).

الشكل 1
الشكل 1: إعداد جراحة التصوير المجسم للرضع. (أ) جهاز ستيريوتاكسي. (ب) قضبان أذن غير قابلة للتمزق. (ج) حامل رأس وبار الحنك المخدر للغاز للرضع P12. (د) معقم الخرز. (ه) وحدة تحكم التدفئة. (و) ذراع ستيريوتاكسي. (G) حقنة نانولتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: المعالم الرئيسية في جمجمة الفأر P11. (أ) رسم تخطيطي للمعالم الرئيسية في جمجمة الرضيع. (ب) يتم تثبيت رأس الرضيع بواسطة ملحقات استيريوتاكسي متخصصة تشمل قضبان أذن غير قابلة للتمزق، وحامل رأس غاز معدل، وقضيب حبيبات للفئران P12. الاختصار: RCS = التقاء الجيوب الأنفية، SSS = الجيب السهمي العلوي، RRV = الأوردة الروسترالية-الأنفية، SOS = الجيب الشمي العلوي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: التعبير الفيروسي الثنائي المستهدف في مرض MeApd بعد جراحة التصوير المجسم للرضع. (أ) رسم تخطيطي للرؤية الإكليلية (MeAPD). (ب) صورة نسيجية تمثيلية للتعبير الثنائي لخلايا الجسم المضاد Foxp2 (الأخضر) وmCherry+ (الأرجواني) في الفئران الذكور البالغة Foxp2cre+/- (ج) عرض موسع لمنطقة التحليل المالي من القنوات المدمجة والفردية. الأسهم البيضاء تشير إلى الأجسام المضادة Foxp2 المسمة معا وخلايا mCherry+ . (د) كفاءة الحقن. (ه) دقة الحقن. (D,E) n=3 فئران، نصفي الكرة الأيسر والأيمن/الفأر. الاختصارات: MeApd = اللوزة الوزينية الخلفية العطرية؛ MeApv = اللوزة الدماغية الوسطى الخلفية البطنية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الطرقالإيجابياتالسلبياتالمرجع
في الرحم الكهربائينقل البلازميدات الأكبريفتقر إلى الاستهداف الدقيق، وعدم السمية، ويحتاج إلى مهارات عاليةوانغ وآخرون، طرق مولبيولوجيا. (2013).
حقن فيروسي داخل البطين الدماغيسريع، سهل، اقتصاديعدم وجود استهداف دقيق، خطر قتل الرضعكيم وآخرون، J Vis Exp. (2014).
الحقن الميكروتكتيكي المجسم عند P0استهداف دقيق، وانخفاض خطر رفض الأمتسمم الخلايا بسبب الفيروس، ليس مثاليا لدراسة النقاط الزمنية بعد البلوغتشين وآخرون، J Vis Exp. (2018).
العبور الجيني بين خطوط الريكومبينازغير جراحيعدم وجود استهداف دقيق، مكلفروبرتسون وآخرون، العلوم العصبية الوطنية (2013).

الجدول 1: ملخص للطرق السابقة المستخدمة لدراسة التطور الخلوي والدوائر الجنيني وما بعد الولادة في القوارض.

المناقشة

دراسة الآليات العصبية التي تقوم عليها السلوكيات الاجتماعية عبر النمو بعد الولادة أمر أساسي لفهم ليس فقط ظهورها، بل أيضا لفهم كيف يمكن أن تعطل هذه الآليات بفعل العوامل البيئية أو في اضطرابات النمو العصبي. تصف دراستنا بروتوكولا مفصلا للجراحة المجسمة لنقل الفيروس بدقة وكفاءة إلى أدمغة الفئران الرضيعة P11-12. لذلك، يسمح هذا البروتوكول بالتلاعب والتسجيل ودراسة الدوائر الكهربائية للمجموعات العصبية الجزيئية المحددة قبل وبعد البلوغ باستخدام استراتيجية فيروسية. نسلط الضوء على التعديلات والرعاية قبل وبعد العملية، بالإضافة إلى مزيج آمن من التخدير ومسكنات الألم التي تتحملها الفئران الرضيع جيدا.

عنصر أساسي وتحدي في جراحة الستيريتاكسي للرضيع هو إعادة إدخال الطفل بنجاح إلى قفصه المنزلي مع والده وأصدقاءه من الولادة. لضمان الرعاية المناسبة للرضيع عند إعادة إدخاله إلى القفص، يجب على الأم استرجاع الطفل والعناية به (دون الإفراط في العناية به)، ويجب مراقبة أي علامات إهمال محتملة عن كثب. بسبب شق الرضيع والخياطة، قد يؤدي السد إلى تمزيق منطقة الرأس بشكل مفرط، مما قد يؤدي إلى تمزق وإزالة الغرز. وهذا سيكون ضارا، ولهذا السبب فإن مراقبة سلوك الأم تجاه الرضيع بعد الجراحة أمر بالغ الأهمية لضمان البقاء. لزيادة قبول الرضيع بعد الجراحة، نوصي باستخدام بيروكسيد الهيدروجين والمحلول الملحي بعد الخياطة لتنظيف أي بقايا دم متبقية من الجلد والفرو واستخدام غرز أرق (7-0) من تلك المستخدمة لدى البالغين (5-0). أدت هاتان الاستراتيجيتان إلى قبول الأم للفئران الصغيرة بعد الجراحة.

بالإضافة إلى ذلك، توفر دراستنا إرشادات حول الاستخدام الآمن للتخدير والمسكنات في جراحات الرضع. وهذا أمر بالغ الأهمية لأن المواليد والفئران الصغيرة لا تتحمل جرعات المسكنات والتخدير كما هو الحال مع البالغين، مما قديؤدي إلى آثار جانبية ضارة على الجهاز التنفسي والقلبي. لاحظنا أن الإيزوفلوران، وهو تخدير فموي، ومزيج من الميلوكسيكام ومسكنات البوبيفاكين، التي تعطى تحت الجلد (داخل الرأس وتحت الجلد على التوالي)، كانت تتحملها الأطفال جيدا وأدت إلى بقاء طويل الأمد. علاوة على ذلك، أظهرنا سابقا أن إجراء الجراحة المجسمة في الفئران الرضيعة أدى إلى أوقات تحقيق مماثلة لفئران صغيرة بعد أسبوعين من الجراحة، مقارنة بالضوابط المتطابقة في الأعمار التي لم تخضع للجراحة14. لذلك، تشير هذه النتائج إلى تعافي كاف وعدم وجود عجز حركي واضح بعد الجراحة في الفئران الرضع. ومن الجدير بالذكر أننا لم نقيس كمية الأكسجين في الدم طوال فترة العملية. يجب مراقبة مستويات الأكسجين في الدم باستخدام جهاز قياس أكسجين النبض لمنع نقص الأكسجين17.

مكون حاسم آخر في هذا البروتوكول هو استخدام نظام الإحداثيات الستيريوتاكسي المعتمد على لامبدا وRCS عند منتصفالسهمية 15. يعد RCS معلما بارزا يعرف بالتقاء الجيب السهمي العلوي مع التقاء الجيوب الشمية العليا على طول خط منتصف السهمية. لقد أظهر هذا المعلم تغيرا موقعيا أقل باستمرار مقارنة بالمعالم الظهرية الأخرى بعد المحاذاة العامة للرأس. وهذا هو الحال حيث أن زيادة مسافة الفصل بين RCS/lambda، مقارنة بالبريغما/اللامبدا، تعزز الاستقرار وقابلية التكرار للزاوية الأفقية بين الحيوانات15.

ركزت الطرق السابقة لدراسة تطور الخلايا العصبية على استراتيجيات الفيروسية في نقاط زمن جنينية ونقطة P0، أو على الهزيجات الجينية لخلايا تحديد المصير محل الاهتمام (الجدول 1). تفتقر تقنيات مثل الحقن الكهربائي للرحم وحقن الفيروسات داخل البطين الدماغي إلى الاستهداف الدقيق. إجراء حقن فيروسية مستهدفة عند P018 يتغلب على هذه المشكلة من خلال حقن تركيب فيروسي بدقة في منطقة الاهتمام. ومع ذلك، يمكن أن تصبح البنى الفيروسية سامة للخلايا بعد عدة أسابيع، مما يؤدي إلى موت الخلايا. لذلك، قد لا يكون حقن تركيب فيروسي في دماغ حديث الولادة لدراسات البلوغ الطولية التي قد تستمر حتى مرحلة البلوغ أمرا مثاليا. لذلك، فإن نهجنا، الذي يتم فيه حقن الفيروس بعد أسبوع ونصف من الولادة، يقلل من خطر تسمم الخلايا خلال فترة البلوغ.

على الرغم من مزايا نهجنا، لا تزال هناك عدة اعتبارات. أولا، يجب تعديل إحداثيات الدماغ المستخدمة في الفئران الصغيرة عن تلك المستخدمة لدى البالغين. على سبيل المثال، في فئران P11 الصغيرة، نستخدم الإحداثيات التالية لاستهداف MeApd: X= +2.03 مم، Y= -4.20 مم، Z= -5.08 مم؛ بينما الإحداثيات المستخدمة في البالغين هي X= +2.15 مم، Y= -5.00 مم، Z= -5.10 مم. للأسف، هناك مراجع أقل لأطلس الدماغ للفئران قبل البلوغ19 مقارنة بتلك الخاصة بالفئران البالغة (أطلس دماغ الفأر ألين، mouse.brain-map.org و atlas.brain-map.org)20,21. لذلك، لتحقيق استهداف فيروسي صحيح بنجاح في مناطق دماغية أخرى خارج منطقة الميكانيك، سيحتاج الباحثون إلى تقدير مستنير للإحداثيات وإجراء اختبارات إحداثيات. ثانيا، يجب أخذ وقت حضانة المركبات المضادة للطائرات في الاعتبار. الوقت الأمثل للحضانة لتعبير AAV في الجسم الحي هو على الأقل من 2 إلى 3 أسابيع. وبالنظر إلى أنه في بروتوكولنا، تجرى الجراحة الستيريتاكسية في الفئران الصغيرة عند P11، سيتمكن الباحثون من بدء اختبار الفئران فقط بعد الجراحة عند P25، بعد فترة حضانة AAV المثلى.

بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة للباحثين لاستهداف مناطق الدماغ ذات الاهتمام بدقة عالية في الفئران الصغيرة باستخدام ناقلات فيروسية. هذا النهج مفيد للغاية، لأنه مرن للغاية: يمكن حقن أي مركبة AAV تجارية أو مصممة خصيصا. لذا، يسمح بدراسة مجموعات الخلايا الفرعية المحددة جزيئيا ودورها التشريحي، وديناميكيات الخلايا العصبية، ودورها الخلوي قبل وبعد البلوغ خلال فترة زمنية حرجة تتماشى مع ظهور السلوكيات الاجتماعية. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النهج ناجح في استهداف ليس فقط اللوزة الدماغية كما هو موضح هنا، بل أيضا البنى تحت القشرية الأخرى مثل منطقة تحت المهاد والمناطق القشرية.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين أي تضارب مصالح ليعلنوا عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور أندرو غورمان، والدكتورة دونا ويب، وديفيد جولدينغ من فرع الطب المقارن (CMB) في المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (NIEHS/NIH) على مناقشاتهم القيمة حول أفضل الممارسات في التخدير وتخفيف الألم في جراحات القوارض. كما نشكر جميع أعضاء مجلس الدوائر العصبية السلوكية في NIEHS على رعايتهم القصوى للحوضى الحيوانية وجميع أعضاء مجموعة الدوائر السلوكية العصبية. وقد دعم هذا العمل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، والمعاهد الوطنية للصحة (NIEHS/NIH) (ZIA ES103403) (J.E.L.). تعتبر مساهمات مؤلفي المعاهد الوطنية للصحة من أعمال حكومة الولايات المتحدة. النتائج والاستنتاجات المقدمة في هذه الورقة هي نتائج المؤلفين ولا تعكس بالضرورة آراء المعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الصحة والخدمات الإنسانية الأمريكية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
رأس مثقاب #75مدينة لقمة الحفر10WS75-850FL
إبرة 27 Gكوفيتروس60757
بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪سوانNDC 0809-0871-43
32٪ بارافورمالديهايدعلوم المجهر الإلكتروني15714
AAV2-hSyn-DIO-mCherryأدجين50459-AAV2
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey (1:1000) مضاد للأرنب IgG (H+L)أبحاث جاكسون للمناعة711-545-152
التوازن التحليليسارتوريوس1102--15
البيتادينصيدلية أفريوNDC 67618-155-15
بوبيفاكينهوسبيراNDC 0409-1163-18
كريوستاتلايكاCM1950
المجهر التشريحيزايس2149-629
مرهم العينديتشا بيطريةبورالوب
وسائط تركيب فلوروماونت مع DAPIثيرمو فيشر العلمي00-4959-52
الجسم المضاد فوكس بي 2 (1:1000)الأجسام المضادة لأطلس/سيرة كوزموHPA000382
فئران Foxp2cre+/-مختبر جاكسون30541
حامل رأس وبار الحنك بتخدير غازي لجراء P12ديفيد كوبف إنسترومنتس1934-C
معقم خرز الزجاجفيشر ساينتيفك10-000-632
الشعيرات الدموية الزجاجيةوورلد بريسيجن إنسترومنتس504949
حامل الماصنة الزجاجيةديفيد كوبف إنسترومنتس1975-1.2-أ
وسادة الحرارةكنت ساينتيفيك  الشركةRT-0520
إيزوفلورانالعناية المركزة بيرامالNDC 66794-017-10
ميلوكسيكامبيفيتال بيتيرينري سمورNDC 46066-937-13
الحفر الصغيرديفيد كوبف إنسترومنتسالحفر موديل 1911
إبرة ميكروفيل المرنةوورلد بريسيجن إنسترومنتسMF28G67-5
شرائح المجهرثيرمو فيشر العلمي12-550-15
زيت المعادنسيغما-ألدرتشM5904-500ML
محقن النانولتروورلد بريسيجن إنسترومنتسNANOLITER2020
خياطة غير قابلة للامتصاصجراحة ADس-N718SP13
قضبان الأذن غير الرابتورديفيد كوبف إنسترومنتس1921-أ
مصل الحمار العاديجاكسون إيمينوريسيرش017-000-121
مركب O.C.T.ساكورا4583
جهاز ستيريوتاكسيكديفيد كوبف إنسترومنتس1900
مسحة قطن معقمةULINES-21102
الستارة المعقمةمستشفيات بوس القابلة للاستبدال696
محلول ملحي معقمهوسبيراNDC 0409-1966-02
المياه المعقمةهوسبيراNDC 0409-4887-24
سكروزفيشر كيميكالS5-500
حقنةفيشر ساينتيفك50-252-2568

المراجع

  1. Andersen, S. L. Trajectories of brain development: Point of vulnerability or window of opportunity. Neurosci Biobehav Rev. 27 (1-2), 3-18 (2003).
  2. Zeiss, C. J. Comparative milestones in rodent and human postnatal central nervous system development. Toxicol Pathol. 49 (8), 1368-1373 (2021).
  3. Bell, M. R. Comparing postnatal development of gonadal hormones and associated social behaviors in rats, mice, and humans. Endocrinology. 159 (7), 2596-2613 (2018).
  4. Auger, A. P., Olesen, K. M. Brain sex differences and the organisation of juvenile social play behaviour. J Neuroendocrinol. 21 (6), 519-525 (2009).
  5. Barkley, M. S., Goldman, B. D. A quantitative study of serum testosterone, sex accessory organ growth, and the development of intermale aggression in the mouse. Horm Behav. 8 (2), 208-218 (1977).
  6. National Research Council (US) Committee on Guidelines for the Use of Animals in Neuroscience and Behavioral Research. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. , The National Academies Press. (2003).
  7. Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods Mol Biol. 1018, 151-163 (2013).
  8. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863(2014).
  9. Robertson, S. D., Plummer, N. W., De Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nat Neurosci. 16 (8), 1016-1023 (2013).
  10. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
  11. Prakash, N., Abu Irqeba, A., Corbin, J. G. Development and function of the medial amygdala. Trends Neurosci. 48 (1), 22-32 (2025).
  12. Raam, T., Hong, W. Organization of neural circuits underlying social behavior: A consideration of the medial amygdala. Curr Opin Neurobiol. 68, 124-136 (2021).
  13. Lischinsky, J. E., et al. Embryonic transcription factor expression in mice predicts medial amygdala neuronal identity and sex-specific responses to innate behavioral cues. Elife. 6, e21012(2017).
  14. Lischinsky, J. E., et al. Transcriptionally defined amygdala subpopulations play distinct roles in innate social behaviors. Nat Neurosci. 26 (12), 2131-2146 (2023).
  15. Chan, E., Kovacević, N., Ho, S. K., Henkelman, R. M., Henderson, J. T. Development of a high resolution three-dimensional surgical atlas of the murine head for strains 129s1/svimj and c57bl/6j using magnetic resonance imaging and micro-computed tomography. Neuroscience. 144 (2), 604-615 (2007).
  16. Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Methods Mol Biol. 176, 1-12 (2021).
  17. Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO during surgical anesthesia in mice. J Neurosci Methods. 159 (2), 261-267 (2007).
  18. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. J Vis Exp. (137), e57270(2018).
  19. Kronman, F. N., et al. Developmental mouse brain common coordinate framework. Nat Commun. 15 (1), 9072(2024).
  20. Dong, H. W. The Allen reference atlas: A digital color brain atlas of the C57BL/6J male mouse. , John Wiley & Sons. (2008).
  21. Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تطور الدماغالحقن الفيروسياضطرابات النمو العصبيالتشذيب التشابكيعملية الميالينإعطاء التخديرالفئران اليافعة

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.