Method Article

النسخات المكانية لتكوين الأسنان المبكر في نسيج الفأر الجنيني المدمج بالبارافين المثبت في الفورمالين

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي استخدام مقاطع مثبتة بالفورمالين ومدمجة بالبارافين من مناطق E13.5 وE15.5 الجمجمة الوجهية في أجنة الفئران لتحليل ملفات التعبير الجيني التفاضلية باستخدام النسخ المكاني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون السن النامي من مجموعات خلاوية متنوعة ومتخصصة للغاية تعمل معا للحفاظ على الشكل والوظيفة الصحيحة. توضيح التفاعلات بين هذه الخلايا والبيئة الدقيقة المحيطة بها أمر حاسم لفهم الآليات التنظيمية الكامنة وراء تطور الأسنان الطبيعي. يمكن أن تؤدي الاضطرابات في هذه العمليات إلى اضطرابات خلقية مثل تعرق الأسنان، وتكوين الأسنان غير الكامل، وتكوين الأسنان غير الكامل. على الرغم من التقدم الكبير الذي حققته تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) في كشف التغاير الخلوي، إلا أنه لا يحافظ على السياق المكاني للخلايا داخل الأنسجة، مما يحد من القدرة على ربط التعبير الجيني ببنية الأنسجة. تعالج تقنيات النسخ المكاني هذا القيد من خلال دمج التحليل الجيني عالي الدقة مع الحفاظ على بنية الأنسجة الأصلية، مما يمكن من تحديد موقع التواقيع الجزيئية في الموقع . هنا، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة لجمع وتثبيت ودمج البارافين في نسيج الجمجمة والوجه الجنيني المناسب لتطبيقات النسخ المكاني لاحقا. تفاصيل سير العمل تفصل وتعامل مع الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمثبتة بالبارافين للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي وشكل الأنسجة من أجل تحليل مكاني عالي الدقة. تتوافق هذه الطريقة مع منصات التسلسل والنسخ المكاني المعتمدة على الصور، مما يتيح التنميط المكاني القابل للتكرار لتكوين الأسنان المبكر في أجنة الفئران. يقدم هذا النهج رؤى قوية حول التنظيم المكاني والديناميكيات الوظيفية لهياكل الجمجمة والوجه في الحالات التطورية والمرضية، مما يوفر إطارا حيويا لربط الآليات الجزيئية بشكل الأنسجة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد تطور الأسنان على تسلسل منسق للغاية من العمليات المورفوجينية خلال النمو الجنيني المبكر 1,2,3,4. على الرغم من تحديد العديد من الجينات الرئيسية ومسارات الإشارات من خلال الدراسات الجينية والتطورية، إلا أن فهمنا لكيفية تفاعل هذه العوامل لتشكيل الهياكل القمجمية والوجهية الفردية لا يزال محدودا. ومن الجدير بالذكر أنه حتى مع التقدم الكبير في ربط المتغيرات الجينية المحددة بكل من اضطرابات الأسنان المزدوجة وغير المتلازمة، لا تزال الآليات الجزيئية التفصيلية التي تقوم عليها التشكل الهيكلي النوعي غير محددة بالكامل 1,2,3,4. تستمر هذه الفجوة المعرفية في تحديد تقدم الاستراتيجيات العلاجية المستهدفة لتحسن الأسنان أو أي انحرافات أخرى في الأسنان.

مكن تسلسل mRNA أحادي الخلية (scRNA-seq) من اكتشاف أنواع خلايا لم تكن معروفة سابقا في الأنسجة السليمة والمصابة بمرضى، بالإضافة إلى تحديد أنواع فرعية متعددة من الخلايا بناء على ملفات تعبير جينية مميزة. ومع ذلك، نظرا لأن scRNA-seq يتطلب تفكيك الأنسجة إلى خلايا منفردة، فإن المعلومات حول الموقع المكاني الأصلي لكل خلية داخل النسيج تضيع. نتيجة لذلك، لا تلتقط هذه المجموعات كيف يتم ترتيب الخلايا بالنسبة لبنية الأنسجة 5,6,7. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد التفاعلات المتوقعة بين الخلية على وجود تفاعلات مكملة للنسخ، لكنها لا تأخذ في الاعتبار المعلومات المكانية الفعلية، وهو أمر مهم لتحديد ما إذا كانت هذه التفاعلات تحدث في الجسم الحي 5,6,7.

تمكن تقنية النسخ المكاني من التحليل التفصيلي عالي الإنتاجية لتعبير الجينات مع الاحتفاظ بالمعلومات المكانية داخل أقسام الأنسجة 8,9. تقنيات النسخ المكاني إما تعتمد علىالتصوير 10,11,12 أو12,13 المعتمدة على التسلسل. تستخدم طرق النسخ المكاني المعتمدة على التصوير FISH لاكتشاف وقياس التعبير الجيني المستهدف بدقة مكانية خلوية أو تحت خلوية. على النقيض من ذلك، تلتقط التقنيات القائمة على التسلسل تعبيرا جينيا على مستوى النسخ المكتوب بدقة مكانية أقل. تستخدم النسخات المكانية القائمة على التسلسل استراتيجية لتحقيق دقة شبه خلية واحدة مع تغطية كاملة للنسخ (~20,000 جين)، تدعم تحليلات استكشافية غير متحيزة، بينما تستهدف النسخ المكاني المعتمد على الصور لوحات الجينات (حتى ~5,000 جين)، مما يمكن من تحليل دقيق قائم على الفرضيات لمسارات محددة وتفاعلات خلايا14.

التطورات التكنولوجية في علم النسخ المكاني الآن تمكن من تحليل تعبير الجينات ضمن بنية الأنسجة المحفوظة. تقدم سير العمل المدمج بالبارافين الثابت في الفورمالين (FFPE) والأنظمة المعتمدة على التشريح بالتبريد نهجا مكملا لعلم النسخ المكاني 15,16,17. يوفر FFPE حفظا متكاملا لبنية الأنسجة، مما يتيح رسم خرائط مكانية دقيقة لتعبير الجينات في الأنسجة المعقدة هيكليا مثل الأسنان النامية ورفوف الحنك. في دراستنا ودراسات أخرى، أسفر تثبيت وأرشفة FFPE عن بيانات نقل مكانية دقيقة وقابلة للتكرار18. تحافظ عمليات التجميد على سلامة الحمض النووي الريبي لكنها أكثر عرضة لتشوه الأنسجة18. لذلك، تم اختيار FFPE لهذه الدراسة. بينما يعتمد نجاح تسلسل الحمض النووي الريبي إلى حد كبير على الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي العالي، يتطلب علم النسخ المكاني أيضا شكل أنسجة عالي الجودة لتحديد مواقع إشارات التعبير الجيني بدقة إلى ميزات نسيجية محددة.

هذا البروتوكول مناسب بشكل أفضل للأنسجة الجمجمية الجنينية للفئران التي تمتد عبر مراحل النمو المبكرة، حيث يعد الحفاظ على بنية الأنسجة الدقيقة أمرا بالغ الأهمية لتحليل النسخ المكاني. من المرجح أن يؤدي سير العمل بشكل غير مثالي في العينات المثبتة بشكل مفرط، أو كتل البارافين ذات التوجيه الخاطئ، أو الأنسجة التي تضعف سلامة الحمض النووي الريبي، مما قد يؤدي إلى انخفاض جودة الإشارة وفقدان الدقة المكانية. يشير التطبيق الناجح لهذه الطريقة إلى شكل الأنسجة السليم، وتشوه الحد الأدنى في المقطع، وإشارات النسخ المكتوبة القوية والمحلولة مكانيا التي تتماشى مع السمات النسيجية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني لصحة الطفل وتنمية الإنسان لرعاية واستخدام الحيوانات (ACUC)، بموجب بروتوكول دراسة الحيوانات #21-031.

1. تحضير حيوانات تجريبية وجمع الأنسجة

  1. قم بإقران ذكر وأنثى Musculus العضليين السليمين والخصيب للتزاوج الزمني. حدد الفئران الحوامل من خلال وجود سدادة مهبلية، محددة بيوم جنيني (E) 0.5.
  2. قتل الفئران الحوامل عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون يليه خلع عنقي الرحم. ضع الحيوان على ظهر الحيوان على سطح جراحي معقم وماص وقم بتعقيم منطقة البطن بنسبة 70٪ إيثانول على طول موقع الشق المقصود.
  3. قم بعمل شق بطني في منتصف الخط باستخدام مقص جراحي معقم، وافتح جدار الصفاق بحذر باستخدام مقص جراحي دقيق لكشف قرون الرحم. قم بإزالة سلسلة الرحم بلطف باستخدام ملقط غير حاد. عزل الأجنة عن طريق تحرير نسيج الرحم على طول عضلة الرحم وقطع القناة البيضية وربط القرن الرحمي في الوسط.
  4. انقل الأجنة الكاملة فورا إلى PBS بارد ومعقم كالثلج في طبق بتري بقطر 10 سم.
  5. افصل بعناية كل جنين عن الأغشية الرحمية والسلى والمشيمة المحيطة، وانقله إلى طبق جديد بحجم 10 سم يحتوي على 1x PBS بارد ومعقم كالثلج.
  6. قم بتشريح رؤوس الأجنة في المراحل التطورية المرغوبة باستخدام شفرة جراحية معقمة، وشطفها مرة واحدة في PBS بارد جدا مرة واحدة قبل معالجة إضافية.

2. تثبيت ومعالجة الأنسجة

  1. قم بتشريح رؤوس الفئران الجنينية في مراحل النمو المرغوبة وتثبيتها في فورمالين متعادل بنسبة 10٪ طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز.
  2. بعد التثبيت، قم بإزالة الفورمالين وشطف العينات ب 1x PBS قبل نقلها إلى إيثانول بنسبة 70٪ للتخزين. قم بإجراء تجفيف الأنسجة، وتنظيف الأنسجة، وتسريب البارافين باستخدام معالج أنسجة آلي.
  3. غرس رؤوس الأجنة في البارافين مع توجيه إما في المستوى الإكليجي أو السهمي.
  4. بعد تصلب الشمع، أزل كتل البارافين من القوالب، وضعها في حاويات محكمة الإغلاق أو أكياس بسحاب معنونة، وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى يتم تقسيمها.
    ملاحظة: يمكن تخزين كتل FFPE لعدة سنوات قبل التقسيم دون التأثير على سلامة الأنسجة.

3. معالجة أنسجة FFPE لعلم النسخ المكاني

  1. تعقيم أسطح العمل والأدوات بإيثانول بنسبة 70٪، ثم المعالجة بمحلول RNase لتقليل تحلل RNA.
  2. جهز حمام ماء يحتوي على ماء منزوع الأيونات وحافظ عليه عند 40 درجة مئوية، مع تعديل درجة الحرارة بين 40 درجة مئوية و43 درجة مئوية حسب الحاجة بناء على المرحلة الجنينية أو خصائص الأنسجة.
  3. قم بتركيب الميكروتوم، ثم تركيب شفرة جديدة بعد مسحها بلطف بمحلول تعقيم RNase، وثبت الشفرة، واضبط زاوية المسافة على 10°.
    ملاحظة: تأكد من استخدام الشفرة الجديدة في التقسيم لتحقيق تقطيع نسيج دقيق. تغيير زاوية شفرة الميكروتوم يمكن أن يؤثر بشكل كبير على جودة المقطع، مما يؤثر على سلامة الأنسجة، وسمك وتجانسها، والحفاظ على الخصائص الشكلية (مورفولوجيا).
  4. قم بقص البارافين الزائد من حول الأنسجة المدمجة، وتركيب كتلة FFPE على المرحلة الباردة من الميكروتوم.
  5. حضر وعالج الملقط والفرش النظيفة باستخدام محلول RNase القابل للتلوث قبل الاستخدام.
  6. محاذاة وجه كتلة البارافين مع شفرة الميكروتوم، وقم بقطع قص بطول حوالي 12 ميكرومتر حتى يتم الاقتراب من المنطقة المعنية (مثلا، حتى يصبح الجزء المتوسط من الضراس مرئيا في المقاطع التاجية). قم بضبط وضع الكتلة والشفرة حسب الحاجة لضمان تناسق وتوجيه الأقسام التاجية للرأس بالكامل.
  7. إذا كان من المقرر إجراء عزل الحمض النووي الريبي لمقاطع الأنسجة، يجب جمع مقاطع 10 ميكرومتر مباشرة في أنابيب طرد مركزي دقيق بحجم 1 مل ومعالجتها وفقا لتوصيات الشركة المصنعة19,20 لتقييم جودة DV200.
  8. اقطع مقاطع تسلسلية بسماكة 5 ميكرومتر، وراقب باستمرار القرب من المنطقة المهتمة من خلال فحص أقسام الاختبار على شريحة عادية تحت المجهر.
  9. بمجرد الاقتراب من منطقة الاهتمام، قم بتقطيع منطقة الأنسجة بعناية باستخدام شفرة مشرط رقم 11 دون قطع كامل، في منطقتين متباعدتين بشكل استراتيجي لمنع الالتفاف أو التصاق الأجزاء. بعد التقسيم، أزل أي بارافين ملحق باستخدام شعيرات فرشاة ناعمة.
  10. قم بتعويمة أجزاء النسيج على حمام الماء عند 41 درجة مئوية للسماح بالاسترخاء اللطيف وتسطيحها قبل التقاطها على منزلق.

4. النسخات المكانية القائمة على التسلسل

  1. اجمع مقاطع الأنسجة على شرائح زجاجية موصى بها، لضمان أن جميع المناطق محل الاهتمام تقع ضمن مساحة 6.5 × 6.5 مم. عند وضع عدة أقسام متجاورة على نفس الشريحة، قم بتسخين الشرائح لفترة وجيزة على سخان منزلق عند 40 درجة مئوية لتعزيز الالتصاق ومنع انفصال الأقسام الموضوعة سابقا. بعد وضع جميع الأقسام، حضن الشرائح في مدفأ منزلق مغطى عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين لتعزيز التصاق الأنسجة.
    ملاحظة: لم تتم معالجة المقاطع التي تتجاوز منطقة 6.5 × 6.5 مم.
  2. بعد الحضانة، قم بإجراء تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) باستخدام بروتوكول تلوين H&E القياسي، مع استبدال الماء منزوع الأيونات بماء الصنبور للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي.
  3. يتم تركيب أغطية الألواح باستخدام 80٪ من الجلسرول، والتقاط صور H&E عالية الدقة، مما يوفر صورة مرجعية عالية الجودة لتحل محل الصورة النموذجية ل H&E التي يتم توليدها بواسطة نظام تصوير الشرائح ونقل الأنسجة.
  4. بعد التصوير، إزالة الشرائح المغلقة عن طريق غمر الشرائح بشكل فردي في أنابيب 50 مل تحتوي على ماء منزوع الأيون، وتحضير الشرائح لتقديمها إلى منشأة النواة للمعالجة اللاحقة.

5. النسخات المكانية القائمة على الصور

ملاحظة: تم توفير20 شريحة من قبل الشركة المصنعة، كل منها يحتوي على منطقة مخصصة للتصوير (خطوط محددة) بقياس 12 مم × 24 مم، مع مساحة متاحة لوضع العينات حوالي 235 مم² (10.45 مم × 22.45 مم²).

  1. وضع أقسام الأنسجة بالكامل داخل هذه المنطقة المحددة، لضمان عدم تداخل المناطق، بما في ذلك البارافين المتبقي. عند وضع عدة أقسام متجاورة، قم بتسخين الشرائح لفترة وجيزة على مدفأ منزلق عند 40 درجة مئوية لتعزيز الالتصاق ومنع انفصال الأجزاء المثبتة سابقا.
  2. بعد وضع جميع أقسام الأنسجة، ضع الشرائح في مدفأ مغطى واحتضنها طوال الليل عند درجة حرارة 40 درجة مئوية لضمان الالتصاق الصحيح.
  3. بعد الحضانة، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة19 لمعالجة الشرائح وتحميلها في الجهاز لتسلسل الحمض النووي الريبي، مع مقارنة البروتوكول مع أحدث إصدار، حيث تخضع التفاصيل الإجرائية لتحديثات دورية.
    ملاحظة: يجب التخلص من جميع المواد الخطرة التي تولد خلال البروتوكول، مثل الفورمالين والإيثانول والمحاليل المعالجة من RNase، وفقا لسياسات السلامة المؤسسية واللوائح المحلية، باستخدام حاويات النفايات الكيميائية المناسبة، وطرق التخلص من المخاطر البيولوجية، وممارسات غطاء الأبخرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الطريقة معالجة رؤوس الأجنة الجرذية التي تم تشريحها حديثا لتوليد عينات FFPE من أنسجة الجمجمة والوجه، بما في ذلك السن النامي، والتي يمكن تقسيمها بسهولة بواسطة الميكروتوم مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي (الشكل 1). تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على رؤوس الأجنة في E13.5 (اليوم الجيني 13.5)، E15.5، وE16.5 لمناطق جمجمة الوجه عالية الدقة تعتمد على الصور (الشكل 2) والنسخ المكاني المعتمد على التسلسل (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، نقدم بروتوكولا مفصلا لتحضير كتل FFPE لرؤوس الأجنة الفأرية المحسنة للاستخدام مع منصات تصوير RNA مكانية عالية الدقة، بما في ذلك النسخ المكاني المعتمد على التسلسل والتصوير. الهدف الرئيسي لهذا البروتوكول هو الحفاظ على شكل الأنسجة وسلامة الأحماض النووية عبر أقسام الرأس بالكامل، مع التركيز بشكل خاص على منطقة الجمجمة والوجه النامية. ضمان هذا المستوى من الحفظ أمر بالغ الأهمية لتحديد أنماط التعبير الجيني المكانية بدقة داخل بيئات معقدة متعددة الأنسجة، مثل الحنك المتطور وهياكل الأسنان...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بصدق الدكتور سيرجي إل. ليكين، والدكتورة إيلينا ماكاريفا (قسم الكيمياء الحيوية الفيزيائية، NICHD/NIH)، والدكتور جيريمي أوليفر بينيا (قسم علم الأحياء الجزيئي للعظام والأسنان، NIDCR/NIH) على نصائحهم في تصميم التجارب والمساعدة الفنية. نشكر الدكتور إيبن جيمس، والدكتور فيفيك مهادفان (مركز الجينوم الجزيئي، NICHD/NIH) على تقديم المساعدة الفنية لعملية النسخ المكاني المعتمدة على التسلسل. نشكر الدكتور غوستاف ويغربلاد (فرع المناعة الذاتية الجهازية، المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلدي، NIAMS/NIH) على تقديم المساعدة الفنية في النسخات المكانية المعتمدة على الصور. نشكر الدكتور مايكل كيلي والدكتور جاتيندر سينغ (منشأة تحليل الخلايا الأحادية CCR (SCAF)، NCI/NIH) على تقديم المساعدة الفنية لعملية النسخ المكاني المعتمدة على الصور. نشكر موظفي مرافق الحيوانات في NICHD على مساعدتهم في تربية الحيوانات وتربيةها. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

المخطوطة الحالية مدعومة بأموال من NIH/NIDCR [منحة، 1RO1DE033520] إلى M.B. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، أو جمع البيانات وتحليلها، أو قرار النشر، أو إعداد المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSثيرمو فيشر10010023استخدام  لأداء الغسلات أثناء سير العمل
أنابيب مخروطية بحجم 50 مل (أمبيون) خالية من الرينزثيرمو فيشرAM12502الاستخدام لتخزين العينات في محاليل مختلفة
هزاز مداري متقدمVWR6683-470استخدم لتحريك الأنسجة في محلول تثبيت أثناء الحضانة
الكحول، 70٪، فيشربراند، هيستوبريبفيشر ساينتيفكHC-1000-1GLاستخدامه لتنظيف وتعقيم جميع أماكن العمل
معالج الأنسجة التفريغ الآليلايكا بيوسيستمزASP300Sاستخدامه لتنظيف العينات وتجفيفها وإعادة ترطيبها وتسريب الشمع
سمك زجاج الغطاء 1.5، 25 مم × 25 مم كورنينغ2850-25الاستخدام لتركيب الشرائح في سير عمل Visium HD
مخزن داكو بلوينغ، جاهز للاستخدامتقنيات أجيلانتCS70230-2الاستخدام في H&. التلوين الإلكتروني
إيوسين-واي مع الفلوكسينفيشر ساينتيفك22050198الاستخدام في H&. التلوين الإلكتروني
هيماتوكسيلين، مايرز، محلول مائي جاهز للاستخدامتقنيات أجيلانتS330930-2الاستخدام في H&. التلوين الإلكتروني
حمام الماء HistoCore  لايكا بيوسيستمزHIS2326كان يستخدم تعويم الأقسام عند 40-43 درجة ودرجة مئوية؛ ج لإزالة التجاعيد من أقسام FFPE  
متصفح Loupe  9.0.010X جينومكس، إنك. الاستخدام لتحليل بيانات Visium HD  
شفرات منخفضة الملف القابلة للاستخدام مرة واحدة DB80LXلايكا بيوسيستمز14035843496استخدم لقسم كتل FFPE  
الفورمالين المحايد المخزن 10٪آذر ساينتفيكNBF-4-Gاستخدامه لإصلاح الأنسجة
محلول إزالة التلوث RNaseZap RNaseثيرمو فيشرAM9782استخدامه لتنظيف وإزالة RNase
الميكروتوم الدوار شبه الآليلايكا بيوسيستمزRM2245استخدم قسم حجب FFPE كما هو مذكور في الإرشادات.
سخان منزلق مع غطاءالعرض الأول  XH2004الاستخدام لحضانة الشرائح عند درجات حرارة مختلفة
شرائح سوبرفروست بلس فيشر ساينتيفك12-550-15 استخدام تركيب أقسام لجهاز Vsium HD
شفرة جراحية رقم 11إنتيجرا ميلتكس4-311الاستخدام في تقويم أنسجة FFPE
البارابلاست الجراحيلايكا بيوسيستمز39601006الاستخدام لإجراء تسريب الأنسجة وغرس الأنسجة
تيسيز كالتشر DISH 100X20مم 500/CSفيشر ساينتيفك877222الاستخدام لجمع وتشريح العينات في 1x PBS
الجلسرول الفائق النقيثيرمو فيشر15514011الاستخدام لتركيب شرائح Visium HD على الزجاج الغطاء قبل CytAssist
فيسيوم سيتاسيست10X جينومكس، إنك. PN-1000442الاستخدام في تجارب سير العمل في Visium HD
تسلسل الحمض النووي الريبي المكاني Visium HD10X جينومكس، إنك. 1000676الاستخدام لإجراء تجارب النسخ المكاني
توطين الحمض النووي الريبي Xenium 5K في الموقع  10X جينومكس، إنك. PN-1000724الاستخدام لإجراء تجارب النسخ المكاني
محلل الزينيوم10X جينومكس، إنك. PN-1000481استخدم تصوير الحمض النووي الريبي Xenium وXenium 5K  
زينيوم إكسبلورر 410X جينومكس، إنك. الاستخدام لتحليل بيانات الزينيوم 
تحديد موقع الحمض النووي الريبي للزينيوم في الموقع10X جينومكس، إنك. 1000672الاستخدام لإجراء تجارب النسخ المكاني

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al. Craniofacial development: neural crest in molecular embryology. Head Neck Pathol. 15 (1), 1-15 (2021).
  4. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), dev184754(2020).
  5. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nat Commun. 11 (1), 4816(2020).
  6. Nagata, M., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals developmental relationships and specific markers of mouse periodontium cellular subsets. Front Dent Med. 2, 679937(2021).
  7. Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Front Cell Dev Biol. 8, 841(2020).
  8. Marx, V. Method of the year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  9. Feng, J., et al. High-resolution spatial transcriptomics and cell lineage analysis reveal spatiotemporal cell fate determination during craniofacial development. Nat Commun. 16 (1), 4396(2025).
  10. Janesick, A., et al. High-resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 8353(2023).
  11. Bliese, S. R., et al. Single-cell resolution spatial transcriptomic signature of the retrosplenial cortex during memory consolidation. Mol Psychiatry. 30, in press (2025).
  12. Aminu, M., et al. CoCo-ST detects global and local biological structures in spatial transcriptomics datasets. Nat Cell Biol. 27 (11), 2019-2031 (2025).
  13. Ren, P., et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 16 (1), 9232(2025).
  14. Long, M., et al. Comparing Xenium 5K and Visium HD data from identical tissue slide at a pathological perspective. Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 219(2025).
  15. Chen, X., et al. Integrative spatial and single-nucleus transcriptomics elucidate cell lineage dynamics in human tooth morphogenesis. Int Dent J. 75 (6), 103920(2025).
  16. Raju, R., et al. Profiles of Wnt pathway gene expression during tooth morphogenesis. Front Physiol. 14, 1316635(2024).
  17. Piña, J. O., et al. Single-cell spatial transcriptomics links Wnt signaling disruption to extracellular matrix development in a cleft palate model. Sci Rep. 15 (1), 29639(2025).
  18. Gao, X. H., et al. Comparison of fresh frozen tissue with formalin-fixed paraffin-embedded tissue for mutation analysis using a multi-gene panel in patients with colorectal cancer. Front Oncol. 10, 310(2020).
  19. Visium spatial gene expression for FFPE tissue preparation guide. Document number CG000408 Rev E. , 10x Genomics. (2023).
  20. Xenium in situ - FFPE tissue preparation handbook. Document number CG000578 Rev F. , 10x Genomics. (2025).
  21. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  22. Kleshchevnikov, V., et al. Cell2location maps fine-grained cell types in spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (5), 661-671 (2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsTooth MorphogenesisMouse Embryonic TissueFormalin Fixed TissueParaffin EmbeddingCraniofacial DevelopmentRNA IntegrityTissue MorphologyGene Expression ProfilingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles