Method Article

النسخات المكانية لتكوين الأسنان المبكر في نسيج الفأر الجنيني المدمج بالبارافين المثبت في الفورمالين

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي استخدام مقاطع مثبتة بالفورمالين ومدمجة بالبارافين من مناطق E13.5 وE15.5 الجمجمة الوجهية في أجنة الفئران لتحليل ملفات التعبير الجيني التفاضلية باستخدام النسخ المكاني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون السن النامي من مجموعات خلاوية متنوعة ومتخصصة للغاية تعمل معا للحفاظ على الشكل والوظيفة الصحيحة. توضيح التفاعلات بين هذه الخلايا والبيئة الدقيقة المحيطة بها أمر حاسم لفهم الآليات التنظيمية الكامنة وراء تطور الأسنان الطبيعي. يمكن أن تؤدي الاضطرابات في هذه العمليات إلى اضطرابات خلقية مثل تعرق الأسنان، وتكوين الأسنان غير الكامل، وتكوين الأسنان غير الكامل. على الرغم من التقدم الكبير الذي حققته تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) في كشف التغاير الخلوي، إلا أنه لا يحافظ على السياق المكاني للخلايا داخل الأنسجة، مما يحد من القدرة على ربط التعبير الجيني ببنية الأنسجة. تعالج تقنيات النسخ المكاني هذا القيد من خلال دمج التحليل الجيني عالي الدقة مع الحفاظ على بنية الأنسجة الأصلية، مما يمكن من تحديد موقع التواقيع الجزيئية في الموقع . هنا، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة لجمع وتثبيت ودمج البارافين في نسيج الجمجمة والوجه الجنيني المناسب لتطبيقات النسخ المكاني لاحقا. تفاصيل سير العمل تفصل وتعامل مع الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمثبتة بالبارافين للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي وشكل الأنسجة من أجل تحليل مكاني عالي الدقة. تتوافق هذه الطريقة مع منصات التسلسل والنسخ المكاني المعتمدة على الصور، مما يتيح التنميط المكاني القابل للتكرار لتكوين الأسنان المبكر في أجنة الفئران. يقدم هذا النهج رؤى قوية حول التنظيم المكاني والديناميكيات الوظيفية لهياكل الجمجمة والوجه في الحالات التطورية والمرضية، مما يوفر إطارا حيويا لربط الآليات الجزيئية بشكل الأنسجة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد تطور الأسنان على تسلسل منسق للغاية من العمليات المورفوجينية خلال النمو الجنيني المبكر 1,2,3,4. على الرغم من تحديد العديد من الجينات الرئيسية ومسارات الإشارات من خلال الدراسات الجينية والتطورية، إلا أن فهمنا لكيفية تفاعل هذه العوامل لتشكيل الهياكل القمجمية والوجهية الفردية لا يزال محدودا. ومن الجدير بالذكر أنه حتى مع التقدم الكبير في ربط المتغيرات الجينية المحددة بكل من اضطرابات الأسنان المزدوجة وغير المتلازمة، لا تزال الآليات الجزيئية التفصيلية التي تقوم عليها التشكل الهيكلي النوعي غير محددة بالكامل

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني لصحة الطفل وتنمية الإنسان لرعاية واستخدام الحيوانات (ACUC)، بموجب بروتوكول دراسة الحيوانات #21-031.

1. تحضير حيوانات تجريبية وجمع الأنسجة

  1. قم بإقران ذكر وأنثى Musculus العضليين السليمين والخصيب للتزاوج الزمني. حدد الفئران الحوامل من خلال وجود سدادة مهبلية، محددة بيوم جنيني (E) 0.5.
  2. قتل الفئران الحوامل عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون يليه خلع عنقي الرحم. ضع الحيوان على ظهر الحيوان على سطح جراحي معقم وماص وقم بتعقيم منطقة البطن بنسبة 70٪ إيثانول على طول موقع الشق المقصود.
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الطريقة معالجة رؤوس الأجنة الجرذية التي تم تشريحها حديثا لتوليد عينات FFPE من أنسجة الجمجمة والوجه، بما في ذلك السن النامي، والتي يمكن تقسيمها بسهولة بواسطة الميكروتوم مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي (الشكل 1). تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على رؤوس الأجنة في E13.5 (اليوم الجيني 13.5)، E15.5، وE16.5 لمناطق جمجمة الوجه عالية الدقة تعتمد على الصور (الشكل 2) والنسخ المكاني المعتمد على التسلسل (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، نقدم بروتوكولا مفصلا لتحضير كتل FFPE لرؤوس الأجنة الفأرية المحسنة للاستخدام مع منصات تصوير RNA مكانية عالية الدقة، بما في ذلك النسخ المكاني المعتمد على التسلسل والتصوير. الهدف الرئيسي لهذا البروتوكول هو الحفاظ على شكل الأنسجة وسلامة الأحماض النووية عبر أقسام الرأس بالكامل، مع التركيز بشكل خاص على منطقة الجمجمة والوجه النامية. ضمان هذا المستوى من الحفظ أمر بالغ الأهمية لتحديد أنماط التعبير الجيني المكانية بدقة داخل بيئات معقدة متعددة الأنسجة، مثل الحنك المتطور وهياكل الأسنان.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بصدق الدكتور سيرجي إل. ليكين، والدكتورة إيلينا ماكاريفا (قسم الكيمياء الحيوية الفيزيائية، NICHD/NIH)، والدكتور جيريمي أوليفر بينيا (قسم علم الأحياء الجزيئي للعظام والأسنان، NIDCR/NIH) على نصائحهم في تصميم التجارب والمساعدة الفنية. نشكر الدكتور إيبن جيمس، والدكتور فيفيك مهادفان (مركز الجينوم الجزيئي، NICHD/NIH) على تقديم المساعدة الفنية لعملية النسخ المكاني المعتمدة على التسلسل. نشكر الدكتور غوستاف ويغربلاد (فرع المناعة الذاتية الجهازية، المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلدي، NIAMS/NIH) على تقديم المساعدة الفنية في النسخات المكانية المعتمدة على الصور. نشكر الدكتور مايكل كيلي والدكتور جاتيندر سينغ (منشأ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSثيرمو فيشر10010023استخدام  لأداء الغسلات أثناء سير العمل
أنابيب مخروطية بحجم 50 مل (أمبيون) خالية من الرينزثيرمو فيشرAM12502الاستخدام لتخزين العينات في محاليل مختلفة
هزاز مداري متقدمVWR6683-470استخدم لتحريك الأنسجة في محلول تثبيت أثناء الحضانة
الكحول، 70٪، فيشربراند، هيستوبريبفيشر ساينتيفكHC-1000-1GLاستخدامه لتنظيف وتعقيم جميع أماكن العمل
معالج الأنسجة التفريغ الآليلايكا بيوسيستمزASP300Sاستخدامه لتنظيف العينات وتجفيفها وإعادة ترطيبها وتسريب الشمع
سمك زجاج الغطاء 1.5، 25 مم × 25 مم كورنينغ2850-25الاستخدام لتركيب الشرائح في سير عمل Visium HD
مخزن داكو بلوينغ، جاهز للاستخدامتقنيات أجيلانتCS70230-2الاستخدام في H&. التلوين الإلكتروني
إيوسين-واي مع الفلوكسينفيشر ساينتيفك22050198الاستخدام في H&. التلوين الإلكتروني
هيماتوكسيلين، مايرز، محلول مائي جاهز للاستخدامتقنيات أجيلانتS330930-2الاستخدام في H&. التلوين الإلكتروني
حمام الماء HistoCore  لايكا بيوسيستمزHIS2326كان يستخدم تعويم الأقسام عند 40-43 درجة ودرجة مئوية؛ ج لإزالة التجاعيد من أقسام FFPE  
متصفح Loupe  9.0.010X جينومكس، إنك. الاستخدام لتحليل بيانات Visium HD  
شفرات منخفضة الملف القابلة للاستخدام مرة واحدة DB80LXلايكا بيوسيستمز14035843496استخدم لقسم كتل FFPE  
الفورمالين المحايد المخزن 10٪آذر ساينتفيكNBF-4-Gاستخدامه لإصلاح الأنسجة
محلول إزالة التلوث RNaseZap RNaseثيرمو فيشرAM9782استخدامه لتنظيف وإزالة RNase
الميكروتوم الدوار شبه الآليلايكا بيوسيستمزRM2245استخدم قسم حجب FFPE كما هو مذكور في الإرشادات.
سخان منزلق مع غطاءالعرض الأول  XH2004الاستخدام لحضانة الشرائح عند درجات حرارة مختلفة
شرائح سوبرفروست بلس فيشر ساينتيفك12-550-15 استخدام تركيب أقسام لجهاز Vsium HD
شفرة جراحية رقم 11إنتيجرا ميلتكس4-311الاستخدام في تقويم أنسجة FFPE
البارابلاست الجراحيلايكا بيوسيستمز39601006الاستخدام لإجراء تسريب الأنسجة وغرس الأنسجة
تيسيز كالتشر DISH 100X20مم 500/CSفيشر ساينتيفك877222الاستخدام لجمع وتشريح العينات في 1x PBS
الجلسرول الفائق النقيثيرمو فيشر15514011الاستخدام لتركيب شرائح Visium HD على الزجاج الغطاء قبل CytAssist
فيسيوم سيتاسيست10X جينومكس، إنك. PN-1000442الاستخدام في تجارب سير العمل في Visium HD
تسلسل الحمض النووي الريبي المكاني Visium HD10X جينومكس، إنك. 1000676الاستخدام لإجراء تجارب النسخ المكاني
توطين الحمض النووي الريبي Xenium 5K في الموقع  10X جينومكس، إنك. PN-1000724الاستخدام لإجراء تجارب النسخ المكاني
محلل الزينيوم10X جينومكس، إنك. PN-1000481استخدم تصوير الحمض النووي الريبي Xenium وXenium 5K  
زينيوم إكسبلورر 410X جينومكس، إنك. الاستخدام لتحليل بيانات الزينيوم 
تحديد موقع الحمض النووي الريبي للزينيوم في الموقع10X جينومكس، إنك. 1000672الاستخدام لإجراء تجارب النسخ المكاني

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsTooth MorphogenesisMouse Embryonic TissueFormalin Fixed TissueParaffin EmbeddingCraniofacial DevelopmentRNA IntegrityTissue MorphologyGene Expression ProfilingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles