اختبار قياس التدفق الخلوي الموحد باستخدام ألواح الأجسام المضادة المؤتلفة المجففة لتوصيف خلايا CAR T

ملخص

يظهر هذا البروتوكول كيف أن لوحات الأجسام المضادة المؤتلفة المجففة تسهل توصيف خلايا مستقبلات مستضدات الكيميرية T (CAR T) من خلال تقليل التفاوت وتبسيط سير العمل. يتيح التقييم القابل للتكرار للسمات الحيوية للجودة، بما في ذلك القياس المطلق لخلايا مستقبلات المستضد الكيميرية التائية، وهو متوافق عبر منصات قياس تدفق الخلايا المختلفة.

الملخص

يستخدم قياس التدفق الخلوي عادة لتقييم الخصائص الحيوية لخلايا مستقبلات المستضدات الكيميرية T (CAR T)، بما في ذلك القابلية للبقاء والنمط الظاهري وكفاءة التحويل. تتطلب سير العمل التقليدية للكواشف السائلة عدة خطوات تحضير، مما قد يسبب تفاوتا واختلافا في التعامل المعتمد على المشغل. توفر لوحات الأجسام المضادة المؤتلفة المجففة المصممة مسبقا تنسيقا بديلا يجمع بين تقنية الأجسام المضادة المؤتلفة وتكوين جاهز للاستخدام. توفر الأجسام المضادة المؤتليفة نوعية محددة وتقليل التباين بين الدفعات، بينما يقلل الشكل المجفف خطوات التحضير ويبسط التعامل مع الكواشف. هنا، نقدم سير عمل خطوة بخطوة لتحليل خلايا CAR T باستخدام لوحات الأجسام المضادة المؤتلفة المجافة. يشمل البروتوكول تلوينات العينات، وجمع البيانات، والتحليل، ويصحبه بنظرة عامة تخطيطية لسير العمل. تظهر نتائج التلوين التمثيلية تطبيقا على الألواح، ويتم إبراز الفروق في وقت الاستخدام العملي مقارنة بسير عمل الكواشف السائل التقليدية. توضح الأمثلة المقدمة كيف يمكن استخدام هذه اللوحات لتبسيط التوصيف متعدد المعلمات لخلايا CAR T T المختلفة. بشكل عام، يوفر هذا العمل إطارا عمليا لتنفيذ ألواح الأجسام المضادة المؤتلفة المجففة في تحليل خلايا CAR T المعتمدة على قياس التدفق الخلوي.

المقدمة

برزت علاجات خلايا CAR T كتقدم كبير في علاج السرطان، خاصة في الأورام الدموية الخبيثة. يستخدم هذا النهج جهاز المناعة الخاص بالمريض من خلال تعديل الخلايا التائية للتعبير عن مستقبلات المستضدات الكيميرية (CARs) التي تتعرف على الخلايا السرطانية وتستهدفها¹. ومع ذلك، فإن البنية التحتية المعقدة للغاية وعمليات التصنيع المكثفة التي تتطلب جهدا كبيرا لإنتاج خلايا CAR T تجعل التوصيف الدقيق والموحد أمرا ضروريا لضمان جودة المنتج وسلامة المرضى. جزء كبير من التكلفة الإجمالية لعلاج CAR T يأتي من العمل المخبري المكثف وإجراءات مراقبة الجودة (QC)، والتي تتضمن العديد منها سير عمل يدوي متعدد الخطوات. في هذا السياق، تعد معايير التوصيف الرئيسية — مثل كفاءة النقل واختبار الهوية — حاسمة لتقييم الإمكانات العلاجية للخلايا المعدلة². تطرح طرق التلوين السائل التقليدية في قياس تدفق السيل، والتي تستخدم عادة لهذه التقييمات، عدة تحديات. يمكن أن تؤدي التغيرات في الماصة، ومشاكل استقرار الكواشف، وتحيز المشغل إلى تناقضات وعدم دقة في البيانات، مما قد يؤثر على موثوقية النتائج³.

يعد قياس تدفق الخلايا تقنية أساسية لتوصيف ومراقبة جودة خلايا CAR T التي، حيث يمكن من تحليل دقيق لمعلمات الخلايا المتعددة. ومع ذلك، فإن الاستخدام التقليدي للكواشف السائلة في هذه العملية مليء بالمخاطر المحتملة ^4,5. يمكن أن يؤدي تغير الطباعة إلى أخطاء كبيرة، خاصة عند التعامل مع كميات صغيرة وعدة كواشف. علاوة على ذلك، فإن الكواشف السائلة عرضة للتدهور مع مرور الوقت، مما قد يؤثر على استقرارها وينتج عنه نتائج تلوين غير متسقة⁶. تحيز المشغلين، الناتج عن التحضير اليدوي والتعامل، يزيد من تفاقم هذه المشاكل، مما قد يؤدي إلى تباين في النتائج عبر المختبرات وحتى خلال التجارب في نفس المختبر. تعد خصائص الجودة الحيوية مثل صلاحية الخلية، وتكرار التحويل، وعدد ^CD3+، والهوية ضرورية لإطلاق منتجات CAR T بأمان. ضمان دقة وثبات هذه القياسات أمر حيوي، لأنها تؤثر بشكل مباشر على الفعالية العلاجية وسلامة خلايا CAR T¹. على سبيل المثال، التقييم الدقيق لتكرار النقل ضروري لتحديد نسبة الخلايا التائية التي تم تعديلها بنجاح للتعبير عن CAR، بينما يوفر عدد ونسبة CD3⁺ رؤى حول التركيب العام ونقاء مجموعة الخلايا التائية.

تقدم ألواح الأجسام المضادة المجففة حلا واعدا لهذه التحديات من خلال توفير توصيل مستمر للكواشف وتقليل وقت الإعداد وخطر الخطأ. تتكون هذه الألواح من عدة أجسام مضادة تم تجفيفها من كوكتيلات مخلوطة مسبقا. بعد التجفيف، تصبح هذه الألواح مستقرة وجاهزة للاستخدام، مما يلغي الحاجة إلى خطوات تحضير معقدة ويقلل من احتمالية الخطأ البشري^6،7. ومن المهم أنه لا حاجة لإعادة تشكيل هذه الألواح المجففة قبل الاستخدام—يمكن إضافة معلقات الخلايا مباشرة إلى خليط الأجسام المضادة المجففة. إن دمج الأجسام المضادة المؤتلفة في هذه الأشكال المجففة يقدم عدة مزايا مقارنة بالكواشف التقليدية متعددة النصوص أو المشتقة من الهجينة. يضمن هيكلها الجزيئي المعرفة اتساقا عاليا وقابلية تكرار الدفع، مما يقلل من التغيرات بين التجارب والمختبرات. منطقة Fc الهندسية المبنية على IgG1 البشري تقلل من التفاعل المتقاطع والتلوين الخلفي. وبالتالي، لا يطلب حجب FC، مما يقلل أكثر من الوقت المطلوب لإجراء اختبار تدفق القياس الخلوي. يحمي التنسيق المجفف المواد الكيميائية من التحلل، ويحافظ على فعاليتها مع مرور الوقت وعبر الدفعات. هذا الاتساق ضروري لتحقيق نتائج موثوقة وقابلة للتكرار في اختبارات قياس التدفق^{الخلوي 8}.

تمتد تطبيقات صيغ الكواشف المجففة عبر مراحل مختلفة من تطوير ومراقبة علاج الخلايا التائية CAR. في مراقبة جودة التصنيع، تسهل الكواشف المجففة أخذ عينات النظام المغلق، مما يضمن التعقيم والتناسق. وهذا مهم بشكل خاص في البيئة السريرية، حيث يكون الحفاظ على سلامة العينة^أمرا بالغ الأهمية. لتوصيف المنتجات، تمكن الكواشف المجففة من تقييم دقيق للأعداد المطلقة والمجموعات المناعية، وهو أمر بالغ الأهمية لتحديد الجودة العلاجية لخلايا CAR T العلاجية. علاوة على ذلك، في بيئات البحث، تعتبر الكواشف المجافة ذات قيمة كبيرة لمراقبة المرضى على المدى الطويل، مما يسمح بتتبع مستمر لاستمرارية خلايا CAR T مع مرور الوقت، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم فعالية وسلامة العلاج على المدى الطويل.

مزايا استخدام ألواح الأجسام المضادة المجففة في قياس تدفق الخلايا متعددة الأضعاف، ومن أهمها قدرتها على تقليل أخطاء التوصيل من خلال توفير لوحة مهيأة بالكامل بدلا من الحاجة إلى إعادة تعليق ودمج المواد الكيميائية يدويا. على عكس الأجسام المضادة المجففة المفردة — التي لا تزال بحاجة إلى إعادة تكوين وتركيب الماصات وبالتالي توفر بشكل أساسي عمر صلاحي أطول — فإن الألواح المجوفة المجمعة مسبقا تلغي عدة خطوات تحضير يدوية. هذا يبسط سير العمل، مما يقلل بشكل كبير من فرص التغير المعتمد على المشغل. ونتيجة لذلك، تصبح العملية بشكل عام أقل عرضة للأخطاء، وأقل استهلاكا للوقت، وأقل اعتمادا على التدريب الفني الموسع، مما يجعلها متاحة لمجموعة أوسع من المختبرات^. علاوة على ذلك، يضمن الشكل المستقر والجاهز للاستخدام لألواح الأجسام المضادة المؤتلفة المجففة أداء متسقا وموثوقا في الاختبارات عبر المشغلين والمواقع⁹.

لتحقيق الإمكانات الكاملة لتقنية الكاشف المجفف في قياس تدفق التومترية، من الضروري تطوير بروتوكول خطوة بخطوة لاستخدامه. يشمل ذلك إرشادات لتلوين الألواح المجففة، والاقتناء، والتحليل الآلي، لضمان توحيد جميع جوانب العملية وتحسينها من أجل الدقة والكفاءة. من خلال توفير بروتوكول واضح وشامل، يمكن للمختبرات تحقيق نتائج متسقة وموثوقة، مما يسهل إطلاق منتجات خلايا CAR T بأمان وفعالية². هنا، نقدم بروتوكولا يستفيد من مزايا ألواح الأجسام المضادة المجففة لمعالجة قيود طرق التلوين السائل التقليدية، مما يعزز الموثوقية والكفاءة وقابلية التكرار—وهي ميزات رئيسية لضمان علاجات آمنة وفعالة لخلايا CAR T (الشكل 1).

البروتوكول

تم جمع جميع العينات البشرية من متطوعين أصحاء مجهولين بعد الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات في منطقة Ärztekammer Nordrhein (#2020272) ونفذت وفقا للوائح الأخلاقية والسلامة البيولوجية المطلوبة.

1. جمع العينات وتحضيرها

1. اجمع عينات من خلايا مستقبلات مستضدات الكيميريك T (CAR T) معقم من أكياس المعالجة لمراقبة جودة التصنيع.
2. يعالج العينات بسرعة للحفاظ على حيوية الخلايا. تخزين العينات عند 2–8 درجات مئوية، محمية من الضوء، حتى تصبغ.
3. حدد عدد الخلايا لكل عينة قبل التلوين.
4. اضبط كل عينة إلى تركيز يصل إلى^{10 6} خلايا نووية لكل 100 ميكرولتر باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)/2 ملليمولار EDTA/0.5٪ BSA، ودرجة حموضة 7.2.
   1. إذا لزم الأمر، قم بعمل الطرد المركزي للعينات عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق. استنشق الفائق بالكامل.
   2. أعد تعليق الخلايا إلى التركيز المناسب.

2. تلوين الألواح الجافة

ملاحظة: تستخدم لوحتان من الأجسام المضادة المجففة المكالمة مسبقا لتلوين العينات: كوكتيل تركيب الخلايا المناعية المؤتلف المجفف (ICC) البشري، وكوكتيل النقل CAR T المؤتلف المجفف، البشري. صبغة السيارة في لوحة النقل CAR T أمر بالغ الأهمية. يتطلب الأمر فصلا موثوقا بين خلايا CAR-سالبة وCAR-إيجابية لتحديد تردد التحويل بدقة. قد يقلل الغسل من تعافي الخلايا بسبب فقدان الخلايا أثناء الطرد المركزي والشفط. لذلك، يفضل عموما بروتوكولات عدم الغسيل عندما تكون هناك حاجة لتركيز دقيق للخلايا.

1. كوكتيل ICC (بروتوكول عدم الغسيل)
   1. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضر مباشرة إلى أنبوب الأجسام المضادة المجفف ICC. اخلط عن طريق التوصيل بأنبوب للأعلى والأسفل و/أو الدوامة لفترة وجيزة لإذابة الحبيبات بالكامل. حضن لمدة 10 دقائق في الظلام عند درجة حرارة الغرفة (19–25 درجة مئوية).
   2. تأكد من أن حبيبة الأجسام المضادة المجففة مذاب بالكامل. تابع مباشرة إلى الشراء دون أي تحفظ.
2. كوكتيل النقل CAR T (بروتوكول الغسيل)
   1. أضف 100 ميكرولتر من نظام التعليق الخلوي المحضر إلى أنبوب النقل الجاف CAR T الجاف.
   2. أضف الحجم المناسب من كاشف كشف CAR (مثل 2 ميكرولتر). اخلط عن طريق التوصيل بأنبوب للأعلى والأسفل و/أو الدوامة لفترة وجيزة لإذابة الحبيبات بالكامل. حضن لمدة 10 دقائق في الظلام عند درجة حرارة الغرفة (19–25 درجة مئوية). تأكد من أن حبيبة الأجسام المضادة المجففة مذاب بالكامل.
   3. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت (buffer). الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق. أزل المادة الفائقة تماما.
3. التلوين الثانوي (إذا لزم الأمر)
   1. قم بغسل ثان (انظر الخطوة 2.2.3) لكواشف الكشف CAR الموسومة بالبيوتين لإزالة الكاشف المتقارن بالبيوتين الحر وتقليل التلوين الخلفي.
   2. أعد تعليق الخلايا في 98 ميكرولتر من الحاجز. أضف 2 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي الموسوم ب فيكوإيريثرين (PE). دوامة للخلط لفترة وجيزة. حضن لمدة 10 دقائق في الظلام عند درجة حرارة الغرفة (19–25 درجة مئوية).
   3. اغسل الخلايا لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة (انظر الخطوة 2.2.3).
4. التحضير النهائي للاستحواذ
   1. اضبط حجم جميع العينات الملونة (كوكتيل النقل CAR T وكوكتيل ICC) إلى 300–500 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت. احم العينات من الضوء وابق على درجة حرارة 2–8 درجات مئوية.
   2. قم بالاكتساب خلال ساعة واحدة للحفاظ على استقرار الفلوروفور والحفاظ على بقاء الخلايا.

3. اكتساب التدفق الخلوي وتحليل البيانات

1. جهز وتحضير جهاز قياس التدفق الخلوي، لضمان تحسين المعايرة وإعدادات الأجهزة.
2. شغل الليزر وغسل النظام السائل. اترك على الأقل 30 دقيقة حتى يسخن منضدة البصريات.
3. أثناء الإحماء، قم بتشغيل برنامج تنظيف بمحلول هيبوكلوريت بنسبة 1٪.
4. استخدم خرز المعايرة لضبط إعدادات الليزر.
5. تحضير عناصر تحكم ملونة بلون واحد للتعويض باستخدام مجموعات أجسام مضادة متطابقة.
   1. بالنسبة للخرز: أضف كمية مناسبة من خرز التحكم الإيجابي والسلبي.
   2. بالنسبة للخلايا: أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية.
   3. بالنسبة للكواشف المتقاربة بالبيوتين: أضف أنبوبا يحتوي على 98 ميكرولتر من المحلول المؤقت بالإضافة إلى 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية الموسومة ب PE.
   4. تحقق من تطابق كواشف التعويض مع مزيج الأجسام المضادة (أرقام الدفعات).
6. حضانة التحكم لمدة 10–20 ثانية، والدوامة لمدة 5 ثوان، ثم الحضانة لمدة 10 دقائق في الظلام عند 19–25 درجة مئوية.
7. قم بتخفيف العينات بسعة 600 ميكرولتر من المخزن وامزج جيدا.
8. قم بإعداد التعويض باستخدام أدوات تحكم ذات صبغة واحدة.
9. اضبط جهود FSC وSSC وحدد عتبات لاستبعاد الحطام.
10. احصل على ما لا يقل عن 50,000–100,000 خلية لمفاوية حية لكل عينة.
11. قم بإجراء البوابات لتقييم القابلية للبقاء وتعبير CD3 وتعبير CAR.
12. للقياس المطلق، حدد نسبة خلايا T الموجبة ل CAR (f₍CAR T₎).
13. عرف إجمالي الكريات البيضاء (N₍total₎) كخلايا حية CD45⁺، خلايا منفردة بعد استبعاد الحطام.
14. يقيس إجمالي عدد كريات الدم البيضاء عن طريق العد المباشر من عينات مصبوغة ب ICC إذا كان ذلك مدعوما من قبل الجهاز أو باستخدام خرزات العد أو محلل أمراض الدم.
15. حساب تركيز خلية CAR T (CAR):
    
    ملاحظة: مثال على حساب مع قيم من الشكل 2 والشكل 3
    ​
    
16. طبق هذه الطريقة في قياس خلايا CAR T عبر أجهزة وسير عمل مختلفة.

النتائج

تم تطبيق ألواح أجسام مضادة مؤتلفة مجافة على عينات خلايا CAR⁺ T لعرض سير عمل تلوين تدفق الخلايا الخلوي. كما هو موضح في الشكل 1، فإن استبدال سير عمل الكواشف السائلة التقليدية بألواح الأجسام المضادة المجففة المصممة مسبقا يلغي عدة خطوات تحضير—بما في ذلك وضع علامات الأنابيب (لتحديد تركيب الأجسام المضادة لللوحة؛ حيث يحتاج كل أنبوب إلى معرف العينة المناسب)، ودمج الكواشف، والخلط اليدوي—مما يبسط عملية التلوين. تحتوي الأنابيب على ملصق يمكن مسحه ضوئيا باستخدام أجهزة قياس خلايا متوافقة أو قراءته يدويا، مما يوفر خيارات مرنة للتعرف على العينة.

تظهر الأمثلة التمثيلية أن لوحة تركيب الخلايا المناعية المجففة تتيح تحديد المجموعات الرئيسية من كريات الدم البيضاء (الشكل 2)، بينما تتيح لوحة النقل المجففة ل CAR T تصور خلايا T المعبر عن CAR وتقييم النقل (الشكل 3). لا يطلب حجب ال FC لهذه الألواح، ويكفي التحكم في النظير الواحد لجميع الأجسام المضادة في اللوحة. تسلط هذه الأمثلة الضوء على تطبيق الألواح المجففة في التحليل متعدد المعلمات لخلايا CAR T وتوضح كيف يمكن تنفيذ سير العمل بكفاءة مع تقليل الخطوات العملية. تركيب ألواح الأجسام المضادة المجففة المستخدمة في هذه الدراسة مقدم في الجدول 1.

يوضح الشكل 4 تقليل وقت التحضير لتجربة تمثيلية عند استخدام الألواح المجففة لكل من المستخدمين الأقل خبرة وللمستخدمين. يبسط التنسيق المجفف إجراءات التلوين، ويقلل من التعامل اليدوي، ويوفر إرشادات عملية لتنفيذ سير العمل والتدريب. ومن المهم أن استخدام كوكتيلات الأجسام المضادة المجففة أدى إلى تكرار مجموعات فرعية لخلايا المناعة مماثلة لتلك التي تحصل عليها في الكوكتيلات السائلة التقليدية (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك، فإن ألواح الأجسام المضادة المجففة مستقرة في درجة حرارة الغرفة ويمكن تخزينها في ظروف محيطة طوال فترة صلاحيتها التي تبلغ سنة واحدة، على عكس الأجسام المضادة السائلة التقليدية التي عادة ما تتطلب تخزينا باردا. يدعم هذا الاستقرار الاستخدام المتكرر، والدراسات طويلة الأمد، وإدارة المخزون المبسطة.

في الختام، تظهر الأمثلة المقدمة كيف يمكن استخدام ألواح الأجسام المضادة المؤتليفة المجففة لتبسيط التوصيف متعدد المعلمات لخلايا CAR T التائية. بشكل عام، يوفر هذا العمل نهجا عمليا لتنفيذ ألواح الأجسام المضادة المجفت في تحليل خلايا CAR T المعتمدة على قياس تدفق التومترية، مع معالجة مبسطة، وتقليل خطوات التحضير، وتكوينات الألواح القابلة للتكيف.

الشكل 1: مقارنة بين سير عمل التلوين اليدوي ولوحات الأجسام المضادة المؤتلفة المجافة. يتضمن سير العمل اليدوي التقليدي (الأعلى) عدة خطوات تحضير، بما في ذلك وضع علامات الأنابيب، ودمج وخلط الكواشف، وإضافة العينات، مما يمكن أن يزيد من الجهد العملي. على النقيض من ذلك، يستخدم سير عمل لوحة الأجسام المضادة المؤتليفة المجففة (الأسفل) ألواح مخلوطة مسبقا وجافة تتطلب فقط إضافة العينة. يقلل هذا النهج المبسط من الخطوات اليدوية ويبسط عملية التلوين، مما يوضح كفاءة سير العمل والتنفيذ العملي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تحليل تدفق الخلايا لعينة من لقدح اللوك الملونة بلوحة الأجسام المضادة المؤتليفة المجففة "كوكتيل تركيب الخلايا المناعية". (أ) تم استبعاد الحطام عن طريق البوابة على FSC مقابل SSC ليشمل جميع الخلايا. (ب) تمت إزالة الدوبليت باستخدام بوابة FSC-A مقابل FSC-H. (ج) تم تحديد كريات الدم البيضاء عن طريق البوابة على خلايا CD45⁺ ، مما يسمح باستبعاد كريات الدم الحمراء المتبقية. (د) تم استبعاد الخلايا الميتة باستخدام تلوين 7-AAD. (E,F) تم تحديد خلايا CD3⁺ وتصنيفها إلى (E) خلايا T و(F) خلايا NKT بناء على تعبير CD56. (G) تم فصل الخلايا التائية لاحقا إلى مجموعات فرعية CD4⁺ وCD8⁺ . (ح) ضمن مجموعة CD3^– ، تم تعريف الخلايا الأحادية بتعبير CD14 وخلايا B بتعبير CD19. (I) تم تقسيم الخلايا المتبقية من CD14^–/CD19^{– إلى الخلايا} الحيضية عالية SSC عالية/CD16، وخلايا العدلات عالية SSC/CD16⁺ ، وخلايا SSC منخفضة/CD56⁺/CD16⁺ . يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تحليل تدفق الخلايا الخلوية لخلايا CAR T من CD19 (FMC63) الملونة بلوحة الأجسام المضادة المؤتلفة المجففة "كوكتيل النقل CAR T". (أ) تم استبعاد الحطام عن طريق البوابة على FSC مقابل SSC ليشمل جميع الخلايا. (ب) تمت إزالة الدوبليت باستخدام بوابة FSC-A مقابل FSC-H. (ج) تم تحديد الكريات البيضاء من خلال البوابة على خلايا CD45⁺ . (د) تم استبعاد الخلايا الميتة بناء على تلوين 7-AAD⁻ . (E,F) تم تحديد خلايا ^CD3+ وفصلها لاحقا إلى مجموعات CAR^{+ وCAR−} . تم تقسيم خلايا (G) CAR⁺ و(H) CAR⁻ إلى مجموعات فرعية من خلايا T CD4⁺ وCD8⁺ . (1) داخل مجموعة CD3⁻ ، تم تعريف الخلايا الأحادية المتبقية بواسطة تعبير CD14. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: توفير الوقت المحقق باستخدام لوحات الأجسام المضادة المجففة عبر مستويات الخبرة. بالنسبة للمستخدمين غير ذوي الخبرة (يسار) وذوي الخبرة (يمين)، تم تقييم الوقت لإعداد تجربة تدفق الخلايا (لوحة الأجسام المضادة المؤتلفة المجففة "كوكتيل تركيب الخلايا المناعية"، ثلاثيات تقنية) من بداية التجربة حتى بداية الحضانة، بما في ذلك التعامل مع الكواشف، واستخدام الماصات، والتوثيق. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: تحليل تدفق الخلايا الخلوية للدم الكامل المتحلل، وتراكب عينة مصبوغة بلوحة الأجسام المضادة المؤتلفة المجفت "كوكتيل تركيب الخلايا المناعية" (أزرق) وعينة مصبوغة بنفس الأجسام المضادة في شكل سائل (برتقالي). (أ) تم استبعاد الحطام عن طريق البوابة على FSC مقابل SSC ليشمل جميع الخلايا. (ب) تمت إزالة الدوبليت باستخدام بوابة FSC-A مقابل FSC-H. (ج) تم تحديد الكريات البيضاء عن طريق البوابة على خلايا CD45⁺ ، مما استبعد بقية كريات الدم الحمراء. (د) تم استبعاد الخلايا الميتة باستخدام تلوين 7-AAD. (E) تم تحديد خلايا CD3⁺ . (و) تم تصنيف هذه الخلايا بعد ذلك إلى خلايا T وخلايا NKT بناء على تعبير CD56. (G) تم فصل الخلايا التائية لاحقا إلى مجموعات فرعية CD4⁺ وCD8⁺ . (ح) ضمن مجموعة CD3^– ، تم تعريف الخلايا الأحادية بتعبير CD14 وخلايا B بتعبير CD19. (I) تم تقسيم الخلايا المتبقية من CD14^–/CD19^{– إلى الخلايا} الحيضية عالية SSC عالية/CD16، وخلايا العدلات عالية SSC/CD16⁺ ، وخلايا SSC منخفضة/CD56⁺/CD16⁺ . (J) تمت مقارنة الترددات التي تم الحصول عليها باستخدام الأجسام المضادة السائلة وألواح الكواشف المجافة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الغرض	V1 فيوبلو	V2 فيوجرين	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 APC	R2 APC-Vio770
تحديد مدى بقاء الخلايا وتركيبها	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
تحديد كفاءة النقل لخلايا CAR T	CD45	CD4	CD3	كاشف كشف CAR	7-AAD	/	CD14	CD8

الجدول 1: تركيب ألواح الأجسام المضادة المؤتلفة المجففة المستخدمة لتحليل خلايا CAR T المعتادة. يسرد هذا الجدول الأجسام المضادة المدرجة في كل لوحة مصابة، ويحدد المستضد المستهدف، والنسخة، والفلوروكروم، والكمية النموذجية لكل أنبوب. يتم عرض لوحتين: لوحة "تركيب الخلايا المناعية" لتحديد المجموعات الرئيسية من الكريات البيضاء الدقيقة، ولوحة "نقل CAR T" للكشف عن تعبير CAR وتوصيف المجموعات الفرعية لخلايا T. توفر المعلومات مرجعا لتنفيذ سير العمل والتكيف الاختياري مع أجسام مضادة مترابطة سائلة إضافية.

المناقشة

توفر ألواح الأجسام المضادة المؤتليفة المجففة سير عمل عملي ومرن لتوصيف خلايا CAR T في المختبر. يقلل التنسيق المصمم مسبقا خطوات التحضير ويبسط التعامل، مما يساعد على الحد من التغير المعتمد على المؤثرات ويدعم التنفيذ المتسق لإجراءات قياس التدفق الخلوي متعددة المعلمات⁸. توضح أمثلة تمثيلية استخدام هذه اللوحات لتحديد المجموعات الفرعية للكريات البيضاء، واكتشاف تعبير CAR، وتقييم المجموعات الفرعية لخلايا التائية. يمكن أيضا تعزيز اللوحات بأجسام مضادة إضافية متراكنة بالسائل لتشمل علامات إضافية أو مجموعات مناعية فرعية، مما يمكن التكيف المرن مع الاحتياجات التجريبية المحددة أو التحليلات ذات المعايير الأعلى.

يعد الكشف الدقيق عن CAR أمرا بالغ الأهمية لتحديد تردد النقل^{اليدوي 1} بشكل موثوق. الفصل الواضح بين مجموعات CAR-سالبة وCAR-إيجابية يعتمد على ظروف التلوين المحسنة بشكل مناسب، خاصة عندما تختلف مستويات تعبير CAR. يمكن لعناصر التحكم مثل عينات التألق ناقص واحد (FMO) دعم تحديد دقيق. في بعض الحالات، قد تحسن خطوات الغسل التمييز عن طريق إزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة؛ ومع ذلك، يمكن أن تقلل هذه الخطوات من تعافي الخلايا بسبب فقدان الخلايا أثناء الطرد المركزي والشفط. لذلك، قد يفضل سير العمل بدون غسل عندما تكون هناك حاجة لقياس دقيق للخلايا.

بينما يستخدم النهج مثاليا كاشف كشف خاص ب CAR يتعرف على المجال خارج الخلوي للCAR المهندس، يمكن أيضا استخدام كواشف بديلة، مثل الأجسام المضادة التي تستهدف مناطق الربط المحفوظة بين مجالات ارتباط المستضد ومجالات الإشارة. تمكن هذه البدائل من اكتشاف الخلايا التي تعبر عن CAR وقد تدمج في سير العمل حيث لا تتوفر كواشف خاصة ب CAR، مع تحسين مناسب.

يمكن للتكامل مع أنظمة الاكتساب والتحليل الآلية، بما في ذلك وضع السريع، أن يبسط جمع البيانات وتحليلها، مما يقلل من وقت التفاعل ويتيح تنفيذ سير العمل بشكل متسق بين المشغلين.

بينما يوضح هذا العمل الطريقة، لم يتم إجراء التحقق الرسمي من الاختبارات للتصنيع المنظم أو اختبار الإطلاق. لم يتم إجراء التحقق من عدة مراكز بعد، لذا لا يزال قابلية التكرار عبر المختبرات غير مؤكدة⁵. يعتمد هذا النهج على لوحات مصاغة مسبقا، مما قد يحد من المرونة للتطبيقات المتخصصة للغاية. ومع ذلك، يمكن تصميم خيارات الألواح المجففة خصيصا لتشمل علامات أو تركيبات محددة، مما يمكن سير عمل مخصص ويتغلب على قيود اللوحات القياسية. تتوازن اعتبارات التكلفة إلى حد كبير من خلال تقليل وقت العمل العملي والإجراءات المبسطة، والتي قد تكون مفيدة بشكل خاص في سير العمل عالي الإنتاجية.

قد يركز العمل المستقبلي على تقييمات الأداء الكمي، والتحقق الرسمي للاستخدام المنظم، والتوسع إلى دراسات متعددة المراكز لتقييم اتساق سير العمل عبر المختبرات. يمثل تصميم الألواح المخصصة طريقا عمليا لتوسيع تغطية الأشرار، ومعالجة الأسئلة التجريبية الفريدة، أو التكيف مع دراسات المراقبة المناعية الطولية.

باختصار، توفر ألواح الأجسام المضادة المؤتليفة المجففة منصة مرنة وعملية لقياس تدفق خلايا CAR T الخلية. تقلل من خطوات التحضير، وتبسط سير العمل، وتدعم تصميم التجارب المرن، بما في ذلك تكوينات اللوحات المخصصة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
(Optional) Biotin Antibody, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	مطلوب فقط في حالة استخدام كاشف CAR مترافق بالبيوتين.
(Optional) CAR T Cell Express Mode Package	Miltenyi Biotec	160-002-376	إضافة برمجية لأجهزة MACSQuant Analyzers؛ تمكن من التحليل التلقائي للبيانات والفتحات، على الرغم من أن التحليل اليدوي ممكن أيضًا.
كاشف CAR المختار القابل للكشف في قناة PE، مثلاً، كاشف CAR CD19، إنسان، بيوتين	Miltenyi Biotec	130-129- 550	الخيارات البديلة: كاشف idiotype CAR CD19 FMC63، PE، REAfinity (130-127-342); كاشف CAR CD22، إنسان، بيوتين (130-126-727); كاشف CAR BCMA، إنسان، PE (130-133-888)
جهاز فحص الجريان الخلوي، مثلاً، MACSQuant Analyzer 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	أنابيب StainExpress متوافقة مع جميع أجهزة فحص الجريان الخلوي القياسية.
كوكتيل التحول CAR T StainExpress، إنسان	Miltenyi Biotec	130-127-638	يمكن طلب تكوينات لوحة الأجسام المضادة المجففة المخصصة من خلال ممثل Miltenyi Biotec المحلي أو فريق الدعم الفني.
كوكتيل تكوين الخلية المناعية StainExpress، إنسان	Miltenyi Biotec	130-127-637	يمكن طلب تكوينات لوحة الأجسام المضادة المجففة المخصصة من خلال ممثل Miltenyi Biotec المحلي أو فريق الدعم الفني.