مقالة بحثية

اختبار قياس تدفق الخلايا المتعدد المعتمد على الخرزات للتحليل الوظيفي لخلايا CAR T

DOI:

10.3791/70344

⸱

يوليو 10, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Miltenyi Biotec, 2Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 3Außenstelle Zelluläre Immuntherapie, Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie (IZI), 4IRCCS Bambino Gesù Children's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة اختبار تدفق الخلايا المعتمد على خرزات متعددة لقياس ما يصل إلى 12 سيتوكينا وجزيئات مؤثر من مستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR)-الخلايا التائية الفائقة المشتقة من خلايا T، مما يتيح تحليلا سريعا وقابلا لإعادة إنتاج وظائف الخلايا التائية الهندسية مع أحجام عينات صغيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل تحليل خلايا CAR T تحديات بسبب تنوعها، واستجاباتها المناعية المعقدة، وقلة توفر العينات. تمكن اختبارات المتعدد الأبعاد التقييم الوظيفي من خلال الكشف المتزامن عن مجموعة واسعة من جزيئات المؤثرات، بما في ذلك السيتوكينات، والكيموكينات، والوسطاء السامين للخلايا. هنا، نصف اختبارا متعدد القنوات يعتمد على الخرزات متوافق مع قياس تدفق الخلايا الخلوي لتحليل إفراز جزيئات المؤثر بواسطة خلايا مستقبلات المستضد الكيميرية البشرية (CAR)-T. يتم حضن الخلايا الفائقة لخلايا CAR T بمزيج من خرزات الالتقاط التي تتكون من عدة مجموعات مشفرة بالفلورة مرتبطة بأجسام مضادة خاصة بالتحليل. ترتبط هذه الخرزات بأهداف قابلة للذوبان في العينة، مكونة مركبات محللة للخرزات يتم اكتشافها لاحقا باستخدام أجسام مضادة للكشف معنونة. يشمل الاختبار لوحة من الوسطاء المناعيين مثل الإنترفيرون (IFN)-γ، الإنترلوكين (IL)-2، عامل نخر الورم (TNF)-α، IL-6، IL-10، عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والبلعمية (GM-CSF)، وجرانزيم B. يسمح استخدام المعايير المحددة مسبقا بقياس كمية لعدة محللات من عينة واحدة. يمكن إجراء جمع البيانات وتحليلها باستخدام طرق التداخل الآلي التي توفرها أدوات البرمجيات المرتبطة بالأدوات أو الويب، مما يسهل معالجة البيانات. في الختام، يتيح اختبار المتعدد الأبعاد المعروض التحليل متعدد المعلمات لوظائف خلايا CAR T ويمكن تطبيقه في سياقات مثل البحث، واختبارات مراقبة الجودة، والدراسات الميكانيكية، والتوصيف الوظيفي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التوصيف الوظيفي ضروريا في اختبار مستقبل مستضدات الكيميرية (CAR) لخلايا T لأنه يوفر رؤى حول قوة وسلامة وآليات عمل هذه العلاجات. يساعد فهم توقيعات السيتوكين والوسيط السام في تقييم فعالية العلاج والآثار الجانبية المحتملة، مما يضمن تطوير علاجات آمنة وفعالة. اختبارات التحليل التقليدية ذات التقسيم الواحد مثل اختبارات التوربين المناعي المرتبطة بالإنزيمات (ELISA) لها قيود، مثل الحاجة إلى أحجام عينات عالية، وأوقات معالجة طويلة، وعمليات منفصلة لكل محلل، مع توفير نطاق ديناميكي محدود داخل العيناتالفردية 1,2. على النقيض من ذلك، تمكن اختبارات التحليل المعتمدة على الخرزات متعددة الاكتشاف المتزامن لوسائط قابلة للذوبان، مما يقلل من وقت المعالجة ومتطلبات العينة مع زيادة النطاق الديناميكي 1,2. تجعل هذه الكفاءة وعمق التحليل أدوات قيمة لتطوير أبحاث وتطوير خلايا CAR T 3,4,5.

يستخدم اختبار المتعدد القنوات المعروض في هذه الدراسة خرز الالتقاط الذي يظهر ملفات فلورية محددة في قنوات فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) وفيكوإيريثرين (PE)، وتغطى بأجسام مضادة محددة ضد المحللات القابلة للذوبان. أثناء الحضانة مع العينة، ترتبط هذه الخرزات بشكل انتقائي بالمحللات المستهدفة من المحلول. بعد التقاط المحلل، تضاف أجسام مضادة للكشف لتشكيل مجمعات شطائر خاصة بالمحلل. هذه الأجسام المضادة إما ترتبط مباشرة بالألوفيكوسيانين (APC) (الكشف المباشر) أو البيوتين (الكشف غير المباشر). للكشف غير المباشر، يلزم إجراء حضانة لاحقة باستخدام جسم مضاد مضاد بيوتين متقارن ب APC (الشكل 1). يتم تحليل المجمعات الناتجة – التي تتكون من خرزات الالتقاط، والمحللات، والأجسام المضادة للكشف – بواسطة قياس تدفق الخلايا لقياس تركيزات التحليل الكهربائي. اختبار التعددية هو تقنية قائمة على الصفائح، تشمل معايير محددة مسبقا تستخدم لتوليد منحنيات معيارية خاصة بالمحلل 1,2.

figure-introduction-1
الشكل 1: مبدأ تقنية السيتوكين وسير عمل الاختبار. يعتمد الاختبار على 12 مجموعة من خرزات الالتقاط المشفرة بالفلورة مرتبطة بأجسام مضادة خاصة بالتحليل. عند حضانة العينة، تتكون مركبات محللة الخرزات يمكن اكتشافها عبر قياس خلوي التدفق باستخدام أجسام مضادة للكشف محددة. يشمل سير عمل الفحص 1) إعداد معايير التحليل والعينات ذات الاهتمام على لوحة مرشح، 2) الحضانة باستخدام خرز الالتقاط، 3) الحضانة باستخدام الأجسام المضادة المضادة للتحليل الموسومة بالبيوتين لتشكيل مجمعات السندويشات، 4) الحضانة باستخدام الأجسام المضادة المضادة للبيوتين الموسومة ب APC، 5) إعادة التعليق في مخزن مؤقت للقياس، و6) جمع العينات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اختبار المتعدد الأبعاد الموصوف في هذه الدراسة متوافق مع قياسات التدفق الخلوية القياسية المزودة بلون أزرق (مثل 488 نانومتر؛ قنوات FITC وPE) وليزر أحمر (مثلا، 635 نانومتر؛ قناة APC). نظرا لتوفر مقياسات تدفق الخلايا على نطاق واسع في مختبرات الأبحاث والبيئات السريرية وبيئات مراقبة الجودة، فإن هذا التوافق يسهل التنفيذ دون الحاجة إلى أجهزة متخصصة إضافية5. في سياق اختبار وظائف خلايا CAR T المتخصصة، يتيح هذا النهج التقييم متعدد المعلمات للاستجابات الوظيفية ضمن سير العمل التحليلي المتاح بشكل شائع6. يقدم الاختبار مزايا كبيرة لأبحاث خلايا CAR T من خلال تمكين القياس المتزامن للمحللات الرئيسية، بما في ذلك GM-CSF، جرانزيم B، الإنترفيرون (IFN)-γ، الإنترلوكين (IL)-2، IL-4، IL-6، IL-10، IL-17A، IL-21، بروتين جاذب كيميائي للخلية الأحادية-1 (MCP-1)، بيرفورين، وعامل نخر الورم (TNF)-α (لوحة سمية الخلايا البشرية). تعد هذه الوسطاء ضروريين لفهم تنشيط خلايا CAR T ووظيفة المؤثرين وإطلاق السيتوكين المرتبط بالسلامة 4,5,7,8.

يتضمن سير عمل الفحص خيارات للبوابة الآلية وتحليل البيانات باستخدام برامج مرتبطة بالأدوات بالإضافة إلى أدوات التحليل المستقلة عن الأدوات والقائمة على الويب5. تدعم هذه الميزات معالجة مبسطة لبيانات تحليل جزيئات تأثير خلايا CAR T من خلال تقليل مدى التدخل اليدوي. قد يساهم استخدام التحليل الآلي في تحسين الاتساق في التعامل مع البيانات ويسهل تقييما أكثر كفاءة للقراءات الوظيفية8.

يحدد البروتوكول الحالي طريقة متعددة قابلة للتكرار وقابلة للتوسع لتحليل وسيط المناعة لخلايا CAR T الوسائلة. من خلال قياس 12 محللا مختلفا في عينة واحدة، يصبح هذا النهج ذا صلة خاصة بالتحقيقات الميكانيكية، والبحوث المبكرة، والدراسات المصاحبة. في المراحل المتقدمة من علاج خلايا CAR، قد يكون من المفيد تقليل عدد السيتوكينات المقاسة، خاصة في بيئة مراقبة جودة منظمة وحساسة للوقت لاختبار إطلاق الأدوية. لهذا الغرض، يمكن تجميع 1 إلى 7 سيتوكين من اللوحة المعروضة لتصميم اختبار سيتوكين مخصص يمكن التحقق منه لتحليلات الخلايا التائية الهندسية. وهذا يجعل البروتوكول الموصوف مناسبا بشكل مثالي للتطبيقات المتنوعة عبر البحث وبيئة مراقبة الجودة في المراحل المبكرة والمتأخرة من علاج خلايا CART 3,4,5,9.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع جميع العينات البشرية من متطوعين أصحاء مجهولين بعد الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات في منطقة Ärztekammer Nordrhein (#2020272) ونفذت وفقا للوائح الأخلاقية والسلامة البيولوجية المطلوبة.

1. الزراعة المشتركة لخلايا T في CAR

  1. جهز مزرعة خلوية لخلايا CAR T البشرية الهندسية في غياب ووجود مستضد متشابه، مثل الخلايا الورمية التي تقدم المستضدات بنسبة 2.5:1 (المؤثر : الخلايا المستهدفة).
  2. حدد نقطة زمنية واحدة أو عدة لجمع الفائق لتحليل السيتوكينات المفرزة مرة واحدة، أو حركية السيتوكينات على مدى إطار زمني محدد، مثل الساعة 4، 8، 16، 24، و48 ساعة.
    ملاحظة: قد تستخدم السوبرناتانتس مباشرة أو يمكن تجميدها للاستخدام لاحقا.

2. تحضير العينات والقياسي

  1. إعادة تشكيل معيار التحليل بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن أو وسط زراعة الخلايا إلى الحبيبة وخلطها بلطف. جهز ستة أنابيب كاشف ونفذ سلسلة تخفيف بنسبة 1:5 للمعيار المعاد تشكيله، حتى 3.2 بيجام/مل أو 0.6 بيجو/مل (حسب المحلل)، وتحضير اختبار فارغ.
  2. اجمع الزائفات الزائدة للزراعة المشتركة في CAR T، على سبيل المثال، بعد 16 ساعة أو 24 ساعة بعد الزراعة المشتركة. اختياريا، يتم جمع خلايا CAR T للنمذجة الظاهرية المتوازية باستخدام قياس تدفق الخلية.
  3. قم بطرد المركزي بالعينات عند حرارة 10,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استخدم السوبرناتانات بشكل مرتب أو خففها لتناسب نطاق الانحناء القياسي.

3. سير عمل الفحص

  1. قم بتدوير خليط خرزات الالتقاط لإعادة تعليقه تماما. أضف 50 ميكرولتر من المعيار أو العينة، مع 20 ميكرولتر من الخرزات المخففة مسبقا، إلى آبار صفيحة الترشيح ذات 96 بئرا.
  2. حضانه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، مع هز عند 450 دورة في الدقيقة، في الظلام. غسل الآبار مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن باستخدام مشعب تفريغ أو جهاز طرد مركزي.
  3. أضف 100 ميكرولتر من مادة الكشف المخفف مسبقا 1:50 (في المخزن المؤقت). حضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة، مع هز عند 450 دورة في الدقيقة، في الظلام. اغسلي مرتين.
  4. أضف 100 ميكرولتر من مادة الكشف المخفف مسبقا 1:50 2 (في المخزن المؤقت). حضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع هز عند 450 دورة في الدقيقة في الظلام. اغسلي مرة واحدة.
  5. للاقتناء، أعد تعليق العينات في 200 ميكرولتر من الحاجز. يظهر الشكل 1 نظرة عامة على سير عمل الاختبار.

4. الاستحواذ وتحليل البيانات

  1. الحصول على بيانات على مقياس تدفق خلوي مزود بأشعة ليزر زرقاء وحمراء (تتطلب قنوات PE، FITC، وAPC). عند العمل مع مقاييس تدفق MACSQuant، استخدم قوالب وضع Express للبوابات المؤتمتة بالكامل وتحليل البيانات.
  2. بدلا من ذلك، رفع ملفات بيانات FSC أو MQD إلى أداة InspectoR المعتمدة على الويب، والتي تقوم بقياس السيتوكين الكمي الآلي وتوفر نتائج جاهزة للتصدير مستقلة عن الجهاز المستخدم.
  3. تأكد من التحقق من الفصل الصحيح بين 12 مجموعة مختلفة من خرزات الالتقاط في قناة FITC مقابل قناة PE.
  4. طبق المنحنى القياسي لحساب تركيزات السيتوكينات، وتصدير وتصور النتائج.
  5. لجمع البيانات على جهاز قياس تدفق MACSQuant، استخدم الرمز الشريطي ثنائي الأبعاد لقارورة الالتقاط التي تحتوي على جميع إعدادات الاقتناء ذات الصلة.
    1. بعد تسجيل الدخول إلى البرنامج، اختر لوحة التصفية MACSPlex كرف عينات واضغط على زر الباركود في شريط الأدوات لتفعيل قارئ الرموز ثنائية الأبعاد.
    2. قدم القارورة للقارئ، مع التأكد من أن الرمز يواجه الضوء الوامض على مسافة مثالية بين 0.5–2.5 سم.
    3. في تبويب التسمية التلقائية ، قم بتعيين خرزات الالتقاط (MPx cyt T-NK,h) وNoLabel. بالنسبة للتخفيف التسلسلي لمعيار خلايا T/NK السامة للخلايا، حدد مواقع المجموعات، وفي تبويب الإعدادات ، اختر وضع التعبير مع النوع: التحليل ووضع: MACSPlex_Standard، مع تطبيق الخلط اللطيف حسب الحاجة.
    4. يتم تعيين العينات غير المعروفة بطريقة مشابهة، مع تحديد مواقعها، والتجميع الاختياري، واختيار MACSPlex_Sample لوضع التعبير، النوع: التحليل، ووضع: في تبويب الإعدادات ، بما في ذلك معرفات العينات والوصف الاختياري.
    5. تحقق من صحة تعريفات الرفوف في جدول التجارب ، وتأكد من مستويات السائل المناسبة في آبار ألواح الفلتر، ثم ابدأ القياس.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد مجموعات خرزات الالتقاط الممثلة المشفرة ل 12 محللا قابلا للذوبان

تم تحديد تجمعات خرزات الالتقاط باستخدام قنوات FITC وPE لمقياس تدفق السيل. تم تحديد تجمعات خرزات مميزة تمثل المحللات الفردية بوضوح في مخطط ثنائي المحور، بما في ذلك IL-10، جرانزيم B، MCP-1، IL-17A، بيرفورين، IL-2، IL-6، IFN-γ، TNF-α، IL-21، IL-4، وGM-CSF (الشكل 2). أظهر كل تجمع توقيع فلوري فريد، مؤكدا نجاح الكشف عن المتعدد الأبعاد والتمايز الواضح بين السيتوكينات والجزيئات المؤثرة المقاسة.

figure-results-1
الشكل 2: اكتشاف مجموعات خرز الالتقاط الممثلة في المتعدد الصور. تحتوي خرزات الالتقاط على شدة فلورية متأصلة يمكن استخدامها لتمييز التجمعات المختلفة الخاصة بالمحللين. يعرض مخطط التشتت فصل الإشارات الخاصة بالتحليل بناء على شدة الفلورة في قنوات FITC (B1) وPE (B2). تظهر الصورة ملفا تمثيليا ل 12 مجموعة من خرزات Capture المشفرة ل GM-CSF، Granzyme B، IFN-γ، IL-2، IL-4، IL-6، IL-10، IL-17A، IL-21، MCP-1 (CCL2)، بيرفورين، وTNF-α. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ملف تركيز السيتوكينات التمثيلي لخلايا CAR T بعد الزراعة المشتركة مع الخلايا الورمية

بعد الزراعة المشتركة لخلايا CAR T مع الخلايا المستهدفة للورم، تم قياس تركيزات السيتوكينات باستخدام لوحة السمية الخلوية البشرية في اختبار المتعدد (الشكل 3). أفرزت خلايا CAR T مستويات عالية من جرانزيم B (49,950.2 pg/mL)، IFN-γ (48,367.8 pg/mL)، TNF-α (7,055.2 pg/mL)، وGM-CSF (6,653.5 pg/mL)، مما يشير إلى تنشيط قوي ووظيفة فعالة سامة للخلية استجابة لتفاعل الورم. تجاوزت مستويات IL-2 الحد الأعلى للكشف (>10,000 pg/m)، مما يتوافق مع الإشارات التكاثرية القوية. لم يتم تخفيف العينة أو إعادة قياسها أكثر. على النقيض من ذلك، كانت السيتوكينات المرتبطة باستجابات خلايا T المساعدة التنظيمية أو البديلة، بما في ذلك IL-6، IL-10، IL-17A، IL-21، وMCP-1، موجودة بمستويات منخفضة أو شبه غير قابلة للكشف. تشير هذه النتائج إلى أن خلايا CAR T لديها استجابة مناعية من النوع 1 (Th1/سمية للخلايا) تتميز بنشاط مؤثر عالي وإنتاج محدود للسيتوكين المثبط للمناعة.

figure-results-2
الشكل 3: ملف السيتوكيني التمثيلي لخلايا CAR T بعد الزراعة المشتركة مع خلايا الورم. تم زراعة خلايا T لمستقبل المستضدات الكيميرية الهندسي (CAR) بشكل مشترك بين عشية وضحاها مع خلايا ورم JeKo-1. تم جمع المواد الفائقة لزراعة الخلايا بعد 16 ساعة من الحضانة وتم طردها لإزالة الجسيمات. تم تحليل العينات المخففة باستخدام لوحة السمية الخلوية البشرية في اختبار المولتيبلكس. تم إجراء منحنيين قياسيين وتم تحديد تركيزات جميع المحللات الاثني عشر. يتم عرض بيانات ممثلة لتحليل وحساب تركيزات خاصة بالتحليل باستخدام وضع Express الخاص بجهاز قياس التدفق الخلوي. يوضح الرسم البياني الشريطي والجدول المرافق المستويات المحسوبة (بيكوغرام/مليلتر) لجزيئات المؤثرات الاثني عشر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

حركية إفراز السيتوكينات لخلايا CAR T عند تحفيز المستضدات الخاص

بعد الزراعة المشتركة لخلايا CAR T مع خلايا مستهدفة تعبر عن (مستضد⁺) أو تفتقر إلى (مستضد⁻) المستضد المرتبط، تمت مراقبة إفراز السيتوكينات على مدى الوقت باستخدام لوحة السمية الخلوية البشرية في اختبار التعدد. أظهرت خلايا CAR T إفرازا سريعا وقويا للسيتوكينات عند التعرف على أهداف المستضد⁺، مع زيادة قوية في تنظيم جرانزيم B، IFN-γ، TNF-α، GM-CSF، وIL-2 خلال 8–24 ساعة، وبلغت ذروتها بعد 48 ساعة (الشكل 4). يشير هذا النمط إلى تنشيط قوي ووظيفة مؤثر سام خلوي بعد تفاعل المستضدات. كما لوحظت زيادات معتدلة في IL-6 وIL-17A وIL-21، بينما بقيت IL-4 وIL-10 وMCP-1 وبيرفورين منخفضة أو مرتفعة بشكل معتدل. على النقيض من ذلك، أظهرت الزراعة المشتركة التي تحتوي على أهداف مستضد⁻ استحثا ضئيلا للسيتوكينات عبر جميع المحللات (الشكل 4). تظهر هذه البيانات معا أن تنشيط خلايا CAR T وإنتاج السيتوكين المؤثرة يحدث تحديدا استجابة للتعرف على المستضدات ويزداد حدة مع مرور الوقت.

figure-results-3
الشكل 4: حركية إفراز جزيئات المؤثر لخلايا CAR T التي تزرع مع خلايا مستضدة إيجابية أو سلبية للمستضد. تم زراعة خلايا T لمستقبلات المستضد الكيميرية (CAR) المعدلة معا مع خلايا مستهدفة إما تعبر عن (مستضد⁺) أو تفتقر إلى مستضد خلايا CAR T المماثلة لمدة 4، 8، 16، 24، و48 ساعة. في كل نقطة زمنية، تم جمع وتحليل المواد الزائدة في الزراعة باستخدام لوحة السمية الخلوية البشرية في اختبار المتعدد لقياس لوحة واسعة من المحللات القابلة للذوبان مع مرور الوقت. تظهر حركية السيتوكينات ل 12 محللا (بيكوغرام/مليلتر). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام اختبار المتعدد لتحليل استجابات الوسيط المناعي القابلة للذوبان في زراعة خلايا CAR T المشتركة. أظهرت خلايا CAR T المزروعة مع خلايا مستهدفة إيجابية للمستضدات زيادة في إفراز IFN-γ، TNF-α، GM-CSF، Granzyme B، وIL-2، بما يتوافق مع تنشيط المؤثر ووظيفة السمية الخلوية 4,5,8. في المقابل، أظهرت الضوابط السلبية للمستضدات إنتاج منخفضا للسيتوكينات، مما يدل على قدرة الاختبار على التمييز بين الاستجابات الخاصة بالمستضدات في الظروف التي تم اختبارها 5,8. تدعم هذه النتائج تطبيق الاختبار لتقييم وظائف خلايا CAR التائية، بما في ذلك استخدامه في التحليلات المتعلقة بالقوة، والتحليل المرتبط بالسلامة، والتحقيقات الميكانيكية.

بينما توفر لوحة التحليل الثابت 12 نظرة عامة شاملة على النشاط المناعي ل CAR T، قد لا يكون من العملي التقاط النطاق الكامل للمحللات في جميع التطبيقات. بالنسبة لسير العمل المركز مثل التحقق من صحة الاختبارات أو اختبار مراقبة الجودة (QC) لمنتجات خلايا CAR T المتخصصة، يمكن تقليل حجم اللوحة إلى مجموعة فرعية مخفضة (مثل IL-2، IFN-γ، وTNF-α) لتبسيط التحليل مع الحفاظ على الحساسية الوظيفية 1,2.

تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول تصميم الزراعة المشتركة لخلايا CAR T واختيار ظروف أخذ العينة بشكل مناسب. على وجه الخصوص، مدة الزراعة المشتركة وعدد خلية المؤثر (نسبة E:T) يحددان بشكل مباشر مقدار السيتوكينات ويجب تعريفها أثناء إعداد الاختبار 5,6. بالإضافة إلى ذلك، يجب تعديل تخفيف العينة لضمان أن تركيزات المحللات تقع ضمن النطاق الديناميكي 1,2 للاختبار. لذا يجب أن يركز استكشاف الأخطاء على التحقق من أداء المنحنى القياسي وضبط ظروف الزراعة المشتركة أو عوامل التخفيف إذا كانت الإشارات خارج النطاق القابل للقياس 1,2.

مقارنة بأنظمة ELISA التقليدية ذات الكتلة المفردة، تولد منصة المولتي-بركس المعتمدة على قياس التدفق مجموعات بيانات عالية الكثافة ومتعددة التحليلات من أحجام عينات قليلة. من خلال تمكين القياس المتزامن لعدة محللات داخل عينة واحدة، يمكن أن يقلل التعدد من استهلاك المواد الكيميائية بشكل عام، ويزيد من إنتاجية العينة، ويقصر وقت الاختبار مقارنة بإجراء عدة اختبارات single-plex 1,2. يمكن أن تقلل خيارات الاستحواذ الآلي والتحليل الموحد من التباين المعتمد على المستخدم وتدعم قابلية التكرار والتوسع عبر الإعدادات التجريبية أو التصنيعية5،8. عادة ما تتراوح حساسية الكشف القياسية في ELISA بين 16 إلى 2000 بيغم/مل (وقد تكون أقل لمجموعات الحساسية العالية). ضمن المنصة المقدمة في هذه الدراسة، تتراوح أدنى تركيزات قابلة للكشف من 0.05 بيغم/مل للمحللات الأكثر حساسية إلى حوالي 93.8 بيجو/مل لأولئك الذين لديهم حساسية أقل بطبيعتها للاختبار. عبر التقييمات الداخلية، أظهر أكثر من 74٪ من المحللات المقاسة حدود كشف أقل من 5 بيغرام/مل، و38٪ كانت قابلة للكشف تحت 1 بيغم/مل، مما يؤكد الحساسية العامة للنظام. نظرا لأن حساسية الحواتم المتعددة قد تختلف حسب السيتوكين، يظل احتمال المنافسة بين الحواتم أمرا مهما. لتقليل هذا التداخل، يستخدم الاختبار حواتم غير متداخلة لالتقاط واكتشاف كل محلل، مما يقلل من التحيز المرتبط بالمنافسة ويحسن موثوقية القياس في الظروف متعددة الإرسال.

قد يختلف أداء التحليل المتعدد بين المحللين حسب حساسية التحليل والسياق البيولوجي، وتحت ظروف معينة، قد تقترب تركيزات المحللات من الحد الأعلى للكشف وبالتالي يجب تقييمها أثناء إعداد الاختبار. وعلى العكس، قد تبقى بعض المحللات (مثل MCP-1 وIL-4 في هذه الدراسة) غير قابلة للكشف حسب الظروف التجريبية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للعوامل التحليلية المسبقة مثل التعامل مع العينات أن تؤثر على قياسات السيتوكينات، ويجب الحفاظ على ظروف معالجة متسقة لضمان المقارنة.

بشكل عام، يتيح هذا النهج المتعدد توصيفا كفء وكمي لوظائف خلايا CAR T الفعالة. مقارنة بمعظم منصات كشف السيتوكين المتعددة، فإن الاختبار متوافق مع مقاييس تدفق الخلايا القياسية ويتضمن أداة برمجية مرتبطة بالأجهزة تسهل جمع البيانات وتحليلها بشكل سهل. بينما تم استخدام كشف السيتوكين متعدد القنوات في بيئات مناعة أخرى، يوضح العمل الحالي تطبيقه على التنميط الوظيفي لخلايا CAR T ضمن سير عمل موحد. يسمح تنسيق التوزيع القائم على الخرزات بالكشف المتزامن عن عدة تحليلات، مما يدعم معدل نقل أعلى مقارنة بطرق البلكس الواحد. تشمل التطبيقات المحتملة التقييم الوظيفي لمنتج الدواء، مثل تقييم رابطات CAR، وتحسين المتجهات، وتطوير العمليات. تدعم قابلية التحليل وقابلية التوسع والتحليل الآلي للاختبار أيضا اختبار القوة، وتحليل السلامة، والدراسات الميكانيكية التي تهدف إلى فهم سلوك ووظائف خلايا CAR T 5,7,8.

بينما توفر ملفات إفراز السيتوكين رؤى قيمة حول تنشيط خلايا CAR T وفعاليتها الوظيفية في المختبر، إلا أنها لا تستطيع تكرار بيولوجيا معقدة تحدد فعالية العلاج لدى المرضى بشكل كامل. عوامل مثل البيئة الدقيقة للورم، كثافة المستضدات، تنظيم المناعة، والاستمرارية في الجسم الحي تؤثر جميعها على أداء خلايا CAR T بما يتجاوز ما يمكن قياسه في الاختباراتالمسيطرة 6,8,10. ومع ذلك، فإن إنشاء اختبارات وظيفية قوية وموحدة مثل تحليل السيتوكينات متعددة القنوات يمثل خطوة مهمة نحو التوصيف الوظيفي لمنتج الدواء 3,4. أنماط السيتوكينات ليست فقط دليلا على نشاط خلايا CAR T بل ترتبط ارتباطا وثيقا بظواهر السمية، بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكينات (CRS) ومتلازمة السمية العصبية المرتبطة بالخلايا المناعية المؤثرة (ICANS)3,6,7. حاليا، يحد التفاوت في طرق القياس والتقارير من قابلية المقارنة بين التجارب، مما يبرز الحاجة إلى تحليل موحد وقابل للتكرار لوسيط المناعة 1,2,3. مع استمرار تقدم التقنيات التحليلية ومجموعات البيانات السريرية، الهدف النهائي هو تحديد توقيعات إفراز تنبؤية تعكس بشكل موثوق الإمكانات العلاجية وسلامة المرضى، مما يجسر الفجوة بين اختبارات القوة قبل السريرية والفعالية السريرية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إدراج M.L. و M.H. كمخترعين في طلب براءة الاختراع WO2021/058811A1. تم إدراج M.H. كمخترع في طلبات براءات الاختراع ومنح براءات اختراع تتعلق بتقنيات CAR T التي قدمتها مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في سياتل، واشنطن، وجامعة فورتسبورغ، ألمانيا. إم. إتش. هو أحد المؤسسين المشارك ومالك الأسهم لشركة T-CURX GmbH في فورتسبورغ، ألمانيا. حصل إم.ه. على رسوم من سيلجين/بي إم إس، يانسن، كايت/جلعاد. ج.ج، إيه.آر.، وسي.إي. هم موظفون في ميلتيني بيوتيك.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل مبادرة الأدوية المبتكرة 2 المشتركة بموجب اتفاقية منحة رقم 945393 T2EVOLVE. يحصل هذا المشروع المشترك على دعم من برنامج هورايزن 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي، والاتحاد الأوروبي لصناعات وجمعيات الأدوية (EFPIA)، والجمعية الأوروبية لأمراض الدم (EHA) (إلى M.H.، C.Q.، M.L.)، ERA-NET TRANSCAN-3 (مكالمة ممولة بالتعاون من EC 2021، ومن SmartCAR-T إلى M.H. وM.L.)، ومؤسسة Wilhelm-Sander-Stiftung (رقم المنحة 2022.134.1 إلى M.L.)، مؤسسة باولا ورودجر رايني (إلى م.ه. وM.L.)، ومؤسسة إيزكيه إف فورتسبورغ (S-511، C-543 إلى M.L.)، المؤسسة الألمانية للأبحاث (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG, TRR 221 (المشاريع الفرعية A03 و A06 إلى M.H. و M.L.); SFB-TRR 338/3 2026–452881907 (المشاريع الفرعية A02 M.H. و C04 M.L.) و CRC1525 (منحة بذور ل M.L.)، مركز أبحاث السرطان البافاري (BZKF؛ تانغو إلى م.ه. وM.L.)، جائزة الإنكا من نوفارتيس (إلى م.ل.)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, humanMiltenyi Biotec130-125-800اختبار السيتوكين المتعدد الحبيبات المستند إلى الكريات لقياس التدفق الخلوي
MACSPlex InspectoR ToolMiltenyi Biotec\أداة ويب لبوابة تحليل بيانات MACSPlex الآلية
MACSQuant Analyzer 10 Flow CytometerMiltenyi Biotec130-096-343أداة قياس تدفق الخلية لقياس البيانات المتعددة
MACSQuant Analyzer 16 Flow CytometerMiltenyi Biotec130-109-803أداة قياس تدفق الخلية لقياس البيانات المتعددة
MACSQuant Express ModeMiltenyi Biotec\برنامج للبوابة والتحليل الآلي
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196وسط زراعة الخلايا خالٍ من المصل والمحسّن لزراعة الخلايا التائية البشرية والفارية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy. Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).
  2. Boulch, M., et al. A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity. Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).
  3. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).
  4. Liu, C., et al. Cytokines: From clinical significance to quantification. Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).
  5. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).
  6. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).
  7. Wang, X., et al. Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro. Front Immunol. 15, 1254162(2024).
  8. Ren, Y., et al. An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome. Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).
  9. Lock, D., et al. Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells. J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).
  10. Bethke, M., et al. Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer. Cells. 13 (22), 1880(2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Immunology and InfectionChimeric Antigen Receptor T Cell TherapyCytokinesChemokinesGranzyme BImmunophenotypingMultiplex AssayHuman
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة