Research Article

طريقة تدفق الخلية المتعددة المستندة إلى الخرز لإعداد التعريف الوظيفي لخلايا CAR T

DOI:

10.3791/70344

⸱

July 10th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Miltenyi Biotec, 2Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 3Außenstelle Zelluläre Immuntherapie, Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie (IZI), 4IRCCS Bambino Gesù Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة اختبارًا لقياس التدفق المستند إلى الخرز المتعدد لتحديد كميات تصل إلى 12 من السيتوكينات والجزيئات المفعِّلة من المصل المشتق من الخلايا التائية المعدلة بالمستقبلات المضادة للمستضد الكيميرى (CAR)، مما يتيح التحليل السريع والقابل للتكرار لوظيفة الخلايا التائية المعدلة بإستخدام كميات صغيرة من العينات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل تحليل الخلايا التائية المعدلة بالمستقبل المناعي المكون من جزأين (CAR T) تحديات بسبب تغایرها، والاستجابات المناعية المعقدة، وتوافر العينات المحدودة. تمكن المقايسات المتعددة من التقييم الوظيفي من خلال السماح بالكشف المتزامن عن مجموعة واسعة من الجزيئات المفعّلة، بما في ذلك السيتوكينات، والكيموكينات، والوسائط السيتوטוکسية. هنا، نستعرض مقايسة متعددة مستندة على الخرز ومتوافقة مع تدفق الخلية لتحليل إفراز الجزيئات المفعّلة بواسطة الخلايا التائية المعدلة بالمستقبل المناعي المكون من جزأين (CAR) البشرية. تُحضَّر سوائل فوقية الخلايا التائية المعدلة بالمستقبل المناعي المكون من جزأين (CAR) مع مزيج من الخرز الالتقاطي الذي يشمل عدة مجموعات مرمزة بالفلورسنت والمقترنة بالأجسام المضادة المحددة للمحلل. ترتبط هذه الخرز بالأهداف الذائبة في العينة، وتشكل مركبات خرز-محلل التي تُكتشف لاحقاً باستخدام الأجسام المضادة المحددة للمحلل المرمزة. تشتمل المقايسة على لوحة من الوسطاء المناعية مثل الإنترفيرون (IFN)-γ، والإنترفيرون (IL)-2، وعامل نخر الورم (TNF)-α، وIL-6، وIL-10، وعامل تحفيز المستعمرات للعدلات والوحيدات (GM-CSF)، والغرانزايم B. يسمح استخدام المعايير المحددة مسبقاً بالقياس الكمي لعدة محللات من عينة واحدة. يمكن إجراء الحصول على البيانات والتحليل باستخدام أساليب البوابة الآلية التي يوفرها أدوات البرامج المرتبطة بالجهاز أو أدوات البرامج المستندة على الويب، مما يسهل معالجة البيانات. في الختام، تتيح المقايسة المتعددة المعروضة التحليل متعدد المعلمات لوظيفة الخلايا التائية المعدلة بالمستقبل المناعي المكون من جزأين (CAR) ويمكن تطبيقها في سياقات مثل البحث، واختبار مراقبة الجودة، والدراسات الآلية، والتوصيف الوظيفي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد التوصيف الوظيفي ضروريًا في اختبار الخلايا التائية المستقبلة للمستضدات الغريبة (CAR T) حيث يوفر رؤى حول فعالية وأمان وآليات عمل هذه العلاجات. يساعد فهم تواقيع السيتوكينات والوسطاء الخلوية في تقييم الفعالية العلاجية والآثار الجانبية المحتملة، مما يضمن تطوير علاجات آمنة وفعالة. الاختبارات المفردة التقليدية مثل المقايسات المناعية المرتبط بالإنزيم (ELISA) لها قيود، مثل الحاجة إلى كميات كبيرة من العينات، وأوقات معالجة طويلة، وعمليات منفصلة لكل مستضد، مع تقديم نطاق ديناميكي محدود داخل العينات الفردية1,2. على العكس، تمكن المقايسات المتعددة القائمة على الكرات من الكشف المتزامن عن عدة وسطاء ذائبين، مما يقلل من وقت المعالجة ومتطلبات العينات بينما يزيد من النطاق الديناميكي1,2. تجعل هذه الكفاءة وعمق التحليل المقايسات المتعددة أدوات قيمة لتطوير أبحاث وتطوير الخلايا التائية CAR3,4,5.

يستخدم المقايس المتعدد المقدم في هذه الدراسة كرات التقاط، والتي تظهر أنماطًا مضيئة محددة في قنوات فلورسسين إيزوثيوسيانات (FITC) وفيكوإيريثرين (PE) ومغلفة بأجسام مضادة محددة للمستضدات الذائبة. أثناء الحضانة مع عينة، ترتبط هذه الكرات بشكل انتقائي بالمستضدات المستهدفة من المحلول. بعد التقاط المستضد، تضاف أجسام مضادة للكشف لتشكيل معقدات شطيرة خاصة بالمستضد. إما أن تكون هذه الأجسام المضادة متصلة مباشرة إلى ألوفيكوبيسين (APC) (الكشف المباشر) أو إلى البيوتين (الكشف غير المباشر). بالنسبة للكشف غير المباشر، مطلوب الحضانة اللاحقة مع جسم مضاد متصل بالـ APC مضاد للبيوتين (الشكل 1). النتائج المعقدة – المكونة من كرات التقاط، والمستضدات، والأجسام المضادة للكشف – يتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي لتحديد تركيزات المستضد. المقايس المتعدد هو تقنية قائمة على الألواح، بما في ذلك المعايير المحددة مسبقًا المستخدمة لإنشاء منحني قياسي خاص بالمستضدات1,2.

الشكل 1
الشكل 1: مبدأ تقنية السيتوكين وسير عمل المقايسة. يستند المقايس إلى 12 مجموعة من الكرات الملتقطة المشفرة بالألوان الفلورية المقترنة بالأجسام المضادة الخاصة بالمستضدات. عند الحضانة مع العينة، تتشكل معقدات الكرات والمستضدات التي يمكن كشفها عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام أجسام مضادة كشف محددة. يتضمن سير عمل المقايسة 1) تحضير معايير المستضدات وعينات الاهتمام على لوحة مرشح، 2) الحضانة مع كرات التقاط، 3) الحضانة مع أجسام مضادة مضادة للمستضدات الموسومة بالبيوتين لتشكيل معقدات شطيرة، 4) الحضانة مع أجسام مضادة موصولة بالـ APC مضادة للبيوتين، 5) التعليق في المخزن المؤقت للقياس، و 6) الحصول على العينة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المقايس المتعدد الموصوف في هذه الدراسة متوافق مع عدادات التدفق الخلوي القياسية المجهزة بليزر أزرق (مثلاً، 488 نانومتر؛ قنوات FITC وPE) وليزر أحمر (مثلاً، 635 نانومتر؛ قناة APC). نظرًا لأن عدادات التدفق الخلوي متاحة على نطاق واسع في مختبرات الأبحاث والبيئات السريرية وبيئات مراقبة الجودة، فإن هذا التوافق يسهل التنفيذ دون الحاجة إلى أجهزة متخصصة إضافية5. في سياق اختبار وظيفة الخلايا التائية CAR، يتيح هذا النهج التقييم متعدد المعايير للاستجابات الوظيفية داخل سير عمل التحليل المتاح بشكل شائع6. يوفر المقايس مزايا كبيرة لأبحاث الخلايا التائية CAR من خلال تمكين القياس المتزامن للوسطاء الرئيسيين، بما في ذلك GM-CSF، والجرانزايم B، وإنترفيرون (IFN)-γ، وإنترلوكين (IL)-2، IL-4، IL-6، IL-10، IL-17A، IL-21، والبروتين الكيميائي الجذاب للوحيدات-1 (MCP-1)، والبيرفورين، وعامل نخر الورم (TNF)-α (لوحة السيتوكينية البشرية). تعتبر هذه الوسطاء حاسمة لفهم تفعيل الخلايا التائية CAR، ووظيفتها الفعالة، والإفراز المرتبط بالسلامة للسيتوكينات4,5,7,8.

يتضمن سير عمل المقايسة خيارات للبوابة الآلية وتحليل البيانات باستخدام برامج الأدوات المرتبطة بالجهاز وكذلك أدوات تحليل ويب مستقلة عن الأداة5. تدعم هذه الميزات معالجة بيانات تنميط جزيئات المفعول في الخلايا التائية CAR بطريقة مبسطة عن طريق تقليل مدى التدخل اليدوي. قد يسهم استخدام التحليل الآلي في تحسين الاتساق في معالجة البيانات وتسهيل تقييم أكثر كفاءة للمخرجات الوظيفية8.

يحدد البروتوكول الحالي طريقة متعدد مكررة وقابلة للتطوير لتحليل الوسطاء المناعية في الخلايا التائية CAR. من خلال قياس 12 مستضدًا مختلفًا في عينة واحدة، فإن النهج مناسب بشكل خاص للتحقيقات الميكانيكية والأبحاث في المراحل المبكرة والدراسات المصاحبة. في المراحل اللاحقة من علاج الخلايا التائية CAR، قد يكون من المفيد تقليل عدد السيتوكينات المقاسة، خاصةً في بيئة مراقبة الجودة (QC) المنظمة والحساسة للوقت لاختبار إطلاق الدواء. لهذا الغرض، يمكن تجميع 1 إلى 7 سيتوكينات من اللوحة المعروضة لتصميم فحص سيتوكين مخصص يمكن التحقق منه لتحليلات الخلايا التائية المعدلة. يجعل هذا البروتوكول الموصوف مناسبًا بشكل مثالي لتطبيقات متنوعة عبر كل من إعدادات البحث ومراقبة الجودة في كل من المراحل المبكرة واللاحقة من علاج الخلايا التائية CAR3,4,5,9.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع جميع العينات البشرية من متطوعين مجهولين أصحاء بعد الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات في مجلس الأطباء في شمال الراين (#2020272) وتم تنفيذها وفقًا للوائح الأخلاقية والسلامة الحيوية المطلوبة.

1. ثقافة CAR T خلية مشتركة

  1. قم بإعداد ثقافة خلية من الخلايا التائية المعدلة وراثيًا البشرية في حالة عدم وجود مستضد مكافئ وفي وجود مستضد مكافئ، على سبيل المثال، خلايا سرطانية مقدمة للمستضد بنسبة 2.5:1 (الخلايا المؤثرة: الخلايا المستهدفة).
  2. حدد نقطة زمنية واحدة أو متعددة لجمع المحلول فوقي لتحليل السيتوكينات المفرز مرة واحدة، أو الديناميات الحركية للسيتوكينات على مدى فترة زمنية محددة، على سبيل المثال، في 4، 8، 16، 24، و48 ساعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام المحلول فوقي مباشرة أو يمكن تجميده لاستخدامه لاحقًا.

2. التحضير القياسي والعينة

  1. قم بإعادة تكوين المعيار التحليلي بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت أو وسط زراعة الخلايا إلى الحبيبات وخلطها بلطف. قم بإعداد ست أنابيب كواشف وقم بإجراء سلسلة تخفيف 1:5 للمعيار المعاد تكوينه، وصولًا إلى 3.2 بيكوغرام / مل أو 0.6 بيكوغرام / مل (حسب التحليل)، وقم بإعداد عينة فارغة.
  2. قم بجمع المحلول فوقي لزراعة CAR T المشتركة، على سبيل المثال، بعد 16 ساعة أو 24 ساعة من زراعة الخلايا المشتركة. اختياريًا، قم بحصاد خلايا CAR T لتحديد النمط الظاهري بالتوازي باستخدام الفحص المتدفق.
  3. قم بفصل العينات عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 × ج لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية. استخدم المحلول فوقي بالطريقة التي هو عليها أو قم بتخفيفها لتناسب نطاق المنحنى المعياري.

3. سير عمل الفحص

  1. قم بهز مزيج الخرزة الالتقاطية لإعادة تعليقها جيدًا. أضف 50 ميكرولتر من المعيار أو العينة، إلى جانب 20 ميكرولتر من الخرزات المخففة مسبقًا، إلى آبار لوحة فلتر 96 البئر.
  2. قم بحضانة العينة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، مع اهتزاز عند 450 دورة في الدقيقة، في الظلام. قم بغسل الآبار مرتين بـ 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت باستخدام منضدة فراغ أو جهاز الطرد المركزي.
  3. أضف 100 ميكرولتر من 1:50 من الكاشف المخفف مسبقًا 1 (في المخزن المؤقت). قم بحضانة العينة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة، مع اهتزاز عند 450 دورة في الدقيقة، في الظلام. قم بالغسل مرتين.
  4. أضف 100 ميكرولتر من 1:50 من الكاشف المخفف مسبقًا 2 (في المخزن المؤقت). قم بحضانة العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع اهتزاز عند 450 دورة في الدقيقة، في الظلام. قم بالغسل مرة واحدة.
  5. للحصول على البيانات، قم بإعادة تعليق العينات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت. يتم عرض نظرة عامة على سير عمل الفحص في الشكل 1.

4. الحصول على البيانات وتحليلها

  1. قم بالحصول على البيانات على جهاز فحص متدفق مزود بمصابيح ليزر زرقاء وحمر (مطلوب قنوات PE وFITC وAPC). عند العمل باستخدام أجهزة الفحص المتدفقة MACSQuant، استخدم قوالب وضع التعبير للتحجيم الآلي الكامل والتحليل البيانات.
  2. بدلاً من ذلك، قم بتحميل ملفات بيانات FSC أو MQD إلى أداة InspectoR المستندة إلى الويب، والتي تؤدي قياسات كمية أوتوماتيكية للسيتوكينات وتوفر نتائج جاهزة للتصدير مستقلة عن الجهاز المستخدم.
  3. تأكد من التحقق من الفصل الصحيح لـ 12 مجموعة مختلفة من الحبيبات الالتقاطية في قناة FITC مقابل PE.
  4. قم بتطبيق المنحنى المعياري لحساب تركيزات السيتوكينات، وقم بتصدير وعرض النتائج.
  5. بالنسبة لجمع البيانات على جهاز فحص متدفق MACSQuant، استخدم الباركود ثنائي الأبعاد لقنينة الخرزات الالتقاطية، والتي تحتوي على جميع إعدادات الجمع ذات الصلة.
    1. بعد تسجيل الدخول إلى البرنامج، حدد MACSPlex Filter Plate كحامل العينات وانقر فوق زر الباركود في شريط الأدوات لتنشيط قارئ الكود ثنائي الأبعاد.
    2. قم بعرض القنينة على القارئ، مع التأكد من مواجهة الكود للضوء الوميضي على مسافة مثالية تتراوح بين 0.5 و2.5 سم.
    3. في علامة التبويب Autolabel، قم بتعيين Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) وNoLabel. لتخفيفات السلسلة للمعيار الخلوي التائي السام/خلايا القاتلة الطبيعية، قم بتحديد مواضع المجموعة وفي علامة التبويب الإعدادات ، حدد وضع التعبير مع النوع: التحليل والوضع: MACSPlex_Standard، مع تطبيق الخلط اللطيف حسب الحاجة.
    4. يتم تعيين العينات غير المعروفة بشكل مماثل، مع تحديد مواقعها، والمجموعة الاختيارية، وتحديد وضع التعبير والنوع: التحليل والوضع: MACSPlex_Sample في علامة التبويب الإعدادات، بما في ذلك معرفات العينات والوصف الاختياري.
    5. تحقق من صحة تعريفات الحامل في جدول التجربة ، وتأكد من مستويات السائل المناسبة في آبار لوحة الفلتر، ثم قم ببدء القياس.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد مجموعات حبوب التقاط التمثيلية التي تشفر 12 تحليلًا قابلاً للذوبان

تم تحديد مجموعات حبوب التقاط باستخدام قنوات FITC و PE لجهاز قياس الخلايا المتدفقة. تم فصل مجموعات الحبوب المميزة التي تمثل تحليلات فردية بوضوح في الرسم البياني ثنائي المحاور، بما في ذلك IL-10، وGranzyme B، وMCP-1، وIL-17A، وPerforin، وIL-2، وIL-6، وIFN-γ، وTNF-α، وIL-21، وIL-4، وGM-CSF (الشكل 2). أظهرت كل مجموعة توقيع فلوريسنت فريد، مما أكد على الكشف الناجح عن المضاعفات والتمييز الواضح للسيتوكينات والجزيئات المؤثرة المقاسة.

الشكل 2
الشكل 2: كشف مجموعات حبوب التقاط المضاعفات التمثيلية. تحتوي حبوب التقاط على شدات فلوريسنت جوهرية يمكن استخدامها لتمييز المجموعات السكانية المختلفة المحددة للمحاليل. يعرض الرسم البياني فصل الإشارات المحددة للمحاليل بناءً على شدة الفلوريسنت في قنوات FITC (B1) و PE (B2). يعرض الشكل ملفًا تعريفيًا تمثيليًا لمجموعات حبوب التقاط الـ 12 التي تشفر GM-CSF، وGranzyme B، وIFN-γ، وIL-2، وIL-4، وIL-6، وIL-10، وIL-17A، وIL-21، وMCP-1 (CCL2)، وPerforin، وTNF-α. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ملف تعريف تركيز السيتوكينات التمثيلي لخلايا CAR T بعد الزراعة المصاحبة مع خلايا الورم

بعد الزراعة المصاحبة لخلايا CAR T مع خلايا الهدف الورمية، تم تقدير تركيزات السيتوكينات باستخدام لوحة السيتوتكسية البشرية للمقايسة المضاعفة (الشكل 3). أفرزت خلايا CAR T مستويات عالية من Granzyme B (49,950.2 pg/mL)، وIFN-γ (48,367.8 pg/mL)، وTNF-α (7,055.2 pg/mL)، وGM-CSF (6,653.5 pg/mL)، مما يشير إلى تفعيل قوي ووظيفة مؤثرة خلوية استجابةً لارتباط الورم. تجاوزت مستويات IL-2 الحد العلوي للكشف (>10,000 pg/mL)، متسقًا مع إشارات انقسامية قوية. لم يتم تخفيف العينة أو إعادة قياسها. على العكس، كانت السيتوكينات المرتبطة بردود الفعل التنظيمية أو البديلة لخلايا T المساعدة، بما في ذلك IL-6، وIL-10، وIL-17A، وIL-21، وMCP-1، موجودة بمستويات منخفضة أو قريبة من غير المكتشفة. تقترح هذه النتائج أن خلايا CAR T قامت برد فعل مناعي من النوع الأول (Th1/مؤثر خلوي) المتميز بنشاط مؤثر عالٍ وإنتاج محدود للسيتوكينات المثبطة للمناعة.

الشكل 3
الشكل 3: ملف تعريف السيتوكينات التمثيلي لخلايا CAR T بعد الزراعة المصاحبة مع خلايا الورم. تمت زراعة خلايا CAR المحورة المستجيبة لمستقبل المستضد المختلط (CAR) ليليًّا مع خلايا ورم JeKo-1. تم حصاد سوائل زراعة الخلايا بعد 16 ساعة من الحضانة وفصلها لإزالة الجسيمات. تم تحليل العينات المخففة باستخدام لوحة السيتوتكسية البشرية للمقايسة المضاعفة. تم إجراء منحنيين معياريين وتم تحديد تركيزات جميع التحليلات الـ 12. يتم عرض مخرج البيانات التمثيلي للتحليل وحساب التركيزات المحددة للمحاليل باستخدام وضع Express الخاص بجهاز قياس الخلايا المتدفقة. يعرض الرسم البياني الشريطي والجدول المصاحب المستويات المحسوبة (بيكوجرام/ملليلتر) للجزيئات المؤثرة الـ 12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ديناميات إفراز السيتوكينات لخلايا CAR T عند التحفيز المحدد للمستضد

بعد الزراعة المصاحبة لخلايا CAR T مع الخلايا المستهدفة التي تعبر (Antigen⁺) أو تفتقر (Antigen⁻) إلى المستضد المكافئ، تم رصد إفراز السيتوكينات مع مرور الوقت باستخدام لوحة السيتوتكسية البشرية للمقايسة المضاعفة. أظهرت خلايا CAR T إطلاقًا سريعًا وقويًا للسيتوكينات عند التعرف على أهداف Antigen⁺، مع زيادة قوية في Granzyme B، وIFN-γ، وTNF-α، وGM-CSF، وIL-2 في غضون 8-24 ساعة، ووصولًا إلى مستويات الذروة في 48 ساعة (الشكل 4). يشير هذا النمط إلى تفعيل قوي ووظيفة مؤثرة خلوية بعد ارتباط المستضد. كما لوحظ زيادة معتدلة في IL-6، وIL-17A، وIL-21، في حين بقيت IL-4، وIL-10، وMCP-1، وPerforin منخفضة أو مرتفعة بشكل معتدل. على العكس، أظهرت الزراعة المصاحبة مع أهداف Antigen⁻ تحريضًا ضئيلًا للسيتوكينات عبر جميع التحليلات (الشكل 4). معًا، توضح هذه البيانات أن تفعيل خلايا CAR T وإنتاج السيتوكينات المؤثرة يحدثان تحديدًا استجابةً للتعرف على المستضد ويشتد مع مرور الوقت.

الشكل 4
الشكل 4: ديناميات إفراز الجزيئات المؤثرة لخلايا CAR T المزروعة مع الخلايا المستهدفة الموجبة للمستضد أو السالبة له. تمت زراعة خلايا CAR المحورة المستجيبة لمستقبل المستضد المختلط (CAR) مع الخلايا المستهدفة إما التي تعبر (Antigen⁺) أو تفتقر (Antigen⁻) إلى المستضد المكافئ لخلايا CAR T لمدة 4، و8، و16، و24، و48 ساعة. في كل نقطة

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام الفحص المتعدد لتصوير استجابات الوسطاء المناعيين الذائبين في زراعة الخلايا التائية المعدلة بالمستضد. أظهرت الخلايا التائية المعدلة بالمستضد المزروعة مع الخلايا المستهدفة الموجبة للمستضد زيادة إفراز IFN-γ، TNF-α، GM-CSF، Granzyme B، و IL-2، بما يتفق مع تفعيل المفعول والوظيفة السيتوتوكسية4,5,8. وعلى العكس، أظهرت الضوابط السلبية للمستضد إنتاجًا منخفضًا للسايتوكينات، مما يوضح قدرة الفحص على التمييز بين الاستجابات المحددة للمستضد في ظل الظروف المختبرة5,8. تدعم هذه النتائج قابلية تطبيق الفحص لتقييم وظيفة الخلايا التائية المعدلة بالمستضد، بما في ذلك الاستخدام في التحليلات المتعلقة بالفعالية، وملفات التعريف المرتبطة بالسلامة، والتحقيقات الميكانيكية.

بينما يوفر اللوحة الثابتة المكونة من 12 تحليلًا نظرة عامة واسعة على النشاط المناعي للخلايا التائية المعدلة بالمستضد، قد لا يكون من العملي التقاط النطاق الكامل للتحليلات في جميع التطبيقات. بالنسبة لخطوط العمل المركزة مثل التحقق من صحة الفحص أو اختبار مراقبة الجودة (QC) لمنتجات الخلايا التائية المعدلة بالمستضد، يمكن تقليل اللوحة إلى مجموعة فرعية مخفضة (مثل IL-2، IFN-γ، و TNF-α) لتبسيط التحليل مع الحفاظ على الحساسية الوظيفية1,2.

تتضمن الخطوات الحاسمة في البروتوكول تصميم زراعة الخلايا التائية المعدلة بالمستضد والاختيار المناسب لظروف الأخذ العينات. على وجه الخصوص، فإن مدة الزراعة المشتركة وعدد الخلايا المفعولة (نسبة E:T) يحددان بشكل مباشر حجم السيتوكينات ويجب تحديدهما أثناء إعداد الفحص5,6. بالإضافة إلى ذلك، يجب ضبط تخفيف العينة لضمان انخفاض تركيزات التحليلات ضمن النطاق الديناميكي للفحص1,2. وبالتالي، يجب أن يركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها على التحقق من أداء المنحنى القياسي وضبط ظروف الزراعة المشتركة أو عوامل التخفيف إذا كانت الإشارات تقع خارج النطاق القابل للقياس1,2.

بالمقارنة مع تقنيات ELISA المفردة التقليدية، تولد منصة الفحص المتعدد المستندة إلى قياس التدفق الخلوي مجموعات بيانات عالية الكثافة ومتعددة التحليلات من أحجام عينات قليلة. من خلال تمكين القياس المتزامن للعديد من التحليلات داخل عينة واحدة، يمكن للفحص المتعدد تقليل الاستهلاك الكلي للكواشف، وزيادة إنتاجية العينة، وتقصير وقت الفحص بالنسبة إلى إجراء العديد من تجارب ELISA المفردة1,2. يمكن أن تؤدي خيارات الاستحواذ الآلي والتحليل المعياري إلى تقليل التباين المعتمد على المستخدم ودعم القدرة على التكاثر والقابلية للتطوير عبر الإعدادات التجريبية أو التصنيعية5,8. عادةً ما تتراوح حساسية اكتشاف ELISA القياسية من 16 إلى 2000 بيكوغرام/ملليلتر (يمكن أن تكون أقل للمجموعات عالية الحساسية)7. ضمن المنصة المعروضة في هذه الدراسة، تتراوح أدنى التركيزات التي يمكن كشفها من 0.05 بيكوغرام/ملليلتر للتحليلات الأكثر حساسية إلى حوالي 93.8 بيكوغرام/ملليلتر لتلك ذات حساسية الفحص المنخفضة. عبر التقييمات الداخلية، أظهرت أكثر من 74٪ من التحليلات المقاسة حدود كشف أقل من 5 بيكوغرام/ملليلتر، و 38٪ كانت قابلة للكشف أقل من 1 بيكوغرام/ملليلتر، مما يؤكد الحساسية الإجمالية للنظام. وبما أن حساسية الفحص المتعدد يمكن أن تختلف حسب السيتوكين، فإن المنافسة المحتملة على المواقع المتفاعلة تظل اعتبارًا مهمًا. لتقليل مثل هذه التدخلات، يستخدم الفحص مواقع متفاعلة غير متداخلة لالتقاط واكتشاف كل تحليل، مما يقلل من التحيز المرتبط بالمنافسة ويحسن موثوقية القياس في الظروف المتعددة.

قد يختلف أداء الفحص المتعدد عبر التحليلات اعتمادًا على حساسية الفحص والسياق البيولوجي، وفي ظل ظروف معينة، قد تقترب تركيزات التحليلات من الحد الأعلى للكشف ويجب بالتالي تقييمها أثناء إعداد الفحص. على العكس، قد تظل بعض التحليلات (مثل MCP-1 و IL-4 في هذه الدراسة) غير قابلة للكشف اعتمادًا على الظروف التجريبية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر العوامل ما قبل التحليل مثل مناولة العينات على قياسات السيتوكين، ويجب الحفاظ على ظروف المعالجة المتسقة لضمان المقارنة.

بشكل عام، تمكن هذه المقاربة المتعددة من التوصيف الكمي والفعال لوظيفة الخلايا التائية المعدلة بالمستضد. بالنسبة إلى معظم منصات كشف السيتوكين المتعددة القائمة، فإن الفحص متوافق مع مقاييس التدفق الخلوي القياسية ويتضمن أداة برمجية مرتبطة بالأداة تسهل الحصول على البيانات والتحليل. بينما تم استخدام كشف السيتوكين المتعدد في إعدادات مناعية أخرى، فإن هذا العمل الحالي يوضح تطبيقه على التوصيف الوظيفي للخلايا التائية المعدلة بالمستضد ضمن سير عمل معياري. يسمح الشكل المستند إلى الخرز بالكشف المتزامن عن العديد من التحليلات، مما يدعم الإنتاجية الأعلى مقارنة بالطرق المفردة. تشمل التطبيقات المحتملة التقييم الوظيفي للمنتج الدوائي، مثل تقييم الرابط CAR، وتحسين المتجه، وتطوير العملية. كما تدعم قابلية الفحص للتطوير وقدرات التحليل الآلي اختبار الفعالية، وملفات تعريف السلامة، والدراسات الميكانيكية التي تهدف إلى فهم سلوك الخلايا التائية المعدلة بالمستضد ووظيفتها5,7,8.

بينما توفر أنماط إفراز السيتوكين رؤى قيمة حول تفعيل الخلايا التائية المعدلة بالمستضد والفعالية الوظيفية in vitro، فإنها لا تستطيع تكرار البيولوجيا المعقدة التي تحدد الفعالية العلاجية في المرضى بشكل كامل. العوامل مثل بيئة الورم، وكثافة المستضد، والتنظيم المناعي، والبقاء in vivo كلها تؤثر على أداء الخلايا التائية المعدلة بالمستضد بما يتجاوز ما يمكن قياسه في التجارب الخاضعة للرقابة6,8,10. ومع ذلك، فإن إنشاء اختبارات وظيفية قوية ومعيارية مثل التوصيف المتعدد للسيتوكينات يمثل خطوة مهمة نحو التوصيف الوظيفي للمنتج الدوائي3,4. لا تدل أنماط السيتوكينات فقط على نشاط الخلايا التائية المعدلة بالمستضد ولكنها ترتبط أيضًا ارتباطًا وثيقًا بظواهر السمية، بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) ومتلازمة السمية العصبية المرتبطة بالخلايا المناعية الفعالة (

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.L. وM.H. مدرجان كمخترعين في طلب براءة الاختراع WO2021/058811A1. M.H. مدرج كمخترع في طلبات براءات الاختراع وبراءات الاختراع الممنوحة المتعلقة بتقنيات CAR T التي تم تسجيلها من قبل مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان، سياتل، واشنطن، ومن قبل جامعة فورتسبورغ، فورتسبورغ، ألمانيا. M.H. هو أحد المؤسسين والمساهمين في T-CURX GmbH، فورتسبورغ، ألمانيا. تلقى M.H. مكافآت مالية من Celgene/BMS، Janssen، Kite/Gilead. J.J، A.R.، وC.E. هم موظفون لدى Miltenyi Biotec.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذه الأبحاث من قبل مبادرة الأدوية المبتكرة 2 للمشروع المشترك بموجب اتفاقية المنح رقم 945393، T2EVOLVE. يتلقى هذا المشروع المشترك الدعم من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في إطار برنامج Horizon 2020، والاتحاد الأوروبي للصناعات الصيدلانية والجمعيات (EFPIA) ورابطة أمراض الدم الأوروبية (EHA) (إلى M.H.، C.Q.، M.L.)، ERA-NET TRANSCAN-3 (دعوة EC المشتركة الممولة في عام 2021، SmartCAR-T إلى M.H. و M.L.)، Wilhelm-Sander-Stiftung (منحة رقم 2022.134.1 إلى M.L.)، مؤسسة Paula & Rodger Riney (إلى M.H. و M.L.)، IZKF Würzburg (S-511، C-543 إلى M.L.)، مؤسسة البحوث الألمانية (Deutsche Forschungsgemeinschaft، DFG، TRR 221 (المشروع الفرعي A03 و A06 إلى M.H. و M.L.)؛ SFB-TRR 338/3 2026–452881907 (المشاريع الفرعية A02 M.H. و C04 M.L.) و CRC1525 (منحة بدء التشغيل إلى M.L.)، مركز بافاريا لبحوث السرطان (BZKF؛ TANGO إلى M.H. و M.L.)، جائزة INCA من قبل Novartis (إلى M.L.)

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, humanMiltenyi Biotec130-125-800اختبار سيتوكين متعدد النقاط يعتمد على الخرز لقياس السيتومترية المتدفقة
MACSPlex InspectoR ToolMiltenyi Biotec\أداة على الويب لفتح وتحليل بيانات MACSPlex الآلية
MACSQuant Analyzer 10 Flow CytometerMiltenyi Biotec130-096-343أداة سيتومترية متدفق لقياس البيانات المتعددة
MACSQuant Analyzer 16 Flow CytometerMiltenyi Biotec130-109-803أداة سيتومترية متدفق لقياس البيانات المتعددة
MACSQuant Express ModeMiltenyi Biotec\برنامج للفتح والتحليل الآلي
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196وسط ثقافة خلوي خالي من المصل محسن تم تطويره لزراعة وتوسع الخلايا التائية البشرية والفأرية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy. Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).
  2. Boulch, M., et al. A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity. Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).
  3. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).
  4. Liu, C., et al. Cytokines: From clinical significance to quantification. Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).
  5. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).
  6. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).
  7. Wang, X., et al. Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro. Front Immunol. 15, 1254162(2024).
  8. Ren, Y., et al. An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome. Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).
  9. Lock, D., et al. Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells. J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).
  10. Bethke, M., et al. Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer. Cells. 13 (22), 1880(2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immunology and InfectionChimeric Antigen Receptor T Cell TherapyFlow CytometryCytokinesChemokinesGranzyme BImmunophenotypingMultiplex AssayHuman
Video Coming Soon

Related Articles