مقالة منهجية

آلية مسحوق إرمياو في علاج التهاب البروستاتا: دراسة تعتمد على علم الأدوية الشبكي والتحقق التجريبي

DOI:

10.3791/70356

⸱

مايو 29, 2026

 , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2The Second Department of Healthcare, China-Japan Friendship Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام نهج علم الأدوية الشبكي، كشفت هذه الدراسة أن مسحوق إرمياو يمارس تأثيره العلاجي ضد التهاب البروستاتا من خلال تثبيط العوامل الالتهابية ومسارات الإشارات المرتبطة به. أظهرت التجارب المائية اللاحقة أن مستخلص الماء قمع بشكل كبير التعبير عن السيتوكينات الالتهابية الرئيسية في نموذج مستحثة من LPS لخلايا ظهارة البروستاتا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول مقاربة بين علم الأدوية الشبكي ونهج التحقق التجريبي لدراسة آلية عمل مسحوق إيرميو (EMP) في علاج التهاب البروستاتا. يتبع سير العمل تصميما خطي: (1) فحص مركبات وأهداف نشطة مدفوعة بقواعد البيانات، (2) بناء وتحليل شبكات التفاعل، و(3) التحقق التجريبي في المختبر . أولا، تم استرجاع المكونات الفعالة من EMP وأهدافها المقابلة من قاعدة بيانات TCMSP، بينما تم الحصول على الأهداف المتعلقة بالتهاب البروستاتا من قاعدة بيانات GeneCards. تم استخدام تقاطع أهداف النبضة الكهربائية مع أهداف الأمراض لتحديد الأهداف العلاجية الرئيسية. ثانيا، تم إنشاء شبكة "الدواء–المكون الفعال–الهدف–المرض' باستخدام Cytoscape. تم إجراء تحليل تفاعل البروتين والبروتين (PPI) وتثريب مسار موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) على الأهداف الرئيسية، مما كشف أن العوامل الالتهابية مثل IL6 وTNF كانت أهدافا أساسية، وأن المسارات مثل PI3K/AKT وMAPK تم إثراؤها بشكل كبير. وأخيرا، تم إجراء التحقق الصناعي باستخدام نموذج التهابي محفز ب LPS لخلايا ظهارة البروستاتا. أدى العلاج بالنبضة النبضية الكهرومغناطيسية إلى تقليل إفراز العوامل الالتهابية IL-6 وTNF-α بشكل ملحوظ مقارنة بالمجموعة التي عالجت ب LPS (p < 0.05)، مما أكد فعالية EMP المضادة للالتهابات. يوفر هذا النهج التكاملي إطارا قابلا للتكرار يمكن تكييفه لدراسة أنظمة علاجية متعددة المكونات الأخرى. في الختام، توضح هذه الدراسة بشكل مبدئي أن النبضة الكهربائية (EMP) تمارس تأثيراتها المضادة لالتهاب البروستاتا من خلال آلية متعددة المكونات والأهداف والمسارات المتعددة، مرتبطة ارتباطا وثيقا بقمع الاستجابات الالتهابية، مما يوفر أساسا علميا لتطبيقه السريري.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب البروستاتا، وخاصة التهاب البروستاتا المزمن غير البكتيري، يمثل اضطرابا مسالك بوليا شائعا يتميز بمسببات معقدة ونقص العلاجات الفعالة للغاية، مما يفرض عبئا كبيرا على جودة حياة المرضى 1,2,3. الإدارة السريرية الحالية لالتهاب البروستاتا تعتمد على نهج متكامل يشمل المضادات الحيوية، وحاصرات مستقبلات α، وأدوية مضادة للالتهاب غير ستيرويدية 4,5,6. تشمل التحديات الرئيسية غياب علاجات محددة للأسباب والتفاعل المعقد بين العوامل النفسية والأعراض الجسدية، التي تساهم مجتمعة في نتائج علاجية غير مرضية وتكرار المرض7. في السنوات الأخيرة، تم تطبيق أساليب الطب التكاملي، مثل الوخز بالإبر والطب العشبي، على نطاق واسع في إدارة التهاب البروستاتا وأظهرت فعالية واعدة. تم تأكيد سلامة وفعالية هذه الأساليب العلاجية من خلال سلسلة من الأدلة البحثية عالية الجودة 8,9,10,11,12.

في هذا السياق، تقدم تركيبات الطب الصيني التقليدي مثل مسحوق إرمياو (EMP)، المعروف بخصائصه المضادة للالتهابات وإزالة السموم، نهجا علاجيا بديلا واعدا 13,14,15. ومع ذلك، لا تزال الآليات الدوائية الدقيقة التي تكمن وراء فعالية النبضة الكهرومغناطيسية ضد التهاب البروستاتا غير واضحة بشكل كامل، ويرجع ذلك أساسا إلى طبيعته متعددة المكونات. يوفر ظهور علم الأدوية الشبكي أداة قوية لفك شفرة نمط العمل المعقد "متعدد المكونات، متعدد الأهداف، متعدد المسارات" المميز في صيغ الطب الصينيالتقليدي 16,17. تضمنت استراتيجيتنا تحديد المكونات النشطة ل EMP وأهدافه المحتملة، تليها تحليل الشبكات لتحديد الأهداف الرئيسية والمسارات. أجريت تجارب لاحقة للتحقق البيولوجي من التأثيرات المضادة للالتهابات والآليات الأساسية، بهدف تأسيس أساس علمي لتطبيق النبضة الكهرومغناطيسية. تقدم هذه الدراسة إطار عمل مشترك بين علم الأدوية الشبكي والتجارب يعزز التفسير الميكانيكي للعلاجات متعددة المكونات

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة لهذه الدراسة، لأنها لم تشمل مشاركين بشريين أو عينات سريرية. تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بخطوط الخلايا وفقا لإرشادات وأنظمة السلامة البيولوجية المؤسسية. تم الحصول على خط الخلايا الظهارية للبروستاتا المستخدم في هذه الدراسة من مورد تجاري معتمد.

ملاحظة: جميع المواد الكيميائية والأدوات والبرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد. يتم عرض مخطط تدفق هذه الدراسة في الشكل 1.

1. فحص المكونات الفعالة

  1. الوصول إلى قاعدة بيانات TCMSP.
  2. اختر "اسم العشب" في مربع البحث، أدخل "هوانغبو"، ثم اضغط على "بحث".
  3. انقر على فلتر "OB"، وحدد "≥30"، وقدم الطلب.
  4. انقر على فلتر "DL"، وقم بتعيين "≥0.18"، وطبق.
  5. انسخ النتائج المصفاة إلى جدول بيانات في إكسل.
  6. استخدم نفس طريقة الفحص للحصول على المكونات الفعالة ل "كانغتشو".
  7. قم بإزالة المكونات النشطة المكررة عن طريق استيراد جميع مجموعات البيانات إلى Microsoft Excel (الإصدار 2019) ودمج قوائم المركبات بصيغة Excel.
  8. قم بإزالة المكونات الفعالة المكررة عن طريق توحيد أسماء المركبات وتحديد مدخلات متطابقة. عندما كانت عدة سجلات تتوافق مع نفس المجمع، كان يتم الاحتفاظ بإدخال تمثيلي واحد فقط.
  9. تأسس الروابط بين "هوانغبو"، "كانغتشو"، والمكونات الفعالة.

2. الحصول على الأهداف المقابلة للمكونات الفعالة

  1. الوصول إلى قاعدة بيانات TCMSP.
  2. اختر "اسم المواد الكيميائية" في مربع البحث، أدخل المكونات النشطة، ثم اضغط على "بحث".
  3. انسخ اسم الهدف المرتبط بكل مكون نشط.
  4. قم بإزالة أسماء الهدف المكررة وإنشاء روابط بين المكونات الفعالة وأسماء الأهداف.
  5. الوصول إلى قاعدة بيانات UniProt (https://www.uniprot.org/)18، واسترجع الرموز الجينية الرسمية لكل اسم مستهدف، واستبدلها بشكل منهجي.

3. الحصول على أهداف الأمراض

  1. ادخل إلى قاعدة بيانات GeneCards (https://www.genecards.org)19.
  2. أدخل "التهاب البروستاتا" في حقل البحث واضغط على أيقونة البحث للحصول على قائمة الجينات ذات الصلة.
  3. فرز الجينات بترتيب تنازلي حسب درجة الصلة.
  4. تصدير الجينات ذات الصلة بصيغة Excel.
  5. تم اختيار الأهداف التي حصلت على درجة ≥1 كأهداف مرتبطة بالتهاب البروستاتا.

4. التحضير لبناء شبكة تنظيمية للمواد الفعالة من الأدوية وهدف الأمراض

  1. احصل على تقاطع الأهداف المتعلقة بالمكونات الفعالة والأهداف المرتبطة بالتهاب البروستاتا، وعرفها كأهداف النبضة الكهربائية لعلاج التهاب البروستاتا.
  2. حدد العلاقة بين المكونات الفعالة والأهداف العلاجية للنبضة الكهربائية لعلاج التهاب البروستاتا.
  3. أنشئ ملف إكسل باسم "Network" مع الأعمدة الثلاثة الأولى باسم "Node1" و"Node2" و"Net".
  4. قم بلصق الروابط بين EMP والدواء في عمودي "Node1" و "Node2"، مع إدخال "ddrugs" في عمود "Net" لجميع الصفوف.
  5. قم بلصق ارتباطات المكونات الفعالة بالأدوية في عمودي "Node1" و"Node2"، مع إدخال "المكون" في عمود "Net" لجميع الصفوف.
  6. ملء عمودي "Node1" و"Node2" بروابط المكونات النشطة مع الأهداف لأهداف EMP لعلاج التهاب البروستاتا، مع إدخال "الهدف" في عمود "Net".
  7. الصق الأهداف العلاجية لEMP لالتهاب البروستاتا في عمود "Node1"، مع إدخال "التهاب البروستاتا" في عمود "Node2" و"المرض" في عمود "Net" لجميع الصفوف.
  8. احفظ ملف Excel "Network" كملف بصيغة txt.
  9. أنشئ ملف إكسل باسم "Type" مع أول عمودين باسم "Node" و"Type".
  10. ملء عمود "عقدة" ب "EMP"، مع إدخال "formula" في عمود "Type".
  11. أدخل "هوانغبو" و"كانغتشو" في عمود "العقدة"؛ أدخل "دواء" في عمود "النوع" لجميع الصفوف.
  12. أدخل المكونات الفعالة في عمود "العقدة" ، بينما أدخل "المكون" في عمود "النوع" لجميع الصفوف المقابلة.
  13. ملء عمود "العقدة" بالأهداف العلاجية للEMP لالتهاب البروستاتا، مع إدخال "الهدف" في عمود "النوع".
  14. أدخل الأهداف المتعلقة بالتهاب البروستاتا في عمود "العقدة"، بينما أدخل "المرض" في عمود "النوع" لجميع الصفوف المقابلة.
  15. احفظ ملف Excel "Type" كملف بصيغة .txt.

5. تصور شبكة تنظيمية "المكون النشط للدواء-المرض-الهدف" بواسطة Cytoscape

  1. أطلق سايتوسكيب.
  2. اذهب إلى "ملف > استيراد > شبكة من نظام الملفات" وافتح ملف "network.txt".
  3. افتح لوحة "الأسلوب". اختر "شكل"، واختر "نوع" من قائمة "العمود" المنسدلة، وقم بتعيين "نوع الخريط" إلى "رسم الخرائط المتقطعة".
  4. خصص أشكال عقد مميزة للفئات التالية: الصيغة، الدواء، المكون، الهدف، المرض.
  5. اختر "ملء اللون"، ثم اختر "النوع" من قائمة "العمود" المنسدلة، وقم بتعيين "نوع التعيين" إلى "التعيين المتقطع".
  6. خصص ألوان عقد مميزة للفئات التالية: الحليب الصناعي، الدواء، المكون، الهدف، المرض.
  7. اختر "الارتفاع" و"العرض"، ثم اختر "النوع" من قائمة "العمود" المنسدلة، وتعيين "نوع التعيين" إلى "التعيين المتقطع".
  8. خصص أحجام عقد مميزة للفئات التالية: الحليب الصناعي، الدواء، المكون، الهدف، المرض.
  9. اختر "حجم الخط التسميمي"، ثم اختر "النوع" من قائمة "العمود" المنسدلة، وقم بتعيين "تعيين النوع" إلى "رسم الخرائط المتقطعة".
  10. خصص أحجام خطوط الملصقات المختلفة للفئات التالية: الصيغة، الدواء، المكون، الهدف، المرض.
  11. إعادة تموضع العقد يدويا لتحسين تخطيط الشبكة.
  12. اذهب إلى "ملف > تصدير صورة > شبكة إلى ملف" واحفظ الشبكة كصورة.

6. تحليل وتصور شبكات PPI

  1. ادخل https://cn.string-db.org/ واذهب إلى وحدة "البروتينات المتعددة".
  2. أدخل قائمة الجينات المستهدفة في مربع البحث، واختر "الإنسان العاقل" كالكائن الحي، ثم اضغط على "بحث".
  3. بعد تحميل النتائج، اضغط على "متابعة".
  4. افتح لوحة "الإعدادات"، وحدد "الحد الأدنى لدرجة التفاعل المطلوبة" إلى "ثقة عالية (0.700)"، واختر "إخفاء العقد غير المتصلة في الشبكة".
  5. انقر على "تحديثe"، ثم تصدير بيانات ارتباط PPI بصيغة TSV عبر قائمة "تصدير".
  6. شغل Cytoscape، انتقل إلى قائمة الملفات، واختر "استيراد الشبكة من نظام الملفات" لفتح ملف TSV الخاص بك.
  7. انتقل إلى قائمة "الأدوات"، ثم اختر "محلل الشبكة > تحليل الشبكات > تفسير الشبكة > تعامل الشبكة كغير موجهة".
  8. انتقل إلى قائمة "الملف"، اختر "تصدير الجدول إلى الملف" في النظام، وصدر بيانات الشبكة.
  9. انتقل إلى لوحة "الأسلوب" وقم بتكوين سمات "الشكل"، "لون التعبئة"، "الارتفاع"، و"العرض".
  10. قم بضبط تخطيط شبكة PPI عن طريق إعادة تموضع العقد.
  11. انتقل إلى قائمة "الملف"، اختر "تصدير صورة الشبكة إلى ملف"، وصدر الشبكة المرئية كصورة.
  12. افتح بيانات شبكة PPI المصدرة باستخدام WPS وفرزها بالترتيب التنازلي حسب عمود "درجة".
  13. اختر أفضل 20 هدفا مرتبا، وأنشئ مخطط شريطي، واحفظ المخطط كصورة.

7. تحليل إثراء مسار KEGG

  1. افتح طرفية أو موجه أوامر، واكتب R، واضغط Enter.
  2. في وحدة تحكم R، شغل الأوامر التالية واحدة تلو الأخرى:
    install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
    BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
  3. حول رموز الجينات الخاصة بأهداف EMP لعلاج التهاب البروستاتا إلى معرفات Entrez باستخدام org. Hs.eg.db.
  4. اقرأ معرفات Entrez وقم بتحليل إثراء KEGG باستخدام حزمة clusterProfiler مع معاملات: organism = "has", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.05.
  5. بعد إزالة المسارات المرتبطة بالأمراض البشرية والأيض من نتائج تحليل إثراء KEGG التي تم الحصول عليها، قم بفرز المسارات المتبقية وفقا لعدد الجينات المخصبة.
  6. حدد العلاقة بين أفضل 15 مسار إشارات مصنفة والأهداف المختلفة.
  7. جهز ملفا من عمودين مع ارتباطات "المسار" و"الهدف"، ثم استيراده إلى Cytoscape عبر "ملف > استيراد > شبكة من الملف".
  8. قم بتعيين أشكال وألوان العقد لتمييز المسارات عن الأهداف باستخدام لوحة "الأسلوب".
  9. قم بضبط التخطيط يدويا وتصدير الشبكة كصورة.

8. التحضير الدوائي

ملاحظة: تتكون تركيبة EMP من 15 جرام من Phellodendri Chinensis Cortex (هوانغبو) و15 جرام من Atractylodis Rhizoma (كانغتشو). تم استخدام طريقة استخراج الماء وترسيب الكحول للحصول على المستخلص للتجارب الخلوية اللاحقة20.

  1. اغمر الدواء في كتلة ماء بمقدار 10 أضعاف لمدة ساعة واحدة.
  2. قم بالتصفية لمدة ساعة واحدة، ثم فلتر الشاش للحصول على القطر.
  3. أضف كتلة ماء بمقدار 10 أضعاف إلى الدواء مرة أخرى، ثم اخمر المحلول لمدة 30 دقيقة، ثم قم بتصفية الشاش للحصول على القطر.
  4. أضف كتلة مكونة من الماء إلى الدواء مرة أخرى، ثم اترك الخليط لمدة 30 دقيقة، ثم قم بتصفية الشاش للحصول على القطر.
  5. امزج الثلاثة المصفى بالصوت، ثم قم بتصفية الخليط عبر ورق الفلتر.
  6. ركز المحلول تحت ضغط منخفض إلى 10٪ من حجمه الأصلي.
  7. برد المركز، أضف الإيثانول ببطء إلى 75٪ مع التحريك، ثم الإغلاق والتخزين عند 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة.
  8. قم بعمل الطرد المركزي للخليط واجمع الفائق.
  9. استمر في التقطير تحت ضغط منخفض.
  10. وأخيرا، قم بتجميد المنتج باستخدام مجفف بالتجميد بالفراغ.
    ملاحظة: يمكن تخزين المسحوق المحمر على درجة حرارة –20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر، وهو ما يعد نقطة توقف آمنة. للاستئناف، أعد تشكيل المسحوق في مذيب مناسب حسب الحاجة.

9. ذوبان الخلايا وزراعتها

ملاحظة: تم تسليم الخلايا المشتراة إلى المختبر على الثلج الجاف. قبل بدء التجربة، تم تحضير وسط خلل الكيراتينوسيت الخالي من الخلايا (K-SFM) مسبقا عن طريق إضافته بعامل نمو البشرة المؤتلف البشري (rEGF) إلى تركيز نهائي 5 نانوغرام/مل، ومستخلص الغدة النخامية البقري بتركيز نهائي 50 ميكروغرام/مل، و1٪ من البنسلين-ستريبتوميسين.

  1. فعل حمام الماء واضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
  2. أزل الخلايا من الثلج الجاف وحركها فورا في حمام الماء حتى تذوب تماما.
  3. أضف 5 مل من K-SFM إلى الخلايا. اخلط الخليط بلطف، ثم قم بالطرد المركزي (4 درجة مئوية، 500 × جم، 5 دقائق).
  4. أزل المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في K-SFM كامل.
  5. انقل الخلايا إلى قارورة T-25 وضعها في حاضنة زراعة الخلايا.
    ملاحظة: تم الحفاظ على معايير البيئة لحاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية، و5٪ CO₂، ورطوبة نسبية ≥ 95٪.

10. الزراعة الفرعية للخلايا

ملاحظة: تم إجراء الزراعة الفرعية عندما وصلت الخلايا إلى التقاء 80–90٪، بنسبة زراعة فرعية تتراوح بين 1:2 إلى 1:3.

  1. استنشق وسط الزراعة الفائق، تليها غسلتين للخلايا باستخدام PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
  2. أدخل 2 مل من تريبسين-إيدتا واترك الخلايا لمدة 3 دقائق لتفكك الإنزيمات.
    تحذير: يتضمن هذا البروتوكول استخدام كواشف خطرة، بما في ذلك عدادة السكريات الدهنية (LPS)، والكلوروفورم، والإيثانول، وكاشف التريزول. يجب تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالمواد الكيميائية الخطرة باستخدام غطاء بخار كيميائي معتمد وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، القفازات، وحماية العين). يجب التعامل مع المواد البيولوجية وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية.
  3. أضف متوسط K-SFM مع 10٪ مصل أبقار جنيني لإنهاء الهضم.
  4. انقل خليط الخلية إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل، وهو جهاز طرد مركزي (4 درجات مئوية، 500 × جم، 5 دقائق)، وإزالة السوبرناتينت.
  5. تم إعادة تعليق حبيبة الخلية في K-SFM كاملة ثم نقلت لاحقا إلى قوارير زراعة جديدة.

11. تحديد أقصى تركيز لعلاج المخدرات عبر اختبار MTS

ملاحظة: تم اختبار كل تركيز دواء باستخدام 5 نسخ تقنية.

  1. هضم خلايا RWPE-1 في مرحلة النمو اللوغاريتمي.
  2. أعد تعليق الخلايا في وسط K-SFM كامل، ثم حدد تركيز الخلية عن طريق العد.
  3. اضبط تعليق الخلية إلى كثافة 1 × 105 خلايا/مل مع وسط K-SFM كامل.
  4. توزيع تعليق الخلية في صفيحة بسعة 96 بئر بسعة 100 ميكرولتر لكل بئر.
  5. تم وضع لوحة ال 96 بئر في حاضنة زراعة الخلايا للزراعة.
  6. بعد 24 ساعة، وبعد أن التصقت الخلايا بالكامل، تم سحب وسط الزراعة والتخلص منه.
  7. استبدال الوسط بوسط K-SFM كامل يحتوي على تركيزات مختلفة من محلول النبضة الكهرومغناطيسية.
  8. أعد الصفيحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى من الحضانة.
  9. استنشق الوسط، ثم شطف الخلايا مرتين باستخدام PBS.
  10. أضف 100 ميكرولتر من وسط K-SFM الكامل إلى كل بئر، ثم حضن اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 4 ساعات أخرى.
  11. قم بتوزيع 10 ميكرولتر من محلول MTS في كل بئر، وتحديد الكمية الزائدة عند 490 نانومتر بعد حضانة لمدة ساعة واحدة.
  12. باستخدام مجموعة الضابط الفارغة (الخلايا المزروعة في وسط كامل دون تحفيز LPS أو علاج دوائي) كخط أساس، تم حساب تكاثر الخلايا تحت كل تركيز علاجي.
    ملاحظة: أعلى تركيز لا يظهر تأثيرا كبيرا على تكاثر الخلايا تم تعريفه بأنه العلاج بالجرعة العالية، يليه نصف تركيزه كعلاج بجرعة متوسطة، وتركيز ربع كعلاج جرعة منخفضة.

12. التدخل الخلوي

  1. هضم خلايا RWPE-1 في مرحلة النمو اللوغاريتمي.
  2. تم إعادة تعليق الخلايا في وسط K-SFM كامل، وتم تحديد تركيز الخلية عن طريق عد الخلايا.
  3. تم تعديل تعليق الخلية إلى كثافة 5 × 105 خلايا/مل باستخدام وسط K-SFM كامل.
  4. تم زرع نظام التعليق الخلوي في صفيحة ذات 6 آبار بسعة 2 مل لكل بئر.
  5. وضعت الصفيحة في حاضنة الزراعة وحضنتها لمدة 12 ساعة للسماح بالالتصاق الخلوي.
  6. تمت معالجة الخلايا بتركيزات نبضة كهرومغناطيسية منخفضة (150 ميكروغرام/مل)، متوسطة (300 ميكروغرام/مل)، وعالية (600 ميكروغرام/مل) على التوالي.
  7. بعد ساعة واحدة، أضيف محلول LPS بقوة 10 ميكروغرام/مل إلى وسط الزراعة.
  8. بعد 24 ساعة من العلاج، تم جمع المادة الفائقة لتحليل ELISA، وتم جمع الخلايا لتحليل RT-PCR.
    ملاحظة: تم اختيار LPS لتحفيز استجابة التهابية بسبب قدرته الراسخة على تنشيط مسارات الإشارات المضادة للالتهاب في خلايا ظهارة البروستاتا؛ تم اختيار التركيز (10 ميكروغرام/مل) بناء على دراسات سابقة أظهرت استحثا قويا للسيتوكينات.

13. عزل الحمض النووي الريبي الكلي

ملاحظة: لمنع تحلل الحمض النووي الريبي، تم ارتداء القفازات والأقنعة طوال العملية التجريبية، واستخدمت رؤوس الماصات الخالية من الرينازات وأنابيب الطرد المركزي.

  1. بعد التدخل، اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS.
  2. أضف 1 مل من مادة تريزول إلى الخلايا وامزجه مع الماصة مرارا لضمان التجانس.
    تحذير: إجراء جميع الإجراءات بغطاء بخار كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  3. انقل الليسات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل ودعه يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  4. بعد ذلك، أضف 0.2 مل من الكلوروفورم وادمر العينة بقوة.
  5. بعد تركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، قم بطرد مركزها على 10,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. بعد الطرد المركزي، انقل بعناية الطور المائي العلوي عديم اللون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
  7. أدخل كمية متساوية من الأيزوبروبانول المبرد مسبقا، ثم اخلط جيدا، ثم حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  8. قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى (4 درجات مئوية، 10,000 × جم، 10 دقائق)، ثم تخلص من الطور السائل واحتفظ بالترسبات.
  9. اشطف الحبيبة ب 1 مل من الإيثانول المبرد مسبقا بنسبة 75٪ وأعد تعليقها بلطف عن طريق التوصيل بالماصات.
  10. قم بإجراء عملية طرد مركزية نهائية عند 4 درجات مئوية و7,500 × جرام لمدة 10 دقائق، ثم أزل المادة الفائقة ودع حبيبات الحمض النووي الريبي تجف في الهواء في خزانة السلامة البيولوجية.
  11. إذابة الحمض النووي الريبي المنقى في 50 ميكرولتر من الماء المعالج ب DEPC.
  12. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي، ونسبة A260/A280، ونسبة A260/A230 باستخدام مطياف NanoDrop لتقييم نقاء الحمض النووي الريبي وضمان تلوث البروتين والمذيبات إلى الحد الأدنى قبل التحليلات اللاحقة.

14. RT-PCR

  1. استخدم 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتحضير نظام تفاعل النسخ العكسي بسعة 20 ميكرولتر.
  2. حضن نظام التفاعل عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم برد إلى 4 درجة مئوية.
  3. قم بتخفيف cDNA الناتج 10 مرات باستخدام الماء المقطر.
  4. جهز نظام تفاعل PCR بسعة 20 ميكرولتر باستخدام cDNA المخفف.
  5. برمج جهاز الدورة الحرارية وضبط ثباتا أوليا عند 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، تليها 40 دورة بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية.
  6. قم بإجراء تحليل منحنى الانصهار وتسجيل قيم التصوير المقطعي لجميع الجينات المستهدفة والجينات المرجعية بعد الانتهاء.
  7. استخدم طريقة 2(-ΔΔCT) لتحديد مستويات التعبير الطبيعية للجينات المستهدفة.

15. اختبار إليسا

ملاحظة: استرجع مجموعة ELISA من التخزين واتركها لتتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.

  1. جهز المحلول القياسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وقم بتخفيفات مناسبة للأجسام المضادة البيوتينيلية والإنزيمات المترافقة ومخزن الغسيل.
  2. قم بالطرد المركزي بجمع السائل الخلوي (4 درجات مئوية، 10,000 × جم، 10 دقائق) وجمع المادة الفائقة.
  3. نقل 100 ميكرولتر من التخفيفات القياسية وعينات الاختبار إلى الآبار المطلية مسبقا.
  4. أغلق الآبار بشريط لاصق وحضن اللوح على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  5. تخلص من السائل من الآبار واغسل الطبق باستخدام غسالة أوتوماتيكية للصحون.
    ملاحظة: اضبط معايير الغسالة الآلية على: 350 ميكرولتر لمخزن غسيل لكل بئر، وقت نقع 15 ثانية بين الصرف والشفط، 5 دورات كاملة.
  6. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة البيوتينيلية العامل في كل بئر. اترك الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  7. تخلص من المحلول واغسل الطبق كما هو موضح في الإصدار 15.5.
  8. كل بئر يحتوي على 100 ميكرولتر من محلول إنزيمي متصل يعمل بمثابة بيبيت، ثم يحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  9. تخلص من المحلول واغسل الطبق كما هو موضح في الإصدار 15.5.
  10. أضف إلى كل بئر 100 ميكرولتر من الركيزة الكروموجينية. حافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الحماية من الضوء.
  11. محلول 100 ميكرولتر من محلول التوقف في كل بئر، ثم اخلط بلطف.
  12. قس فورا الكثافة البصرية (OD) عند 450 نانومتر.
  13. حدد منحنى قياسي عن طريق رسم متوسط قيم OD مقابل التركيزات القياسية باستخدام برنامج Curve Expert.
  14. تحديد تركيز كل عينة عن طريق الاستيفاء من المنحنى القياسي باستخدام قيمة OD الخاصة به.

16. التحليل الإحصائي

  1. تشغيل برنامج SPSS (الإصدار 20.0).
  2. استيراد مجموعة البيانات إلى إحصائيات SPSS وتعريف المتغيرات بشكل مناسب. استخدم تحليل > الإحصاء الوصفي> استكشاف لحساب المتوسط والانحراف المعياري (SD).
  3. استخدم تحليل > مقارنة المتوسطات > تحليل النوفاع أحادي الاتجاه لمقارنات مجموعات متعددة.
  4. احصل على قيم p مباشرة من جداول مخرجات الاختبار والتقرير عنها وفقا لذلك.
  5. عرض جميع النتائج كمتوسط ± SD وأخذ الفروقات ذات دلالة إحصائية عندما يكون p < 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد المركبات الفعالة والتنبؤ بالأهداف

تظهر هذه النتائج فعالية علم الأدوية الشبكي المتكامل ونهج المختبر لدينا في تحديد والتحقق من أهداف العلاج النبضي الكهرومغناطيسي في التهاب البروستاتا. أظهر البحث في قاعدة بيانات TCMSP 46 مكنا حيويا نشطا من الأعشاب المكونة ل EMP، أي 178 هدفا محتملا. من قاعدة بيانات جينكاردز، تم الحصول على 13,960 هدفا مرتبطا بالتهاب البروستاتا. تم تعريف الأهداف ال 162 المشتركة بين كلا المجموعتين كأهداف للاستخدام الكه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يدمج هذا البروتوكول علم الأدوية الشبكي مع التحقق التجريبي لتوفير إطار منهجي لدراسة آليات العلاج متعددة المكونات. تشمل الخطوات الحرجة الفحص الدقيق للمركبات الفعالة باستخدام عتبات محددة (OB ≥ 30٪، DL ≥ 0.18)، وبناء شبكة موثوق، واختيار مناسب لنماذج التحقق التجريبية. يعد اختيار المعامل بعناية في تحليلات المعلوماتية الحيوية والسيطرة الصارمة على الظروف التجريبية أمرا ضروريا لضمان قابلية التكرار.

التهاب البروستاتا هو اضطراب مسالك بولية صعب الإدارة سريريا بسبب عدم وضو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يذكرون أي تضارب مصالح في هذا العمل.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة مشروع الشباب التابع لمستشفى الصداقة الصيني-الياباني (رقم 2020-1-QN-8)، وهو صندوق البحث العلمي لمستشفى مركز الطيران (رقم YN202530).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم IL-6 ELISA البشري4AbioCHE0009
بشري TNF-&; مجموعة إليسا4AbioCHE0019
مكملات K-SFMبروسيلCM-0200
الدهون الدهنية السكريةسولاربيولوجياL8880
MTSبروميغاG1111
نظام النسخ العكسيبروميغاA3500
RWPE-1بروسيلCL-0200RRID:CVCL_EQ24
الوسط الكامل لخلية RWPE-1بروسيلCM-0200
SYBR Green Realtime PCR Master MixتويوبوQPK-201
كاشف تريزولثيرمو فيشر ساينتيفيك (إنفيتروجين)15596026
تريبسين-إيدتاجيبكو (ثيرمو فيشر)25200072

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hua, L., et al. Prostatitis and male infertility. Aging Male. 28 (1), 2494550(2025).
  2. Ye, Y., et al. Thermosensitive hydrogel with emodin-loaded triple-targeted nanoparticles for a rectal drug delivery system in the treatment of chronic non-bacterial prostatitis. J Nanobiotechnol. 22 (1), 33(2024).
  3. Ma, X., et al. Study progress of etiologic mechanisms of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. Int Immunopharmacol. 148, 114128(2025).
  4. Franco, J. V. A., et al. Pharmacological interventions for treating chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a Cochrane systematic review. BJU Int. 125 (4), 490-496 (2020).
  5. Kwan, A. C. F., Beahm, N. P. Fosfomycin for bacterial prostatitis: a review. Int J Antimicrob Agents. 56 (4), 106106(2020).
  6. Magri, V., et al. Multidisciplinary approach to prostatitis. Arch Ital Urol Androl. 90 (4), 227-248 (2019).
  7. Pena, V. N., et al. Diagnostic and management strategies for patients with chronic prostatitis and chronic pelvic pain syndrome. Drugs Aging. 38 (10), 845-886 (2021).
  8. Sun, Y., et al. Efficacy of acupuncture for chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a randomized trial. Ann Intern Med. 174 (10), 1357-1366 (2021).
  9. Xue, Y., Duan, Y., Gong, X., Zheng, W., Li, Y. Traditional Chinese medicine on treating chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 98 (26), e16136(2019).
  10. Zhang, K., et al. Comparative analysis of efficacy of different combination therapies of α-receptor blockers and traditional Chinese medicine external therapy in the treatment of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: Bayesian network meta-analysis. PLoS One. 18 (4), e0280821(2023).
  11. Zheng, X., et al. Efficacy of acupuncture combined with traditional Chinese medicine on chronic prostatitis: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 100 (46), e27678(2021).
  12. Wu, Z., et al. Traditional Chinese herbal medicine retention enema combined with perineal massage (THREM): a promising therapeutic strategy for refractory chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS). Transl Androl Urol. 13 (5), 759-768 (2024).
  13. Li, Z., et al. Chinese herbal formula Ermiao powder regulates cholinergic anti-inflammatory pathway in rats with rheumatoid arthritis. Chin J Integr Med. 26 (12), 905-912 (2020).
  14. Wu, J., et al. An integrative pharmacology model for decoding the underlying therapeutic mechanisms of Ermiao powder for rheumatoid arthritis. Front Pharmacol. 13, 801350(2022).
  15. Xia, Z., Li, Q., Tang, Z. Network pharmacology, molecular docking, and experimental pharmacology explored Ermiao wan protected against periodontitis via the PI3K/AKT and NF-κB/MAPK signal pathways. J Ethnopharmacol. 303, 115900(2023).
  16. Jin, Q., et al. Network and experimental pharmacology to decode the action of Wendan decoction against generalized anxiety disorder. Drug Des Devel Ther. 16, 3297-3314 (2022).
  17. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  18. UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase in 2025. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D609-D617 (2025).
  19. Stelzer, G., et al. The GeneCards suite: from gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1.30.1-1.30.33 (2016).
  20. Yu, X. B., et al. Chondroprotective effects of Gubitong recipe via inhibiting excessive mitophagy of chondrocytes. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 8922021(2022).
  21. Ru, J., et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
  22. Chen, G. Y., et al. Mechanisms of total glucosides of paeony in alleviating methotrexate-induced liver injury. Drug Des Devel Ther. 19, 3407-3423 (2025).
  23. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  24. Shoskes, D. A., Nickel, J. C. Quercetin for chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. Urol Clin North Am. 38 (3), 279-284 (2011).
  25. Meng, L. Q., et al. Quercetin protects against chronic prostatitis in rat model through NF-κB and MAPK signaling pathways. Prostate. 78 (11), 790-800 (2018).
  26. Tian, Y. Q., et al. Berberine hydrochloride alleviates chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome by modifying gut microbiome signaling. Asian J Androl. 26 (5), 500-509 (2024).
  27. Alomari, G., Al-Trad, B., Al-Najjar, A., Haija, Y. A. Stigmasterol as a potential phytotherapeutic agent for benign prostatic hyperplasia: modulation of inflammation, oxidative stress, and apoptosis. Mol Biol Rep. 52 (1), 740(2025).
  28. D'Arcy, Q., et al. Beta-sitosterol alters collagen distribution in prostate fibroblasts. J Diet Suppl. 21 (3), 313-326 (2024).
  29. Otasek, D., et al. Cytoscape automation: empowering workflow-based network analysis. Genome Biol. 20 (1), 185(2019).
  30. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2023: protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D638-D646 (2023).
  31. Majeed, A., Mukhtar, S. Protein-protein interaction network exploration using Cytoscape. Methods Mol Biol. 2690, 419-427 (2023).
  32. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1826299(2022).
  33. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  34. Fan, S., et al. Polygonum capitatum combined with ciprofloxacin ameliorated chronic bacterial prostatitis by inhibiting NF-κB/IL-6/JAK2/STAT3 pathway. J Ethnopharmacol. 344, 119539(2025).
  35. Vickman, R. E., et al. TNF is a potential therapeutic target to suppress prostatic inflammation and hyperplasia in autoimmune disease. Nat Commun. 13 (1), 2133(2022).
  36. Liu, X., et al. NLRP3-mediated IL-1β in regulating the imbalance between Th17 and Treg in experimental autoimmune prostatitis. Sci Rep. 14 (1), 18829(2024).
  37. Liu, H., et al. IL-1β-primed mesenchymal stromal cells exert enhanced therapeutic effects to alleviate chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome through systemic immunity. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 514(2021).
  38. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5233462(2021).
  39. Zhang, Z., et al. Isoliensinine suppresses chondrocytes pyroptosis against osteoarthritis via the MAPK/NF-κB signaling pathway. Int Immunopharmacol. 143 (3), 113589(2024).
  40. Guo, Q., et al. NF-κB in biology and targeted therapy: new insights and translational implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 53(2024).
  41. Oeckinghaus, A., Ghosh, S. The NF-kappaB family of transcription factors and its regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (4), a000034(2009).
  42. Ou, Q., et al. Apoptosis releases hydrogen sulfide to inhibit Th17 cell differentiation. Cell Metab. 36 (1), 78-89.e5 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

KEGG PI3K AKT MAPK

مقالات ذات صلة