مقالة منهجية

PCR متداخل بخطوة واحدة لتركيب سريع لقوالب حمض النووي الريبي الموجه الواحد لنظام كريسبر

193 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70369

⸱

أبريل 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

في هذه المقالة

ملخص

تتيح طريقة PCR المتداخلة ذات خطوة واحدة باستخدام أربعة بادئات توليد سريع ومنخفض التكلفة لقوالب DNA لنسخ sgRNA في المختبر . تنتج نسبة البرايمر المحسنة (50:5:1:50) sgRNA عالي الجودة خلال 5 ساعات، مع التحقق الوظيفي من خلال الاختبارات المخبرية ونشاط التحرير في الخلايا HEK293T.

الملخص

لقد أحدث نظام CRISPR–Cas ثورة في تحرير الجينوم؛ ومع ذلك، غالبا ما تتضمن الطرق التقليدية لتوليد RNA موجه واحد (sgRNA) خطوات استنساخ تستغرق وقتا طويلا أو مجموعات تخليق تجارية باهظة الثمن. يتم تقديم استراتيجية PCR متداخلة محسنة بخطوة واحدة لتخليق سريع وفعال من حيث التكلفة لقوالب الحمض النووي لنسخ sgRNA في المختبر . باستخدام أربعة بادئات متداخلة جزئيا تمتد عبر محفز T7، وتسلسل الدليل الخاص بالهدف، وهيكل sgRNA، يتم تجميع القوالب الكاملة في تفاعل PCR واحد دون الاستنساخ. أثبت التحسين التجريبي المنهجي نسبة برايمر مثالية (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50)، مما يقلل من المنتجات الثانوية غير المحددة مع تعظيم إنتاجية المنتج الكامل الطول، كما أكد الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز. تم توسيع هذا النهج بنجاح ليشمل قوالب ل sgRNA المكورات العنقودية الذهبية Cas9 (saCas9)، مما أظهر قابلية التطبيق عبر الأنظمة إلى ما وراء Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). على الرغم من أن التخليق الكيميائي المباشر ل sgRNA يقدم مزايا مثل النقاء العالي، والتعديلات الكيميائية لتعزيز الاستقرار، وتقليل التأثيرات خارج الهدف، إلا أنه لا يزال مكلفا للغاية للتطبيقات عالية الإنتاجية أو الشاشات واسعة النطاق التي تتطلب العديد من sgRNAs. أظهرت اختبارات الانقسام في المختبر أن الحمض النووي الريبي التوجيهي الناتج بهذه الطريقة يحقق كفاءة تحرير مماثلة لتلك التي يتم الحصول عليها من خلال الاستنساخ التقليدي القائم على البلازميدات. علاوة على ذلك، فإن مركبات الريبونوكليوبروتين التي تم تجميعها مع هذه ال sgRNA وتسليمها إلى خلايا HEK293T عبر التقميم الكهربائي أدت إلى تكوين إندل قابل للكشف في الموقع المستهدف، مما يؤكد الوظيفة في الجسم الحي. تشير تحليلات التكلفة إلى أن هذه الطريقة تقلل بشكل كبير من تكاليف تحضير القوالب مقارنة بمجموعات التخليق التجارية مع تقليل وقت التسليم من أيام إلى ساعات، مما يوفر نهجا سهل الوصول وقابل للتوسع للمختبرات العاملة في البحث الجيني.

المقدمة

نظام كريسبر-كاس، المستمد من آلية مناعية تكيفية في البكتيريا والعتائق، أحدث ثورة في الهندسة الوراثية من خلال تمكين تحرير الجينوم بدقة عبر كائنات متعددة 1,2. مكون رئيسي هو الحمض النووي الريبي ذو الدليل الواحد (sgRNA)، وهو حمض نوكر كيمري يوجه نوكلياز كاس إلى مواقع جينومية محددة؛ يسمح تصميمه المعياري بإعادة الاستهداف من خلال تعديل تسلسل بروتوسفاسير حوالي 20 نيوكليوتيدا3. بعيدا عن SpCas9، تم اعتماد نوكلياز كاس أخرى ذات خصائص مميزة على نطاق واسع. المكورات العنقودية الذهبية Cas9 (saCas9) أصغر، مما يسهل توصيل الفيروسات المرتبطة بالأدينوفيروس (AAV) وبالتالي يوسع خيارات التوصيل4. يتطلب كل نظام هياكل RNA إرشادية محددة، مما يجعل طريقة التخليق متعددة الاستخدامات مرغوبة للغاية3.

تشمل الطرق التقليدية لتوليد RNA التوجيهية الوظيفية الاستنساخ القائم على البلازميدات، مجموعات تخليق sgRNA التجارية، أو التخليق التجاري المباشر ل sgRNA 5,6. يتطلب الاستنساخ القائم على البلازميدات عدة خطوات تتطلب جهدا كبيرا—الهضم التقييدي، الربط، التحول، وفحص المستعمرات—وعادة ما يستغرق أكثر من 48 ساعة2،4،6. مجموعات sgRNA التجارية، رغم تقديمها سير عمل مبسط (<5 ساعات)، تظل مكلفة للغاية للتطبيقات عالية الإنتاجية، حيث تكلف عادة 35–45 دولارا لكل تفاعل. يوفر التخليق الكيميائي المباشر ل sgRNA مزايا مثل النقاء العالي، والتعديلات الكيميائية لتعزيز الاستقرار، وتقليل التأثيرات خارج الهدف7؛ ومع ذلك، فهو مكلف للغاية (عادة من 200 إلى 280 دولارا لكل sgRNA) للتطبيقات عالية الإنتاجية أو الشاشات واسعة النطاق التي تتطلب مئات من sgRNAs.

على النقيض من ذلك، تكمل طريقة PCR المتداخلة ذات الخطوة الواحدة الموضحة هنا تخليق القالب في أقل من 5 ساعات باستخدام بادئات قياسية بتكلفة تقارب 5–8 دولارات لكل sgRNA، مما يمثل انخفاضا كبيرا في الوقت وتكلفة المادة. علاوة على ذلك، تحقق sgRNA المنتجة بهذه الطريقة كفاءة تحرير مماثلة لتلك الناتجة عن الاستنساخ القائم على البلازميدات، كما تؤكد اختبارات الانقسام في المختبر . يتم توضيح مقارنة هذه الأساليب في الشكل 1.

يوفر PCR التمديد التداخلي (OE-PCR) استراتيجية سريعة ومستقلة عن الليغاز لتجميع شظايا الحمض النووي8. تم تكييف هذا النهج لتخليق قوالب sgRNA باستخدام بادئات متداخلة. في تفاعل من خطوة واحدة باستخدام أربعة بادئات متداخلة جزئيا، يحدث ارتباط تنافسي: تحدد البادئات الخارجية (AF1 وTracr-R) حدود التضخيم، بينما يجب تخفيف البادئات الداخلية (AF2 و AF3) لضمان امتداد منظم من كلا الطرفين نحو المركز. على الرغم من هذا الإطار النظري، لم يتم التحقيق بشكل منهجي في معامل حاسم يؤثر على كفاءة التجميع—وهو نسبة البرايمر المثلى. علاوة على ذلك، لا يزال التطبيق الأوسع لطرق OE-PCR عبر أنظمة كريسبر المختلفة غير مستكشف بشكل كاف.

لمعالجة هذه القيود، تم تصميم دراسة لتحسين والتحقق من طريقة PCR متداخلة ذات خطوة واحدة لتخليق قوالب sgRNA. تم تحديد نسبة التمهيد المثلى من خلال تصميم تجريبي منظم، مع استخدام الرحلان الكهربائي بجل الأغاروز لتحديد الظروف التي تنتج منتجا واحدا بالحجم الصحيح. بعد التحسين، تم تقييم مرونة الطريقة عبر نظامين CRISPR مستخدمين على نطاق واسع (SpCas9 و saCas9)، مع تضخيم ناجح لكلا القالبتين. أظهر التحقق الوظيفي باستخدام اختبارات الانقسام في المختبر أن sgRNA المولدة باستخدام هذه الطريقة تحقق كفاءات مماثلة لتلك التي يتم الحصول عليها من خلال الاستنساخ القائم على البلازميدات.

لتقييم الوظائف بشكل أكبر في السياق الخلوي، تم مركب sgRNA في SpCas9 مع بروتين Cas9 لتكوين مركبات ريبونوكليوبروتين (RNP) وتم توصيله إلى خلايا HEK293T عبر الحفر الكهربائي. تم تقييم تحرير الجينوم في موقع داخلي باستخدام اختبار T7 Endonucallow I (T7EI)، مع أنماط انقسام على هلام الأغاروز تشير إلى تكوين إندل قابل للكشف في الجسم الحي. تظهر هذه النتائج مجتمعة أن هذه الطريقة تنتج قوالب sgRNA عالية الجودة ووظيفية بشكل موثوق. يصف البروتوكول التالي الإجراء التفصيلي باستخدام SpCas9 كمثال تمثيلي، مع توفير قوالب تمهيدية للتكيف مع نوكلياز Cas الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم استخدام خط الخلايا HEK293T المتوفر تجاريا (ATCC CRL-3216) وفقا لإرشادات اللجنة الأخلاقية لمستشفى الشعب الأول في مدينة تشنتشو، جامعة جنوب الصين، لاستخدام خطوط الخلايا المشتقة من البشر. تم إدراج الكواشف والبرمجيات والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تصميم تسلسلات أهداف sgRNA

  1. حدد المنطقة الجينومية المستهدفة باستخدام أدوات إلكترونية معروفة (مثل CRISPRscan، CHOPCHOP، أو معهد برود CRISPick).
  2. يمكنك الوصول إلى خادم الويب الخاص ب CHOPCHOP على https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9.
  3. أدخل معلومات الجين المستهدف واختر نظام CRISPR/Cas المناسب (مثل EGFR ل CRISPR/Cas9) (الشكل 2A).
  4. راجع جدول المخرج، بما في ذلك الترتيب، التسلسل المستهدف، الموقع الجيني، الخيوط، محتوى GC (٪)، التكامل الذاتي، المواقع غير المستهدفة المتوقعة (MM0، MM1، MM2، MM3)، ودرجة الكفاءة (الشكل 2B).
  5. اختر تسلسل RNA موجه بكفاءة عالية في الهدف ونشاط غير متوقع منخفض.
  6. سجل تسلسل أهداف sgRNA النهائي لتصميم البرايمر (مثل تسلسل أهداف EGFR: "CTTAATTCCTTGATAGCGACGG") (الشكل 2B).

2. تخليق وتحضير أربعة بادئات متداخلة

  1. صمم أربعة بادئات أوليجونكليوتيدية (AF1، AF2، AF3، Tracr-R) ذات مناطق متداخلة كما يلي (الشكل 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [متابعة الهدف] GTTTTAGAGCTAGAAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAATAAGGCTAGCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    ملاحظة: استبدل [تسلسل الهدف] في تمهيد AF1 بالتسلسل الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.6.
  2. قم بتصنيع البادئات بمقياس 25 نانومول مع تنقية إزالة الملح القياسية.
  3. أعد تعليق البرايمرات المجففة في ماء خال من النوكلياز إلى تركيز مخزوني 100 ميكرومولار. الطرد المركزي عند 5000 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

3. تحسين تركيز البرايمر وPCR المتداخل بخطوة واحدة لتخليق قالب sgRNA

  1. تحضير خلطات الأساس بتركيزات AF2 وAF3 متفاوتة وفقا للجدول 1. حافظ على AF1 و Tracr-R عند 10 ميكرومولار.
  2. تحضير تفاعلات PCR في أنابيب خالية من النوكلياز بسعة 0.2 مل وفقا للجدول 2. استخدم بوليميراز DNA عالي الدقة.
  3. اخلط بلطف عن طريق الطباعة خمس مرات. لا تقم بالدوامة. الطرد المركزي عند 5000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
  4. شغل PCR باستخدام ظروف الدورة الموضحة في الجدول 3.

4. الرحلان الكهربائي واستعادة قوالب الحمض النووي

  1. حضر جل أغاروز بنسبة 2٪ عن طريق إذابة 2 جرام أغاروز في 100 مل من محلول 1× TAE. برد إلى 50–60 درجة مئوية، أضف صبغة حمض نووي 5 ميكرولتر، ثم صب الهلام.
  2. اترك الجل ليتصلب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. حمل منتج PCR بسعة 10 ميكرولتر ممزوجا مع 2 ميكرولتر من 6× مخزن تحميل. يشمل سلم DNA بقدرة 100 bp.
  4. شغل الرحلان الكهربائي عند 100 فولت لمدة 30–40 دقيقة.
  5. تصور تحت إضاءة UV. تأكد من أن الحالة 9 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) تنتج نطاقا واحدا ~120 نقطة قوة (الشكل 4A).
  6. استخدم تركيزات الأساس المحسنة: AF1 10 ميكروM، AF2 1 ميكروM، AF3 0.2 ميكروM، Tracr-R 10 ميكرومتر.
  7. قم بإزالة الشريط المستهدف باستخدام مشرط معقم. قلل من التعرض للأشعة فوق البنفسجية إلى ≤30 ثانية.
    ملاحظة: احتفظ شرائح الجل على درجة حرارة −20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو استمر فورا.

5. تنقية قوالب الحمض النووي

  1. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الهلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة10.
  2. حمض نووي مائلوت في مياه خالية من النوكلياز مسبقا (60 درجة مئوية) بسعة 20–30 ميكرولتر.
  3. قياس تركيز الحمض النووي. العائد النموذجي: 15–50 نانوغرام/ميكرولتر؛ A260/A280: 1.8–2.0.
    ملاحظة: قم بتخزين الحمض النووي النقي عند −20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.

6. النسخ الصناعي وتنقية sgRNA

  1. تجميع تفاعل النسخ باستخدام مجموعة تخليق RNA من T7 (الجدول 4). التحضير على الثلج11.
    ملاحظة: استخدم مواد خالية من RNase وقم بتطهير جميع الأسطح.
  2. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
  3. أضف 1 ميكرولتر DNase I وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. قم بتنقية sgRNA باستخدام مجموعة تنظيف RNA12.
  5. الخروج في مياه خالية من النوكلياز بسعة 30–50 ميكرولتر.
  6. قم بقياس sgRNA. العائد المتوقع: 700–900 نانوغرام/ميكرولتر؛ A260/A280: 1.9–2.1.
    ملاحظة: تخزين sgRNA عند −80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.

7. اختبار الانقسام في المختبر للتحقق من نشاط sgRNA

  1. تحضير وتنقية الحمض النووي المستهدف. ضبط التركيز إلى 60 نانوغرام/ميكرولتر13.
  2. تجميع تفاعل الانقسام (الجدول 5)—الحضانة المسبق بدون حمض نووي عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تضمين عنصر تحكم سلبي.
  3. أضف 1 ميكرولتر حمض نووي مستهدف.
  4. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  5. أضف 4 ميكرولتر من 6× مخزن تحميل لإيقاف التفاعل.
  6. شغل المنتجات على جل أغاروز بنسبة 2٪ بجهد 100 فولت لمدة 30–40 دقيقة.
  7. تصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تأكيد الانقسام (مثلا، 617 بوت قوة → 414 بيس بي بي + 203 بيس بيت) (الشكل 4C).

8. التحقق الخلوي لتحرير Cas9 الموجه بواسطة sgRNA

  1. تحضير مركب الريبونوكليوبروتين (RNP) عن طريق خلط بروتين Cas9 وsgRNA بنسبة مولية 1:2. اجمع بين 10 ميكرولتر Cas9 (4 ملغ/مل)، و280 ميكرولتر sgRNA (60 نانوغرام/ميكرولتر)، و200 ميكرولتر DMEM. حضن لمدة 15 دقيقة.
  2. زراعة HEK293T الخلايا حتى ~80٪ تقارب. احصد وعدل إلى 3 × 106 خلايا لكل عينة.
  3. ادمج مركب RNP مع الخلايا وحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. انقله إلى كوفيت مسام كهربائية بقطر 2 مم. قم بالإلكتروبات عند 115 فولت، 4 مللي ثانية، نبضة واحدة (575 فولت/سم). أضف فورا 10 مل وسط كامل وانقل إلى صفيحة ذات 6 آبار.
  5. حضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 48 ساعة.
  6. استخلاص الحمض النووي الجيني من الخلايا المعالجة والمراقبة. قياس التركيز.
    ملاحظة: قم بتخزين الحمض النووي عند −20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  7. تضخيم الموقع المستهدف بواسطة PCR (الجدول 6 والجدول 7).
    ملاحظة: الحجم المتوقع للمنتج: 617 نقطة أساس ل EGFR.
  8. تحقق من منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 2٪. قم بتنقية الشريط الصحيح وقياس كمية الحمض النووي.
  9. قم بتنفيذ تكوين التشابك غير المتجانس (الجدول 8 والجدول 9).
  10. أضف 1 ميكرولتر من T7 إندونوكلياز I وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أوقف التنشيط عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  11. أضف حاجز تحميل واستخدم جل أغاروز بنسبة 2٪.
  12. التصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تأكيد تكوين الإندل (617 نقطة → 414 نقطة أساس + 203 نقطة بوصة حركة) (الشكل 4D).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ينتج التطبيق الناجح لبروتوكول PCR المتداخل ذو الخطوة الواحدة شريط DNA حاد واحد بالحجم المتوقع عند تحليله بواسطة الرحلان الكهربائي بجل الأغاروز.

نسب البرايمر دون الأمثل، خاصة تلك التي تحتوي على تركيزات مفرطة من البادئات الداخلية (AF2 و AF3)، تؤدي إلى نطاقات إضافية أكبر من المنتج المتوقع، مما يشير إلى تضخيم غير نوعي أو تكوين تمهيد التمهيد الزائد، إلى جانب نطاقات باهتة تمثل وسطيات تجميع غير مكتملة (الشكل 4A، الظروف 1، 4، 7، و10). تعم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم وصف بروتوكول مبسط واقتصادي لتخليق قوالب الحمض النووي sgRNA عبر استراتيجية PCR متداخلة بخطوة واحدة. تلغي هذه الطريقة الحاجة إلى بناء واستنساخ البلازميد، مما يقلل وقت تحضير القالب من عدة أيام إلى حوالي 5 ساعات. جانب رئيسي من هذا النهج هو التحسين المنهجي لنسبة البرايمر، التي تم تحديدها 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R)، والتي تتوافق مع تركيزات عاملة تبلغ 10 ميكرومولار، 1 ميكرومولار، 0.2 ميكرومولار، و10 ميكرومولار على التوالي. تقلل هذه النسبة من المنتجات الثانوية غير المحددة وتعظم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل مشروع أبحاث الصحة التابع للجنة الصحة الإقليمية في هونان (رقم المنحة W20243264)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هونان (رقم المنحة 2023JJ50368)، ومشروع البحث الرئيسي لوزارة التعليم في مقاطعة هونان (رقم المنحة 24A0607)، ومشروع الفريق المبتكر لمستشفى الشعب الأول في تشنتشو (رقم المنحة CX202103).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 bp DNA LadderTIANGENMD109علامة حجم الحمض النووي للرحلان الكهربائي
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849Mمتفاعل تضخيم PCR
50 bp DNA LadderTIANGENMD108علامة حجم الحمض النووي للشظايا الصغيرة
6DNA loading bufferTIANGEN1109565متفاعل تحميل العينة للرحلان الكهربائي
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219تنقية الحمض النووي من جل الأغاروز
Agarose I Thermo Scientific 17850تحضير جل الأغاروز
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicأداة تصميم sgRNA
CentrifugeHENGNUO2-16Rترسيب العينة
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023Aمكمل زراعة الخلايا
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682متفاعلات تحضير محلول تخزين TAE
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/أداة تصميم sgRNA
CO2 incubatorThermo Scientific51032874حضانة الخلايا الثديية
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/أداة تصميم sgRNA
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500وسط زراعة الخلايا
dsDNaseThermo Scientific EN0771إزالة قالب الحمض النووي بعد النسخ
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830الكهربائي للخلايا
EDTA Na2BioSharpBS108متفاعلات تحضير محلول تخزين TAE
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8حضانة بدرجة حرارة متحكم بها
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNالرحلان الكهربائي على جل الأغاروز
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258التصوير وتحليل الجل
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5نوكلياز Cas9 لتحرير الجينوم
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304عزلة الحمض النووي الجيني
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040Sالنسخ في المختبر لـ sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834تضخيم PCR
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000cقياس كمية الحمض النووي
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211تصور الحمض النووي في جل الأغاروز
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578تضخيم PCR عالي الدقة
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptالأوليغونوكليوتيدات لتجميع قالب sgRNA
Tris-baseBioSharpBS083متفاعلات تحضير محلول تخزين TAE
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01تنقية الحمض النووي الريبي

المراجع

  1. Tamura, R., Kamiyama, D. CRISPR-Cas9-mediated knock-in approach to insert the GFP(11) tag into the genome of a human cell line. Methods Mol Biol. 2564, 185-201 (2023).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Graf, R., Li, X., Chu, V. T., Rajewsky, K. sgRNA sequence motifs blocking efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Cell Rep. 26 (5), 1098 (2019).
  7. Hendel, A., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).
  8. Brunetti, L., et al. Highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by CRISPR/Cas9. J Vis Exp. (134), e57278 (2018).
  9. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  10. Bien, H. . Qiagen QIAquick gel extraction kit (28704 and 28706), centrifuge processing. , (2015).
  11. MalagodaPathiranage, K., Banerjee, R., Martin, C. T. A new approach to RNA synthesis: immobilization of stably and functionally co-tethered promoter DNA and T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 52 (17), 10607-10618 (2024).
  12. Xiao, G., et al. Direct detection from sputum for drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using a CRISPR-Cas14a-based approach. BMC Microbiol. 25 (1), 188 (2025).
  13. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  14. Hu, Z., et al. Customized one-step preparation of sgRNA transcription templates via overlapping PCR using short primers and their application in vitro and in vivo gene editing. Cell Biosci. 9 (1), 25 (2019).
  15. Pan, C., et al. A new method to synthesize multiple gRNA libraries and functional mapping of mammalian H3K4me3 regions. Nucleic Acids Res. 51 (9), e52 (2023).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR guide RNA cloning for mammalian systems. J Vis Exp. (140), e57998 (2018).
  19. Basila, M., Kelley, M. L., Smith, A. V. B. Minimal 2'-O-methyl phosphorothioate linkage modification pattern of synthetic guide RNAs for increased stability and efficient CRISPR-Cas9 gene editing avoiding cellular toxicity. PLoS One. 12 (11), e0188593 (2017).
  20. Kratschmer, C., Levy, M. Effect of chemical modifications on aptamer stability in serum. Nucleic Acid Ther. 27 (6), 335-344 (2017).
  21. Maio, G., et al. Systematic optimization and modification of a DNA aptamer with 2'-O-methyl RNA analogues. ChemistrySelect. 2 (7), 2335-2340 (2017).
  22. Pasternak, A., et al. A chemical synthesis of LNA-2,6-diaminopurine riboside, and the influence of 2'-O-methyl-2,6-diaminopurine and LNA-2,6-diaminopurine ribosides on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 35 (12), 4055-4063 (2007).
  23. Shang, Z., et al. CRISPR/Cas12a with Universal crRNA for Indiscriminate Virus Detection. Molecules. 29 (24), 5842 (2024).
  24. Wang, Z., et al. crRNA scaffold remodeling controls CRISPR–Cas12a activity for enhanced performance. Nucleic Acids Res. 54 (5), 2310-2325 (2026).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA

مقالات ذات صلة