يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل النواة المفردة من أنسجة استئصال الشريان التاجي البطني الرحمي لمرضى ترقيع الشريان التاجي

699 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70382

⸱

أبريل 3, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

في هذه المقالة

ملخص

تمت معالجة عينات أنسجة استئصال الشريان التاجي لعزل النوى المفردة باستخدام بروتوكول تفكك محسن. تم التحقق من سلامة النوى المعزولة من خلال ثلاثة طرق تكميلية: التلوين بتقنية التريبان بتقنية الاستبعاد الأزرق لتقييم سلامة الغشاء، والميكروسكوب الكونفوكلي المعتمد على DAPI لتأكيد الشكل النووي، وقياس تدفق الخلايا لقياس العائد والنقاء النووي.

الملخص

تصلب الشرايين هو حالة التهابية مزمنة وتقدمية تتميز بتراكم اللويحات في جدران الشرايين. خلال تطور تكون اللويحات، تصبح بعض الآفات غير مستقرة، وتعرف باسم اللويحات عالية الخطورة، وقد تسبب احتشاء عضلة القلب. تتكون اللويحة التصلبية من خلايا العضلات الملساء، وخلايا البطانة، وخلايا المناعة، والخلايا الدهنية، والخلايا النخرية، وأي منها يمكن أن يسبب تمزق اللويحة. من الضروري دراسة التغاير الخلوي داخل اللويحات المصلبة للشرايين لفهم الآليات الكامنة وراء عدم استقرار اللويحات بشكل أفضل. نقدم بروتوكولا سهل التكرار لعزل والتحقق من النوى من نسيج استئصال الشريان التاجي البشري البشري الذي تم الحصول عليه من مرضى يخضعون لجراحة تحويل مسار الشريان التاجي (CABG). تحفظ جميع الأنسجة على الجليد الرطب في وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) للحفاظ على سلامة الخلايا قبل الحصاد. يتم تفريم عينات الأنسجة بدقة ثم تمزيق بلطف باستخدام مدقة دقيقة في مخزن التحلل لتحليل الخلايا وإطلاق النوى. ثم يتم تقييم النوى المعزولة من حيث السلامة والعائد باستخدام اختبار الاستبعاد الأزرق التريبان في مجهر مركب مقلوب. يتيح تلوين DAPI تصور النوى السليمة بواسطة المجهر الكونفوكلي، ويوفر قياس تدفق الخلايا القياسية الفلورية لتقييم عائد العزل النووي والتحقق من صحة التجمع النووي. على عكس الطرق التقليدية للعزل عبر تفكك الخلية الواحدة، يقلل العزل النووي من الإجهاد الخلوي ويحافظ على البيئة النصية الأصلية، مما يمنع التغيرات في التعبير الجيني. التحضير النووي عالي الجودة الذي يتم الحصول عليه من خلال هذه الطريقة متوافق مع التطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (snRNA-seq).

المقدمة

يعد مرض القلب والأوعية الدموية التصلب الشرايري (ASCVD) السبب الرئيسي للوفاة والإعاقة في العالم، وعلى الرغم من التقدم العلاجي الكبير، لا يزال عبئه دون أن ينخفض. تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن في جدار الشريان، مدفوع بتفاعلات معقدة وديناميكية بين مجموعات خلايا متنوعة تنظم بشكل جماعي التقدم الصامت من المرض تحت السريري المبكر إلى أحداث القلب والأوعية الدموية (CV) التي تغير الحياة2.

في الشرايين المتوسطة والكبيرة، تراكم ترسبات الكوليسترول داخل البلاعم هو علامة مميزة لتصلب الشرايين3. تتكون اللويحة التصلبية من الأحماض الدهنية، والكوليسترول، والخلايا الالتهابية، والكالسيوم، والفيبرين، وخلايا العضلات الملساء، وخلايا البطانة، والحطام الخلوي داخل تحت البطانة4. تصنف اللويحات المصحبة بتصلب الشرايين إلى نوعين: منخفضة المخاطر وعالية الخطورة. تعرف اللويحات عالية الخطورة من خلال ميلها لتحفيز حدث قلبي وعائي لاحق، عادة من خلال آليات مثل تآكل اللويحاتأو تمزقها.

تشمل خصائص اللويحات عالية الخطورة نوى دهنية كبيرة، وعدة خلايا التهابية، وعدد أقل من خلايا العضلات الملساء، وغطاء ليفي رقيق، وتكلس دقيق، ونزيف داخل اللويحة، وأوعية جديدة جديدة، ونواة نخرية6. يتم الكشف عن اللويحات عالية الخطورة سريريا باستخدام أساليب تصوير غير جراحية وغازية، وهي تصوير الأوعية الدموي المحوسوب للتاجيين التاجيين (CCTA) والتصوير المقطعي التماسكي البصري (OCT) على التوالي 7,8. على الرغم من التقدم الكبير في تصوير القلب والأوعية الدموية، لا يزال من الصعب التنبؤ بتمزق اللويحات التصلب التي تسبب احتشاء عضلة القلب، وليس دائما مفيدافي البيئات السريرية.

على الرغم من عقود من البحث، ما زلنا نفتقر إلى مؤشرات حيوية متداولة موثوقة يمكنها تحديد الأنماط الظاهرية لللويحات عالية الخطورة بشكل محدد، مما يترك فجوة حرجة في إدارتنا السريرية لتصلب الشرايين. وهذا يؤكد الحاجة إلى استراتيجيات جزيئية يمكنها توصيف هذه اللويحات بمستوى بيولوجي أكثر أساسية 7,10. في هذا السياق، حظيت العلامات القائمة على RNA باهتمام كبير، حيث يمكنها التقاط النشاط النسخي المعقد الذي يحدث داخل البيئة الدقيقة للبلاك11. لقد أثبتت التطورات الحديثة في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) قوة خاصة، حيث قدمت حلا غير مسبوق لتحديد الخلايا الفردية داخل اللويحات المصلبة للشرايين وكشف مجموعات خلايا مميزة، وأنماط تعبير جينات، ومسارات جزيئية تكمن وراء ضعف البلاك12،13. على الرغم من هذه التطورات، لا توجد معرفة كافية حول العمليات التنظيمية، والتفاعلات، والأهمية الوظيفية لأنواع الخلايا المختلفة المتورطة في تطور تصلب الشرايين14.

عندما يكون عبء تصلب الشرايين شديدا ومنتشر، يصبح إعادة التصنيع الجراحي هي الاستراتيجية العلاجية الحاسمة. استئصال الشريان التاجي (CE) هو إجراء جراحي مساعد لجراحة تحويل مسار الشريان التاجي (CABG) حيث يتم إزالة اللويحات التصلبية الميكانيكية من الشرايين التاجية الممرضة بشكل منتشر لتمكين التطعيم التحويلي وتحقيق إعادة تقويم كامل لعضلة القلب15,16. تعد اللويحات المصلبية للشرايين وعينات استئصال الشرايين تحديا خاصا في التعامل معها لأنها تحتوي على الكثير من الأنسجة النخرية، وترسبات الدهون، والفيبرين، والتكلس. عندما يتم تفكيك هذه الأنسجة للتحليل، تنتج حطاما كبيرا يسد المرشحات والأنظمة الميكروفلويدية، مما يجعل عزل الخلايا المفردة الحيةأمرا صعبا للغاية. في الواقع، وجدت إحدى دراسات لويحات السباتي أن الخلايا الحية تمثل أقل من 1٪ من جميع الجسيمات بعد معالجة الأنسجة؛ أما الباقي فكان مجرد حطام لوحة18.

ولزيادة تعقيد هذا التحدي، توجد اللويحات المصلبة للشرايين في حالة من الإجهاد الأيضي والتأكسدي المزمن، حيث تجعل الخلايا التي تخضع لموت المبرمج، والشيخوخة، وعمليات تنكسية أخرى أغشية الخلايا أكثر هشاشة وعرضة للاضطراب، مما يجعل عزل الخلايا المفردة الحية أمرا صعبا للغاية 18,19,20. الهضم الميكانيكي والإنزيمي المطلوب لتحضير عينات لتحليل scRNA-seq غالبا ما يتسبب في تلف هذه الخلايا المتضررة بالفعل، مما يقلل من قابلية العيش ويؤدي إلى معدلات احتجاز خلوية ضعيفة. تميل هذه العملية أيضا إلى فقدان مجموعات الخلايا الهشة أو النادرة بشكل انتقائي، مما يدخل تحيزا كبيرا في كل من بيانات النسخ وأنواع الخلايا الممثلة في النتائج النهائية. تصبح هذه المشكلة أكثر وضوحا في اللويحات المتكلسة أو شديدة المرض، حيث تسبب ظروف المعالجة القاسية اللازمة لتفكيك الأنسجة ضررا إضافيا لقدرة الخلايا على العيش 18,21,22.

على النقيض من ذلك، تبقى النواة سليمة هيكليا حتى في ظلهذه الظروف الصعبة. ويرجع ذلك أساسا إلى الغلاف النووي، وهو طبقة ثنائية دهنية مزدوجة مدعمة بطبقات نووية (Lamin A/C و Lamin B)، والتي توفر صلابة ميكانيكية ومقاومة للضغوط الأسموزية والإنزيمية والفيزيائية التي تعطل غشاء البلازما بسهولة24,25. كما تحافظ الصفيحة النووية على الشكل النووي حتى عندما يكون السيتوبلازم المحيط متضررا بشدة26. وهذا يجعل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) بديلا أكثر عملية وموثوقية لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) لتحليل نسيج تصلب الشرايين27. من خلال التقاط معلومات النسخ من النوى السليمة بدلا من الخلايا الكاملة، يتجاوز snRNA-seq القيود التي تفرضها ضعف القدرة على البقاء والمحتوى العالي من الحطام، مما يتيح تصفيفا أكثر دقة وشمولا لبيئة البلاك الدقيقة18.

لذلك، في هذه الدراسة، نقدم بروتوكول عزل النوى المحسب تم تطويره خصيصا لأنسجة استئصال الشريان التاجي، يتضمن تحلل غير أيوني قائم على المنظفات ومدة التحلل المعدلة تجريبيا بناء على درجة تكلس الأنسجة، لإنتاج نوى عالية الجودة ذات سلامة هيكلية وRNA محفوظة مناسبة لتحليل snRNA-seq لاحقا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة بموافقة ووفقا لإرشادات لجنة الأخلاقيات الإنسانية في معهد جامعة يون. إن. ميهتا لأمراض القلب ومركز البحوث (EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024) وجامعة غوجارات للتكنولوجيا الحيوية (GBU_IHEC/2023/006). تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين قبل جمع العينات. تم اختيار المرضى الذين خضعوا لجراحة تحويل مسار الشريان التاجي مع استئصال شرايين تاجية للدراسة الحالية. بعد الإزالة الجراحية، تم وضع نسيج استئصال الشريان الداخلي فورا في وسط RPMI خال من المصل، وحافظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية، ونقل إلى المختبر خلال حوالي 12 ساعة في حالة تجميد. راجع جدول المواد لمزيد من التفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في البروتوكول التالي.

1. عزل النوى

ملاحظة: قم بجميع الخطوات على الثلج واستخدم مواد معقمة. جهز جميع المخازن الطازجة.

  1. اغسل النسيج مرة أو مرتين بوسط RPMI خال من المصل لإزالة بقع الدم والشظايا. باستخدام ملقط معقم، انقل الأنسجة إلى صحن بتري معقم وسجل الوزن.
  2. باستخدام شفرة جراحية (رقم 10)، قم بتقطيع النسيج إلى قطع صغيرة بحجم ∼1 مم3 .
  3. تحضير مخزن تحلل بقوة 1 مل عن طريق دمج 10 ملليموتر تريس-HCl، درجة حموضة 7.4، 10 ملليمولار NaCl، 3 ملليمولار MgCl2 (باستخدام محاليل مخزون 1 م لكل مكون)، 0.1٪ (v/v) نونيدت P-40 في مياه خالية من النوكلياز. أضف المكونات بالترتيب التالي: ماء خال من النوكلياز أولا، ثم Tris-HCl، NaCl، MgCl₂، وNP-40 في النهاية، لتجنب تكوين رغوة.
    ملاحظة: يجب تحضير مخزن التحلل طازجا في يوم الاستخدام وحفظه مبردا على الثلج في جميع الأوقات. لا تتجمد.
  4. أضف محلول تحلل مبرد بسعة 1 مل إلى الأنسجة في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 5 مل.
  5. قم بتحليل النسيج على الثلج باستخدام مدقة دقيقة بتطبيق قوة لطيفة ومتسقة وتدوير المدقة باتجاه عقارب الساعة وعكس عقارب الساعة بالتناوب. استمر في التحلل لمدة تقارب 30 دقيقة، مع التأكد من بقاء العينة باردة طوال الوقت.
    ملاحظة: قم بتحليل الأنسجة حتى تصبح عكارة. استخدم رأس بسعة 1000 ميكرولتر للخلط بلطف عن طريق التوصيل بالماصات.
  6. قم بترشيح المحلول باستخدام مصفاة بحجم مسام 100 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل لإزالة الحطام وقطع الأنسجة.
    ملاحظة: يجب أن يبدو الترشيح أقل عكارة مع بقاء الحطام الظاهر على المصفاة.
  7. قم بالطرد المركزي على النوى عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح.
    ملاحظة: يجب أن تتكون رصاصة مرئية في أسفل الأنبوب.
  8. قم بإزالة المادة الفائقة باستخدام رأس ماصة عادي دون الإزعاج بالحبيبة.
  9. تحضير محلول غسل وإعادة تعليق النوى عن طريق دمج ألبومين مصل البقر بنسبة 1٪ (BSA) (باستخدام 10٪ من محلول المخزون)، ومثبط RNase بمقدار 0.2 U/μL (باستخدام محلول مخزون 20 U/μL) في محلول محلول محلول العزل الفوسفوري من Dulbecco 1X (DPBS). أضف المكونات بالترتيب التالي: DPBS أولا، ثم BSA، وأخيرا مثبط RNase.
    ملاحظة: يجب تحضير المخزن طازجا في يوم الاستخدام والحفاظ عليه مبردا على الثلج طوال الوقت. لا تتجمد.
  10. أعد تعليق الحبيبة في غسيل النوى وحاجز إعادة التعليق. برد المخزن على الثلج قبل الاستخدام.
  11. قيم كفاءة التحلل وفعالية الخلية عن طريق التلوين ب 5 ميكرولتر تريبان بلو والعد في جهاز قياس الدم الخلوي.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا الصالحة لا تزال موجودة، قم بالطرد المركزي بقوة 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم كرر الأقسام من 3 إلى 10.
  12. قم بترشيح المحلول باستخدام مصفاة بحجم مسام 30 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل لإزالة الحطام والكتل.
  13. قم بالطرد المركزي على النوى عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح.
  14. قم بإزالة المادة الفائقة باستخدام طرف ماصة عادية، ثم أعد تعليق الحبيبة في 1 مل من غسيل النوى وحاجز التعليق الإضافي.

2. توصيف النوى المعزولة

  1. صبغة تريبان بلو لتقييم سلامة الأنوى.
    1. خذ 15 ميكرولتر من تعليق النوى المعزولة في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
    2. أضف 5 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء (0.4٪ w/v) وامزج بلطف عن طريق استخدام الماصات.
    3. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح بالصبغة بشكل صحيح.
    4. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الخليط المصبوغ على جهاز قياس الهيموسيتوميتر.
    5. راقب تحت المجهر المركب المقلوب لفحص الشكل وعدد النوى.
  2. تحليل القياس الخلوي لتدفق النوى الواحدة لتعليق النوى الواحدة
    1. خذ 1 مل من تعليق النوى المعزولة وقم بطرد مركزه بضغط 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح.
    2. قم بإزالة المادة الفائقة باستخدام رأس ماصة عادية وأعد تعليق الحبيبة في مخزن FACS سعة 200 ميكرولتر (1X PBS و1٪ BSA).
    3. قسم 200 ميكرولتر من النوى المعلقة إلى مجموعتين: احتفظ ب 100 ميكرولتر كعنصر تحكم غير مصبوغ واستخدم 100 ميكرولتر كعينة مصبوغة.
    4. أضف 1 ميكرولتر 4'، 6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI) (مخزون 1 ملغ/مل) إلى العينة الملونة لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام/مل. اخلط بلطف وحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 5 دقائق قبل تحليل التدفق الخلوي.
    5. في مقياس التدفق الخلوي المستخدم لهذه الدراسة، استخدم الليزر البنفسجي عند 405 نانومتر، وكشف باستخدام 448/45 نانومتر. افحص عينة الضابط غير الملطخة أولا واحصل على ما لا يقل عن 10,000 حدث من إجمالي السكان.
    6. اضبط الجهد على 183 فولت للتشتت الأمامي (FSC)، و300 فولت للتشتت الجانبي (SSC)، و400 فولت ل V450 (ليزر DAPI). اضبط الحد عند 10,000 ل FSC.
      ملاحظة: جميع إعدادات جهد وكسب الجهاز ثابتة عبر العينات للحفاظ على الاتساق.
    7. رسم مساحة التشتت الأمامي (FSC-A) مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) لتمييز المقاطع المنفردة عن الدوبليت والتجميعات. ارسم بوابة حول الأحداث التي تظهر علاقة خطية للاحتفاظ فقط بنوى الفرد الصغيرة.
    8. أنشئ رسم بياني ثنائي المتغير لمنطقة التشتت الجانبي (SSC-A). تطبيق بوابة واسعة تشمل كامل مجموعة التشتت، حيث أن النوى المعزولة عادة ما تظهر ملف تشتت غير متجانس دون وجود مجموعات فرعية مميزة.
    9. أنشئ رسم كثافة ثنائية الأبعاد (لون زائف) بين SSC-A مقابل بنفسجي بمساحة 450 نانومتر (V450-A). استخدم التحكم غير المصبوغ لتعريف الفلورة الخلفية وتوجيه موقع البوابة بدقة. تحديد وتحديد مجموعة DAPI⁺ المميزة التي تتوافق مع النوى السليمة.
      ملاحظة: بما أنه يستخدم فلوروكروم واحد (DAPI)، فلا حاجة لتعويض التألق.
  3. تصوير النوى المعزولة باستخدام المجهر الكونفوكالي
    1. خذ 50 ميكرولتر من تعليق النوى وأضف 1 ميكرولتر DAPI (1 ملغ/مل) إلى العينة الملونة لتحقيق تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل، اخلط برفق، وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام قبل التصوير الكونفوكي.
    2. قم بتركيب 5 ميكرولتر من تعليق النوى الملونة على شريحة زجاجية نظيفة وتغطيتها بغطاء منزلق.
      ملاحظة: تجنب التثبيت للحفاظ على الشكل النووي.
    3. تخيل النوى باستخدام مجهر كونفوكالي مقلوب. افتح برنامج المجهر الكونفوكالي وراقب أولا في مجال ساطع 10X، ثم انتقل إلى حقل ساطع 40X.
    4. التقاط صور كونفوكال باستخدام مجهر كونفوكال ليزر مزود بكاشف طيفي وأهداف PLAN APO λD 40X (NA 0.95, RI 1.0). استثار DAPI باستخدام ليزر 405 نانومتر وجمع الانبعاث بين 429-474 نانومتر.
    5. كانت معايير التصوير كما يلي:
      1. وضع الكاشف: متعدد القنوات (GaAsP)
      2. الماسح الضوئي: جالفانو أحادي الاتجاه
      3. وضع المسح: النطاق
      4. متوسط الخط: 2X
      5. الدقة: 1024 × 1024 بكسل
      6. زمن الاستقامة: 2.0 ميكروثانية
      7. حجم الثقب الدبوس: 47.7 ميكرومتر
      8. قوة الليزر: 0.1-9.3٪ (حسب شدة الحقل)
      9. زيادة الكاشف: 37.8-45.9٪
      10. زووم: 1.0X
      11. المعايرة: 0.43-0.58 ميكرومتر/بكسل
    6. التقاط جميع الصور باستخدام كاميرا AX مع وضع تداخل بسيط وتحت تكوينات بصرية متطابقة، ويجب أن يكون نظام التركيز المثالي (PFS) نشطا أثناء التصوير للحفاظ على استقرار المستوى z.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم جمع نسيج استئصال الشرايين الداخلية البشرية البشرية من المرضى الذين خضعوا لجراحة CABG. تم وزن الأنسجة ومعالجتها لعزل النوى، وتم تأكيد النوى المعزولة أيضا بواسطة قياس تدفق الخلايا والمجهر الكونفوكلي (الشكل 1).

تقييم Trypan Blue لجودة عزل النوى
تم وزن النسيج المحفوظ في وسط RPMI، وبلغ حجمه 247.8 ملغ. تم تفريم النسيج، ثم تجانس في مخزن التحلل باستخدام مفرد صغير للعزل النووي (الشكل 2A-C

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم وصف سير عمل محسن لعزل النوى عن أنسجة استئصال الشريان التاجي البشري في البروتوكول الحالي. تم تصميم بروتوكول العزل النووي الموضح هنا خصيصا لتجاوز القيود الحرجة للحصول على خلايا سليمة وقابلة للحياة من اللويحات الصلبة التاجية المتقدمة. على عكس الأساليب التقليدية لتسلسل scRNA التي تعتمد على الهضم الإنزيمي القاسي والتفكك الميكانيكي21,30، يستخدم بروتوكولنا المحسن التجانس الميكانيكي اللطيف في مخزن تحلل يحتوي على منظف غير أيوني (Nonide...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين أي تضارب مصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل المجلس الهندي للأبحاث الطبية (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) وبالتعاون مع معهد جامعة ن. ميهتا لأمراض القلب ومركز البحوث في أحمد آباد. تشترف خوشي جاني بمنح المؤهل المشترك بين CSIR-UGC (UGC) ومجلس البحث العلمي والصناعي (CSIR) في حكومة الهند لمنحهم المؤهل المشترك CSIR-UGC NET (رقم مرجع NTA: 241620143543).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 μ مصفاة Mميلتيني بيوتيك 130-098-463
30 & mu; مصفاة Mميلتيني بيوتيك 130-098-458
مصل البقر ألبومينهاي ميدياTC546-25G
الطرد المركزيMPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
المجهر المركبنيكونNA مجهر نيكون إكليبس TS2 المقلوب (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
المجهر الكونفوكالي  نيكونNAمجهر نيكون Ti2-E المقلوب الكونفوكي (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
الغطاء المغلقهاي ميدياBG011C
قارورة عينة CRYOCHIL واسعة الفمتارسونز883191
DAPIسيغماD9542-5MG
DPBSجيبكو (ثيرموفيشر)10010-023
أنبوب الطرد المركزي (15 مل)تارسونز546021
جهاز قياس التدفق الخلوي بكالوريوس العلوم الحيوية663029BD FACSLyric (جهاز 3L12C CEIVD)
مقياس الدمأكسبيوCCB 100
أنبوب الطرد المركزي الدقيق (1.5 مل)تارسونز500010C
أنبوب الطرد المركزي الدقيق (5 مل)تارسونز500050
MgCl2سيغماM1028-100ML
المدقة الدقيقةتارسونز160020
NaClسيغماS9888-500G
NP-40هاي ميدياMB143-100ML
ماء خال من النوكليازجيبكو (ثيرموفيشر)W4502-1L
مثبط RNaseسيغما333540201
RPMI 1640جيبكو (ثيرموفيشر)11875093
Slide ريفييرا72910135
تريس-HClسيغماT2194-100ML
تريبان بلو  سيغما302643-25G

المراجع

  1. Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
  2. de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).
  3. Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis. Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).
  4. Ajoolabady, A., et al. Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms. Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).
  5. Dawson, L. P., Layland, J. High-risk coronary plaque features: a narrative review. Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).
  6. Tong, W., et al. Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles. Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).
  7. Lu, G., et al. Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome. Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).
  8. Kinoshita, D., et al. High-risk plaques on coronary computed tomography angiography. JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).
  9. Canu, M., et al. Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient. Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).
  10. Liu, X., et al. Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques. Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).
  11. Chiorescu, R. M., et al. Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature. Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).
  12. The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. Front. Cardiovasc. Med. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).
  13. Adam, C. A., et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field. Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).
  14. Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment. Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).
  15. Kelly, J. J., et al. Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database. Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).
  16. Ghatanatti, R. Coronary endarterectomy: recent trends. J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).
  17. Li, Y., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue. Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).
  18. Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution. Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).
  19. Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).
  20. Ahmad, H., et al. Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue. Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).
  21. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  22. Williams, J. W., et al. Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research. Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).
  23. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  24. Gruenbaum, Y., Foisner, R. Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation. Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).
  25. Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. Nuclear mechanics in disease. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).
  26. Dechat, T., et al. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).
  27. Oh, J. -M., et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).
  28. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  29. Gulko, A., et al. Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing. STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).
  30. Fernandez, D. M., et al. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).
  31. Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).
  32. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).
  33. Pan, H., et al. Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human. Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).
  34. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  35. Litviňuková, M., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).
  36. Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
  37. Rani, U., et al. Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology. J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).
  38. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).
  39. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  40. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DAPI
عزل النواة المفردة من أنسجة استئصال الشريان التاجي البطني الرحمي لمرضى ترقيع الشريان التاجي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.