تحليل متعدد الأوميكس التكاملي لبوتي هواتان تانغ في مرض الانسداد الرئوي المزمن

ملخص

يكشف التحليل المتعدد الأوميكس لبوتي هواتان تانغ (BTHTT) في مرض الانسداد الرئوي المزمن عن قدرته على تعديل محور الأيض لهرمون الغدة الدرقية IL-1R2/IL-1β. يوفر هذا العمل إطارا لمزيد من التحقق الميكانيكي للمكونات النشطة الحيوية في BTHTT، مما يؤسس أساسا لدراسات التدخل السببي المستقبلية اللازمة لتأكيد هذا المحور.

الملخص

استخدمت هذه الدراسة إطارا متعدد الأوميكس وعلم الأحياء الحاسوبي لدراسة الإمكانات العلاجية لصيغة الطب الصيني التقليدي (TCM) بوتي هواتان تانغ (BTHTT) ضد مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). لوحظت تحسينات فسيولوجية كبيرة في نموذج الفئران بعد تدخل BTHTT. أظهرت التحليلات النسيجة انعكاسا في تلف الرئة المرضي، بينما أكدت الفحوصات الكيميائية الحيوية وعلم النسخ تطبيع مستويات IL-1β وIL-1R2 . بالإضافة إلى ذلك، كشف تحليل التحليل الأيضي أن BTHTT يصحح الاضطرابات في مستويات هرمونات الغدة الدرقية T3 وT4. لوحظ وجود ارتباط سلبي بين محور IL-1β/IL-1R2 وهذه الهرمونات الغدية، مما يشير إلى أن تنظيمها مرتبط بالتأثير العلاجي للتركيبة. بعيدا عن القياسات المباشرة، حددت خوارزميات التعلم الآلي عشرة جينات توقيع للمرض المزمن المزمن من قواعد بيانات سريرية. تشير تحليلات إثراء المسارات إلى أن BTHTT قد يعمل من خلال تفاعلات السيتوكين-السيتوكين-المستقبلات ومسارات تخليق هرمون الغدة الدرقية. علاوة على ذلك، بينما تم تحديد 283 مكونا في الجسم الحي، تعتبر مركبات مثل تانشينون IIA وكريبتوتانشينون حاليا مواد فعالة مرشحة. يدعم دورهم كمحركات أساسية نموذج يرتبطون فيه بثبات ب IL-1R2؛ يعتمد هذا الاستنتاج على محاكاة الالتحام الجزيئي والديناميكا الجزيئية (MD) بدلا من العزل التجريبي المباشر. بشكل عام، تدعم البيانات نموذجا يمارس فيه BTHTT تأثيرا متعدد الأهداف على مرض الانسداد الرئوي المزمن من خلال تعديل الالتهاب والتوازن الأيضي. يوفر هذا النهج المتكامل أساسا علميا مصقنا للتطبيق السريري ل BTHTT ويبرز مسارات محددة للتحقق التجريبي المستقبلي.

المقدمة

مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، وهو أحد أكثر أمراض الجهاز التنفسي شيوعا في الممارسة السريرية، أصبح ثالث سبب وفاة على مستوى العالم بسبب معدل الإعاقة المرتفع جدا وتفاقم الحالة الحادة المتكررة¹. كان مرض الانسداد الرئوي المزمن عاملا مهما أدى إلى فقدان القدرة العاملة لدى السكان وزيادة حادة في تكاليف رعاية الأسرة، حيث تجاوزت الخسائر الاجتماعية والاقتصادية بكثير معظم الأمراض المزمنة². في مبادرة "الصين الصحية 2030"، تم إدراج مرض الانسداد الرئوي المزمن كمرض رئيسي للوقاية والعلاج. وبسبب عدم الفهم الكامل للآليات الكامنة وراء مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، ظل الاستخدام المشترك لموسعات الشعب الهوائية والكورتيكوستيرويدات هو العلاج الأساسي. بينما قدم هذا النهج راحة واضحة نسبيا للأعراض، إلا أنه لا يستطيع منع التدهور التدريجي في وظيفة الرئة. علاوة على ذلك، فإن الاستخدام طويل الأمد للكورتيكوستيرويدات يزيد حتما من حدوث التفاعلات السلبية، مما يؤثر بشكل أكبر على فعالية الأدوية على المدى الطويل وتحمل المرضى³. أظهرت الدراسات أنه حتى مع العلاج الثلاثي، لا يزال 28٪–31٪ من المرضى يعانون من تفاقم حاد أو تفاقم الأعراض. لذلك، يبقى تطوير أدوية فعالة للانسداد الرئوي المزمن قضية رئيسية ورئيسية في أبحاث الانسداد الرئوي المزمن الحالية⁴.

لتلبية هذه الاحتياجات، تم تطوير صيغ كلاسيكية للطب الصيني التقليدي مثل بوتي هواتان تانغ (BTHTT)، شينغماي ين، وبو في تانغ. من بينها، كان BTHTT بارزا بشكل خاص لتأثيراته الكبيرة في تقوية الرئة، وتعزيز الطاقة، ومعالجة البلغم لتخفيف السعال ^5,6,7,8. استخدم BTHTT على نطاق واسع في العلاج السريري لمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، ليس فقط لفعاليته المذهلة وآثاره الجانبية القليلة، بل أيضا لإمكانية عكس التدهور التدريجي في وظيفة الرئة. كان يحمل وعدا كبيرا في السياقات السريرية والاجتماعية، وكان لديه إمكانية "التطور الثانوي" كدواء رئيسي، ذو قيمة علمية واقتصادية كبيرة 9,10,11,12. ومع ذلك، وبسبب نقص البحث العلمي المنهجي وطويل الأمد، عانت الدراسات حول BTHTT عموما من فهم غير واضح لأسسه المكون وأهدافه الأساسية غير المحددة للعمل. في الأساس، كان ذلك بسبب نواقص كبيرة في الأبحاث حول الآلية الرئيسية والأساس العلاجي المحتمل ل BTHTT.

استجابة لهذه الخاصية، فإن دمج تقنيات الأوميكس المتعددة مثل الأيض وعلم النسخ، بالإضافة إلى طرق التنقيب متعددة الخوارزميات، مع التركيز على الارتباطات الرئيسية بين الجينات الرئيسية المميزة والمسارات الأيضية الرئيسية في بيئة الجسم الدقيقة، لا يستطيع 13,14,15 فقط استكشاف جوهر العلاج، بل أيضا تقييم الفعالية التآزرية للمكونات النشطة. يركز بشكل خاص على محور هرمون الغدة الدرقية، حيث تشير الأبحاث الناشئة إلى أن خلل الغدة الدرقية هو مرض متكرر مصاحب في مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، وغالبا ما يرتبط بزيادة الالتهاب الجهازي وضعف وظيفة عضلات الجهاز التنفسي. قد يمثل تعديل هذا المحور مسارا جديدا لاستعادة التوازن الأيضي في أمراض الرئة^16,17.

باختصار، اعتمدت هذه الدراسة نهجا ثلاثي الجوانب يجمع بين تكامل الوسائط المتعددة والبيولوجيا الحاسوبية، استنادا إلى فرضية التوافق بين المتلازمة والصيغ. من ناحية، استخدم تقنيات الكيمياء الدوائية في مصل الطب الصيني التقليدي لتحديد المكونات المنقولة في الدم لمادة BTHTT في ظروف فعالة. من ناحية أخرى، مع التركيز على الجينات الرئيسية المميزة لمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، استخدم التحليل الأيضي الشامل للأنسجة لاكتشاف مؤشرات الأمراض من الجزيئات الصغيرة الداخلية وبناء تقييم دقيق للتأثيرات العامة للصيغة. وفي الوقت نفسه، وبالاقتران مع التعدين متعدد الخوارزميات وتحليل التعرف على النسخ، حدد التحليل الجينات الرئيسية المميزة التي ينظمها BTHTT في ظروف فعالة وأجرى تحليلا للارتباط بين الجينات الرئيسية المميزة والمسارات الأيضية الرئيسية. تم فحص أساس المادة العلاجية المحتمل من خلال الالتحام الجزيئي وتحليل الديناميكا الجزيئية.

استنادا إلى إطار عمل الوسائط المتعددة لدينا والملف الدوائي ل BTHTT، تقترح هذه الدراسة التنبؤات القابلة للاختبار التالية. التعديل المضاد للالتهاب: تدخل BTHTT يقلل بشكل كبير من مؤشرات الالتهاب الجهازي والرئوي، وبشكل خاص من خلال تطبيع محور التعبير IL-1β/IL-1R2 لتقليل تلف الأنسجة. الاستعادة الأيضية: يغير BTHTT الإشارات في مسار تخليق هرمون الغدة الدرقية، مما يؤدي إلى تصحيح قابل للقياس لمستويات T3/T4 وتحسن لاحق في الحالة الأيضية للبيئة الدقيقة للرئة. الاستعادة الأيضية: يغير BTHTT الإشارات في مسار تخليق هرمون الغدة الدرقية، مما يؤدي إلى تصحيح قابل للقياس لمستويات T3/T4 وتحسن لاحقا في الحالة الأيضية لبيئة الرئة الدقيقة.

البروتوكول

ملاحظة: المواد الكيميائية والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

جمع البيانات السريرية ومعالجتها المسبقة

لدراسة التواقيع الجزيئية لمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، تم استرجاع مجموعات بيانات النسخ من قاعدة بيانات التعبير الجيني (GEO). تم اختيار خمس مجموعات بيانات إجمالا: GSE11784، GSE12472، GSE16972، GSE38974، و GSE222965. تم تنزيل البيانات الخام وملفات التعليقات التوضيحية للمنصة لرسم خرائط المجسات إلى الجينات. عندما استهدفت عدة مجسات جين واحدا، تم الاحتفاظ بأقصى قيمة تعبير. تم دمج مصفوفات التعبير الجيني الناتجة (صفوف كجينات، وأعمدة كعينات) في مجموعة بيانات اكتشاف واحدة. لمراعاة الاختلافات التقنية بين منصات المصفوفات الدقيقة المختلفة ومجموعات الدراسة، تم إجراء تصحيح تأثير دفعات باستخدام خوارزمية ComBat من حزمة sva R. تم التحقق من فعالية التصحيح من خلال مخططات تحليل المكونات الرئيسية (PCA). بعد التصحيح الدفعي، تم استخدام مجموعة بيانات الاكتشاف المدمجة للتحليل التفاضلي. تم تحديد الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) بين مرضى الانسداد الرئوي المزمن ومجموعة التحكم الأصحاء باستخدام حزمة ليما. تم تعيين عتبات الأهمية عند |logFC| ≥ 1 وP ≤ 0.05.

لتحديد أكثر الجينات المميزة متانة، تم دمج ثلاث خوارزميات تعلم آلي مستقلة. لضمان موثوقية النماذج ومنع تسرب البيانات، تم تضمين عملية اختيار الميزات داخل حلقات التحقق المتقاطع حيثما كان ذلك مناسبا، وتم فصل مجموعة بيانات الاكتشاف بشكل صارم عن مجموعات التحقق المستقلة. تم تطبيق نموذج LASSO على نماذج DEGs باستخدام حزمة glmnet. استخدمنا التحقق المتقاطع بعشرة أضعاف لتحديد المعامل الأمثل للعقوبة. تم اختيار قيمة معامل العقوبة المثلى التي تتوافق مع الحد الأدنى لخطأ التحقق المتقاطع كعتبة لتحديد جينات الميزة الأساسية. تم استخدام SVM لتصنيف الجينات بناء على قوتها التمييزية. تم تنفيذ استراتيجية تحقق متقاطع من 10 مرات لتحديد نقطة الحد الأدنى لخطأ التعميم، وبالتالي تحديد العدد الأمثل للجينات المميزة. تم استخدام حزمة الغابة العشوائية لترتيب مستويات DEG بناء على دقة الانخفاض المتوسط ومؤشر الجيني. تم اختيار الجينات التي حصلت على أعلى درجات الأهمية كميزات مرتبطة بالمرض.

تم أخذ تقاطع الميزات التي حددتها LASSO وSVM وrandomForest لتحديد الجينات الأساسية النهائية المميزة. تم تقييم الأداء التشخيصي لهذه الجينات باستخدام تحليل منحنى خاصية التشغيل المستقبلية (ROC). تم حساب المساحة تحت المنحنى (AUC) وفترات الثقة المرتبطة بها 95٪ باستخدام حزمة pROC. تم اعتبار الجين ذو قيمة تشخيصية عالية إذا كان AUC > 0.70. وأخيرا، تم التحقق من صحة مستويات التعبير ودقة التشخيص لهذه الجينات في مجموعة تحقق مستقلة لضمان تعميم النتائج.

باستخدام PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) وdrugbank (https://go.drugbank.com/)، تم الحصول على ما مجموعه 12 ملفا دوائيا محددا، مثل LABAs، LAMAs، SABAs، SAMAs، فلوتيكازون بروبيونات، بوديسونيد، بيكلوميثازون، فلوتيكازون، سالميترول، أوميكليدينيوم، فيلانتيرول، ثيوفيلين. تم معايرة الأهداف المجمعة باستخدام قاعدة بيانات Uniprot (https://www.uniprot.org/)، حيث تمت إزالة الجينات غير البشرية، وحذف الأهداف المكررة غير الصالحة للحصول على أسماء جينية موحدة. من خلال إدخال الكلمات المفتاحية "مرض انسداد رئوي مزمن" و"COPD" في قواعد بيانات GeneCards (https://www.genecards.org/)، OMIM (https://www.omim.org/)، وDisGENET (https://www.disgenet.org/)، تم استرجاع الأهداف المتعلقة بالمرض. تم دمج جميع الأهداف من قواعد البيانات الثلاث في ملف إكسل، وتمت إزالة الجينات المكررة، وتمت معايرة البيانات باستخدام قاعدة بيانات يوني بروت للحصول على معلومات الجين النهائية لهدف المرض.

تطوير نموذج التعلم الآلي

تم بناء إطار عمل متعدد الخوارزميات لتعلم الآلة باستخدام حزم R glmnet وe1071 وrandomForest بشكل متسلسل. على وجه التحديد، تم إجراء انحدار LASSO لتقليل الأبعاد المعتمدة على العقوبة، وتم استخدام تحليل آلة متجه الدعم (SVM) لتقييم أخطاء التحقق بناء على تجميع العينات، واستخدم نظام الغابة العشوائية لتصفية الميزات وفقا لدرجات الأهمية. وقد أسفرت هذه العملية عن تصورات تشخيصية متوافقة، بما في ذلك منحنيات التحقق المتقاطع ومخططات فقاعات أهمية الجينات. بعد بناء النموذج، تم إجراء تحليل مخطط فين على مجموعات الجينات التي حددتها هذه الخوارزميات المتعددة لاستخراج جينات ميزات "التقاطع" المتداخلة، مما يعزز موثوقية المؤشرات الحيوية المحتملة. ثم تم استخراج مصفوفة التعبير لهذه الجينات لعرض اختلافات التعبير بين المجموعات عبر مخططات الكمان. وأخيرا، تم توليد منحنيات ROC عبر حلقات تكرارية لكل جين لحساب المساحة تحت المنحنى (AUC)، مما يؤكد قيمتها التشخيصية كمؤشرات حيوية مرشحة.

إدخال نموذج حيواني

تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة قويتشو الطبية (2303411) واتبع إرشادات ARRIVE ولوائح رعاية الحيوان. إجمالي 72 ذكرا من جرذ سبراج-داولي (SD) بدرجة SPF (230 ± 20 جرام). بعد أسبوع واحد من الإسكان التكيفي في ظروف قياسية (25 ± 1 درجة مئوية، 50 ± 5٪ رطوبة، دورة 12 ساعة من الضوء إلى الظلام)، تم تقسيم الفئران عشوائيا إلى مجموعة التحكم (المجموعة C) (n = 24) ومجموعة النموذج (مجموعة M) (n = 48).

خضعت مجموعة M لنمذجة عاملين: التعرض المتقطع لدخان السجائر (9 أسابيع، 6 أيام في الأسبوع، 3 سجائر بحثية يوميا مقسمة إلى جلستين، 30 دقيقة في كل جلسة) وحقن LPS داخل القصبة الهوائية (200 ميكروغرام لكل غرس، مرة كل أسبوعين)^18,19. تلقت مجموعة C حجما مكاويا من المحلول الملحي الطبيعي. بعد النمذجة الناجحة، تم تقسيم المجموعات عشوائيا إلى مجموعة M (n = 12)، ومجموعة BTHTT عالية الجرعة (مجموعة H) (عالية، 1× جرعة سريرية، n = 12)، ومجموعة BTHTT منخفضة الجرعة (مجموعة L) (منخفضة، 1/2× جرعة سريرية، n = 12)، مع تدخل مستمر لمدة أسبوعين. تم تزويد مجموعتي C و M بالماء المقطر بشكل متزامن.

تم تسجيل وزن الجسم ومعايير النشاط العفوي أسبوعيا. في نهاية النمذجة والعلاج، تم جمع أنسجة الرئة، والمصل، وسوائل الغسيل في المصل والشعب الهوائية (BALF). تم قياس مستويات العلامات الالتهابية (مثل TNF-α، IL-1β، IL-6، IL-8، OPN، وMCP-1) باستخدام ELISA وفقا لتعليمات المجموعة. كما أجريت تحليلات علم أمراض الأنسجة وتحليلات متعددة الأوميكس.

إعطاء العلاج

بوتي هواتان تانغ (BTHTT) يتكون من تسعة أعشاب طبية صينية تقليدية: أستراجالوس ميمبرناسيوس (فيش). بجي. (أستراغالي راديكس، 15 جم)، Pseudostellaria heterophylla (Miq.) باكس (Pseudostellariae Radix، 15 جم)، Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex، 15 جم)، Angelica sinensis (Oliv.) ديلس (Angelicae Sinensis Radix، 10 جم)، Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma، 15 جم)، Perilla frutescens (L.) Britt. (بيريلا فوليوم، 10 جرام)، رافانوس ساتيفوس ل. (سائل رافاني، 10 جرام)، ليبيديوم أبيتالوم ويلد. (Descurainiae Semen، 10 ج)، وMahonia fortunei (ليندل.) Fedde (Mahoniae Folium، 10 جرام). تم نقع المواد العشبية في ماء يزيد وزنها بمقدار 10 أضعاف وزنها لمدة 30 دقيقة ثم تم تغطيتها لمدة ساعة واحدة. تم ترشيح الريش، وجمع الترشيح وتقسيمه إلى ثلاث أجزاء متساوية للإعطاء الفموي.

استنادا إلى السلامة والفعالية السريرية، كانت الجرعة القياسية من BTHTT للبالغين 1.57 ج∙^كجم-1∙^يوم-1 وفقا لإرشادات الأدوية السريرية. بالنظر إلى عامل تحويل الجرعة للفئران، الذي أشار إلى أن الجرعة القياسية من دواء الفئران كانت 6.3× الجرعة القياسية البشرية، تم تعيين مجموعة H المقابلة للفئران عند 9.9 ج∙كجم-1∙يوم-1، وتم تعيين مجموعة L عند نصف هذه الجرعة (4.95 ج∙^كجم-1∙يوم^). نظرا لأن الحجم المركز النهائي ل BTHTT كان 50 مل، فإن الحجم المعطى لمجموعة H في الفئران كان حوالي 1.6 مل، وللمجموعة L حوالي 0.8 مل. كان الدواء يعطى مرة واحدة يوميا عن طريق التمهيد الفموي.

جمع الأنسجة وBALF

في نقاط التجارب النهائية (الأسبوع 9 والأسبوع 11)، تم تخدير الفئران عن طريق حقن داخلي الصوديوم بنتوباربيتال 5٪ (1 مل/100 جم). تم جمع الدم من الوريد البوبي، وترك ليقف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم تم تمركزه المركزي عند 13,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. كان الفائق يخزن عند -80 درجة مئوية. تم تجميد أنسجة الرئة بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم جمع BALF من خلال ثلاث غسلات متتالية باستخدام PBS البارد.

تحليل علم النسخ

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة الرئة وتم التحكم في الجودة باستخدام (A₂₆₀/_{A 280} > 1.8) (RIN ≥ 7.0. تم بناء مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي: تم إثراء mRNA بالقليغو(dT)، وتجزئه، واستخدم لتخليق cDNA مزدوج السلسلة، ثم تم ربطه بأوليغونيوكليوتيدات المكيلة وتضخيمه بواسطة PCR. تم قياس المكتبات والتحقق من جودتها قبل التسلسل. بما في ذلك فحص توزيع المحتوى، وتحليل توزيع الكثافة FPKM لكل عينة، وتحليل تقييم الجودة العام ل RNA-seq²⁰.

تمت معالجة بيانات النسخ الخام التي تولدها منصة التسلسل باستخدام سكريبتات Perl لإزالة تسلسلات المحولات والقراءات منخفضة الجودة (قراءات تحتوي على Q ≤ 25 قاعدة تمثل > 60٪ أو معدل N > 5٪). تم الحصول على قراءات نظيفة بعد هذه العملية التصفية. تم محاذاة القراءات النظيفة مع الجينوم المرجعي باستخدام HISAT2، وتم قياس مستويات التعبير الجيني لحساب قيم FPKM. تم إجراء تحليل تعبير تفاضلي (مع معايير فحص |log2FC| > 1 وp-adj < 0.05). استند شرح عوامل النسخ إلى قواعد بيانات Animal TFDB أو Pfam/DBD، مع مطابقة معرفات الجينات ومعلومات مجالات البروتين²¹.

تم استخدام استراتيجية رسم خرائط جينية متعامدة لضمان الدقة المنهجية للتحقق من صحة الأنواع المختلفة. تضمنت هذه الاستراتيجية استرجاع الأورثولوجات في الفئران لجينات بشرية أساسية (مثل SRPX2، IL-1R2، TFF3) باستخدام قواعد بيانات NCBI HomoloGene وEnsembl BioMart. اقتصر الاختيار على أزواج جينية تظهر علاقة خرائط "واحد لواحد" واضحة وهوية عالية لتسلسل البروتين. في الحالات التي كان فيها عدة مرشحين حاضرين، كان يعطى الأفضلية للأزواج المتحامية المعتمدة من قبل HGNC. لضمان دقة عالية في الكشف، تم تصميم بادئات RT-qPCR محددة بناء على تسلسلات mRNA لمتراثي الفئران المحددين. تم تحديد معايير التحقق من ذلك من خلال الاتساق في اتجاه التعبير والتحقق الوظيفي. الاتساق في اتجاه التعبير: في نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن للفئران الناتج عن الدخان، أظهر RT-qPCR أن اتجاهات التعبير للجينات المستهدفة في نسيج رئة الجرذان كانت متوافقة تماما مع تلك التي لوحظت في مجموعات بيانات GEO السريرية البشرية. اعتبرت الجينات التي تظهر نفس قطبية التغير عبر الأنواع تحمل الحفظ كعلامات حيوية للمرض. التحقق المرضي: عند الاتساق في التعبير، تم إجراء تحليل الارتباط للتحقق من مشاركة هذه الجينات في التطور المرضي للمرض المزمن.

سير عمل الميتابولومكس

تم توحيد نسيج الرئة (20–50 ملغ) في ماء ميثانول-أسيتونيتريل مبرد مسبقا (2:2:1، v/v) وتم تثبيته في حمام ثلج. تم طرد المركزي بحرارة 13,000 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. كان الفائق مركزا في الفراغ، وأعيد إذابته في ماء الأسيتونيتريل (1:1، فولت/فولت)، وتم ترشيحه عبر غشاء بحجم 0.22 ميكرومتر لتحليل LC-MS²².

تم تحقيق الفصل الكروماتوغرافي باستخدام عمود UPLC قائم على الأميد (1.7 ميكرومتر، 2.1 مم × 100 مم). تم الحفاظ على درجة حرارة العمود عند 25 درجة مئوية. تكونت المرحلة المتحركة من (أ) ماء يحتوي على 25 ململ أسيتات أمونيوم و25 ملليمولار أمونيا، و(ب) أسيتونيتريل. تم ضبط معدل التدفق عند 0.5 مل/دقيقة، وحجم الحقن 2 ميكرولتر. كان برنامج الترشيد التدرج كما يلي: 0–0.5 دقيقة، 95٪ B؛ 0.5–7 دقائق، انخفاض خطي ل B من 95٪ إلى 65٪؛ 7–8 دقائق، انخفاض خطي ل B من 65٪ إلى 40٪؛ 8–9 دقائق، B بقيت عند 40٪؛ 9–9.1 دقيقة، زيادة خطية ل B من 40٪ إلى 95٪؛ 9.1–12 دقيقة، وظل B عند 95٪. خلال التحليل بأكمله، تم الاحتفاظ بالعينات عند 4 درجات مئوية في جهاز العينة الذاتية. لضمان استقرار النظام وموثوقية البيانات التجريبية، تم تحليل العينات بتسلسل عشوائي، مع توزيع عينات مراقبة الجودة (QC) في قائمة الانتظار. تم إجراء تحليل مطيافية الكتلة باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل فائق الأداء (UHPLC) مرتبط بمطياف كتلة. تم تأين العينات باستخدام التأين بالرش الكهربائي (ESI) في وضعي الأيونات الموجبة والسالبة. كانت إعدادات مصدر ESI وMS كما يلي: تم ضبط غاز جهاز التنشيح (Gas 1) على 50، الغاز المساعد (Gas 2) على 2، درجة حرارة مصدر الأيون إلى 350 °م، وجهد الرش (ISVF) إلى 3,500 فولت في وضع الأيون الموجب و2,800 فولت في وضع الأيون السالب. تم ضبط نطاق الكتلة ل MS1 من 70 إلى 1,200 دالتون، بدقة 60,000 ووقت تراكم مسح 100 مللي ثانية. في MS2، تم استخدام الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) مع طاقة تصادم متدرجة. كما تم ضبط نطاق الكتلة ل MS2 من 70 إلى 1,200 دالتون، بدقة 60,000 ووقت تراكم مسح 100 مللي ثانية. تم تعيين وقت الاستبعاد الديناميكي عند 4 ثوان.

تم تحويل بيانات الأيض الخام إلى صيغة mzXML ثم معالجتها لمحاذاة القمة، وتصحيح وقت الاحتفاظ، واستخراج مساحة الذروة. تضمن سير عمل معالجة البيانات المسبق الخطوات التالية: أولا، تمت إزالة قمم الأيونات ذات معدل مفقود > 50٪. ثانيا، تم احتساب القيم المتبقية المفقودة باستخدام خوارزمية KNN. ثالثا، تم التخلص من السمات الأيضية التي تحتوي على انحراف معياري نسبي (RSD) >50٪). تم تقييم جودة البيانات التجريبية باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وتجميع عينات مراقبة الجودة. شملت التحليلات اللاحقة الإحصاءات أحادية المتغير (مثل اختبارات t)، والإحصاء متعدد المتغيرات (PLS-DA)، وفحص المستقلبات التفاضلية (VIP > 1 و p < 0.05)، وتحليل إثراء مسار KEGG (اختبار فائق الهندسة) ^23,24.

تأسيس طرق تحليلية للمكونات في الجسم الحي والصناعي

تحضير عينات BTHTT للاختبار الصناعي : تم استخراج BTHTT عن طريق المحلول في الماء (2 × 30 دقيقة)، ثم تركيزه إلى 1.1–1.2 جم/مل، ثم تجفيفه بالتجميد. قبل التحليل، تم خلط 600 ميكرولتر من محلول المسحوق المجفف بالتجميد مع 400 ميكرولتر من الميثانول، ثم إعادة إذابته في 40٪ ميثانول، وطرد مركزه لجمع المادة الفائقة.

تحضير عينات BTHTT للاختبار الحي : تم إزالة البروتين من المصل عن طريق خلطه مع الميثانول (1:1) وترسيب عند −20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تلاها الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة. تم تجفيف المادة الفائقة بالفراغ وإعادة إذابتها في 40٪ ميثانول للحصول على العينة النهائية. لتحضير عينات المصل الفارغ + BTHTT، تم إضافة كمية مناسبة من المصل الفارغ مع المادة الفائقة BTHTT في المختبر ، وتم تنفيذ الخطوات المتبقية كما هو موصوف.

تم فصل العينات باستخدام نظام UHPLC مزود بعمود UPLC عكسي الطور (2.1 مم × 100 مم، 1.8 ميكرومتر). تم الحفاظ على درجة حرارة العمود عند 35 درجة مئوية، وتم ضبط معدل التدفق عند 0.3 مل/دقيقة. تكونت المرحلة المتنقلة من (أ) حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الماء و(ب) حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الأسيتونيتريل. تم إجراء استبعاد التدرج كما هو موضح في الجدول 1.

تم استخدام مطياف الكتلة لجمع كل من الطيف MS1 وMS2. تم اقتران مطياف الكتلة بنظام UHPLC ويعمل في وضعي ESI الإيجابي والسالب. كانت معايير ESI كما يلي: جهد الرش 3800 فولت (ESI+) / 3500 فولت (ESI-)، ضغط غاز الغلاف 45 أرب، ضغط الغاز المساعد 20 أرب، درجة حرارة أنبوب نقل الأيونات 320 درجة مئوية، ودرجة حرارة جهاز التبخير 350 درجة مئوية. تم ضبط وضع الكشف على MS2 (Full-MS/dd-MS2) بالمسح الكامل/البيانات (Full-MS/dd-MS2) بدقة 60,000 ل MS1 و15,000 ل MS2. تم اختيار أفضل 10 أيونات MS1 لتجزئة MS/MS مع طاقات تصادم متدرجة طبيعية تبلغ 20 و40 و60. تم ضبط نطاق الكتلة ل MS1 من 90 إلى 1,300 دالتون.

في التحليل الحي ، بما في ذلك عينات المجموعة الفارغة، وعينات المجموعة المجهزة، وعينات المجموعة الفارغة + BTHTT، تم حقن 6 ميكرولتر من كل عينة بدقة. للتحليل الصناعي ل BTHTT، تم حقن 2 ميكرولتر من العينة. تم حقن كل دفعة من عينات المجموعة الفارغة والجرعة مرة واحدة، بينما تم حقن عينات المجموعة الفارغة + عينات BTHTT في ثلاث نسخ، وتم حقن عينات BTHTT في خمس نسخ.

تمت معالجة البيانات بصيغة mzXML وتحديد المركبات بناء على قاعدة بيانات مطيافية الكتلة التجارية عالية الدقة للطب الصيني التقليدي المحلي. تم تحديد معايير التحديد كما يلي: خطأ كتلي <25 جزء في المليون ل MS1 ودرجة مطابقة > 0.7 ل MS2 (حيث تعكس الدرجة تشابه الأيونات الجزئية، مع ≥0.7 كعتبة موثوقة)^25,26. شمل التحليل الإحصائي عد المركبات وتصنيفها (مثل الفلافونويدات والقلويدات)، والذي تم بالتزامن مع تعليقات من قاعدة بيانات الطيف الكتلي²⁷.

الالتحام الجزيئي ومحاكاة MD

لدراسة أنماط الارتباط المحتملة بين البروتينات المميزة المحددة والروابط المقابلة لها، تم إجراء الربط الجزيئي في السيليكو . تم استرجاع البنى ثلاثية الأبعاد للجزيئات الصغيرة من قاعدة بيانات PubChem، وتم تحسين تكويناتها الهندسية. تم الحصول على البنى البلورية للبروتينات المستهدفة من بنك بيانات البروتين RCSB (PDB). باستخدام PyMOL، تمت إزالة جزيئات الماء والذرات غير المتجانسة، وتم استخراج الروابط المتبلور المشتركة لتحديد إحداثيات الموقع النشط. تمت إضافة ذرات الهيدروجين، وتم تعيين شحنات غاستايجر باستخدام البرمجيات. تم تنفيذ محاكاة الإرساء، حيث تولد 15 تشكيلات مستقلة في كل جولة. تم اختيار التكوين ذو أقل طاقة ارتباط لمزيد من التحليل. لتوصيف التفاعلات غير التساهمية بدقة، تم تحليل مركبات المستقبل-الليغاند باستخدام محلل تفاعل البروتين-الليغاند (PLIP). ملاحظة: من المهم التأكيد على أن نتائج الالتحام هذه توفر دعما هيكليا للتفاعلات الجزيئية المحتملة وتعمل كأساس لمزيد من التحسين الديناميكي؛ ومع ذلك، فهي لا تشكل دليلا مستقلا على الفعالية البيولوجية.

لتقييم استقرار وتطور التكوين لمجمعات البروتين-الليغاند المتوقعة تحت ظروف فسيولوجية ذات صلة، تم إجراء محاكاة للديناميكا الجزيئية باستخدام حزمة برنامج GROMACS. تم توليد ملفات الطوبولوجيا لكل من البروتينات والليغاندات بناء على حقل القوة GROMOS96 43a1. تم وضع كل مجمع في مركز صندوق عشري الأوجه، مع الحفاظ على مسافة لا تقل عن 1.0 نانومتر من حواف الصندوق، وتم حلها باستخدام نموذج SPC المائي. لضمان الحيادية الكهربائية، تمت إضافة أيونات الصوديوم أو الكلوريد إلى النظام حسب الحاجة. تم إجراء تقليل الطاقة باستخدام خوارزمية الهبوط الأكثر انحدارا حتى أصبحت القوة القصوى أقل من 1000.0 ^{كيلوجول-1∙مول-1}∙^{نانومتر-1}. ثم تم تعديل النظام على مرحلتين: أولا، تم استخدام مجموعة NVT لتسخين النظام إلى 300 كلفن فوق 100 حصان باستخدام منظم حرارة بمقياس V؛ ثانيا، تم استخدام مجموعة NPT لتثبيت الضغط عند 1 بار فوق 100 حصان لكل بوصة باستخدام باروستات بارينيلو-رحمن. تم إجراء محاكاة الإنتاج لمدة إجمالية تبلغ 10 نانوثانية مع خطوة زمنية قدرها 2 fs. تم حساب التفاعلات الكهروستاتيكية طويلة المدى باستخدام طريقة شبكة الجسيمات إيوالد (PME)، بينما تم إدارة تفاعلات فان دير فال قصيرة المدى والتفاعلات الكهروستاتيكية بنصف قطر قطع 1.2 نانومتر. لضمان موثوقية المحاكاة، تم تنفيذ ثلاث عمليات مستقلة حيثما أمكن. تم تقييم استقرار المجمعات كميا من خلال حساب متوسط انحراف جذر التربيع (RMSD) وتذبذب متوسط الجذر التربيعي (RMSF) لذرات العمود الفقري البروتيني بالنسبة للبنية الأولية. تم استخدام تحقيق هضبة في ملف RMSD كمعيار أساسي لتوازن النظام واستقرار الهيكل.

التحليل الإحصائي العام

في هذه التجربة، أجريت حسابات جماعية باستخدام اختبارات t أو تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA).

النتائج

التنبؤ بالجينات الرئيسية المميزة في مرض الانسداد الرئوي المزمن

بعد تصحيح تأثير دفعات البيانات السريرية من منصات ميكروآراي متعددة (الملف التكميلي 1–الشكل التكميلي S1)، تم إجراء تحليل تعبير تفريقي. تم تحديد 34 جينا مرشحا (32 تم رفع تنظيمه و2 تم تخفيض تنظيمه)، بما في ذلك SRPX2 وCLDN10 وTFF3 (الشكل 1A).

لتحسين هذه المرشحات إلى توقيع تنبؤي...

المناقشة

إن تخليق وصيانة مستويات هرمون الغدة الدرقية أمر مهم لمرضى الانسداد الرئوي المزمن وتمتد إلى ما هو أبعد من مجرد وظيفة الغدد الصماء، مما يؤثر بشكل عميق على تقدم المرض، والحالة الغذائية، ووظائف الرئة، والتوقعات العامة ^31,32,33. خصوصا خلال التفاقم الحاد، غالبا ما كان مرضى مرض الانسداد الرئوي المزمن يظهرون حالة شبيهة بقصور الغدة الدرقية تعرف باسم "متلازمة انخفاض T3". تم الإبلاغ عن أن انخفاض مستويات هر...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأسيتونيتريل (درجة كروماتوغرافية)	ميرك، ألمانيا	1499230-935
المحلل الحيوي Agilent 4150	شركة أجيلنت تكنولوجيز، الولايات المتحدة الأمريكية
أسيتات الأمونيوم	سيغما، ألمانيا	SRE0035-20230321
أنجيليكا سينينسيس (أوليف.) ديلس (أنجيليكي سينينسيس راديكس)،	شركة قويتشو شانهايتونغجيا للأدوية، الصين	20240807
Astragalus membranaceus (فيش.) بجي. (أستراغالي راديكس)،	شركة قويتشو شانهايتونغجيا للأدوية، الصين	20240601
مكتب كيم		برمجيات رسم البنية الكيميائية والنمذجة الجزيئية
سيناموموم كاسيا (إل.) ج. بريسل (سينامومي كورتكس)،	شركة قويتشو شانهايتونغجيا للأدوية، الصين	20240901
جهاز الطرد المركزي في إبندورف 5430 R	إبندورف، ألمانيا
السجائر التجريبية	هاربين تايهوا، الصين	20230208
جراف باد بريزم 8		برمجيات التحليل الإحصائي والرسوم البيانية
سجائر هوانغشان		تجارب السجائر البحثية للتعرض للدخان
IL-1 & بيتا؛ مجموعة ELISA	شنغهاي للتكنولوجيا الحيوية المرتبطة بالإنزيمات، الصين	E-EL-R0012c-20230522
منصة التسلسل Illumina Novaseq 6000	إلومينا، الولايات المتحدة الأمريكية
ليبيديوم أبيتالوم ويلد. (Descurainiae Semen)	شركة قويتشو شانهايتونغجيا للأدوية، الصين	20240201
Lepidium sativum L. (سائل Raphani)	شركة قويتشو شانهايتونغجيا للأدوية، الصين	20240301
ليبوبوليسكاريد (LPS)	شركة شاندونغ هوينو للأدوية، الصين	20230315
ماهونيا فورتوني (ليندل.) فيدي (فوليوم ماهونيا)	شركة قويتشو شانهايتونغجيا للأدوية، الصين	20240301
الميثانول (درجة كروماتوغرافية)	فيشر، الولايات المتحدة الأمريكية	DK745764
مطياف نانودروب ND-2000	ثيرمو ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية
بيريلا فروتيسينس (إل.) بريت. (أوراق البيريل)	شركة قويتشو شانهايتونغجيا للأدوية، الصين	20240510
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) باكس (Pseudostellariae Radix)،	شركة قويتشو شانهايتونغجيا للأدوية، الصين	20250201
فلوروميتر كيوبت 4.0	ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية
مجموعة بناء مكتبة RNA	ABclonal، الولايات المتحدة الأمريكية	RK20301-20230415
سمينا		برنامج الالتحام الجزيئي
سالفيا ميلتيوريزا Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma)	شركة قويتشو شانهايتونغجيا للأدوية، الصين	20240902
مسجل النشاط التلقائي للحيوانات الصغيرة (KW-ZF)	نانجينغ كارلفين للتكنولوجيا الحيوية، الصين
الصوديوم بنتوباربيتال	شركة شنغهاي لشراء الكواشف التجريبية، الصين	20230412
TNF-&; مجموعة ELISA	شنغهاي للتكنولوجيا الحيوية المرتبطة بالإنزيمات، الصين	E-EL-R2856c-20230522
قاعدة بيانات التصلب المتعدد للطب الصيني التقليدي (شركة شنغهاي لتقنية البروتين التطبيقي المحدودة)		قاعدة بيانات الطيف الطيفي للطب الصيني التقليدي التجاري
كاشف تريزول	ماغن، الصين	20230508
عمود UPLC BEH Amide		عمود تحليلي UHPLC قائم على أميد
عمود UPLC HSS T3		عمود تحليلي UHPLC معكوس الطور (نوع T3)
نظام Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS	ثيرمو ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية
نظام VANQUISH UHPLC-Q-EXACTIVE HF-X MS	ثيرمو ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية