يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الإنتاج السريع لريبونوكلياز SLFN14 البشري المؤتلف، والتحليل التواقيومتري، باستخدام الفوتومترية الكتلية

961 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70393

⸱

فبراير 20, 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إنتاج ريبونوكلياز SLFN14 البشري المؤتلف، وتحليله الستيكيومتري بواسطة الفوتومترية الكتلية.

الملخص

الريبونوكليازات هي فئة متخصصة من بروتينات ارتباط الحمض النووي الريبي التي تحفز انقسام الحمض النووي الريبي وتساهم في عمليات بيولوجية متنوعة بما في ذلك تنظيم الجينات. ومع ذلك، لا تزال بنية ووظيفة وتنظيم العديد من الريبونوكلياز البشري غير موصوفة جيدا بسبب تحديات إنتاج البروتينات المؤتلفة. تصف هذه الطريقة نهجا فعالا للتعبير العابر، والتنقية، والتحليل القياسي للريبونوكلياز شلافين 14 (SLFN14) البشري. تم التعبير عن SLFN14 الموسوم بالعلم المؤتلف في خلايا تعليق HEK293 وعزله باستخدام سير عمل تنقية سريع من خطوتين يتكون من كروماتوغرافيا الألفة المضادة للعلم تليها كروماتوغرافيا استبعاد الحجم منخفضة الدقة. كشف الفوتومتري الكتلي، وهو تقنية حساسة لجزيء واحد، أن SLFN14 يشكل في الظروف الفسيولوجية للملح هومويدايمر متصل بالحمض النووي الريبي الخلوي، بينما يعزز الملح العالي تفكك الحمض النووي الريبي مع الحفاظ على ترتيب الهومو دايمر. بروتين SLFN14 البشري المؤتلف الناتج مناسب للدراسات الهيكلية اللاحقة والاختبارات الكيميائية الحيوية النوعية. هذا النهج السريع لعزل البروتينات البشرية المؤتلفة وتوصيف العينات قابل للتطبيق بشكل واسع على إنتاج ريبونوكلياز ثدييات أخرى وبروتينات ارتباط الحمض النووي الريبي المخصصة للتوصيف الفيزيائي الحيوي والكيميائي الحيوي.

المقدمة

شلافين 14 (SLFN14)هو عامل تقييد مضيف للريبونوكلياز والثدييات 1,2,3 قيد الدراسة. ينتمي بروتين SLFN14 البشري إلى عائلة مكونة من ستة أعضاء من منظمات جينات SLFN، حيث يلعب أدوارا في المناعة، والنشاط المضاد للفيروسات، والحساسية الكيميائية، وتمايز الخلايا 4,5,6,7,8. لا تزال الرؤية الميكانيكية لدور منظمي جينات SLFN غير مكتملة؛ ومع ذلك، يحمل العديد من الأعضاء نشاطا من الريبونكلياز الضروري للتحكم الانتقالي 7,9. يتم تنشيط ريبونوكلياز SLFN عند تجانس البروتين، مكونة شق ربط RNA مركب ماهر في انقسام الركيزة10,11. لحماية الخلايا من الانقسام الزائف للحمض النووي الريبي، توجد معظم ريبونوكلياز SLFN بشكل رئيسي كمونومر وتنتظر التنشيط بواسطة إشارات جزيئية خاصة بكل عضو في العائلة 5,7,11,12.

مكن الإنتاج المؤتلف لجرعة SLFN14 البشرية دراسات جزيئية شاملة لهذا الريبونوكلياز الذي لم يدرس سابقا، مما وفر رؤى جديدة حول وظيفته وتنظيمه 2,13,14. لقد سرع بروتين SLFN14 المنقى في توصيف نشاط انقسام الحمض النووي الريبي المعتمد على البنية باستخدام اختبارات الانقسام في المختبر 2,14. تكشف دراسات المجهر الإلكتروني بالتجميد (cryoEM) لبروتين SLFN14 المنقى أيضا عن ترتيب متجانس SLFN14، حيث يتم تحميل الحمض النووي الريبي المزدوج إلى شق مركزي 2,13,14. تميزت التجميع الأعلى من الدرجة العليا ل SLFN14 أيضا بتقنية الفوتومترية الكتلية، وهي تقنية جزيء واحد لقياس الكتلة الجزيئية. بشكل غير متوقع، تظهر هذه التقنية الحساسة أن SLFN14 يشكل في الغالب متجانسا مقاوما للملح، لكنه يمكنه أيضا تكوين هوموتيترامر حساس للملح بوظيفة غير معروفة 2,13,14. بشكل مجتمع، كانت القدرة على الحصول على بروتين SLFN14 البشري المنقي علامة فارقة حاسمة، أتاحت رؤى جزيئية مبكرة ستغذي بلا شك مرحلة جديدة مثيرة من البحث في التحكم الانتقالي بوساطة SLFN14.

كان من الصعب تاريخيا الحصول على ريبونوكلياز SLFN14 المؤتلف باستخدام استراتيجيات إنتاج البروتين القياسية. أشار التقرير الأصلي الذي وصف النشاط الإنزيمي ل SLFN14 إلى انخفاض الإنتاجية، وانخفاض الاستقرار، وانخفاض ذوبانيته1. يتميز بروتين SLFN14 البشري بسلسلة طويلة من البولي ببتيدات، ومقاومة للماء بشكل واضح، وتسمية خلاوية تعتمد على الريبونكلياز، والتي تعيق بشكل كبير استخدام أنظمة التعبير البكتيرية التقليدية 1,13,14. ومع ذلك، توفر آليات الترجمة والمرافق المتطورة بديلا قويا ينتج بكفاءة بروتين SLFN14 بشري كامل الطول15. تم استخدام كل من أنظمة تعبير الحشرات والفيروس الباكولوفيروسي والثدييات للحصول على بروتين SLFN14 بشري كامل الطول لدراسات التجميد والاختبارات الكيميائية الحيوية 2,13,14. ومع ذلك، في بعض الحالات، تطلب بروتين SLFN14 المستخرج من الحشرات طفرات مستقرة لمنع تجمع العينات2. يرتبط توصيل الجينات بواسطة فيروس الباكولو أيضا بالتزام كبير بجهد كبير ووقت طويل يؤخر تقدم البحث15,16. من ناحية أخرى، يوفر بروتين SLFN14 المؤتلف المعزول من مضيف تعبير ثديي ميزة السرعة ويتجنب الحاجة إلى هندسة البروتينات في تحسين العينات.

تم تصميم هذه الطريقة لتوفير نهج سريع نسبيا ومنخفض الجهد لإنتاج بروتين SLFN14 البري المؤتلف المناسب للدراسات الجزيئية اللاحقة. يوفر استخدام الخلايا الثديية بيئة شبه طبيعية للحفاظ على طي البروتين بشكل صحيح دون الحاجة إلى هندسة البروتينات SLFN1413. طريقة توصيل الجينات المعتمدة على المواد الكيميائية، على عكس استراتيجية ناقل الفيروس، تسرع أيضا من الجدول الزمني للإنتاج من أشهر إلى يوم15. لموازنة التكلفة العالية نسبيا لزراعة الخلايا الثديية، تستخدم هذه الطريقة كاشف الترانسفيكشن الفعال من حيث التكلفة من البولي إيثيلينامين (PEI) وخلية الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) التي تنمو في تعليق17,18. لتقليل فقدان البروتين أثناء معالجة العينة، تستخدم هذه العملية أيضا استراتيجيات استهلاك عينات منخفضة لتنقية البروتين SLFN14 والتحليل التواقيومتري لمراقبة جودة العينة. يوفر هذا البروتوكول الذي يستمر أربعة أيام تفاصيل محددة حول كيفية أداء 1) التعبير الجيني العابر في خلايا HEK293، 2) سير عمل كروماتوغرافي من خطوتين باستخدام أعمدة الدوران، و3) تحديد قياس التسلسل البروتيني بواسطة الفوتومترية الكتلية. المنتج النهائي من هذا الإجراء هو بروتين SLFN14 من النوع البشري البري الذي يحمل علامة Myc-Flag مزدوجة الطرف C (SLFN14Myc-Flag) يمكن استخدامها في دراسات التجميد اللاحق والتوصيف الكيميائي النوعي13. يمكن تطبيق هذا النهج متعدد الاستخدامات لعزل وتوصيف بروتينات ارتباط الحمض النووي الريبي البشري الأخرى التي لم تدرس بشكل كاف، وخاصة جينات الريبونوكلياز الكبيرة والسامة للخلايا التي غالبا ما يصعب التعبير فيها بشكل مفرط في أنظمة التعبير غير المتجانسة. لذلك، يخفض هذا البروتوكول الحاجز أمام التوصيف الجزيئي الشامل للبروتيوم البشري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يجب إجراء التجارب التي تشمل زراعة الخلايا HEK293 تحت شروط السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2) وفقا لبروتوكولات السلامة الحيوية المؤسسية المعتمدة.

1. التعبير المؤقتلعلم الMyc-Flag في SLFN14 في خلايا الثدييات

  1. تضع خليا تعليق HEK293 للبذور في الثدييات بحجم 0.5 × 106 خلايا/مل في وسط نمو خال من المصل المدفأ مسبقا لحجم نهائي 320 مل في قارورة 1 لتر مهواة مع حاجز.
  2. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية، 125 دورة في الدقيقة، 8٪ ثاني أكسيد الكربون، 75-80٪ رطوبة لمدة 24-32 ساعة.
  3. تحقق من أن عدد الخلايا هو 1.2-1.8 ×10 6 خلايا/مل وأن قابلية العيش تزيد عن 90٪ باستخدام صبغة تريبان بلو وعداد الخلية19.
  4. أطلق 40 مل من الزراعة في ثمانية أنابيب مخروطية.
  5. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 20-25 درجة مئوية.
  6. تخلص من وسط النمو.
  7. أعد تعليق كل حبيبة خلوية بلطف في 38 مل من وسط نقل مصلي خالي من المصل المسخن مسبقا لحجم نهائي 304 مل.
    ملاحظة: سيتم توفير ال 16 مل المتبقية من حجم الزراعة الأصلي الموضح في الخطوة 1.1 بواسطة خليط النقل الموضح في الخطوة 1.12.
  8. انقل الخلايا إلى قارورة جديدة ذات فتحات تهوية بسعة 1 لتر.
  9. في أنبوب مخروطي، أضف 320 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي المنقى الذي يشفد جين SLFN14Myc-Flag المؤتلف، إلى 8 مل من وسط النقل الخالي من المصل وحضن لمدة 5 دقائق عند 20-25 درجة مئوية.
    ملاحظة: تركيز البلازميدات عادة ما يكون 500 نانوغرام/ميكرولتر عند حجم نهائي 640 ميكرولتر.
  10. بالتزامن مع الخطوة 1.9، أضف 960 ميكروغرام من PEI المعقم بفلتر 0.22 ميكرومتر إلى 8 مل من وسط النقل الخالي من المصل وحضن لمدة 5 دقائق عند 20-25 درجة مئوية.
    ملاحظة: عادة ما يكون حجم التخزين العامل 1 ملغ/مل عند حجم نهائي 960 ميكرولتر.
  11. أضف خليط PEI ببطء (انظر الخطوة 1.10) باتجاه النزول إلى محلول الحمض النووي البلازميدي المؤتلف (انظر الخطوة 1.9) وحضن 15 دقيقة عند 20-25 درجة مئوية.
  12. أضف ببطء 16 مل من خليط DNA/PEI بشكل إسطباقي إلى الخلايا المحضرة في الخطوة 1.8.
  13. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية، 125 دورة في الدقيقة، 8٪ ثاني أكسيد الكربون، 75-80٪ رطوبة لمدة 48 ساعة.
  14. تفريغ 40 مل من الخلايا المنقولة إلى ثمانية أنابيب مخروطية.
  15. احصد الخلايا المنقولة عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 20-25 درجة مئوية.
  16. قم بتفريغ المادة الفائقة وتخزين الحبيبات الثمانية في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. تنقية SLFN14المعاد تركيبها ذات خطوتين

  1. كروماتوغرافيا الألفة المضادة للأعلام.
    نفذ بروتوكول كروماتوغرافيا الألفة المضادة للعلم بشكل مكرر، باستخدام أربع حبيبات خلوية من الخطوة 1.16 لكل تحضير.
    1. تحضير الراتنج.
      1. توازن راتنج الأغاروز المضاد للعلم إلى 20-25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. أعد تعليق الراتنج بلطف عن طريق قلب الزجاجة مباشرة قبل نقل 40 ميكرولتر من خليط الراتنج بنسبة 50٪ إلى أنبوب ميكرو طرد مركزي بسعة 2 مل.
        ملاحظة: اقطع طرف الماصة لجمع العجينة اللزجة بسهولة.
      3. أعد تعليق الراتنج في 1 مل من محلول غسيل عالي الملح (50 ململ ثلاثي الهيدروجينيوم 7.4، 600 ملميلي NaCl، 5 ملليمولار MgCl2، 0.5 ملليمويل β-ME، 0.1٪ Tween-20).
      4. احتضن لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      5. قم بطرد مركزي بمحلول الراتنج عند 8,000 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
      6. استنشق وتخلص من محلول الغسيل عالي الملح مع الحرص على عدم إفساد الراتنج.
    2. توضيح تحليل محلل الخلايا.
      1. أعد تعليق كل حبيبة خلية منقلة ب 225 ميكرولتر من مخزن إعادة التعليق المبرد (50 ملليموتر تريس pH 7.4، 600 ملليمولار NaCl، 5 ملليمولار MgCl2، 0.5 ملليمولار β-ME، 0.5٪ تريتون-X-100، 1 ملليمولار PMSF، 5 ميكروغرام/ملليلتر ليوبيبتين، 1 ملليمولار بنزاميدين، 0.7 ميكروغرام/ملليتر بيبستاتين A، 0.25 U/mL نيوكلياز جينيوس) ليصبح الحجم الإجمالي 900 ميكرولتر عبر أربع حبيبات خلايا.
      2. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 2 مل تم تبريده مسبقا على الثلج.
      3. حضن أنبوب الطرد المركزي الدقيق أفقيا على جهاز التقطيع لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: احتفظ بكمية 20 ميكرولتر من إجمالي التحلل عند -20 درجة مئوية لحل المشكلات في حال انخفاض مستويات تعبير البروتين.
      4. قم بتوضيح محلل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 21,300 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    3. التقاط وغسل ألفة البروتين.
      1. اجمع بين الليزات الموضح (انظر الخطوة 2.1.2.4) مع راتنج مضاد للعلم المتوازن (انظر الخطوة 2.1.1.6).
      2. حضن خليط راتنج الليزات في أنبوب طرد مركزي دقيق موضوع أفقيا على جهاز نوتاتور لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      3. قم بعمل طرد مركزي لخليط راتنج الليزات عند 8000 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية لتكوين حبيبة راتنج.
      4. تخلص من حوالي 700 ميكرولتر من المادة الفائقة مع الحذر من إزعاج حبيبات الراتنج.
        ملاحظة: تخزين 20 ميكرولتر من السوبرناتانت عند -20 درجة مئوية بعد الربط بالراتنج لحل المشكلة في حال ضعف كفاءة الالتقاط.
      5. أعد تعليق خليط الراتنج الفائق المتبقي وانقل المحلول إلى عمود دوران فارغ بسعة 800 ميكرولتر تم إدخاله في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ بسعة 2 مل.
      6. قم بطرد المركزي بعمود الدوران عند 1000 × g لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من تدفق التيار الخارجي.
      7. شطف أنبوب الطرد المركزي الدقيق الفارغ من الخطوة 2.1.3.5 بسعة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل عالي الملح وانقل المحلول إلى عمود الدوران.
        ملاحظة: تساعد هذه الخطوة في استعادة أي راتنج متبقي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
      8. قم بطرد المركزي بعمود الدوران عند 1000 × g لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من تدفق التيار الخارجي.
      9. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل عالي الملح إلى عمود الدوران. قم بطرد المركزي بعمود الدوران عند 1000 × g لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من تدفق التيار الخارجي. كرر هذه الخطوة ليصل مجموع أربع غسولات عالية الملح.
      10. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل منخفض الملح (50 ملليمول ثلاثي الهيدروجينيوم 7.4، 150 ملليمولار NaCl، 5 ملليمولار MgCl2، 0.5 ملليموغل β-ME، 0.1٪ Tween-20) إلى عمود الدوران. قم بطرد المركزي بعمود الدوران عند 1000 × g لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من تدفق التيار الخارجي. كرر هذه الخطوة ليصبح المجموع غسلتين منخفضتين من الملح.
      11. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل ATP (50 ملليموتر ثلاثي الهيدروجينيوم 7.4، 150 ملليمولار NaCl، 5 ملليمولارMgCl 2، 0.5 ملليمولار β-ME، 0.1٪ Tween-20، 10 ملليمول ATP) إلى عمود الدوران. سد أسفل عمود الدوران واحتضن لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. افصل عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي عند 1000 × g لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من تدفق التيار الخارجي. كرر هذه الخطوة ليصبح المجموع أربع غسلات ATP.
      12. قم بغسل نهائي بإضافة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل منخفض الملح إلى عمود الدوران. قم بطرد المركزي بعمود الدوران عند 1000 × g لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من تدفق التيار الخارجي.
    4. استشلال البروتين بواسطة 3xFlag ببتيد.
      1. قم بمسح أسفل عمود الدوران بمسح منخفض الوبر لإزالة السائل الزائد وسد أسفل عمود الدوران.
      2. أضف 55 ميكرولتر من 3xFlag Elution Buffer (50 مللي مول ثلاثي الرقم الهيدروجيني 7.4، 150 ملليمول NaCl، 5 ملليمولار MgCl2، 0.5 ملليمولار β-ME، 0.1٪ Tween-20، 300 ميكروغرام/ملليتر 3xFlag ببتيد) مباشرة فوق الراتنج.
      3. أغلق فتحة عمود الدوران بطبقة باراغليمة ووضع العمود في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.7 مل.
      4. حضن عمود الدوران عموديا على جهاز التنوتر لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: لتثبيت عمود الدوران عموديا، قم بتركيب رف أنابيب الطرد المركزي الدقيق على المصباح باستخدام الأشرطة المطاطية.
      5. أزل البارافيلم وقم بتدوير سدادة عمود. اجمع بروتين SLFN14Myc-Flag المؤتلف المائل في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف بسعة 1.7 مل بواسطة الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
      6. احتفظ ب 50 ميكرولتر من إلوات راتنج مضاد Flag للكروماتوغرافيا الاستبعادية بالحجم اللاحق و5 ميكرولتر لتحليل SDS-PAGE.
  2. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.
    إجراء بروتوكول إزالة الكروماتوغرافيا بالحجم باستخدام محلول إزالة الملح منخفض الملح (150 ملليموتر NaCl) لتحليل بروتينMyc-Flag القياسي SLFN14 أو محلول إزالة الملح عالي الملح (500 mM NaCl) لتوصيف APO SLFN14Myc-Flag .
    1. اجمع بين راتنجين مضاد للعلم بسعة 50 ميكرولتر من الخطوة 2.1.4.6 ليصبح المجموع 100 ميكرولتر عينات.
    2. جهز عمودا لإزالة الملح بقطر 0.5 مل مع وزن جزيئي بمقدار 40 كيلو دالتون عن طريق فك الغطاء، وإزالة الإغلاق السفلي، وإدخال العمود في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 2 مل.
    3. قم بطرد المركزي بعمود إزالة الملح الدوراني عند 700 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية لإزالة محلول تخزين العمود. تخلص من تدفق المرور.
    4. أضف 300 ميكرولتر من محلول إزالة الملح منخفض أو عالي الملح (20 ملليمول ثلاثي الرقم الهيدروجيني 7.4، 150/500 ملليمولار NaCl، 1 ملليمول MgCl2، 1 ملليمول TCEP) إلى عمود إزالة الملح بالدوران. قم بطرد مركزي على عمود الدوران عند 700 × g لمدة دقيقة إلى دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من التدفق الزائد. قم بتنفيذ هذه الخطوة ثلاث مرات لتحقيق توازن كامل للعمود.
    5. قم بمسح أسفل عمود إزالة الملح بالدوران بمسح منخفض الوبر.
    6. انقل عمود إزالة الملح الدوراني إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف بسعة 1.7 مل.
    7. أضف 100 ميكرولتر من الراتنج المضاد للعلم المركب (انظر الخطوة 2.2.1) إلى مركز قاعدة العمود دون إحداث اضطراب للراتنج.
    8. يتم إخراج بروتين SLFN14Myc-Flag المؤتلف عن طريق طرد عمود إزالة الملح الدوراني عند 700 x g لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
    9. احتفظ ب 95 ميكرولتر من البروتين المؤتلف المستعاد لتوصيف الجزيئات و5 ميكرولتر لتحليل SDS-PAGE.
  3. توصيف عينة بروتين SLFN14الميكانيك-فلاج المنقى.
    1. قم بإجراء الرحلان الكهربائي الهلام للسلفات الصوديوم دوديسيل بولي أكريلاميد (SDS-PAGE).
      1. اجمع 5 ميكرولتر من 2x مخزن عينة Laemmli مع 5 ميكرولتر من العينة التي جمعت في مراحل مختلفة على طول بروتوكول التنقية.
      2. خذ عينات حرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      3. حل سلم بروتين واسع النطاق مع 10 ميكرولتر من خليط العينة-لاملي ب 4-15٪ SDS-PAGE عند 200 فولت لمدة 30 دقيقة.
      4. تخيل أحزمة البروتين عن طريق صبغ الجل بمحلول صبغة Coomassie G-250 لمدة 30 دقيقة على هزاز مداري وإزالة صبغة الجل بماء منزوع الأيونات على هزاز مداري حتى تصبح الخلفية واضحة.
      5. فحص نطاقات البروتين الناتجة للتأكد من أن العينة المستخرجة من الخطوة 2.2.9 هي شريط بروتين واحد يطابق الوزن الجزيئي النظري ل SLFN14Myc-Flag البالغ 107.5 كيلو دالتون (kDa).
    2. قم بقياس البروتين وحمض النووي باستخدام القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية/البصرية.
      1. قم بفراغ مطياف ميكرو حجم بسعة 2 ميكرولتر من محلول إزالة الملح منخفض أو عالي الملح، مع مطابقة مخزن تخزين البروتين.
      2. قس الامتصاص عند 260 نانومتر و280 نانومتر من 2 ميكرولتر من بروتين SLFN14Myc-Flag المؤتلف المستعاد (انظر الخطوة 2.2.9) باستخدام مطياف ميكروحجم.
      3. احسب تركيز بروتين SLFN14Myc-Flag المؤتلف باستخدام الامتصاص المسجل عند 280 نانومتر ومعامل انقراضه (93330 M-1 سم³) باستخدام قانون بير-لامبرت20.
      4. احسب نسبة امتصاص العينة A260/280 بقسمة قيمة الامتصاص المسجلة عند 260 نانومتر على قيمة الامتصاص المقاسة عند 280 نانومتر لتحديد ما إذا كان حمض النووي ينقي بشكل مشترك مع بروتين SLFN14Myc-Flag المؤتلف.
        ملاحظة: نسبة A260/280 فوق 0.7 تشير على الأرجح إلى وجود حمض نووي21.
    3. قم بقياس الحمض النووي الريبي الخلوي بواسطة الفلورومترية.
      1. قم بقياس محتوى الحمض النووي الريبي باستخدام 1-3 ميكرولتر من البروتين المؤتلف المستعاد من الخطوة 2.2.9 باستخدام صبغة فلورية عالية الحساسية خاصة بالحمض النوويالريبي 22.

3. تحليل كتلة جزيئية SLFN14Myc-Flag بواسطة الفوتومترية الكتلية

  1. إعداد جهاز قياس الكتلة الفوتومترية.
    1. شغل الليزر باستخدام المفتاح الموجود خلف صندوق الإلكترونيات في مقياس الكتلة الضوئي.
    2. شغل جهاز العزل واضغط على زر "العزل" لتقليل اهتزازات الأجهزة.
    3. افتح برنامج AcquireMP.
    4. انتظر ساعة واحدة حتى يصل الجهاز إلى التوازن الحراري.
  2. تحضير شريحة الغلاف.
    1. أمسك شريحة غطاء زجاجي في وضع عمودي باستخدام ملقط ذو طرف ناعم.
    2. اشطف جانبي شريحة غطاء الزجاج بماء فائق النقي من النوع الأول متبوعا بكحول الأيزوبروبيل. كرر هذه الخطوة ليصبح المجموع ثلاث مرات.
    3. اشطف كل جانب من شريحة غطاء الزجاج للمرة الأخيرة بماء فائق النقي من النوع الأول لمدة 45 ثانية.
    4. قم بإزالة قطرات الماء الزائدة من شريحة غطاء الزجاج بلطف عن طريق الشفط باستخدام رأس ماصة نظيف متصل بخط تفريغ.
    5. خزن شريحة الغطاء الزجاجي النظيف في صندوق بلاستيكي مبطن بورق العدسات لنقلها إلى مقياس الكتلة الضوئي.
  3. قم بتركيب شريحة الغطاء على الآلة.
    1. ضع حشية سيليكون ذات 6 آبار على أداة محاذاة المعادن باستخدام ملقط ذو طرف ناعم.
    2. ضع شريحة غطاء الزجاج النظيف من الخطوة 3.2.5 فوق حشية السيليكون واستخدم ملقط الطرف الناعم للضغط برفق حول حشية السيليكون.
      ملاحظة: لا تطبق ضغطا على آبار العينة.
    3. ضع قطرة من زيت الغمر على عنك مقياس الكتلة الضوئي.
    4. اقلب شريحة غطاء الزجاج بحيث يكون حشية السيليكون متجهة للأعلى وضع شريحة غطاء الزجاج برفق على العين باستخدام ملقط طريف ناعم.
    5. ثبت الزوايا العلوية اليسرى والسفلى اليمنى لشريحة غطاء الزجاج باستخدام المغناطيس.
    6. تحت التحكم الجانبي، اختر البئر العلوي الأيسر في برنامج AcquireMP لمحاذاة الليزر مع مركز البئر.
  4. تحليل معايير البروتين ذات النطاق الواسع.
    1. تحضير محلول معاير واسع النطاق 50 مرة (90 كيلو دالتون إلى 1 ميداليا) عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من مخزون معاير 500x إلى 9 ميكرولتر 1x محلول فوسفات-محلول ملحي.
    2. جهز مخزون عمل معاير 5x عن طريق دمج 2 ميكرولتر من محلول معاير واسع النطاق 50x من الخطوة 3.4.1 إلى 18 ميكرولتر 1x محلول فوسفات مخزن.
    3. أضف 10 ميكرولتر من محلول إزالة الملح منخفض أو عالي المصفى بعمق 0.22 ميكرومتر إلى البئر الفارغ.
      ملاحظة: من المهم مطابقة المخزن المؤقت المصفى في هذه الخطوة مع المخزن المؤقت المستخدم لتحضير عينة SLFN14Myc-Flag في الخطوة 2.2.9.
    4. أغلق الغطاء.
    5. تحت خيار البحث عن التركيز، انقر على "تخفيف القطرات" في برنامج AcquireMP لتحديد التركيز الصحيح لبئر العينة.
    6. أضف 10 ميكرولتر من مخزون العمل المعاير 5x إلى قطرة المخزن (انظر الخطوة 3.4.3) وارفع وأسفل بلطف لخلط المحلول.
    7. أغلق الغطاء.
    8. افحص إعدادات الجهاز للتأكد من أن قيم الحركة والإشارة والتشبع والحدة مستقرة ومثالية.
      ملاحظة: القيم المثلى ستظهر باللون الأزرق، والقيم الشاذة ملونة بالبرتقالي.
    9. انقر على "تسجيل" في برنامج AcquireMP لتسجيل فيديو مدته 60 ثانية.
    10. احفظ ملف النتائج (.mpr) مع عنوان وصفي وطابع زمني.
  5. أنشئ منحنى معايرة.
    1. افتح برنامج DiscoverMP.
    2. تحت القياسات، انقر على زر "+ فتح" وانتقل إلى ملف النتائج المعايرة من الخطوة 3.4.10.
    3. انقر مرتين على ملف معايير البروتين المدرج لعرض النتائج.
    4. تحت تكوين الرسم البياني، اضبط حدود التباين إلى 0.00000 و -0.03000 على التوالي.
    5. حدد يدويا منحنى غاوسي لأول أربع قمم بروتين قياسية عن طريق سحب المؤشر عبر كل قمة فردية.
    6. انقر على "إنشاء" واختر "معايرة الكتلة".
    7. تحت رأس المعايرة، قم بتعيين كل قمة معايرة مجهزة من الخطوة 3.5.5 إلى كتلتها الجزيئية المعروفة 86، 172، 258، و344 كيلو دالتون على التوالي.
    8. تحقق من أن منحنى المعايرة يحتوي على R2 قريب من 1.0 وأقصى خطأ كتلي (MME) أقل من 2٪.
    9. انقر على "تأكيد المعايرة" واحفظ ملف منحنى المعايرة (.mc).
      ملاحظة: يجب إعادة معايرة مقياس الكتلة كل ساعة.
  6. تحليل بروتينعلم الفطر SLFN14 المؤتلف في ظروف منخفضة وعالية الملح.
    1. تحضير محلول 50 ميكرولتر من بروتين SLFN14Myc-Flag المؤتلف بحجم 50 نانومتر (انظر الخطوة 2.2.9) باستخدام محلول إزالة الملح منخفض الملح لتحليل العينة القياسي تحت ظروف الملح الفسيولوجية أو محلول إزالة الملح عالي الملح لتوصيف عينات بروتين APO.
    2. قم بالطرد المركزي بخليط بروتين SLFN14Myc-Flag المؤتلف بطول 50 نانومتر بوزن 21,300 x جرام لمدة 10 دقائق عند 20-25 درجة مئوية لإزالة تجمع البروتين والغبار المحتمل.
    3. تحت التحكم الجانبي، انقر على "البئر التالي" في برنامج AcquireMP.
    4. قم بتحميل 10 ميكرولتر من محلول إزالة الملح منخفض أو عالي المصفى بحجم 0.22 ميكرومتر داخل البئر وأغلق الغطاء.
      ملاحظة: من المهم مطابقة المخزن المؤقت المصفاة في هذه الخطوة مع المخزن المستخدم لتحضير تخفيف عينةMyc-Flag في SLFN14 في الخطوة 3.6.1.
    5. تحت خيار البحث عن التركيز، انقر على "تخفيف القطرات" لتحديد التركيز الصحيح لبئر العينة الجديدة.
    6. حمل 10 ميكرولتر من محلول بروتين SLFN14Myc-Flag المؤتلف بحجم 50 نانومتر من الخطوة 3.6.2 إلى قطرة المخزن واستخدم الماصة بلطف لخلط العينة.
    7. أغلق الغطاء وتأكد من إعدادات الآلة المثلى كما هو موضح في الخطوة 3.4.8.
    8. انقر على "تسجيل" في برنامج AcquireMP لتسجيل فيديو مدته 60 ثانية.
      ملاحظة: يتم تحقيق دقة كتلة مثلى من فيديو مدته 60 ثانية مع حوالي 1000-4000 عد إجمالي.
    9. احفظ ملف النتائج (.mpr) مع عنوان وصفي وطابع زمني.
  7. احسب الكتلة الجزيئية والقياس القياسي لبروتينMyc-Flag المؤتلف SLFN14.
    1. تحت القياسات داخل برنامج DiscoverMP، انقر على زر "+ فتح" لاختيار ملف النتائج من الخطوة 3.6.9.
    2. تحت المعايرة، انقر مرتين على ملف منحنى المعايرة الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.5.9 لتطبيق المعايرة.
    3. حدد منحنى غاوسي يدويا لكل نوع منأنواع Myc-Flag من SLFN14 مرصود عن طريق سحب المؤشر عبر كل قمة للحصول على قيمة كتلة جزيئية محسوبة.
    4. احسب متوسط الكتلة الجزيئية لكل نوع قليغومري من ثلاث قياسات مستقلة، مع الانحراف المعياري المقابل لها.
    5. تحديد القياس الجزئي لبروتين SLFN14Myc-Flag المؤتلف، من خلال تقييم متوسط الكتلة الجزيئية المحسوبة مع أعداد صحيحة للقيمة النظرية للكتلة لبروتومر SLFN14Myc-Flag .
      ملاحظة: الكتلة النظرية لمونومر SLFN14Myc-Flag هي 107.5 كيلو دالتون، والدايمر 215 كيلو دالتون، والترايمر 322.5 كيلو دالتون، والرباعي 430 كيلو دالتون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم توضيح ناقل ثديي مصمم للتعبير الجيني العابر لبروتين SLFN14Myc-Flag البشري المؤتلف الكامل في الشكل 1. يصور سير عمل التنقية المكون من خطوتين عزل بروتين SLFN14Myc-Flag من خلايا HEK293 (الشكل 2A). يظهر جل التغيير التمثيلي الناجح لبروتين SLFN14Myc-Flag المنقى في الشكل 2B. تعتمد خطوة كروماتوغرافيا الألفة على التفاعل الانتقائي والعالي الألفة بين علامة العلم في طرف C من S...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تؤكد عدة خطوات حاسمة على أداء ومرونة بروتوكول إنتاج البروتين هذا. لتعظيم إنتاج البروتينات المؤتلفة، نستخدم خلايا HEK293 التي تمتص بشكل عال للحمض النووي البلازميدي الأجنبي ويمكن زراعتها معلقة لتعظيم كثافة الخلايا عبر الوسط المحجم23. يستخدم كاشف النقل الحيوي PEI في هذا البروتوكول واسع النطاق لنقل الجينات لأنه يمكنه تحقيق كفاءة نقل عالية وبتكلفة منخفضة نسبيا مقارنة بالكواشف الشائعةالأخرى 17. يتم حضن الخلايا المنقولة لفترة قصيرة للسماح بفرط الت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر أعضاء مختبر بيلون على قراءتهم النقدية لهذه المخطوطة. وقد حظي هذا العمل بدعم من برنامج البحوث الخارجية للمعهد الوطني للصحة الأمريكي، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS؛ R35GM147123 إلى M.C.P.) وتم تحويلها إلى كلية بايلور للطب ونقلها إلى جامعة ولاية نيويورك في بوفالو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-ميركابتوإيثانول (b-Me)سيغماM3148-500ML14.3 مليون محلول توك
AcquireMP 2024 R2ريفين/برامج اكتساب البيانات
أدينوسين-5'-ثلاثي الفوسفات ثلاثي هيدرات ملح الصوديوم (ATP)كيم-إمبكس إنترناشونال00015-100Gقم بضبط المحلول إلى درجة الحموضة 7.0
جل الألفة M2 المضادة للعلمميليبورA2220راتنج مضاد للأعلام
هيدرات هيدروكلوريد البنزاميدينسيغماB6506-25Gمثبط البروتين
معايير البروتين واسعة النطاق (10-250 كيلو دالتون)بيو-رادP7719Sمعايير البروتين الملون مسبقا
الكونتيسة 3إنفيتروجينA49862عداد الخلايا الآلي
ديسكفر إم بي v2024 R2ريفين/برنامج تحليل البيانات
محلول دولبيكو الملحي المخزن بالفوسفاتكورنينغ21-031-CVمخزن محلول 1x
ببتيد DYKDDDDKثيرمو فيشر العلميA368053xFlag ببتيد
خلايا فريستايل 293-Fثيرمو فيشر العلميR79007خلايا التعليق الثديية
قدم ملف Geniust M nuclease DMFسانتا كروزSC-391121Bالنيوكلياز الشامل
هايكلون CDM4HEK293 الإعلامسيتيفاSH3085802وسط نمو خال من المصل
وسائط HyClone SFM4Transfx-293سيتيفاSH3086002وسط النقل العابر
إيمرسول 518Fزايس4Y00-R0DY-1007-3BF3زيت الغمر
كحول الأيزوبروبيلماكرون فاين للكيميكاويات3032-02
مخزن عينات Laemmliبيو-راد1610737مخزن 2x محلول
ليوبتينVWRJ580-25MGمثبط البروتين
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)فيشر ساينتيفكM33-500
ماس فيرنس P1 ريفينMP-CON-41033مخزون معاير 500x
مجموعة تحضير عينات MassGlass UCريفينMP-CON-21022السلايد والحشية
عمود الدوران الحيوي الدقيقبيو-راد7326204عمود دوران بولي بروبيلين فارغ
نظام Milli-Q IQ 7000ميليبورZIQ7000T0Cالماء فائق النقاء من النوع الأول
جل ميني-بروتيان TGX الخالي من البقعبيو-راد45680864-15٪ صفحة SDS
مينيترون مع رطوبة وتبريد وثاني أكسيد الكربونإنفورز72175هزاز الحاضنة
مجموعة محاذاة MPريفينMP-CON-21019أداة محاذاة، ملقط ذو طرف ناعم، مغناطيس
النانوفوتوميترImplenNP80مطياف الفوتومتري للأشعة فوق البنفسجية
ناتاتوركلاي آدامز براند421105
الببستاتين Aسانتا كروزSC-45036Bمثبط البروتين
فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)منتجات البحث الدوليةP20270-25.0مثبط البروتين
قارورة هز البولي كربونات  دوران ويتون كيمبلWPFBC1000Sقارورة قاعدة محشورة مهواة
بوليثيلينيمين (PEI) ميغاواط 40,000العلوم متعددة24765كاشف النقل
فلوروميتر الكيوبت 4ثيرمو فيشر العلميQ33226
مجموعة اختبار الحساسية عالية الحساسية للحمض النووي الريبي الكيوبتثيرمو فيشر العلميس32852القياس باستخدام صبغة خاصة بالحمض النووي الريبي
سيمبلي بلو سيفستينثيرمو فيشر العلميLC6065كومسي G-250
الحمض النووي للبلازميدات للتعبير SLFN14أوريجينRC226257نسخة ORF موسومة ببشرية
كلوريد الصوديوم (NaCl)ميليبور1.37017
تريس، الرقم الهيدروجيني 7.4ثيرمو فيشر العلميJ60202. K2مخزن محلول مخزن بحجم 1 متر
هيدروكلوريد الفوسفين تريس (2-كربوكسي إيثيل) (TCEP)تكنولوجيا الذهب الحيويةTCEP10TCEP
ترايتون X-100VWRM143-1Lالمنظف
صبغة ترايبان الزرقاءثيرمو فيشر العلميT102820.4٪ أسهم الحلول
20 سنةVWR0777-1Lالمنظف
تو إم بيريفينMP-PRO-00001فوتوميتر الكتلة
عمود زيبا 40K ديسالتينثيرمو فيشر العلميA57759كروماتوغرافيا استبعاد الحجم

المراجع

  1. Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes. Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).
  2. Li, M., et al. Human schlafen 14 cleavage of short double-stranded rnas underpins its antiviral activity. Adv Sci (Weinh). 12 (37), e01727(2025).
  3. Seong, R. K., et al. Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication. Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).
  4. Jo, U., Pommier, Y. Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins. Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).
  5. Lee, S., et al. Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death. Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).
  6. Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies. Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).
  7. Zhang, P., et al. Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA. Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).
  8. Li, M., et al. Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11. Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).
  9. Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner. Viruses. 16 (4), (2024).
  10. Metzner, F. J., et al. Mechanistic understanding of human slfn11. Nat Commun. 13 (1), 5464(2022).
  11. Garvie, C. W., et al. Structure of pde3a-slfn12 complex reveals requirements for activation of slfn12 rnase. Nat Commun. 12 (1), 4375(2021).
  12. Kugler, M., Metzner, F. J., Witte, G., Hopfner, K. P., Lammens, K. Phosphorylation-mediated conformational change regulates human slfn11. Nat Commun. 15 (1), 10500(2024).
  13. Van Riper, J., et al. Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage. Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).
  14. Luo, M., et al. Structural and functional characterization of human slfn14. Nucleic Acids Res. 53 (10), (2025).
  15. Schellenberg, M. J., Maheshwari, S., Pillon, M. C. Encyclopedia of cell biology. Vol. 1, Elsevier. 57-73 (2022).
  16. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system. J Vis Exp. (173), e62510(2021).
  17. Ojha, R., Timin, E., Szirovicza, L., Xu, W., Hepojoki, J. A systematic comparison of in-house prepared transfection reagents in the delivery of mrna or DNA to a wide range of cultured cells. J Biol Chem. 301 (12), 110742(2025).
  18. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension. J Vis Exp. (106), e53568(2015).
  19. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biol Proced Online. 19, 8(2017).
  20. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4 (11), 2411-2423 (1995).
  21. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  22. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the qubittm rna hs assay using rna spike-in. BMC Mol Biol. 16, 9(2015).
  23. Swiech, K., et al. Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii. BMC Biotechnol. 11, 114(2011).
  24. Gu, J., et al. Correction: Advances in the structures, mechanisms and targeting of molecular chaperones. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 117(2025).
  25. Bernhard, H., et al. Structural basis of spliced leader rna recognition by the trypanosoma brucei cap-binding complex. Nat Commun. 16 (1), 685(2025).
  26. Lai, S. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  27. Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
  28. Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev. Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).
  29. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).
  30. Carrasco-Zanini, J., et al. Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome. Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).
  31. Adhikari, S., et al. A high-stringency blueprint of the human proteome. Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).
  32. Liao, J. Y., et al. Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).
  33. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. Rna-binding proteins in human genetic disease. Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).
  34. Poodts, J., et al. Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system. Viruses. 14 (12), (2022).
  35. Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Methods. 147, 40-49 (2018).
  36. Shi, X., Jarvis, D. L. Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إنتاج البروتين المؤتلفالبروتينات الرابطة للحمض النووي الريبوزي (RNA)خلايا HEK293 المعلقةكروماطوغرافيا الألفةكروماطوغرافيا الاستبعاد الحجميقياس اتحادية البروتينهلام SDS-PAGEالتوصيف الكيميائي الحيوي
الإنتاج السريع لريبونوكلياز SLFN14 البشري المؤتلف، والتحليل التواقيومتري، باستخدام الفوتومترية الكتلية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.