مقالة بحثية

تقييم بيوفيغم مقارن في المختبر على أسطح حمض بوليلاكتيك ثلاثية الأبعاد والبولي إيثيلين تيريفثالات المعدلة بالجليكول

DOI:

10.3791/70394

⸱

أبريل 3, 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory of Emerging Infectious Diseases, School of Medicine, Pontifícia Universidade Católica do Paraná

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقيم هذه الدراسة تكوين الغشاء الحيوي على حمض البولي لاكتيك المطبوع ثلاثي الأبعاد (PLA) والبولي إيثيلين تيريفثالات جليكول (PETG) باستخدام نماذج ثابتة وشبه ثابتة وديناميكية في المختبر . تدعم هذه المنهجية تطوير الأجهزة الطبية الأكثر أمانا وتطور أبحاث الأغشية الحيوية في المواد الحيوية المطبوعة ثلاثية الأبعاد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد سرعت الطباعة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) تطوير الأجهزة الطبية المخصصة، لكن تكوين الأغشية الحيوية على المواد المطبوعة لا يزال يشكل تهديدا كبيرا لسلامة وأداء الزرعات. نظرا لأن كيمياء المواد وخصائص السطح المعتمدة على الطباعة يمكن أن تؤثر على التصاق البكتيريا وتحملها للمضادات الحيوية، هناك حاجة إلى نهج موحدة في المختبر تتيح مقارنات ذات معنى بين البوليمرات المستخدمة عادة في الطباعة ثلاثية الأبعاد. هنا، نقارن تطور الأغشية الحيوية على حمض البولي لاكتيك (PLA) والبولي إيثيلين تيريفثالات جليكول (PETG) باستخدام إطار تقييم متعدد النماذج في المختبر يلتقط الجوانب التكميلية لبيولوجيا الأغشية الحيوية، بما في ذلك الالتصاق المبكر، والنضج، والتحمل لمضادات الميكروبات، تحت ظروف الكهرباء الساكنة والتدفق. تم تحديد وتقييم الأغشية الحيوية S. aureus باستخدام نقاط النهاية الكمية (الحمل البكتيري القابل للحياة وتركيز الحد الأدنى من القضاء على الأغشية الحيوية [MBEC]) والنوعية (المجهر الإلكتروني الماسح). دعم كل من PLA وPETG تكوين الأغشية الحيوية عبر النماذج؛ ومع ذلك، كان PLA يميل إلى إظهار التصاق مبكر أعلى وكثافة أغشية حيوية أكبر. في الاختبارات الثابتة، أظهر PLA قيم CFU أعلى من PETG، بينما كانت قيم MBEC للفانكومايسين متشابهة بين المواد. لوحظت فروق تعتمد على الاختبارات في MBEC عبر المنصات، مما يؤكد كيف يمكن لبنية النموذج أن تؤثر على القابلية الظاهرة لمضادات الميكروبات. تحت التدفق الديناميكي، زاد عبء الغشاء الحيوي مقارنة بالظروف الثابتة، مع اختلافات تعتمد على المادة بشكل طفيف. تسلط هذه النتائج مجتمعة الضوء على قابلية كلا البوليمرين لتكون الأغشية الحيوية وتظهر قيمة إطار متعدد النماذج لتقييم سلوك الأغشية الحيوية المرتبط بالمواد وقياس أداء المضادات الميكروبية على الركائز ذات الطباعة ثلاثية الأبعاد ذات الأجهزة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدت التطورات الحديثة في الطباعة ثلاثية الأبعاد إلى تزايد اعتماد الأجهزة الطبية المطبوعة ثلاثية الأبعاد بسبب فعاليتها من حيث التكلفة، ودقتها العالية، وتصميمها الهيكلي المعقد، والاستخدام الفعال للمواد، وتصميمها المخصصللمريض 1,2. تدفع هذه التطورات تقدما سريريا كبيرا في تطوير زرعات العظام المخصصة 3,4,5,6، والجمجمة والوجه 7,8، والأسنان 1,9، والعمود الفقري10,11.

تسمح العديد من التقنيات والمواد الآن بالتحكم الدقيق في معايير التصميم، مما يجعل من الممكن تحسين خصائص السطح وتعزيز الوظائف العامة للجهاز 2,12,13. سطح الزرعة مهم للغاية، لأنه يعمل كواجهة رئيسية مع بيئة المضيف ويؤثر على الاستجابات المناعية، والالتصاق البكتيري، ودمج الأنسجة—وهي عوامل أساسية لأداء الجهاز على المدى الطويل14،15. ومع ذلك، فإن هذه الواجهة نفسها تشكل تحديا كبيرا، حيث يمكن أن تؤدي العدوى المرتبطة بالأجهزة الطبية القابلة للزرع إلى مضاعفات شديدة وغالبا ما يصعب علاجها بسبب قدرة الممرضات على تكوين الأغشية الحيوية المتصلة على السطح 16,17,18,19.

في هذا السياق، يمثل اختبار النماذج البيوفيلم في المختبرات على المواد المخصصة لتصنيع الأجهزة الطبية القابلة للزرع خطوة أساسية في عملية تقييم المخاطر وتطوير المنتج.20. تمكن هذه الاختبارات من دراسة قابلية المادة للالتصاق الميكروبي، وتكوين الغشاء الحيوي، ونضجها، بالإضافة إلى تقييم فعالية استراتيجيات مضادات الميكروبات أو التعديلات السطحية التي تهدف إلى منع نمو الميكروبات.

قيد إضافي للعديد من اختبارات الغشية الحيوية في المختبر هو أنها غالبا ما تجرى على ركيزة واحدة موحدة (غالبا بوليمر واحد أو مادة مختبرية عامة)، بافتراض ضمني أن النتائج قابلة للنقل عبر مواد الجهاز21. وهذا يمثل مشكلة في الأجهزة الطبية المطبوعة ثلاثية الأبعاد، حيث يمكن أن تختلف كيمياء البوليمرات وخصائص السطح المعتمدة على التصنيع بشكل كبير وقد تؤثر مباشرة على التصاق البكتيريا، ونضج الأغشية الحيوية، وتحملها للمضادات الميكروبية22. وبالتالي، فإن تقييم سلوك الغشاء الحيوي على البوليمرات الفعلية المستخدمة في التصنيع، بدلا من الاستنتاج من ركيزة مرجعية واحدة، يعالج فجوة مهمة في ممارسة الاختبار الحالية.

نظرا لأن سطح الزرعة هو الواجهة الرئيسية مع المضيف، فإنه يؤثر بشكل كبير على التصاق البكتيريا وتكوين الأغشية الحيوية، مما يدعم العديد من العدوى المرتبطة بالجهاز وفشل العلاج. افترضنا أن الميكروفونات المطبوعة ثلاثية الأبعاد المستخدمة عادة تختلف في قدرتها على دعم تطور الغشاء الحيوي في S. aureus وفي قابليتها للقضاء على الأغشية الحيوية بوساطة الفانكومايسين. وبناء عليه، أجرينا تقييما نوعيا وكميا لتكون الأغشية الحيوية على نماذج المواد المطبوعة ثلاثية الأبعاد. في هذه الدراسة، تم إجراء تقييم نوعي وكمي لتكوين الأغشية الحيوية على نماذج المواد المطبوعة ثلاثية الأبعاد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التعامل مع جميع المواد الكيميائية الخطرة (مثل الجلوتارالديهايد، ومحلول كاكوديلات الصوديوم، والهيكسام ميثيلديسيلازان [HMDS]، والإيثانول) وفقا لسياسات الصحة والسلامة البيئية (EHS) المؤسسية. تم تحضير واستخدام الكواشف المتطايرة/السامة باستخدام غطاء بخار كيميائي معتمد مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، واقيات العين، وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية)، وتم إبعاد المذيبات القابلة للاشتعال عن مصادر الإشعال. تم فصل النفايات الكيميائية وجمعها في حاويات معلمة بشكل صحيح (بما في ذلك نفايات مخصصة تحتوي على الزرنيخ للكاكوديلات، ونفايات مذيبات لأنظمة HMDS/الإيثانول) للتخلص منها من خلال برنامج النفايات الخطرة المؤسسي. تم تطهير المواد الخطرة البيولوجية (المزارع البكتيرية، الأطباق الملوثة، والمواد القابلة للتخلص مرة واحدة) وفقا لإجراءات السلامة الحيوية (مثل التعقيم أو المطهرات المعتمدة) قبل التخلص منها، وتم إجراء أي تعقيم بأكسيد الإيثيلين وفقا لبروتوكولات المنشأة المعتمدة وممارسات التهوية المطلوبة.

نماذج مطبوعة ثلاثية الأبعاد
تم تصميم النماذج باستخدام برامج تصميم مجانية بمساعدة الحاسوب وطباعتها باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد مزودة بتقنية نمذجة الترسيب المنصهر، مع خيوط بقطر 1.75 مم من حمض البولي لاكتيك (PLA) والبولي إيثيلين تيريفثالات جليكول (PETG) (جدول المواد). كانت معايير الطباعة المستخدمة في تصنيع العينات كما يلي: سرعة حركة الفوهة (0.4 مم) 1800 مم/دقيقة؛ سرعة الطبقة الأولى 300 مم/دقيقة؛ درجة حرارة الفوهة عند البثق 220 درجة مئوية (PLA) و255 درجة مئوية (PETG)؛ درجة حرارة السرير 60 درجة مئوية؛ ارتفاع الطبقة 0.08 مم؛ عرض البثق 0.48 مم و؛ كثافة الحشو 100٪ لجميع العينات. لم تتطلب أي من العينات استخدام هياكل دعم. تكونت النماذج ثلاثية الأبعاد من أقراص، وألواح ذات قاع مسطح، وجهاز كالغاري بيوفيلم (CBD)، وجهاز روبينز المعدل (MRD). تم تصميم الأقراص كأسطوانة بقطر 6 مم × 6 مم (ارتفاع).

بالنسبة لل CBD، تم إنشاء نموذج (جدول المواد). تكون CBD من جزأين: لوحة قاعدة، ولوحة ميكروتيتر قياسية ب 96 بئر (صيغة ANSI/SLAS)، وغطاء (صفيحة دبابية): غطاء بوليمر (PLA أو PETG) يحتوي على 96 وتدا أسطوانيا بقطر 2 مم و5 مم (ارتفاع). تم تطوير MRD بدبابيس بقطر 4 مم (قطر وارتفاع) مثبتة في نموذج لولبي (جدول المواد). بعد الانتهاء من عملية الطباعة، تمت إزالة النماذج بعناية من لوحة البناء، وفحصها بصريا بحثا عن أي تشوهات، ثم تعقيم بأكسيد الإيثيلين.

نموذج القرص للغشاء الحيوي الثابت
تم استخدام هذه الطريقة لتحفيز تكوين الغشاء الحيوي على PLA باستخدام الأقراص الأسطوانية 6 مم ×6 مم 23 الموصوفة سابقا (الشكل 1).

figure-protocol-1
الشكل 1: أقراص PLA وPETG ولوحة ب 24 بئر لتكوين الأغشية الحيوية على نماذج هذه الأقراص. (أ) أقراص PLA وPETG مطبوعة ثلاثية الأبعاد ممثلة قبل التلقيح البكتيريا وتكوين الأغشية الحيوية. (ب) أقراص PLA وPETG موضوعة في صفيحة ب 24 بئرا أثناء تحفيز الأغشية الحيوية تحت ظروف الزراعة المختبرية . الاختصارات؛ PLA = حمض بولي لاكتيك؛ PETG = بولي إيثيلين تيريفثالات غليكول معدل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تخزين S. aureus عند −80 درجة مئوية في مرق الصويا التريبتي (TSB) مع مكمل 15٪ جلسرول، وقبل كل تجربة، تم زراعته على الأجار الدموي وحضانه لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم إعادة تعليق مستعمرة معزولة في 10 مل من TSB مع تغذية 50 مللي مولار جلوكوز، وأضيفت إلى أنبوب مخروطي بسعة 50 مل، وحضنتها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في هزاز مداري بسرعة 120 دورة في الدقيقة. تم طرد مركزي الزراعة الناتجة لمدة 5 دقائق عند 200 × جم، وتم التخلص من المادة الفائقة. تم غسل الحبيبة ثلاث مرات بكمية 10 مل من المحلول المعقم بنسبة 0.9٪ NaCl. في الخطوة النهائية للغسل، تم إعادة تعليق الحبيبة في 10 مل من TSB طازج للحصول على تعليق بكتيري بعكارة تعادل معيار ماكفارلاند 0.5 (حوالي 1.5 ×10 8 CFU/mL)، كما تم تحديده بواسطة القياس النفيلومتري. ثم تم تخفيف التعليق بنسبة 1:10 في 10 مل من TSB في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل لتحقيق تركيز بكتيريا نهائي يبلغ 107 CFU/mL. في التجارب على الأقراص، أضيف 2 مل من التعليق البكتيري السابق إلى كل بئر من صفائح 24 بئر معقمة لتغطية كل مجموعة من الأقراص (PLA وPETG) لمدة ساعتين للسماح بالالتصاق الخلوي. ثم تم نقل الأقراص بشكل معقم باستخدام ملقط معقم إلى صفيحة معقمة جديدة تحتوي على 2 مل من 0.9٪ NaCl لإزالة الخلايا العوالية. تمت إضافة 10 مل من TSB طازجة إلى الآبار، وتم حضن الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. خلال هذه الخطوة، تكون الخلايا الملتصقة بأسطح القرص طبقة حيوية. بعد الحضانة، تم استنشاق وسط الزراعة، وغسلت الأقراص ب 2 مل من 0.9٪ NaCl لإزالة الوسط المتبقي والخلايا غير الالتصقة. تم تجهيز صفيحة ب 24 بئر تحتوي على 1 مل من محلول الفانكومايسين عند تخفيف تسلسلي (2–4,096 ملغ/لتر)، وتم غمس الأقراص لمدة 24 ساعة. تم تضمين مجموعة ضابطة بدون فانكومايسين (NaCl 0.9٪). بعد 24 ساعة، تم غسل الأقراص ب 2 مل NaCl بنسبة 0.9٪.

لقياس البكتيريا الملتصقة على الأقراص، تم نقل كل قرص باستخدام ملقط معقم إلى أنبوب دقيق يحتوي على 1 مل من NaCl معقم بنسبة 0.9٪ وتم سوتيكه في حمام فوق صوتي لمدة 15 دقيقة عند 40 كيلوهرتز و37 درجة مئوية لفصل الخلايا الملتصقة. تم تدوير الأنابيب الدقيقة لمدة 60 ثانية لضمان تفكيك كامل لمجموعات الخلايا. تم طلاء 100 ميكرولتر من العينة غير المخففة (10°) و10⁻2 و10⁻4 في NaCl معقم بنسبة 0.9٪ على TSA وحضانها لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 °م. تم قياس نمو البكتيريا عن طريق عد CFU على لوحة ويعبر عنها كCFU/mL.

ألواح ذات 24 بئرا مسطحة القاع لتركيز أقل قدر ممكن من القضاء على الأغشية الحيوية
في التجارب على ألواح 24 بئرا، أضيف 3 مل من التعليق البكتيري (المحضر كما هو موضح أعلاه) إلى كل بئر لمدة ساعتين للسماح بالالتصاق الخلوي بشكل كاف. بعد ذلك، تم استنشاق التعليق البكتيري، وأضيف 3 مل من NaCl المعقم بنسبة 0.9٪ لإزالة الخلايا العوالقة. ثم أضيف 3 مل من TSB طازجة، وتم حضن الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. خلال هذه الخطوة، تشكل الخلايا الملتصقة بأسطح الآبار طبقة حيوية. بعد الحضانة، تم استنشاق TSB، وغسلت الآبار ب 3 مل من NaCl بنسبة 0.9٪ لإزالة الخلايا المتوسطة المتبقية والخلايا غير الملتصقة. تمت إضافة 3 مل من محلول الفانكومايسين عند التخفيف التسلسلي (2–4096 ملغ/لتر) إلى كل بئر. تم تضمين مجموعة ضابطة بدون فانكومايسين (NaCl 0.9٪).

بعد 24 ساعة، تم إزالة المحلول، وغسل كل بئر بلطف مرتين بسعة 3 مل من 0.9٪ NaCl. تمت إضافة ثلاثة ملليلتر من 0.9٪ NaCl إلى كل بئر، وتم تغطية اللوحة وإغلاقها بطبقة بارافيلم، ثم تم تثبيتها في حمام فوق صوتي لمدة 15 دقيقة عند 40 كيلوهرتز و37 درجة مئوية لفصل الفيلم الحيوي الملتصق. تم جمع أليكوت بمقدار 100 ميكرولتر من الآبار، وتم طلاء العينة غير المخففة (10°) وتخفيفات 10⁻2 و10⁻4 المحضرة في NaCl معقم بنسبة 0.9٪ على TSA وحضنتها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم تم قياس نمو البكتيريا عن طريق عد CFU/mL. تم إجراء جميع التجارب على ثلاث نسخ. تم تعريف الحد الأدنى من تركيز القضاء على الأغشية الحيوية (MBEC) بأنه تقليل لا يقل عن 3 log10 مقارنة بمجموعة الضابطين (الشكل 2).

figure-protocol-2
الشكل 2: ألواح مطبوعة ب 24 بئرا. (أ)ألواح ذات 24 بئر مطبوعة ب PLA. (ب)ألواح ذات 24 بئر مطبوعة ب PETG. الاختصارات؛ PLA = حمض بولي لاكتيك؛ PETG = بولي إيثيلين تيريفثالات غليكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

جهاز الأغشية الحيوية في كالغاري
يتكون CBD من صفيحة ميكروتيتر بسعة 96 بئر وغطاء يحتوي على 96 دبابة، كل واحدة مصممة لتناسب بدقة داخل البئر عند وضع الغطاء على اللوحة. لتحفيز تكوين الغشاء الحيوي، تم ملء كل بئر من صفيحة معقمة مكونة من 96 بئر بسعة 200 ميكرولتر من التعليق البكتيري، ثم وضعت أغطية مشابك معقمة على اللوحة. تم حضن الألواح المجمعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تحت ظروف ثابتة للسماح بتطور الأغشية الحيوية على الأوتاد. بعد الحضانة، تم شطف أغطية الأوتاد بلطف في صفيحة تحتوي على 96 بئر تحتوي على 200 ميكرولتر من 0.9٪ NaCl لإزالة الخلايا العوالقية. تم غمس الصفيحة التي تحتوي على الأوتاد في صفيحة أخرى تحتوي على 96 بئر تحتوي على فانكومايسين بتركيزات تدريجية (2–4,096 ملغ/لتر) وحضنتها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تحت ظروف ثابتة.

تم شطف اللوح مع الأوتاد في صفيحة بسعة 96 بئر تحتوي على 200 ميكرولتر من 0.9٪ NaCl، وتم ختم الأوتاد بعناية في صفيحة TSA بقطر 15 سم وحضنتها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لوحظ نمو بكتيريا، وتم تعريف MBEC بأنه أدنى تركيز لا يحدث فيه نمو. تم إجراء جميع التجارب بثلاث نسخ (الشكل 3).

figure-protocol-3
الشكل 3: جهاز كالغاري وألواح ذات قاع مسطح بسعة 96 بئر مطبوعة ب PLA وPETG. (A) جهاز كالغاري مطبوع ب PLA. (ب)ألواح ذات 96 بئر مسطحة القاع مطبوعة ب PLA. (ج) جهاز كالغاري مطبوع ب PETG. (D) ألواح ذات قاع مسطح ب 96 بئر مطبوعة ب PETG. الاختصارات؛ PLA = حمض بولي لاكتيك؛ PETG = بولي إيثيلين تيريفثالات جليكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نظام ديناميكي تحت ظروف تدفق مستمرة
يحتوي كل MRD على خمسة أوتاد فردية مثبتة في نموذج لولبي ومرتبة خطيا على قناة ذات مقطع عرضي مستطيل. تكون النظام الديناميكي من قارورة تحتوي على 1 لتر من المحلول مع المضاد الحيوي المراد اختباره متصلا بمضخة بيريستالية عبر أنبوب سيليكون مرتبط ب MRD. تم التجميع في خزانة تدفق هواء طبقية لمنع التلوث. تم الحفاظ على معدل التدفق المتوسط عند 1 مل/دقيقة وتم تدويره عبر النظام لمدة 24 ساعة. يتم التخلص من السائل المار عبر جهاز MRD في قارورة زجاجية أخرى (دون إعادة تدوير).

تم تحفيز أغشية S. aureus على أوتاد MRD، حيث أسقطت الأوتاد على صفائح 24 بئر مع TSB بتركيز 3 مل بتركيز 107 CFU/mL. تم شطف الأوتاد بلطف بالغمر في صفيحة تحتوي على 24 بئر مملوءة بمحلول NaCl بسعة 3 مل من 0.9٪. تم تثبيت المسامير بعناية في MRD (n = 5). تم حقن محلول فانكومايسين (40 ملغ/لتر) مخفف بنسبة 0.9٪ NaCl عبر MDR باستخدام المضخة كما هو موضح أعلاه لمدة 24 ساعة. تم تضمين مجموعة ضابطة بدون مضادات حيوية (0.9٪ NaCl). تم اختيار هذا التركيز بناء على تركيز المصل الذي تم الحصول عليه خلال الجرعات العالية من فانكومايسين الوريدي، كما هو موضح سابقا24. تمت إزالة الدبابيس معقمة من جهاز MRD باستخدام ملقط معقم، ووضعت في أنابيب دقيقة تحتوي على 1 مل من NaCl معقم بنسبة 0.9٪ بعد الغسل ب 0.9٪ NaCl، وتم تحويلها إلى صوت في حمام فوق صوتي لمدة 15 دقيقة عند 40 كيلوهرتز و37 درجة مئوية لضمان الانفصال الكامل للغشاء الحيوي. تم تدوير الأنابيب الدقيقة لمدة 60 ثانية، وتم تكرار العملية ثلاث مرات لتعطيل تجمعات الأغشية الحيوية المتبقية. تم طلاء أليكوت بسعة 100 ميكرولتر على TSA، وتم حضن الصفائح لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تم قياس نمو البكتيريا والتعبير عنه كوحدة CFU/mL (الشكل 4).

figure-protocol-4
الشكل 4: جهاز روبينز المعدل مع PETG وPLA وصورة للنظام الديناميكي. (أ) جهاز روبينز معدل مطبوع ب PETG أو PLA. (ب) صورة للنظام الديناميكي. الاختصارات؛ PLA = حمض بولي لاكتيك؛ PETG = بولي إيثيلين تيريفثالات جليكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المجهر الإلكتروني الماسح
لتصور شكل وبنية الأغشية الحيوية، تم إجراء المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) على الأقراص. تم تحفيز الغشاء الحيوي على الأقراص كما هو موضح في البروتوكولات. تمت إزالة الأقراص بعناية من اللوحة باستخدام ملقط معقم وثبتها بمحلول (0.68 جرام سكاروز، 0.42 جرام من كاكودييلات الصوديوم، 0.6 مل 30٪ جلوتارالدهايد)، مع 19.4 مل من الماء منزوع الأيون، لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، تم نقل العينات إلى محلول عازل (0.68 جرام سكروز و0.42 جرام من كاكوديلات الصوديوم) لمدة 10 دقائق. ثم تم تجفيف العينات في سلسلة إيثانول متدرجة (35٪، 50٪، 70٪، و100٪) لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد ذلك، تم نقل العينات إلى طبق بتري آخر وتغطيتها بمادة هيكساميثيل ديزيلازان بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق. وأخيرا، تم طلاء الأقراص بالذهب باستخدام مضخة دوارة وتركيبها على جزء معدني للملاحظة تحت تكبيرات مختلفة على مجهر إلكتروني ماسح (الشكل 5).

figure-protocol-5
الشكل 5: المجهر الإلكتروني الماسح لنماذج PLA وPETG المطبوعة ثلاثية الأبعاد مع وبدون الحث البيوفيلم. (أ) صورة بالمجهر الإلكتروني الماسح لPLA بدون فيلم حيوي. (ب) صورة مجهرية إلكترونية ماسحة ل PETG بدون فيلم حيوي. (ج) صورة مجهرية إلكترونية ماسحة لبكتيريا تشكل الأغشية الحيوية على أقراص PLA. (د) صورة ميكروسكوبية إلكترونية ماسحة لبكتيريا تشكل الأغشية الحيوية على أقراص PETG. تظهر C و D سمات نموذجية للأغشية الحيوية: تنظيم البكتيريا في بنية ثلاثية الأبعاد، التصاق بالأسطح، ووجود مصفوفة خارج الخلية. شريط القياس الأبيض يمثل 10 ميكرومتر. الاختصارات؛ PLA = حمض بولي لاكتيك؛ PETG = بولي إيثيلين تيريفثالات غليكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

التحليل الإحصائي
كانت بعض التحليلات وصفية. بالنسبة للبيانات الكمية، برر حجم العينة استخدام الوسيط مع النطاق الرباعي، مع اختبار مان-ويتني للمقارنة الإحصائية. تم اعتبار قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نموذج القرص للغشاء الحيوي الثابت
يستخدم هذا الاختبار لتحديد MBEC على العينات الفردية. أظهرت التخفيفات الثنائية التدريجية لفانكومايسين تكوين الأغشية الحيوية الأساسي 7.48 × 105 CFU/mL [IQR 6.34–8.72] ل PLA و3.60 × 105 CFU/mL [IQR 3.08–5.52] ل PETG. على الرغم من أن كلا المادتين أظهرتا كثافات أغشية حيوية ضمن نطاق 10إلى 5 ، لوحظ فرق ذو دلالة إحصائية في إنتاج الفيلم الحيوي بينهما (p = 0.015). عند تعرضه للفانكومايسين، كان MBEC 512 ملغ/لتر لكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقترح هذه الدراسةتقييما شاملا لتكوين الأغشية الحيوية على البوليمرات الطبية المطبوعة ثلاثية الأبعاد، وتحديدا PLA وPETG، باستخدام أربع منصات تجريبية مكملة: اختبارات الأقراص الثابتة، نماذج الصفائح ذات 24 بئرا، CBD، ونظام تدفق ديناميكي قائم على MRD. من خلال دمج هذه النماذج، تهدف الدراسة إلى توصيف كيفية تصرف مواد الطباعة المميزة عند تعرضها لتحفيز الغشاء الحيوي ب S. aureus، وتحديد MBEC لفانكومايسين عبر ظروف اختبار مختلفة. يتيح هذا النهج متعدد المعايير مقارنة التفاوت المعتمد ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يعارضون مصالحهم. تم استخدام ChatGPT لمراجعة القواعد.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر رينيه فليمان على الدعوة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.9٪ NaClفريسينيوس كابي البرازيل، سيارا، البرازيل17811
طابعة ثلاثية الأبعاد بتقنية نمذجة الترسيب المنصهرة (Bambu X1-Carbon) مختبر بامبو، شنزن، الصينPF001-P
غار الدمنيوبروف، باران وأكوت؛ البرازيلPA31
جهاز كالغاري للفيلم الحيوي قابل للتحميللا توجد رفقةانظر الرابط (بدون أرقام الكتالوج)https://www.printables.com/model/1464751-calgary-model-biofilm
لوحة متعددة البئر لزراعة الخلايا، 24 بئرغراينر بيو-ون، كريمسمü نستر وأومل; سترايش، النمسا 662160
الطرد المركزي (5910 ري)إبندورف، هامبورغ، ألمانيا5943000511
أنبوب الطرد المركزي معقم 15 ملكورنينغ، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية430790
أنبوب الطرد المركزي المعقم 50 ملكورنينغ، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية430291
وحدة تحكم إلكترونية للحنجرة (Easypet® 3)إبندورف، هامبورغ، ألمانيا4430000018
الإيثانول (&GE; 99.5٪، مادة ACS)سيغما-ألدريتش، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية459844
جلوتارالديهايدميرك، دارمشتات، ألمانيا8143931000
هيكساميثيلديسيلازانميرك، دارمشتات، ألمانيا440191
الحاضنة (502/4-C)فانيم، س&أتيلدي؛ أو باولو، البرازيل502007700
خزانة تدفق الهواء الطبقي (BioSEG 9)فيكو، س&أتيلدي؛ أو باولو، البرازيل1EAC3770
الماصة الميكانيكية (مرجع إيبندورف&2)إبندورف، هامبورغ، ألمانيا4924000061
جهاز روبينز المعدل قابل للتحميللا توجد رفقةانظر الرابط (بدون أرقام الكتالوج)https://www.printables.com/model/1481700-robbins-device-modified
نيفيلوميتر ألفاكيت، فلوريان&أوكيوت؛ بوليس، البرازيل7718
هزاز المداري (INNOVA 44R)إبندورف، هامبورغ، ألمانياM1282-0314
بارافيلم إمأمكور، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكيةPM-996
مضخة التوازي (Minipuls® 3)جيلسون، فيلييه-لو-بيل، فرنساF117604
طبق بتري (90 × 15 مم)غرينر بيو-ون، Sã؛ أو باولو، البرازيل630164
نصيحة Pipette 1– 200μ Lكورنينغ، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكيةCLS4142
بولي إيثيلين تيريفثالات جليكول (PETG)كراليال، الصين44759
حمض البولي لاكتيك (PLA) فائق الصمامات والريج؛ PLA PRO1BASF، مارسن، هولنداPR1-7501A075
مضخة دوارة (Q150R ES Plus)كوروم تكنولوجيز، لويس، المملكة المتحدة13034
المجهر الإلكتروني الماسح (Vega3 LMU)تيسكان، برنو، جمهورية التشيكانظر الرابط (بدون أرقام الكتالوج)https://tescan.com/product-portfolio
الماصة المصلية 10 ملكورنينغ، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكيةCLS4488
كاكوديلات الصوديومسيغما-ألدريتش، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكيةC0250
المكورات العنقودية الذهبية ATCC® السلالة 25923لابوركلين، بينهايس، البرازيل660674
سكروزسيغما-ألدريتش، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية59378
النسخة القابلة للتحميل ذات القاع المسطح ذات 24 بئرلا توجد رفقةانظر الرابط (بدون أرقام الكتالوج)www.printables.com/model/104339-24-well-plates ؛
تربتيك سوي أغار  كاسفي، مدريد، إسبانياK25-1068
مرق الصويا التريبتيكي  سيغما-ألدريتش، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية22092
فريزر فائق الانخفاض (IULT 335 D)إندريل، بارانá، البرازيل12038
حمام فوق صوتي (سونيكلين 15)ساندرز الطبية، ميناس جيرايس، البرازيلانظر الرابط (بدون أرقام الكتالوج)https://sandersdobrasil.com.br/produto/lavadora-ultrassonica-soniclean-15d/
فانكومايسينABL، Sã أو باولو، البرازيل15,56,20,041
دوامة (FLEXVORTEX)لوكوس، س&أتيلدي؛ أو باولو، البرازيل4500

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kouhi, M., et al. Recent advances in additive manufacturing of patient-specific devices for dental and maxillofacial rehabilitation. Dent Mater. 40 (4), 700-715 (2024).
  2. Mamo, H. B., Adamiak, M., Kunwar, A. 3D printed biomedical devices and their applications: A review on state-of-the-art technologies, existing challenges, and future perspectives. J Mech Behav Biomed Mater. 143, 105930(2023).
  3. Przadka, M., et al. Advances in 3D printing applications for personalized orthopedic surgery: From anatomical modeling to patient-specific implants. J Clin Med. 14 (11), (2025).
  4. Ling, K., Wang, W., Liu, J. Current developments in 3D printing technology for orthopedic trauma: A review. Medicine (Baltimore). 104 (12), e41946(2025).
  5. Long, T., Tan, L., Liu, X. Three-dimensional printing in modern orthopedic trauma surgery: A comprehensive analysis of technical evolution and clinical translation. Front Med (Lausanne). 12, 1560909(2025).
  6. Cong, B., Zhang, H. Innovative 3D printing technologies and advanced materials revolutionizing orthopedic surgery: Current applications and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1542179(2025).
  7. Slavin, B. V., et al. 3D printing applications for craniomaxillofacial reconstruction: A sweeping review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (12), 6586-6609 (2023).
  8. Moncayo-Matute, F. P., et al. 3D printing and virtual surgical planning in craniofacial and thoracic surgery: Applications to personalised medicine. J Pers Med. 15 (9), (2025).
  9. Dimitrova, M., et al. Recent advances in 3D printing of polymers for application in prosthodontics. Polymers (Basel). 15 (23), (2023).
  10. Iqbal, J., et al. Recent advances of 3D-printing in spine surgery. Surg Neurol Int. 15, 297(2024).
  11. Hajnal, B., et al. Clinical applications of 3D printing in spine surgery: A systematic review. Eur Spine J. 34 (2), 454-471 (2025).
  12. Paul, G. M., et al. Medical applications for 3D printing: Recent developments. Mo Med. 115 (1), 75-81 (2018).
  13. Liaw, C. Y., Guvendiren, M. Current and emerging applications of 3D printing in medicine. Biofabrication. 9 (2), 024102(2017).
  14. Mendonça, C. J. aD., Dantas, L. R., Soni, J. F., Tuon, F. F. Antimicrobial action of a biodegradable thermoplastic impregnated with vancomycin for use in 3D printing technology. Braz Arch Biol Tech. 67, 13(2024).
  15. Dantas, L. R., Witt, M. A., Carneiro, E., Tuon, F. F. Nanoarchitectonics for advancing bone graft technology: Integration of silver nanoparticles against bacteria and fungi. Microorganisms. 12 (12), 2616(2024).
  16. Stewart, P. S., Bjarnsholt, T. Risk factors for chronic biofilm-related infection associated with implanted medical devices. Clin Microbiol Infect. 26 (8), 1034-1038 (2020).
  17. Amod, A., Anand, A. A., Sahoo, A. K., Samanta, S. K. Diagnostic and therapeutic strategies in combating implanted medical device-associated bacterial biofilm infections. Folia Microbiol (Praha). 70 (2), 321-342 (2025).
  18. Oliva, A., et al. Challenges in the microbiological diagnosis of implant-associated infections: A summary of the current knowledge. Front Microbiol. 12, 750460(2021).
  19. Veerachamy, S., Yarlagadda, T., Manivasagam, G., Yarlagadda, P. K. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proc Inst Mech Eng H. 228 (10), 1083-1099 (2014).
  20. Ortis, G. B., et al. Additive manufacturing, thermoplastics, CAD technology, and reverse engineering in orthopedics and neurosurgery applications to preventions and treatment of infections. Antibiotics (Basel). 14 (6), 561(2025).
  21. Coenye, T., Nelis, H. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. J Microbiol Methods. 83 (2), 89-105 (2010).
  22. Riga, E. K., Vohringer, M., Widyaya, V. T., Lienkamp, K. Polymer-based surfaces designed to reduce biofilm formation: From antimicrobial polymers to strategies for long-term applications. Macromol Rapid Commun. 38 (20), 1700216(2017).
  23. Soni, J. F., et al. Evaluation of silver nanoparticle-impregnated PMMA loaded with vancomycin or gentamicin against bacterial biofilm formation. Injury. 54 (6), 110649(2023).
  24. Borges, N. H., Suss, P. H., Ortis, G. B., Dantas, L. R., Tuon, F. F. Synergistic activity of vancomycin and gentamicin against Staphylococcus aureus biofilms on polyurethane surface. Microorganisms. 13 (5), 1119(2025).
  25. Pedroni, M. A., et al. Different concentrations of vancomycin with gentamicin-loaded PMMA to inhibit biofilm formation of Staphylococcus aureus and their implications. J Orthop Sci. 29 (1), 334-340 (2024).
  26. Tuon, F. F., et al. Antimicrobial treatment of Staphylococcus aureus biofilms. Antibiotics (Basel). 12 (1), 87(2023).
  27. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  28. Carstensen, S., et al. Transcriptional evaluation of functional genes of resistance, biofilm, and quorum sensing in ctx-m15 ESBL-producing Klebsiella pneumoniae after meropenem concentration based on serum level. Res Microbiol. , (2025).
  29. Kraft, L., Ribeiro, V. S. T., Goncalves, G. A., Suss, P. H., Tuon, F. F. Comparison of amphotericin B lipid complex, deoxycholate amphotericin B, fluconazole, and anidulafungin activity against Candida albicans biofilm isolated from breakthrough candidemia. Enferm Infecc Microbiol Clin (Engl Ed). 41 (10), 596-603 (2023).
  30. Chaiben, V., et al. A carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii outbreak associated with a polymyxin shortage during the COVID pandemic: An in vitro and biofilm analysis of synergy between meropenem, gentamicin, and sulbactam. J Antimicrob Chemother. 77 (6), 1676-1684 (2022).
  31. Da Rocha, L., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilm adherence to PEEK and titanium-alloy prosthetic spine devices. Eur J Orthop Surg Traumatol. 32 (5), 981-989 (2022).
  32. Mendonca, J. R., Dantas, L. R., Tuon, F. F. Activity of multipurpose contact lens solutions against Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, and Candida albicans biofilms. Ophthalmic Physiol Opt. 43 (5), 1092-1099 (2023).
  33. Koch, J. A., et al. Staphylococcus epidermidis biofilms have a high tolerance to antibiotics in periprosthetic joint infection. Life (Basel). 10 (11), 314(2020).
  34. Dunne, W. M. Jr Bacterial adhesion: Seen any good biofilms lately. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 155-166 (2002).
  35. Beckman, R. L. T., Cella, E., Azarian, T., Rendueles, O., Fleeman, R. M. Diverse polysaccharide production and biofilm formation abilities of clinical Klebsiella pneumoniae. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 151(2024).
  36. Dantas, L. R., Ortis, G. B., Suss, P. H., Tuon, F. F. Advances in regenerative and reconstructive medicine in the prevention and treatment of bone infections. Biology (Basel). 13 (8), 582(2024).
  37. Molina-Manso, D., et al. In vitro susceptibility to antibiotics of staphylococci in biofilms isolated from orthopaedic infections. Int J Antimicrob Agents. 41 (6), 521-523 (2013).
  38. Cieslinski, J., et al. Direct detection of microorganisms in sonicated orthopedic devices after in vitro biofilm production and different processing conditions. Eur J Orthop Surg Traumatol. 31 (6), 1113-1120 (2021).
  39. Fernandez-Grajera, M., Pacha-Olivenza, M. A., Fernandez-Calderon, M. C., Gonzalez-Martin, M. L., Gallardo-Moreno, A. M. Dynamic adhesive behavior and biofilm formation of Staphylococcus aureus on polylactic acid surfaces in diabetic environments. Materials (Basel). 17 (13), 3184(2024).
  40. Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), (2015).
  41. Sikdar, R., Elias, M. H. Evidence for complex interplay between quorum sensing and antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa. Microbiol Spectr. 10 (6), e0126922(2022).
  42. Kruger, H. C., et al. Antimicrobial action, cytotoxicity, calcium ion release, and pH variation of a calcium hydroxide-based paste associated with Myracrodruon urundeuva Allemao extract. Aust Endod J. 48 (1), 170-178 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة