مقالة منهجية

رسم خريطة شكل الخلايا النجمية الكبدية في نماذج الفئران لتليف الكبد

DOI:

10.3791/70396

⸱

فبراير 13, 2026

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول خط تصوير شامل لتصوير ونمذجة شكل الخلايا النجمية الكبدية في نسيج الكبد السليم. يجمع هذا النهج بين وضع العلامات الفلورية للأرومات الليفية باستخدام وراثة الفئران، وتحضير الأنسجة المعتمدة على تدفق الدم الكبدي في الموقع الطبيعي، وطريقة تنظيف الأنسجة iDISCO المعدلة لتحقيق الشفافية البصرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأرومات الليفية المقيمة في الأنسجة هي المحركات الخلوية للتليف عبر الأنسجة. داخل الكبد، تنشط الخلايا النجمية الكبدية (HSCs)، وهي الخلايا المحيطة المقيمة ذات شكلها الفريد "الشبيه بالنجوم"، لتصبح الخلايا الليفية العضلية الليفية أثناء الإصابة لإنتاج الندبة الكبدية. بينما أوضح عقود من العمل مسارات الإشارات الرئيسية التي تقوم عليها تنشيط HSC، لا تزال الأهمية الوظيفية لشكلها التغصني المميز بمراوغة بسبب القيود التقنية في التصوير والتحليل. يقدم هذا البروتوكول خط تصوير شامل لتصوير ونمذجة شكل الهرمون الهوكي في نسيج الكبد السليم. يجمع هذا النهج بين وضع العلامات الفلورية على الخلايا العالية العالية باستخدام جينات الفئران، وتحضير الأنسجة المعتمد على تدفق الدم للكبد في الموقع ، وطريقة تنظيف الأنسجة المعدلة iDISCO لتحقيق شفافية بصرية في عينات الأنسجة التي قد تصل سمكها إلى عدة سنتيمترات. يتم تصوير العينات الممسحة باستخدام منصات المجهر الكونفوكالي المحسنة، وتعالج مجموعات بيانات الصور من خلال سير عمل تحليلي مخصص لإعادة بناء HSCs الفردية ثلاثية الأبعاد بدقة خلية واحدة. معا، يتيح هذا الخط من إعادة رسم الخرائط لمورفولوجيا HSC داخل البيئة الدقيقة للكبد المعقدة، بما في ذلك عملياتها التغصنية وعلاقاتها المكانية مع الخلايا المجاورة. بعيدا عن الكبد، يمكن التكيف مع الخلايا الليفية في أعضاء أخرى، مثل الرئة والكلى والأمعاء والقلب، حيث تظهر خلايا الميزانشيما المقيمة أدوارا ليفية مشابهة في الأمراض. لذلك، يؤسس الإطار المقترح أساسا منهجيا للدراسات المقارنة بين الأعضاء لفحص علاقات البنية والوظيفة في الخلايا الليفية والهشاشة العلاجية في الأمراض الليفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التليف، أو الندوب المرضية للأنسجة، هو المسار المشترك الأخير لمعظم أمراض الأعضاء المزمنة ويساهم في حوالي 40٪ من الوفياتفي الدول الصناعية. في الكبد، ينشأ التليف من إصابات مزمنة مثل التهاب الكبد الفيروسي، تعاطي الكحول، أو مرض الكبد الدهني المرتبط بالخلل الأيضي (MASLD) بشكل متزايد، والذي يصيب حاليا 30-40٪ من البالغين في الولايات المتحدة. الإهانات المزمنة للكبد والتليف التدريجي الناتج تزيد بشكل كبير من خطر الإصابة بأمراض الكبد في مراحلها النهائية مثل تليف الكبد، وفشل الكبد، وسرطان الخلاياالكبدية 2. 3، 4، 5.

الخلايا النجمية الكبدية (HSCs) هي مركز في توازن الكبد وتكوين الأليف. في الكبد السليم، توجد الخلايا الهوائية العالية في حالة سكونية تخزن فيتامين أ وتساهم في توازن خلايا الكبد، وبشكل عام الكبد بأكمله. وقد تم إثبات ذلك بوضوح من خلال دراسات استنزاف HSC، حيث يؤدي إزالة معظم الخلايا الهرمونية العالية في الكبد السليم إلى تقليل كتلة الكبد والحد بشدة من تجدد الكبد 7,8. عند الإصابة، تنشط الخلايا الصلبة العالية إلى خلايا شبيهة بالخلايا الليفية العضلية التي تتكاثر، تهاجر إلى المناطق التالفة، وتنتج مصفوفة خارج الخلايا (ECM) الزائدة، مكونة ندوبا ليفية. الخلايا الليفية المنشطة في الكبد الليفية هي أيضا مصدر للأرومات الليفية المرتبطة بالسرطان وتلعب أدوارا تعزز الأورام في سرطان الخلايا الكبدية 9,10,11,12. تمتلك الخلايا الهوائية الهادئة شكلا فريدا يشبه الخلايا العصبية مع أجسام خلايا صغيرة تمتد منها الإسقاطات طويلة المدى. تتحول الخلايا الميثروبروسية إلى شكل مسطح يشبه الورقة عند تفعيلها في التليف13. بينما أوضحت عقود من العمل مسارات الإشارات التي تتحكم في إنتاج ECM بواسطة HSCs، لا تزال الأهمية الوظيفية لشكلها العصبي المميز، وكيفية تنظيمه، وما إذا كان يمكن أن يسهل التفاعلات داخل مجال HSC، ويساهم في التحول الليفي والأمراض إلى HSCبعيدة المنال.

الطرق الحالية لتصوير شكل الخلايا العالية العالية تقتصر على صور ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) إما للخلايا المزروعة في المختبر أو مقاطع الأنسجة في الجسم الحي ، ونادرا ما تلتقط كامل شكل الخلايا مع الإسقاطات التي تمتد عدة أطوال لجسم الخلايا في جميع الاتجاهات. علاوة على ذلك، فإن العلامة الأكثر استخداما لمركز HSC، ديسمين، لا يمكنها التقاط الشكل الفريد الشبيه بالخلايا العصبية لمركبات HSC في التلوين المناعي الفلوري، حيث أن ديسمين هو بروتين هيكلي خلوي يضع فقط علامات على الخيوط الوسيطة داخلHSCs 16. هذه التحديات المنهجية حتى الآن أعاقت القدرة على التقاط شكل HSC وتفاعلاته الخلوية بشكل كامل بطريقة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) في سياقها الطبيعي عند دقة خلية واحدة. نتيجة لذلك، بقيت أسئلة أساسية حول كيفية ارتباط مورفولوجيا HSC بحالتها الوظيفية وتفاعلاتها مع أنواع الخلايا المجاورة دون حل.

تقدم هذه المقالة خط أنابيب تصوير وتحليل مبتكرة وشاملة لتصوير ونمذجة شكل الهرمونك الهرموني في أنسجة الكبد السليمة. تدمج هذه الطريقة عدة ابتكارات رئيسية: (1) وضع العلامات الفلورية على الميكروبات السطحية باستخدام نماذج الفئران المراسلة الوراثية، (2) تحسين تروية الكبد في الموقع والتثبيت للحفاظ على بنية الأنسجة والعلاقات الخلوية سليمة، (3) بروتوكول تنظيف الأنسجة المعدل القائم على iDISCO لتحقيق الشفافية البصرية17، (4) المجهر الكونفوكلي عالي الدقة لالتقاط صور الأنسجة العميقة، و(5) سير عمل حسابي مخصص لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد والكمية تحليل كل وحدة HSC. يفرض البروتوكول قيودا معينة على حجم الأنسجة والالتزام الزمني يجب أخذها في الاعتبار. معا، يوفر هذا البروتوكول إطارا قويا وقابلا للتكرار لالتقاط البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد لل HSCs ولرسم خريطة علاقاتها المكانية مع الخلايا الوعائية والمناعية والمجاورة المحيطة. الاستراتيجيات وخطوط الأنابيب المعروضة هنا للكبد قابلة للتكيف بسهولة مع أعضاء أخرى أيضا17، 18، 19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع تجارب الفئران المستخدمة في هذه الدراسة تمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في كلية إيكان للطب في مؤسسة جبل سيناي. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. توليد الفئران التي تحمل الفئران الموسومة ب tdTomato (TdT) HSCs

  1. أنشأ مربي Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) (سلالة مختبرات جاكسون #00791420 وسلالة موارد وأبحاث الفئران المتحولة (MMRRC) #06959521-JAX على التوالي).
    ملاحظة: توقع وجود القمامة بعد 3 أسابيع. استخدم إناث LratCre للتكاثر، حيث تم اكتشاف بعض تعبير Cre في خط الجرثولة الذكري.
  2. جمع الذيول والنمط الجيني F1 للتعرف على Tg(Lrat:Cre); فئران Tg(LSL-TdT) التي تعبر بشكل انتقائي عن فلوروفور TdTomato في خلايا النجوم الكبدية.

2. تروية الكبد في الموقع والتثبيت

  1. إعداد ما قبل الجراحة
    1. حضر خليط كيتامين/زيلازين لتخدير الفئران بخلط 2 مل من الكيتامين، 1 مل من الزيلزين، و7 مل من الماء.
      ملاحظة: الكيتامين مادة خاضعة للرقابة وتتطلب ترخيصا وتنظيما مناسبين للاستخدام في المختبرات.
    2. تحضير محلول التروية من 4٪ بارافورمالديهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن فوسفات واحد (PBS).
    3. قم بإعداد المضخة البريستالتية بالسماح لتدفق 1x PBS عبر الأنبوب وضبط معدل التدفق عند 2 مل/دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعة هواء داخل الأنبوب.
  2. زن الفأر لتحديد كمية خليط الكيتامين/الزيلزين الذي يجب حقنه.
  3. حقن خليط الكيتامين/الزيلزين داخل الصفاق داخل الفأرة.
    ملاحظة: حقن 200 ميكرولتر من الخليط لكل 20 جرام من وزن الفأر.
  4. ضع الفأر في وعاء بغطاء وانتظر حوالي 20 دقيقة حتى يخدر الفأر بالكامل.
    ملاحظة: اضغط على إصبع الفأرة للتحقق من عدم وجود رد فعل. تأكد من أن الفأر لا يزال على قيد الحياة عند بدء التروية.
  5. انقل الفأر من الحاوية الزجاجية إلى منصة الجراحة في وضعية الاستلقاء.
    تحذير: PFA سام ومتقلب؛ لذا، قم بإجراء عملية التروية في غطاء كيميائي. جمع وتخلص من تدفق PFA بشكل صحيح وفقا لإرشادات السلامة الحيوية المؤسسية.
  6. اضغط على راحتي قدم الفأر بالملاقط لضمان عدم حدوث أي حركات رد فعل أو تشنج.
  7. اضرب 4 كف بالإبر لنشر بطن الفأر.
  8. رش البطن بنسبة 70٪ إيثانول لترطيب الفرو.
  9. استخدم الملقط لالتقاط الجلد في منتصف البطن، محاذاة الأرجل الخلفية، وابدأ بقطع الجلد (كلا الطبقتين) لكشف البطن.
  10. استخدم مسحات قطنية مبللة من PBS لتحريك الأمعاء وأعضاء أخرى إلى الجانب ورفع الفص الأيسر.
  11. اقطع بعناية الغشاء المتصل بين الفص الأيسر والفص الذيلي.
  12. استخدم خياطة لربط الخصم الأيسر عند القاعدة العلوية.
  13. اقطع الفص الأيسر أسفل عقدة الغرز ووضع الفص الأيسر جانبا لجمع عينات الأنسجة ومعالجتها، حسب الاحتياجات التجريبية (مثل التجميد المباشر في النيتروجين السائل، أو التضمين في مركب درجة حرارة القطع البصري (OCT)، أو تثبيت الفورمالين).
  14. استخدم مسحات قطنية مبللة من PBS لتحريك الكبد وكشف الوريد البوبي.
  15. أدخل إبرة القسطرة بحذر في الوريد البابي عند منتصف طول الوريد الداخلي تقريبا.
    ملاحظة: للمساعدة في إدخال القسطرة، ارفع جسم الفأر بوضع ملقط تحت الجسم لضمان سطح أكثر استواء. قم بمحاذاة إبرة القسطرة بحذر بشكل موازي قدر الإمكان مع الوريد البابي قبل الإدخال.
  16. أزل إبرة القسطرة.
    ملاحظة: تأكد من تدفق الدم العكسي عبر القسطرة للدلالة على نجاح الإدخال.
  17. شغل مضخة التروية بمعدل تدفق 2 مل/دقيقة، ووصل الأنبوب بالقسطرة، ثم حقن الكبد ب 20 مل من 1x PBS.
    ملاحظة: تأكد من أن القسطرة مليئة بالكامل بالدم، وأن الأنبوب مملوء بالكامل بمخزن التروية، قبل توصيلهما لضمان عدم دخول فقاعات هواء إلى النظام.
  18. قم بتثبيت الشريان الرئوي فوق الكبد باستخدام دموية لمنع مرور 1x PBS عبر القلب.
  19. اقطع الوريد الأجوف السفلي لتحرير تراكم الضغط.
  20. اضبط سرعة المضخة إلى 5 مل/دقيقة.
    ملاحظة: اترك حوالي 15 دقيقة لإنهاء التروية.
  21. أوقف المضخة لتغيير الخزان إلى 4٪ PFA.
    ملاحظة: تأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء في الأنبوب عن طريق إيقاف المضخة عندما لا يزال هناك سائل في الخزان.
  22. قم بتغذية الكبد بجرعة 25 مل من 4٪ PFA.
  23. بمجرد اكتمال التروية، قم بإزالة الكبد من الأعضاء المحيطة عن طريق قطع الأنسجة المتصلة.
  24. ضع الكبد في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل، مملوء ب 25 مل من 4٪ من PFA.
  25. ضع الأنبوب أفقيا على منصة هزاز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة عند 1.5 دورة في الدقيقة، لضمان حركة المحلول.
  26. اغسل الكبد ثلاث مرات في 1x PBS على منصة هزاز على طاولة لمدة 30 دقيقة في كل منها على درجة حرارة الغرفة عند 1.5 دورة في الدقيقة.
  27. خزن الكبد في 20 مل 1x PBS مع 0.02٪ NaN3 عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: احتفظ بالكبد لفترة طويلة في هذه المرحلة، حتى سنة واحدة على الأقل.

3. تنظيف الأنسجة المعتمد على iDISCO+

ملاحظة: الوصف الأصلي لبروتوكول iDISCO+ متاح عند 17

اليوم الأول: جفاف عينات

  1. اقطع عينات الكبد إلى قطع بأحجام تقريبية 0.5-1 سم3.
    ملاحظة: قم بقص عينات مختلفة إلى أشكال مختلفة لتسهيل الكشف أثناء خطوات التصوير.
  2. حضر 20٪ (حجم/حجم)، 40٪، 60٪، و80٪ من الميثانول في الماء في زجاجات زجاجية منفصلة.
  3. ضع عينات الكبد في قوارير زجاجية ذات أغطية براغي (مثلا، 4-7 مل).
    ملاحظة: ضع حتى 6 قطع عينات من الكبد في قارورة زجاجية واحدة بحجم 7 مل.
  4. جفف العينة باستخدام تخفيف الميثانول بسلسلةH2O، 20٪ (حجم/حجم)، 40٪، 60٪، و80٪ لمدة ساعة لكل منها في درجة حرارة الغرفة على مدور عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي.
  5. اغسل العينة بميثانول 100٪ آخر على مدور عجلة عند 8 دورة في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  6. برد العينة على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
  7. جهز 66٪ من تخفيفات DCM في الميثانول في زجاجة زجاجية.
    ملاحظة: حضر مخففات جديدة في كل مرة. استخدم أسطوانات زجاجية لتحضير المحلول، حيث يمكن للتيار المستمر أن يذيب البلاستيك مثل البوليسترين.
  8. حضن العينات في محلول 66٪ DCM/ميثانول طوال الليل على محول عجلة بسرعة 8 دورات في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة، دون حدوث طرد مركزي.
    ملاحظة: احذر من العينات التي تطفو إلى الأعلى بعد إضافة المحلول.

اليوم الثاني: تبييض العينات

  1. غسل العينة مرتين باستخدام 100٪ ميثانول على محول عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي لمدة ساعة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
  2. برد العينة على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
  3. قم بتبييض العينة في 5٪ H2O 2 مبرد في الميثانول (1 حجم من 30٪ H2O2 إلى 5 أحجام من الميثانول)، على مدور عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي، عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: جهز حلا جديدا في كل مرة.

اليوم 3-5: نفاذية العينة

  1. إعادة ترطيب الميثانول بسلسلة2O: 80٪، 60٪، 40٪، 20٪، 1x PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على مدور عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي.
  2. غسل العينة مرتين في PTx.2 (الجدول 1) لمدة ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة على محول عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي.
  3. حضن العينات في محلول نفاذية (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية لمدة يومين.

اليوم 5-17: تصنيف المناعة

  1. حجب العينات في محلول الانسداد (الجدول 1) لمدة يومين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: حضر محلول حاجب جديد في كل مرة بسبب عدم استقرار مصل الحمار. احتفظ بمحلول الانسداد المتبقي عند 4°C لمدة تصل إلى شهر.
  2. حضن العينات في أجسام مضادة أولية مخففة في PTwH (الجدول 1) مع 5٪ DMSO و3٪ سيروم الحمار عند 37 درجة مئوية على جهاز تدوير العجلة عند 5 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي لمدة 4 أيام.
    ملاحظة: ابدأ بتخفيف الأجسام المضادة الأولية بنسبة 1:500.
  3. غسل العينات بضغط PTwH 4-5 مرات لمدة ساعة لكل منها في درجة حرارة الغرفة على مدور عجلة بسرعة 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي.
    ملاحظة: اختياريا، اترك العينات لتغسل طوال الليل.
  4. حضن العينات في أجسام مضادة ثانوية ويوديد بروبيديوم مخفف ب PTwH مع 3٪ مصل حمار عند 37 درجة مئوية على جهاز تدوير عجلة عند 5 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي لمدة 4 أيام.
    ملاحظة: ابدأ بتخفيف الأجسام المضادة الثانوي بمقدار 1:500. استخدم تخفيف يوديد البروبيديوم بنسبة 1:250 من محلول مخزون يوديد بروبيديوم بمقدار 5 ملغ/لتر.
  5. غسل العينات بضغط PTwH 4-5 مرات لمدة ساعة لكل منها في درجة حرارة الغرفة على مدور عجلة بسرعة 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي.
  6. اترك العينة تغسل في PTwH طوال الليل، في درجة حرارة الغرفة على محول عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث أي طرد مركزي.

اليوم 18: التنظيف

  1. جفف العينة باستخدام تخفيف الميثانول في سلسلةH2O، بنسبة 20٪ (حجم/حجم)، 40٪، 60٪، 80٪ لمدة ساعة لكل منها في درجة حرارة الغرفة على مدور عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي.
  2. غسل العينة مرتين بميثانول 100٪ أثناء الدوران لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على دوار عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي.
  3. حضن العينة في مخففات DCM بنسبة 66٪ (حجم/حجم) في الميثانول لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة على مدور عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي.
  4. اغسل العينة مرتين بتيار مستمر 100٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على محول عجلة عند 8 دورات في الدقيقة، دون حدوث طرد مركزي.
  5. حضن العينة في DBE طوال الليل في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير.
  6. تخزين العينات على المدى الطويل في DBE لمدة تصل إلى سنة واحدة دون تأثير على إشارة التلوين.

4. تصوير المجهر الكونفوكالي

  1. ضع العينة المأخوذة في طبق زجاجي مقاس 35 مم مع قاع زجاجي #1.5.
  2. املأ الطبق بالسينامات الإيثيلي لغمر العينة بالكامل.
  3. ضع الطبق على الكونفوكال واضبط التركيز لتحديد أفضل مستوى يعطي أعلى إشارة.
  4. احصل على صورة بلاطة على أكثر مستوى سطوعا لالتقاط مساحة كبيرة من العينة، باستخدام صيغة 1024 × 1024 وسرعة 600.
    ملاحظة: استخدم هدفا أقل (10x أو 20x) لصورة البلاط لتقليل وقت التصوير وحجم الملف.
  5. استنادا إلى صورة البلاط، اختر المناطق ذات الاهتمام لجمع مسح Z عالي الدقة.
  6. التقط صورة z-scan عبر الأنسجة المزيلة، تغطي عمق النسيج بالكامل بأفضل دقة من المجهر، باستخدام تنسيق 1024 × 1024 وسرعة 600.
    ملاحظة: استخدم عدسة هدف 40x في الغمر بالزيت لإعطاء أفضل دقة ل HSC.
  7. احفظ ملفات الصور بصيغة LIF وعرض الملفات باستخدام Fiji أو ImarisViewer 11.0.0.

5. تحليل الصور لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد والتحليل الكمي للمراكز العالية العالية الفردية

  1. حول ملفات الصور إلى تنسيق IMS باستخدام ImarisFileConverter 10.2.0.
  2. استخدم نموذج Surface على Imaris 10.2.0 لاكتشاف الجسم في الصور.
  3. استخدم معالج Create لإجراء تحليل على منطقة ثلاثية الأبعاد محددة ذات اهتمام، ثم طبقها على الصورة كاملة.
    ملاحظة: استخدم هذا لتسريع عملية التحليل.
  4. اختر قناة المصدر، الشدة المطلقة، ثم قم بإلغاء تحديد زر السلس لتحديد عتبة الشدة للصورة كاملة.
  5. عدل العتبة لالتقاط جميع الكائنات في الصورة.
  6. استخدم عدد الفوكسل لتصفية أجسام الحطام.
  7. أنهي الساحر، اضغط زر الإحصائية للحصول على جميع القياسات الإحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمثيل التروية الناجحة وتثبيت كبد الفأر بلون موحد شاحب بلون بيج أصفر للكبد، مما يعكس إزالة الدم واختراق المثبت بكفاءة (الشكل 1A,B). يؤدي التروية غير السليمة إلى مناطق حمراء داكنة أو بنية من جلطات الدم، مما يقلل من وضوح البصر ويؤدي إلى إشارة خلفية عالية في هذه المناطق (الشكل 1C).

أثناء تنظيف الأنسجة، تحافظ عينات الأنسجة على مظهر بيج شاحب من التروية وحتى حضانة الأجسام المضادة الثانوي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول خط إنتاج لتحضير عينات قابل للتكرار وقابل للتكيف يؤدي إلى التصور ثلاثي الأبعاد والتحليل الكمي لمورفولوجيا HSC في نسيج الكبد السليم. يتيح دمج وسم الخلايا الفلورية الوراثية، وضخ الكبد في الموقع ، وطريقة تنظيف iDISCO+ المعدلة تصوير أحجام الأنسجة الكبيرة بدقة خلية واحدة مع الحفاظ على البنية المكانية للبيئة الدقيقة للكبد.

خطوة حاسمة لنجاح هذه الطريقة هي التروية الكبدية الفعالة. يمكن أن يؤدي التروية غير الكاملة إلى حبس الدم والدهون، مما يؤ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يدعم هذا العمل من خلال 1R01 DK136016-01 و5P30CA196521 (منحة مركز NCI). تم إجراء المجهر و/أو تحليل الصور في مركز المجهر والتصوير الحيوي المتقدم في كلية إيكان للطب في ماونت سيناي. وقد تم دعم هذا البحث جزئيا من معهد تيش للسرطان في ماونت سيناي، P30 CA196521 - منحة دعم مركز السرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة المضادة لعلاج RFP، أرنب، ممتصة مسبقاروكلاند600-401-379
طبق زجاجي مقاس 35 مم بأربع حجرات مع ميكروويل 20 مم، زجاج تغطية #1.5سيلفيسD35C4201.5N
حقن أناسد (حقن زيلازين)شركة أكورن، إنك.NDC 593990110-2020 ملغ/مل
أنابيب الطرد المركزي المخروطي: 50 مل فالكون352098
عواد القطنميدلاينMDS202000
قفل منحني  النوادي الدمويةفيشر ساينتيفك16-100-117
IgG مضاد للفئران AffiniPure Donkey Cy3 المترافقة (H+L)جاكسون إيمينوريسيرش712-165-153
مقص دقيق يعمل 4.75" منحني حاد/غير حادروبوز للأداة الجراحية
728501
ديبنزيل إيثر (DBE)، 98٪سيغما ألدريتش108014
ثنائي كلوروميثان (DCM)،  ≥ 99.8%سيغما ألدريتش270997
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، > 99.9%سيغما ألدريتشD8418
الأجسام المضادة الثانوية الممتزة بشدة من نوع Donkey Anti Rabbit IgG (H+L)، أليكسا فلور 647ثيرموفيشر ساينتيفيكA31573
مصل الحمارإي إم دي ميليبورS30
إيثيل سينامات، 99٪سيغما ألدريتش112372
مقص دقيق جدا للتحليل الدقيق؛ شفرة 24 ممفيشر ساينتيفكNC9232515
فأر الأجسام المضادة أحادية النسيلة F4/80ثيرموفيشر ساينتيفيك14-4801-82
فيجيالمعاهد الوطنية للصحة
الملقطفيشر ساينتيفكNC9214139
الجلايسينبيو-راد1610718
ملح الصوديوم هيبارينكيم-إمبكس29984
فرن هجينة هايبيدترياد ساينتيفكماكسي 14
بيروكسيد الهيدروجين، 30٪سيغما ألدريتش31642
برنامج Imaris 10.2.0أوكسفورد إنسترومنتس
برنامج ImarisFileConverter 10.2.0أوكسفورد إنسترومنتس
ImarisViewer 11.0.0أوكسفورد إنسترومنتس
قسطرة IVشركة إكسل إنترناشونال.EXE 26751
الكيتامين، حقن الهيدروكلوريدديشراB8U4100 ملغ/مل
برنامج LAS X 4.4.0.24861لايكا
المجهر الكونفوكال لايكا ستيلاريس 8لايكا
الميثانول، درجة HPLCفيشرA452-2
المدوران متعدد الأغراضشركة ساينتيفيك إندستريز، إنك.الطراز 151
إبر (27G × 1/2'')BD305109
بارافورمادهيلد، مسحوق، 95٪سيغما ألدريتش158127
مضخة بريستالتيةجيلسونموديل مينيبولز 3
أنبوب مضخة بيريستالتيك، ماسترفليكسثيرمو ساينتفيك96400-16أنابيب مضخة سيليكون دقيقة معالجة ببيروكسيد 3.1 مم × 7.6 متر لتر/ثانية، حجم L/S 16، شوكة خرطوم 1/8 بوصة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيتيفاSH30256.01معقم، درجة حموضة 7.0 - 7.2، بدون كالسيوم، مغنيسيوم
يوديد بروبيديوم، ≥ 94.0٪ (HPLC)سيغما ألدريتشP4170
شفرات الحلاقةأمريكان لاين66-0362
منصة هزازVWRموديل 200
صوديوم أزيد، ≥ 99.5%سيغما ألدريتشS2002
الخياطةإثيكونJ109T
حقنة (1 مل)BD309628
ترايتون إكس-100سيغماT9284
توين-20ثيرمو ساينتفيكJ20605-AP
القوارير، الغطاء المثبت بغطاء صلب مع بطانة ألمنيوم، مجمعة مسبقاسيغما ألدريتش27470-Uالمجلد 7 مل، قارورة زجاجية كهرمانية، O.D. ×؛ H 17 مم & مرة؛ 60 مم، خيط لمسافة 15-425

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Henderson, N. C., Rieder, F., Wynn, T. A. Fibrosis: from mechanisms to medicines. Nature. 587 (7835), 555-566 (2020).
  2. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  3. Amini-Salehi, E., et al. Global prevalence of nonalcoholic fatty liver disease: An updated review meta-analysis comprising a population of 78 million from 38 countries. Arch Med Res. 55 (6), 103043(2024).
  4. Ekstedt, M., et al. Fibrosis stage is the strongest predictor for disease-specific mortality in NAFLD after up to 33 years of follow-up. Hepatology. 61 (5), 1547-1554 (2015).
  5. Hagström, H., et al. Fibrosis stage but not NASH predicts mortality and time to development of severe liver disease in biopsy-proven NAFLD. J Hepatol. 67 (6), 1265-1273 (2017).
  6. Geng, Y., Schwabe, R. F. Hepatic stellate cell heterogeneity: Functional aspects and therapeutic implications. Hepatology. , (2025).
  7. Trinh, V. Q. -H., et al. Hepatic stellate cells maintain liver homeostasis through paracrine neurotrophin-3 signaling that induces hepatocyte proliferation. Sci Signal. 16 (787), eadf6696(2023).
  8. Sugimoto, A., et al. Hepatic stellate cells control liver zonation, size and functions via R-spondin 3. Nature. 640 (8059), 752-761 (2025).
  9. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  10. Gäbele, E., Brenner, D. A., Rippe, R. A. Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell. Front Biosci. 8 (4), 69-77 (2003).
  11. Marra, F. Hepatic stellate cells and the regulation of liver inflammation. J Hepatol. 31 (6), 1106-1119 (1999).
  12. Milani, S., et al. Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis. Gastroenterology. 98 (1), 175-184 (1990).
  13. Sato, M., Suzuki, S., Senoo, H. Hepatic stellate cells: Unique characteristics in cell biology and phenotype. Cell Struct Funct. 28 (2), 105-112 (2003).
  14. Du, K., Jun, J. H., Dutta, R. K., Plasticity Diehl, A. M. heterogeneity, and multifunctionality of hepatic stellate cells in liver pathophysiology. Hepatol Commun. 8 (5), e0411(2024).
  15. Trivedi, P., Wang, S., Friedman, S. L. The power of plasticity-Metabolic regulation of hepatic stellate cells. Cell Metab. 33 (2), 242-257 (2021).
  16. Niki, T., et al. Comparison of glial fibrillary acidic protein and desmin staining in normal and CCl4-induced fibrotic rat livers. Hepatology. 23 (6), 1538-1545 (1996).
  17. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  18. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  19. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (1), 43-55 (2014).
  20. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  21. Mederacke, I., et al. Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology. Nat Commun. 4, 2823(2013).
  22. Slater, T. F., Cheeseman, K. H., Ingold, K. U. Carbon tetrachloride toxicity as a model for studying free-radical mediated liver injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 311 (1152), 633-645 (1985).
  23. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  24. Shrirao, A. B., et al. Autofluorescence of blood and its application in biomedical and clinical research. Biotechnol Bioeng. 118 (12), 4550-4576 (2021).
  25. Croce, A. C., Bottiroli, G. Lipids: Evergreen autofluorescent biomarkers for the liver functional profiling. Eur J Histochem. 61 (2), 2808(2017).
  26. Jafree, D. J., Long, D. A., Scambler, P. J., Moulding, D. Tissue clearing and deep imaging of the kidney using confocal and two-photon microscopy. Methods Mol Biol. , 103-126 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة