تقييم تأثيرات التريبتولايد على الجيفيرين والكوليبيستين والالتهام الذاتي في نموذج الفأر Aβ1-42

ملخص

يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج فأر مجمع يشبه مرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42 وتقييم تأثيرات التريبتولايد على البروتينات المرتبطة بالمشبك العصبي المثبط للحصين، وإشارات PI3K/Akt/GSK-3β، والمؤشرات المرتبطة بالالتهام الذاتي.

الملخص

يرتبط مرض الزهايمر بخلل في وظيفة التشابك العصبي، لكن الإجراءات الموحدة لتقييم كيفية تأثير الأمراض الناتجة عن Aβ على البروتينات المثبطة المرتبطة بالمشبك العصبي والإشارات المرتبطة بالالتهام الذاتي بعد تدخل المرشحين لا تزال محدودة. يصف هذا البروتوكول سير عمل لإنشاء نموذج فأر شبيه بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42 وتقييم تأثيرات التريبتولايد على الجيفيرين في الحصين، كوليبيستين، إشارات PI3K/Akt/GSK-3β، والمؤشرات المرتبطة بالالتهام الذاتي. تتلقى الفئران البالغة C57BL/6J حقنا ثنائي الجانب داخل البطين الداخلي للبطين من Aβ1-42 محضرة في ظروف تحفز التجمع، تليها إعطاء يومي داخل الصفاق للتريبتولايد مع أو بدون مثبط PI3K LY294002. يتم تقييم التعلم المكاني والذاكرة باستخدام اختبار متاهة الماء موريس. يتم تقييم إصابة الخلايا العصبية في الحصين وترسيب Aβ بواسطة تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين والكيمياء المناعية Aβ، ويتم تحليل محللات الحصين بواسطة الوتات الغربية لقياس الجيفيرين، والجيفيرين الفوسفوريل، والكوليبيستين، وبروتينات الإشارة PI3K/Akt/GSK-3β، وLC3-II/I، وp62. تشمل الاعتبارات الإجرائية الرئيسية تحضير Aβ1-42 الموحد، الحقن المجسم الدقيق، ظروف اختبار سلوكية متسقة، اختيار منطقة الاهتمام بشكل أعمى، وتحليل الصور والكثافات الموحد. باستخدام هذا السير العملي، أدى إعطاء Aβ1-42 إلى حدوث عجز في التعلم المكاني والذاكرة، وإصابة في الخلايا العصبية في الحصين، وترسيب Aβ، وانخفاض تعبير الجيفيرين والكوليبيستين، وتغيير في إشارات PI3K/Akt/GSK-3β، وزيادة تراكم LC3-II/I وp62. عكس تريبتولايد جزئيا هذه التغيرات السلوكية والنسيجية والجزيئية، بينما LY294002 خفف من تأثيراته. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم التغيرات الجزيئية الناتجة عن Aβ في الحصين والتدخلات المرشحة، مع الاعتراف بأن هذا النموذج لا يعيد إنتاج التطور المزمن متعدد العوامل لمرض الزهايمر البشري.

المقدمة

مرض الزهايمر (AD) هو اضطراب تنكسي عصبي تقدمي يتميز بتدهور معرفي، وضعف في الذاكرة، واضطرابات سلوكية، ويمثل أحد الأسباب الرئيسية للخرف لدى كبار السن. على الرغم من أن ترسيب الأميلويد β (Aβ)، وأمراض التاو، وخلل التشابك، والالتهاب العصبي، وتوازن البروتين المعطل قد تم الارتباط به على نطاق واسع في تكوين مرض مرض الزهايمر، إلا أن الآليات الجزيئية التي تربط السمية المرتبطة ب Aβ باضطراب البروتين المشبكي المثبط لا تزال غير مفهومة بشكل كامل 1,2,3,4 . قد يخل الخلل التشابكي التثبيطي التوازن بين الإثارة والتثبيط في الدوائر العصبية، مما يساهم في عدم استقرار الشبكة وضعف الإدراك. ومع ذلك، فإن أحداث الإشارات داخل الخلية التي تنظم بروتينات السقالة المثبطة المرتبطة بالمشابك العصبية تحت ظروف مرضية شبيهة ب AD الناتجة عن Aβ تتطلب مزيدا من التوضيح⁵.

الجيفيرين هو بروتين رئيسي لدعم ما بعد المشبك يثبت ويثبت مستقبلات الناقلات العصبية المثبطة، بما في ذلك مستقبلات الجلايسين ومستقبلات حمض γ-أمينوبيوتيريك من النوع A، في مواقع ما بعد المشبك⁶. كوليبيستين، المشفر بواسطة ARHGEF9، هو عامل تبادل نوكليوتيدات الجوانين يتفاعل مع الجيفيرين ويعزز التجمع وتحديد موقع الغشاء للمكونات المشبكية المثبطة⁷. لذلك، فإن التفاعل الوظيفي بين جيفيرين وكوليبيستين ضروري لتنظيم وصيانة ولدونة المشابك المثبطة. قد يؤثر اضطراب هذا المركب البروتيني على النقل العصبي المثبط ويساهم في حدوث عجز معرفي. ومن الجدير بالذكر أن استقرار الجيفيرين والتجمع المشبكي يمكن تنظيمه بواسطة آليات تعتمد على الفسفرة. تم الإبلاغ عن تأثير الإشارات المرتبطة بالأوليغومر Aβ على الكينازات مثل كيناز جليكوجين سينثاز-3β (GSK-3β)، والتي قد تعزز فسفر الجيفيرين عند السيرين 270 وبالتالي تؤثر على تجمع وتحلل الجيفيرين. تشير هذه النتائج إلى أن تنظيم جيفيرين بوساطة كيناز قد يمثل رابطا جزيئيا مهما بين علم الأمراض المرتبط ب Aβ وخلل التشابك المثبط ^8,9.

يعد مسار PI3K/Akt مسارا رئيسيا للإشارات داخل الخلية يشارك في بقاء الخلايا العصبية، واللدونة المشبكية، وتوازن البروتين، وتنظيم الالتهام الذاتي. يمكن لنشاط الأكت أن يثبط GSK-3β من خلال الفسفرة المثبطة (التهبث)، مما يعدل الركائز اللاحقة المشاركة في وظيفة الخلايا العصبية واستقرار التشابك العصبي. تم ربط خلل تنظيم إشارات PI3K/Akt/GSK-3β بإصابة عصبية مرتبطة بمرض الزهايمر وقد يساهم في كل من ضعف التشابك العصبي وتدهور البروتين^{غير الطبيعي 10,11}. بالتوازي، التهام الذاتي هو مسار أساسي لتحلل داخل الخلية يزيل العضيات التالفة والبروتينات غير المطوية. ارتبط خلل الالتهام الذاتي والليسوسوم ارتباطا وثيقا بتراكم Aβ، وأمراض التاو، وتلف الخلايا العصبية في السنة^{الثانية عشرة} من الميلاد. ومع ذلك، فإن تغييرات LC3-II/I وحدها لا تستطيع التمييز بين زيادة تكوين الأوتوفاجوسومات وضعف التحلل الذاتي الذاتي؛ لذلك، هناك حاجة إلى مؤشرات إضافية مثل P62 لتقييم التغيرات المتعلقة بالتدفق الذاتي بشكل أفضل. معا، تدعم هذه الملاحظات الحاجة إلى فحص نشاط PI3K/Akt، والتنظيم الوسيط ل GSK-3β لجيفيرين، والمؤشرات المرتبطة بالالتهام الذاتي ضمن نفس الإطار التجريبي.

تريبتوليد، وهو ديتربين ثلاثي أكسيد نشط بيولوجيا تم عزله من تريبيريجيوم ويلفوردي، تم الإبلاغ عن أنه يمارس تأثيرات مضادة للالتهابات، وتعديل المناعة، وحماية عصبية¹³. أشارت دراسات سابقة إلى أن التريبتولايد يمكن أن يحسن الأداء المعرفي ويحافظ على البروتينات المثبطة المرتبطة بالمشبك في نماذج شبيهة بمرض الزهايمر. ومع ذلك، لم يتم تعريف العلاقة الميكانيكية بين معالجة التريبتوليد، وتنشيط مسار PI3K/Akt، وفسفرة الجيفيرين بوساطة GSK-3β، وتعبير كوليبيستين، والتغيرات في البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي بشكل كامل. ما إذا كان التريبتولايد ينظم تعبير الجيفيرين والكوليبستين في الحصين من خلال آلية مرتبطة ب PI3K/Akt/GSK-3β في نموذج فأر شبيه بمرض الزهايمر المستحث ب Aβ1-42 لا يزال^{غير واضح.}

مقارنة بنماذج الزهايمر المعدلة وراثيا المزمنة، مثل فئران APP/PS1 أو 5xFAD، والنماذج المعتمدة على الاعتلال الدماغي، يوفر الحقن داخل البطين المجمع Aβ1-42 نهجا سريعا وسهل الوصول تقنيا لتحفيز إصابة الحصين المرتبطة ب Aβ وضعف معرفي. يكون هذا البروتوكول مناسبا عندما يكون الهدف التجريبي هو تقييم السمية العصبية قصيرة المدى الناتجة عن Aβ، والتغيرات الجزيئية في الحصين، والتأثيرات المرتبطة بالتدخل على مسارات الإشارات المحددة. ومع ذلك، لا يعيد هذا النموذج إنتاج الأميلويد المزمن، أو أمراض التاو، أو التغيرات الوعائية، أو تعقيد المناعة العصبية، أو التقدم المعتمد على العمر لمرض الزهايمر البشري. لذلك، يجب تفسير النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول على أنها أمراض شبيهة بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ، ويفضل التحقق منها في النماذج المعدلة وراثيا المزمنة، أو النماذج المرتبطة بالتاو، أو الأنظمة العصبية المشتقة من الإنسان. على الرغم من الأدلة السابقة التي تربط بين أمراض Aβ، وإشارات PI3K/Akt/GSK-3β، والبروتينات المثبطة المرتبطة بالمشبك العصبي، والاضطرابات المرتبطة بالالتهام الذاتي بأمراض شبيهة بمرض الزهايمر، إلا أن القليل من البروتوكولات تدمج الاختبارات السلوكية، والتقييم النسيجي للحصين، والكيمياء المناعية Aβ، وتحليل البروتينات المرتبطة بالمشبك المثبط، وتقييم إشارات الكيناز، واكتشاف العلامات المرتبطة بالالتهام الذاتي ضمن نموذج تدخل واحد مستحث بواسطة Aβ1-42. تحد هذه الفجوة المنهجية من التقييم القابل لتكرار ما إذا كانت المركبات المرشحة تعدل التغيرات في البروتينات المثبطة المرتبطة بالمشبك العصبي من خلال مسارات إشارات داخل الخلية محددة.

هدف هذا البروتوكول هو توفير سير عمل قابل للتكرار لتقييم تعبير الجيفيرين والكوليبستين في الحصين وآلياتهما التنظيمية المرتبطة بهما في نموذج فأر شبيه باضطراب ثنائي القطب Aβ1-42 معالج بالتريتوليد، مع أو بدون مثبط PI3K LY294002. المساهمة الأصلية لهذا العمل هي دمج إعطاء Aβ1-42 المجسم، والتعديل الدوائي لمسارات الإشارة، واختبار متاهة الماء موريس، والتقييم النسيجي والكيميائي المناعي، وتحليل البقعة الغربية للبروتينات المرتبطة بالمشبك المثبط، وإشارات PI3K/Akt/GSK-3β، والمؤشرات المرتبطة بالالتهام الذاتي. كانت الفرضية العملية أن الأمراض الشبيهة بالزهايمر الناتجة عن Aβ1-42 ترتبط بضعف إشارات PI3K/Akt، وتغير فسفرة الجيفيرين المرتبطة ب GSK-3β، وانخفاض تعبير الجيفيرين والكوليبيستين في الحصين، وتراكم غير طبيعي للبروتينات المرتبطة بالالفافيا الذاتية، في حين أن علاج التريبتولايد سيعكس جزئيا هذه الشذوذات السلوكية والجزيئية.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في جامعة هوبي للطب، وأجريت وفقا للإرشادات المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (رقم SYXK2019-0031). يجب إجراء جميع الإجراءات التي تشمل الحيوانات، وAβ1-42، والتريبتوليد، و LY294002، والبارافورمالديهايد، والإكسيلين، والإيثانول، والكواشف الكيميائية المضيئة باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر، وقفازات، ونظارات واقية. يجب جمع جثث الحيوانات، وأنسجة الدماغ، والمستهلكات الملوثة ب Aβ، ونفايات بارافورمالديهايد، ونفايات الزيلين، والمواد الملوثة ب ECL بشكل منفصل والتخلص منها وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية والتخلص من النفايات الكيميائية. تم إجراء تحليل الصور باستخدام ImageJ. لتحليل الهيستوكيميائية المناعية، تم تحويل الصور إلى تدرج رمادي 8-بت أو خضوع لفك الالتفاف اللوني لعزل التلوين الإيجابي ل DAB. تم تطبيق نفس العتبة على جميع الصور ضمن نفس التجربة. تم قياس مساحة التلوين الإيجابية، والمنطقة الكلية ذات الاهتمام، والكثافة المتكاملة. بالنسبة للتلمع الغربي، تم قياس شدة الشريط باستخدام أداة تحليل الجل بعد طرح الخلفية. تم تطبيع مستويات البروتين المستهدف إلى β-أكتين، بينما تم تطبيع البروتينات المفسفرة إلى مستويات البروتين الكلية المقابلة لها.

المواد والكواشف المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد، بما في ذلك أسماء المنتجات، والمصنعين، وأرقام الكتالوج أو الطرازات، والوصف العام.

الحيوانات والتجميع التجريبي
تم شراء ثمانية وأربعين فأرا بالغة من نوع C57BL/6J، بما في ذلك 24 ذكرا و24 أنثى، تتراوح أعمارهم بين 10-12 أسبوعا ووزنها 22-28 جرام، من مركز التجارب الحيوانية في جامعة هوبي الطبية. تم إيواء الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض عند 22 ± 2 درجة مئوية مع وصول حر إلى ماء معقم وطعام القوارض القياسي. بعد أسبوع واحد من التأقلم، تم تقسيم الفئران عشوائيا إلى أربع مجموعات: مجموعة الضابطة، مجموعة النموذج الشبيه بالزهايمر المستحث بواسطة Aβ1-42، مجموعة المعالجة بالتريتوليد، ومجموعة العلاج المشترك LY294002 زائد التريبتوليد، مع 12 فأرا في كل مجموعة. تم موازنة الفئران الذكور والإناث عبر المجموعات بأكبر قدر ممكن من التساوية.

تم إذابة ببتيد Aβ1-42 في محلول ملحي عادي معقم إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام/ميكرولتر. لتحضير Aβ1-42 في ظروف تحفيز التجمع، تم حضن المحلول عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام في حمام مائي دائري، وخلطه بلطف قبل الاستخدام، وترك على الثلج أثناء الحقن. تم تكييف هذا الشرط من إجراءات التجميع Aβ42 المنشورة سابقا. في هذه الدراسة، لم يتم تمييز حالة التجميع لدفعة Aβ1-42 المحقونة بالضبط بشكل مستقل بواسطة فلورة ثيوفلافين T أو SDS-PAGE/البلوت الغربي أو المجهر الإلكتروني الناقل. لذلك، يشير مصطلح "Aβ1-42 المجمع" في هذا البروتوكول إلى Aβ1-42 الذي تم إعداده تحت ظروف حضانة محفزة للتجمع.

لتأسيس النموذج، تم تخدير الفئران عن طريق حقن 10٪ بنتوباربيتال صوديوم داخل الصفاق بجرعة 0.04 مل/10 جرام وزن الجسم. تم تأكيد التخدير الكافي من خلال غياب انسحاب الدواسات وردود فعل القرنية. ثم تم تثبيت كل فأر على جهاز ستيريوتاكسي، وحلق فروة الرأس وتعقيم باليودوفور أو إيثانول بنسبة 75٪. تم إجراء شق في منتصف الجمجمة لكشف الجمجمة، وتم تحديد البريغما تحت المجهر المجسم. تم تعديل الجمجمة بحيث يتم وضع البريغما واللامبدا على نفس المستوى الأفقي.

تم إجراء حقن البطين الجانبي الثنائي باستخدام الإحداثيات التالية بالنسبة للبريغما: الأمام الخلفية، −0.50 مم؛ متوسط الجانب ±1.00 مم; والظهري البطني، على بعد −3.00 مم من سطح الجمجمة. تم حقن حجم إجمالي 2 ميكرولتر مجمع من محلول Aβ1-42 ببطء (2 ميكرولتر/دقيقة) في كل بطين جانبي باستخدام حقنة دقيقة. تم إجراء الحقن بسرعة منخفضة وثابتة لتقليل تلف الأنسجة والارتجاع. بعد الحقن، تركت الإبرة في مكانها لمدة حوالي 5 دقائق، ثم تم سحبها تدريجيا. تلقت فئران التحكم حجما مساويا من المحلول الملحي الطبيعي المعقم عند نفس الإحداثيات وباستخدام نفس الإجراء الجراحي. بعد الحقن، تم إغلاق شق فروة الرأس باستخدام الغرز أو مشابك الجرح، ووضعت الفئران في قفص تعافي دافئ حتى استعادت وعيها. تمت مراقبة التعافي بعد العملية، ووزن الجسم، وشفاء الجروح، وسلوك العناية النفسية، والنشاط الحركي، وعلامات الألم أو الضيق يوميا.

تم بدء التدخل الدوائي بعد أسبوعين من الحقن المجسم، بعد أن اعتبر النموذج مستقرا. تم إذابة التريبتولايد في محلول ملحي طبيعي يحتوي على 4٪ بروبيلين جليكول وأعطي داخل الصفاق مرة واحدة يوميا لمدة 30 يوما متتاليا. تلقت المجموعة التي عولجت بالتريبتوليد تريبتوليد بجرعة 0.2 ملغ/كغ يوميا، بينما تلقت مجموعة العلاج المشترك LY294002 مع التريبتوليد تريبتوليد مع مثبط PI3K LY294002 بجرعة 0.3 ملغ/كغ مرة واحدة يوميا لمدة 30 يوما متتاليا. تلقت مجموعة الضابطة ومجموعة النماذج الشبيهة ب AD المستحثة ب Aβ1-42 كميات متساوية من محلول المركبات باستخدام نفس جدول الحقن¹⁶.

اختبار متاهة الماء موريس
تم تقييم التعلم المكاني والذاكرة باستخدام متاهة موريس المائية بعد 24 ساعة من الإعطاء النهائي للدواء. تكونت المتاهة المائية من بركة دائرية مملوءة بالماء تحافظ على درجة حرارة 22 °م ± 1 °م. تم وضع إشارات بصرية حول المسبح وبقيت دون تغيير طوال التجربة. خلال مرحلة الملاحة في المكان، كانت المنصة المخفية ثابتة في الربع المستهدف. قبل الاختبار يوميا، كان يسمح للفئران بالتأقلم مع غرفة الاختبار لمدة تقارب 30 دقيقة.

تم إجراء اختبار الملاحة في المكان لمدة 6 أيام متتالية. في كل تجربة، كان يوضع الفأر برفق في الماء، مواجها جدار المسبح من أحد الأجزاء الابتدائية، ويسمح له بالبحث عن المنصة المخفية لمدة تصل إلى 60 ثانية. إذا وجد الفأر المنصة خلال 60 ثانية، يسمح له بالبقاء على المنصة لمدة 15 ثانية. إذا فشل الفأرة في تحديد موقع المنصة خلال 60 ثانية، كانت توجهها إلى المنصة وتسمح لها بالبقاء هناك لمدة 20 ثانية لتسهيل دمج الذاكرة المكانية. خضع كل فأر لأربع تجارب يوميا، وتم تسجيل زمن الهروب ومسافة السباحة وسرعة السباحة باستخدام نظام تتبع فيديو آلي.

في اليوم السابع، تم إزالة المنصة لإجراء المحاكمة. وضع الفأر في الماء من الربع المقابل للموقع الأصلي للمنصة وسمح له بالسباحة بحرية لمدة 60 ثانية. تم تسجيل عدد عبورات المنصات ونسبة الوقت الذي قضوه في الربع المستهدف. بعد كل تجربة، كان يجفف الفأر ويعاد إلى قفص دافئ لمنع انخفاض حرارة الجسم^17,18.

جمع الأنسجة
بعد اختبارات السلوك، تم تخدير الفئران بعمق عن طريق حقن 10٪ بنتوباربيتال صوديوم داخل الصفاق بجرعة 0.04 مل/10 جرام من وزن الجسم. تم اختيار ثمانية فئران من كل مجموعة عشوائيا لاستخراج بروتين الحصين. تمت إزالة أدمغتهم بسرعة على الجليد، وتم تشريح أنسجة الحصين الثنائية على سطح بارد كالثلج. وضعت عينات الحصين في مبردات مبردة مسبقا، وتم تجميدها في النيتروجين السائل، وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى استخراج البروتين.

أما الفئران الأربعة المتبقية من كل مجموعة فقد استخدمت للتحليلات النسيجة والكيميائية المناعية. تحت التخدير العميق، تم تثبيط الفئران عبر القلب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات حتى أصبح الكبد شاحبا، تلاها 4٪ بارافورمالديهايد. تمت إزالة الأدمغة بعناية وتثبيتها لاحقا في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد التثبيت، تم إرسال أنسجة الدماغ إلى منصة التجارب المرضية، حيث تم دمج البارافين والتشريع اللاحق. تم التعامل مع البارافورمالديهايد في غطاء بخار كيميائي، وتم جمع النفايات المحتوية على بارافورمالديهايد بشكل منفصل وفقا لمتطلبات التخلص المؤسسي من النفايات الكيميائية.

صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين
تم قطع أنسجة دماغية مدمجة بالبارافين إلى مقاطع تاجية بحجم 4 ميكرومتر تحتوي على الحصين. تم خبز الأقسام عند حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، ثم تم إزالة البارافين مرتين في الزيلين لمدة 10 دقائق لكل منها، ثم إعادة ترطيبها من خلال محاليل إيثانول متدرجة (100٪، 95٪، 85٪، و75٪) تليها ماء مقطر (5 دقائق لكل خطوة). بعد إعادة الترطيب، تم صبغ الأجزاء بالهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق، وشطفها بماء الصنبور الجاري، وتم تمييزها لفترة وجيزة بالكحول الحمضي (2 ثانية) عند الحاجة، وصبغها بماء الصنبور الجاري. ثم تم تلوين الأقسام بالإيوزين لمدة 5 دقائق، ثم جففها عبر الإيثانول المدرج، وتطهيرها بالزيلين مرتين لمدة 5 دقائق لكل منها، وتركيبها على راتنج محايد.

تمت ملاحظة شكل الحصين تحت المجهر الضوئي. تم التقاط الصور من نفس المنطقة الفرعية للحصين عبر جميع المجموعات، باستخدام معلمات التكبير والتصوير 20×. تم تقييم تلف الخلايا العصبية بناء على كثافة الخلايا العصبية، وتكوين النوى، والترتيب غير المنظم باستخدام برنامج تحليل الصور من قبل باحث أعمى عن تخصيص المجموعة¹⁹.

الكيمياء المناعية Aβ
بالنسبة لكيمياء الهيستومياء المناعية Aβ، تم إزالة البارافين من البارافين وإعادة ترطيبه كما هو موصوف لتلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين. تم إجراء استرجاع المستضدات في مخزن استرجاع المستضدات EDTA عند pH 8.0 عن طريق تسخين الأقسام في فرن الميكروويف بقوة عالية لمدة 3 دقائق مرتين. تركت الأقسام لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة ثم غسلت ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها. تم منع نشاط البيروكسيداز الداخلي باستخدام بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تلاها غسل PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها. تم حظر الارتباط غير النوعي بمصل ماعز طبيعي بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم حضانة الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع جسم مضاد أولي ضد Aβ مخفف بمقدار 1:200 في PBS. بعد الحضانة، تم غسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها، ثم حضنتها بجسم مضاد ثانوي مرتبط ب HRP لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسل باستخدام PBS، تم تطبيق ركيزة DAB، وتمت مراقبة تطور اللون تحت المجهر. توقف التفاعل بالماء المقطر بمجرد ظهور التلوين البني الإيجابي. تم تلوين الأجزاء بالهيماتوكسيلين، وتجفيفها عبر الإيثانول المتدرج، وإزالتها بالزيلين، وتركيبها على راتنج محايد. تم التقاط الصور من نفس المنطقة الفرعية للحصين عبر جميع المجموعات باستخدام إعدادات مجهرية متطابقة بتكبير 20×. تم قياس التلوين المناعي Aβ باستخدام برامج تحليل الصور. تم الحفاظ على عتبة التلوين الإيجابية ثابتة عبر جميع الصور، وتم حساب ترسيب Aβ كمساحة التلوين الإيجابية مقسومة على إجمالي عدد الخلايا في كل حقل مجهري.

استخراج البروتين بالحصين وتحليل البقعة الغربية
تم الاحتفاظ بأنسجة الحصين المجمدة على الجليد وتجانسها في محلول تحلل بارد جدا من RIPA يحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتاز. تم حضن المتجانسات على الثلج لمدة 30 دقيقة وتحويلها إلى دوامات متقطعة لضمان التحلل الكافي. ثم تم طرد المركزي على 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، وجمعت المواد الفائقة لتحليل البروتين. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، تم تحضير معايير BSA وعينات البروتين في نسخة مكررة، وخلطها مع كاشف BCA العامل، وحضنتها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وقياسها عند 562 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولوب. تم حساب تركيزات البروتين وفقا للمنحنى القياسي، وتم تعديل جميع العينات لنفس التركيز النهائي قبل الرحلان^{الكهربائي 20}.

تم فصل 20 ميكروغرام من البروتين الكلي من كل عينة حصين بواسطة 12٪ SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF. تم إجراء الرحلان الكهربائي عند 80 فولت للتكديس و120 فولت للفصل. تم نقل البروتينات إلى أغشية PVDF مفعلة في الميثانول باستخدام النقل الرطب عند 100 فولت لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد النقل، تم حجب الأغشية ب 5٪ من BSA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم تم حضن الأغشية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد الجيفيرين (تخفيف 1:1000)، الجيفيرين المفسفر (تخفيف 1:500)، كوليبستين (تخفيف 1:1000)، PI3K (تخفيف 1:1000)، Akt (تخفيف 1:1000)، Akt المفسفر (تخفيف 1:1000)، GSK-3β (تخفيف 1:1000)، GSK-3β المفسفر (تخفيف 1:1000)، التخفيف المفسفر GSK-3β (تخفيف 1:1000)، LC3 (تخفيف 1:1000)، p62 (تخفيف 1:1000) و β-أكتين (تخفيف 1:5000). بعد الغسل باستخدام TBST، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية متقاربة ب HRP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (تخفيف 1:5000). تم تصور أشرطة البروتين باستخدام ركيزة كيميائية مضيئة من ECL وتم التقاطها باستخدام نظام تصوير كيميائي للتلوين. تم قياس شدة النطاق باستخدام برامج تحليل الصور. تم تطبيع مستويات التعبير الكلي للبروتين إلى β-أكتين. تم تضمين صور البقعة الغربية عالية الدقة غير المقتطعة في المواد الإضافية.

البيانات الإحصائية
تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام التحليل الإحصائي وبرامج توليد الرسوم البيانية. تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD، كما هو موضح في أسطوانات الأرقام. تم إجراء اختبارات سلوكية وقياس الصور بواسطة باحثين غير مدركين لتوزيع المجموعات. تم تحليل زمن الهروب خلال مرحلة تدريب متاهة الماء موريس باستخدام تحليل التحليل السطحي (ANOVA) ثنائي الاتجاه بمقاييس متكررة، مع المجموعة ويوم التدريب كعاملين. تم تحليل بيانات تجارب المسبار، والقياس النسيجي، والقياس المناعي الكيميائي للسم، وقياس كثافة الكتلة الغربية باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه. تم تعريف الدلالة الإحصائية بأنها p < 0.05. تم استخدام تدوين الدلالة القياسي كما يلي: *p < 0.05، **p < 0.01، و ***p < 0.001. تم الإبلاغ عن أحجام العينات الدقيقة في أساطير الأشكال المقابلة. توزع الذكور والإناث بالتساوي بين المجموعات التجريبية. ومع ذلك، لم يتم إجراء تحليل إحصائي طبقي للجنس لأن الدراسة لم تصمم أو تدعم الكشف عن التأثيرات الخاصة بالجنس. يتم الاعتراف بهذا القيد في قسم النقاش.

النتائج

ضعف التعلم والذاكرة في الفئران الشبيهة بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42 وتحسن جزئي بعد علاج التريبتوليدي

لتأسيس نموذج فأر شبيه ب AD مستحث بواسطة Aβ1-42، تم حقن Aβ1-42 المجمع بشكل ستيريتاكسي في البطينات الجانبية الثنائية لفئران C57BL/6J. بعد تأسيس النموذج، تم علاج الفئران بمركبات أو تريبتوليد أو تريبتوليد مع مثبط PI3K LY294002. ثم تم تقييم التعلم المكاني والذاكرة باستخدام متاهة موريس المائية.

خلال مرحلة التنقل في المكان التي استمرت 6 أيام، انخفض زمن الهروب تدريجيا عبر جميع المجموعات، مما يشير إلى أن الفئران اكتسبت مهمة التعلم المكاني من خلال التدريب المتكرر (الشكل 1A). ومع ذلك، أظهرت الفئران الشبيهة باضطراب الزهايمر الناتجة عن Aβ1-42 زمن استجابة أطول باستمرار في الهروب مقارنة بالفئران الضابطة، خاصة في أيام التدريب المتأخرة، مما يشير إلى ضعف في التعلم المكاني. أدى علاج التريبتولايد إلى تقليل زمن الهروب مقارنة بمجموعة النماذج الشبيهة بالزهايمر المستحثة بواسطة Aβ1-42، بينما أدى العلاج المشترك مع LY294002 إلى ضعف هذا التحسن. تشير هذه النتائج إلى أن التريبتولايد حسن جزئيا من ضعف التعلم المكاني الناتج عن Aβ1-42، وقد تم تخفيف هذا التأثير بواسطة تثبيط PI3K.

دعمت مسارات السباحة التمثيلية هذه التغيرات السلوكية بشكل أكبر (الشكل 1B). أظهرت فئران التحكم نمط بحث أكثر مباشرة وموجها نحو الهدف حول موقع المنصة، بينما أظهرت فئران شبيهة ب AD المستحثة ب Aβ1-42 مسار سباحة متفرق وغير فعال. أظهرت الفئران المعالجة بالتريبتولايد سلوك بحث أفضل، مع تركيز أكبر في المسارات حول المنطقة المستهدفة. على النقيض من ذلك، أظهرت الفئران التي عولجت ب LY294002 والتريبتولايد بحثا أقل كفاءة من تلك التي عولجت بالتريتوليد فقط. في تجربة المسبار التي أجريت بعد إزالة المنصة، عبرت الفئران الشبيهة باضطراب ثنائي الفعل ب Aβ1-42 الموقع الأصلي للمنصة أقل مرات من فئران التحكم، مما يشير إلى ضعف في الاحتفاظ بالذاكرة المكانية (الشكل 1C). زاد علاج التريبتولايد من عدد عبور المنصات، بينما قلل LY294002 المعالجة المشتركة هذا التأثير. وبالمثل، انخفضت نسبة الوقت الذي يقضى في الربع المستهدف في الفئران الشبيهة بمرض Aβ1-42 مقارنة بالفئران الضابطة، وزادت بعد علاج التريبتوليد، وانخفضت مرة أخرى بعد LY294002 العلاج المشترك (الشكل 1D).

تظهر هذه النتائج السلوكية معا أن الحقن الثنائي داخل البطين الداخلي المجمع Aβ1-42 تسبب في نقص في التعلم المكاني والذاكرة لدى الفئران. عكس تريبتولايد جزئيا هذه الاضطرابات السلوكية، بينما LY294002 خفف من تأثير التريبتوليدات الوقائي، مما يشير إلى أن إشارات PI3K/Akt قد تساهم في التأثيرات السلوكية التي لوحظت في هذا النموذج.

تسببت حقن Aβ1-42 في إصابة عصبية في الحصين وترسيب Aβ، والتي تم تخفيفها بواسطة التريبتوليد.

للتحقق بشكل أكبر من وجود تغيرات مرضية شبيهة بمرض الزهايمر الناتجة عن Aβ1-42 وتقييم تأثير التريبتولايد على إصابة الحصين، تم إجراء تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين وتحليل الكيمياء المناعية Aβ على مقاطع الدماغ من كل مجموعة.

أظهر التلوين العالي أن الخلايا العصبية في مجموعة الضابطة كانت مرتبة بكثافة ومنتظمة، مع شكل خلوي وبنية نووية واضحة نسبيا (الشكل 2A). في المقابل، أظهرت الفئران الشبيهة بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42 تلفا واضحا في الخلايا العصبية في الحصين، تميز بترتيب خلوي غير منظم، وانخفاض كثافة الخلايا العصبية، وزيادة التكثف النووي. حسن علاج التريبتولايد جزئيا شكل الخلايا العصبية في الحصين، مع ترتيب خلوي أكثر حفظا وتقليل وضوح البكنويات النووية مقارنة بمجموعة النماذج المستحثة بواسطة Aβ1-42. ومع ذلك، فإن العلاج المشترك مع LY294002 خفف من التأثير الوقائي للتريبتوليد، كما يظهر في اضطراب وإصابة عصبية أكثر وضوحا مقارنة بالمجموعة التي عولجت بالتريتوليد.

ثم أجريت الكيمياء المناعية Aβ لتقييم ترسيب Aβ في الحصين (الشكل 2B). لوحظ تلوين إيجابي Aβ طفيف في مجموعة التحكم، بينما أظهرت مجموعة النماذج الشبيهة ب AD المستحثة ب Aβ-42 زيادة ملحوظة في إشارات Aβ البنية الموجبة باللون البنوي. أدى علاج التريبتولايد إلى تقليل التلوين الإيجابي ب Aβ مقارنة بمجموعة النموذج، مما يشير إلى أن التريبتولايد خفف من ترسيب Aβ في هذا النموذج. على النقيض من ذلك، أظهرت الفئران التي عولجت ب LY294002 زائد التريبتوليد زيادة في التلوين الإيجابي Aβ مقارنة بالفئران التي عولجت بالتريتوليد فقط. أكد التحليل الكمي هذه الملاحظات النسيجة. تم زيادة مساحة الإشارة الموجبة Aβ التي تم تطبيعها إلى إجمالي عدد الخلايا في كل حقل مجهري في مجموعة النموذج الشبيه بالاضطراب الناتج عن Aβ1-42 مقارنة بمجموعة التحكمة، وانخفضت بعد علاج التريبتوليد، وزادت جزئيا مرة أخرى بعد LY294002 المعالجة المشتركة (الشكل 2B).

تشير هذه النتائج إلى أن حقن Aβ1-42 تسبب في إصابة عصبية الحصين وتراكم Aβ، بينما خفف التريبتوليد جزئيا من هذه التغيرات المرضية. يشير الانعكاس الذي لوحظ بعد LY294002 العلاج المشترك إلى أن إشارات PI3K/Akt قد تساهم في تأثير الحماية للتريبتوليد.

أعاد تريبتولايد تعبير الجيفيرين والكوليبيستين في الحصين وعدل إشارات PI3K/Akt/GSK-3β

لتحديد ما إذا كانت التغيرات السلوكية والنسيجية مصحوبة بتغيرات في البروتينات المرتبطة بالمشبك العصبي المثبط وإشاراتها التنظيمية في الأعلى، تم تحليل تحللات الحصين من كل مجموعة بواسطة الطلاء الغربي. مقارنة بمجموعة الضابطة، أظهرت الفئران الشبيهة بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42 انخفاضا ملحوظا في تعبير الجفيرين في الحصين، في حين زادت مستويات الجيفيرين المفسفرة (الشكل 3A). أعاد علاج التريبتولايد جزئيا التعبير الكلي للجيفيرين وقلل من مستويات الجيفيرين المفسفر. على النقيض من ذلك، أضعف LY294002 العلاج المشترك تأثير التريبتوليد، كما يظهر من خلال انخفاض تعبير الجيفيرين وزيادة الجيفيرين المفسفر مقارنة بالمجموعة التي عولجت بالتريتوليد. تشير هذه النتائج إلى أن الأمراض الناتجة عن Aβ1-42 ارتبطت ليس فقط بانخفاض وفرة الجيفيرين في الحصين، بل أيضا بتحسن فسفرة الجيفيرين، بينما عكس التريبتولايد جزئيا هذه التغييرات.

أظهر كوليبستين نمط تعبير مشابه لجيفيرين الكلي. أظهرت الفئران الشبيهة بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42 انخفاضا في تعبير كوليبستين في الحصين مقارنة بالفئران الضابطة، بينما أعاد علاج التريبتولايد تعبير كوليبيستين. LY294002 العلاج المشترك عكس هذا التأثير جزئيا (الشكل 3B). تشير هذه النتائج إلى أن التريبتولايد حافظ على تعبير البروتينات المثبطة المرتبطة بالمشبك العصبي في الحصين، وقد تم تخفيف هذا التأثير بواسطة تثبيط PI3K. ثم تم فحص مسار الإشارة PI3K/Akt/GSK-3β لتوضيح التغيرات الجزيئية الكامنة وراء فسفر الجيفيرين. في مجموعة النماذج الشبيهة بالAD المستحثة بواسطة Aβ1-42، انخفض تعبير PI3K ونسبة p-Akt/Akt مقارنة بمجموعة الضابطة، مما يشير إلى ضعف نشاط الإشارة PI3K/Akt (الشكل 3B). كما تم تقليل نسبة p-GSK-3β/GSK-3β في مجموعة النماذج. نظرا لأن فسفرة GSK-3β في موقع التثبيط تعكس كبح نشاط GSK-3β، فإن هذا الانخفاض يشير إلى زيادة نسبية في نشاط GSK-3β في الحصين الشبيه بالزهايمر الناتج عن Aβ1-42. أدى علاج التريبتولايد إلى زيادة تعبير PI3K، وأعاد نسبة p-Akt/Akt، ورفع نسبة p-GSK-3β/GSK-3β. وقد أضعفت هذه التأثيرات بسبب LY294002 العلاج المشترك.

تشير هذه النتائج معا إلى أن الأمراض الشبيهة بالزهايمر الناتجة عن Aβ1-42 ارتبطت بانخفاض تعبير الجفيرين والكوليبيستين في الحصين، وزيادة فسفرة الجيفيرين، وضعف الفسفرة المثبطة بوسائط PI3K/Akt ل GSK-3β. عكس التريبتولايد جزئيا هذه التغيرات الجزيئية، بينما LY294002 خفف من تأثيرات التريبتوليد، مما دعم مشاركة إشارات PI3K/Akt/GSK-3β في تنظيم جيفيرين وكوليبيستين في الحصين في هذا النموذج.

خفف التريبوليد من اضطرابات البروتين المرتبطة بالالتهام الذاتي في الحصين لدى الفئران الشبيهة بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42

لتحديد ما إذا كانت الأمراض الشبيهة بالزهايمر الناتجة عن Aβ1-42 وعلاج التريبتولايد مرتبطين بتغيرات في البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي، تم فحص تعبير LC3 وp62 في محللات الحصين بواسطة الطلاء الغربي. مقارنة بمجموعة الضابطة، أظهرت الفئران الشبيهة بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42 زيادة في نسبة LC3-II/I، مما يشير إلى زيادة تراكم LC3-II المرتبط بالبلعميات الذاتية. بالتوازي، ارتفع تعبير p62 أيضا في مجموعة النموذج، مما يشير إلى تراكم ركائز مرتبطة بالالتهام الذاتي في الحصين. أدى علاج التريبتولايد إلى تقليل نسبة LC3-II/I وتعبير p62 مقارنة بمجموعة النماذج الشبيهة بالزهايمر المستحثة بواسطة Aβ1-42. تشير هذه النتائج إلى أن التريبتولايد خفف من التراكم غير الطبيعي للبروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي الناتج عن Aβ1-42. على النقيض من ذلك، زاد LY294002 العلاج المشترك نسبة LC3-II/I وتعبير p62 مقارنة بعلاج التريبتوليد وحده، مما يشير إلى أن تثبيط PI3K خفف من تأثير التريبتولايد على التغيرات البروتينية المرتبطة بالالتهام الذاتي (الشكل 4).

بشكل عام، قدمت مجموعة الضابطة الملف السلوكي والنسيجي والجزيئي الأساسي، بينما أكدت مجموعة النموذج الشبيه بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42 أن إعطاء Aβ1-42 داخل البطين الدماغي أدى إلى ضعف معرفي، وإصابة في الحصين، وترسيب Aβ، وانخفاض البروتينات المرتبطة بالمشابك العصبية المثبطة، وتغيرات في إشارات PI3K/Akt/GSK-3β، وتراكم البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي. أظهرت المقارنة بين مجموعة النموذج المستحثة بواسطة Aβ1-42 ومجموعة المعالجة بالتريتوليد أن التريبتوليد عكس جزئيا هذه الشذوذات. أظهرت المقارنة بين مجموعة العلاج بالتريتوليد ومجموعة العلاج المشترك بالتريبتوليد LY294002 بالإضافة إلى التريبتوليد أن تثبيط PI3K خفف من تأثيرات التريبتوليد. تدعم هذه النتائج الفرضية العملية بأن التريبتولايد يعدل التغيرات في الجيفيرين والكوليبيستين والبروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي في نموذج شبيه ب AD مستحث بواسطة Aβ1-42 من خلال آلية مرتبطة ب PI3K/Akt/GSK-3β.

توفر البيانات:

جميع البيانات الخام اللازمة لإعادة إنتاج نتائج هذه الدراسة مقدمة كملف تكميلي 1 وملف تكميلي 2. تشمل هذه الصور الأصلية للبلوط والجل الغربي، وبيانات البقع غير المقطوعة، والقيم الرقمية الخام المستخدمة في التحليلات الإحصائية، والرسوم البيانية المولدة. (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2) توفر هذه الملفات البيانات الخام التي تدعم النتائج الكمية المبلغ عنها في الشكل 1–4.

الشكل 1: حسن التريبتولايد جزئيا من نقص التعلم المكاني والذاكرة في الفئران الشبيهة بالزهايمر الناتجة عن Aβ1-42. (أ) زمن الهروب من الكمون خلال مرحلة الملاحة في الأماكن التي تستمر 6 أيام في متاهة موريس المائية. (ب) مسارات السباحة التمثيلية خلال تجربة المسح. (ج) عدد المعابر فوق موقع الرصيف الأصلي بعد إزالة الرصيف. (د) نسبة الوقت الذي يقضى في الربع المستهدف خلال تجربة المسبار. تعرض البيانات كمتوسط في المتوسط ± SD. تم تحليل زمن الهروب بواسطة تحليل ANOVA ثنائي الاتجاه بمقاييس متكررة، وتم تحليل بيانات تجارب المجسات بواسطة اختبار ANOVA أحادي الاتجاه. Ctr، مجموعة الضابطة؛ AD، مجموعة نماذج شبيهة ب AD المستحثة بواسطة Aβ1-42؛ TP، مجموعة العلاج بالتريتوليد؛ LY، LY294002 مع مجموعة العلاج المشترك مع التريبتوليد. n = 6 لكل مجموعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: إصابة عصبية مخففة من التريبتولايد وترسيب Aβ في فئران شبيهة بمرض الزهايمر الناتجة عن Aβ1-42. (أ) صور تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين الممثلة لمقاطع الحصين من كل مجموعة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (B) صور تلوين كيميائية مناعية ممثلة Aβ وتحليل كمي لترسيب Aβ الموجب في الحصين. شريط القياس = 50 ميكرومتر. تعرض البيانات كمتوسط ± SD. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه. Ctr، مجموعة الضابطة؛ AD، مجموعة نماذج شبيهة ب AD المستحثة بواسطة Aβ1-42؛ TP، مجموعة العلاج بالتريتوليد؛ LY، LY294002 مع مجموعة العلاج المشترك مع التريبتوليد. n = 3 لكل مجموعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: استعاد تريبتولايد تعبير الحصين من جيفيرين وكوليبيستين وعدل الإشارات المرتبطة ب PI3K/Akt/GSK-3β في فئران شبيهة بمرض Aβ1-42. (أ) صور البقعة الغربية التمثيلية والتحليل الكمي للتعبير الكلي للجيفيرين والجيفيرين المفسفر في تحللات الحصين من كل مجموعة. (ب) صور البقعة الغربية التمثيلية والتحليل الكمي للكوليبيستين، PI3K، Akt، Akt المفسفر، GSK-3β، وGSK-3β المفسفر في محللات الحصين. تم تطبيع كوليبستين وPI3K إلى β الأكتين. تم قياس Akt المفسفرة وGSK-3β المفسفرة كنسب p-Akt/Akt وp-GSK-3β/GSK-3β على التوالي. تعرض البيانات كمتوسط ± SD. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه. Ctr، مجموعة الضابطة؛ AD، مجموعة نماذج شبيهة ب AD المستحثة بواسطة Aβ1-42؛ TP، مجموعة العلاج بالتريتوليد؛ LY، LY294002 مع مجموعة العلاج المشترك مع التريبتوليد. n = 3 لكل مجموعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: التريبتولايد خفف من اضطرابات البروتين المرتبطة بالالتهام الذاتي في الحصين لدى الفئران الشبيهة بمرض الزهايمر الناجم عن Aβ1-42. صور البقعة الغربية التمثيلية والتحليل الكمي لتعبير LC3-I/II وp62 في محللات الحصين من كل مجموعة. تم حساب نسبة LC3-II/I بقسمة شدة نطاق LC3-II على شدة نطاق LC3-I، وتم تطبيع تعبير p62 إلى β-أكتين. تعرض البيانات كمتوسط ± SD. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه. Ctr، مجموعة الضابطة؛ AD، مجموعة نماذج شبيهة ب AD المستحثة بواسطة Aβ1-42؛ TP، مجموعة العلاج بالتريتوليد؛ LY، LY294002 مع مجموعة العلاج المشترك مع التريبتوليد. n = 3 لكل مجموعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف الإضافي 1: صور بقعة غربية غير مقصوصة. يتم تحديد النطاقات المستخدمة في التكميم، وتعرض مؤشرات الوزن الجزيئي حيثما توفرت المعلومات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: القيم الرقمية الخام المستخدمة في التحليلات الإحصائية في هذا المقال. يحتوي هذا الملف على مجموعات البيانات العددية الخام المستخدمة لإنشاء الرسوم البيانية الكمية في الشكل 1–4، بما في ذلك قياسات سلوك متاهة المياه موريس، وقياس الكيمياء المناعية Aβ، وقيم كثافة البقعة الغربية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

الاقتراح الميكانيكي المركزي لهذه الدراسة هو أن علم الأمراض الناتج عن Aβ1-42 يثبط إشارات PI3K/Akt، ويقلل من الفسفرة المثبطة ل GSK-3β، ويعزز فسفرة الجيفيرين، ويقلل من تعبير الجيفيرين والكوليبيستين في الحصين، ويساهم في تراكم البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي، بينما يعكس التريبتولايد جزئيا هذه التغيرات من خلال مسار مرتبط ب PI3K/Akt/GSK-3β. تظهر هذه الدراسة أن الأمراض الشبيهة بمرض الزهايمر الناتج عن Aβ1-42 يصاحبها ضعف في التعلم والذاكرة المكانية، وإصابة عصبية في الحصين، وزيادة ترسيب Aβ، وانخفاض تعبير الجيفيرين والكوليبيستين، وزيادة فسفرة الجيفيرين، وتغير في إشارات PI3K/Akt/GSK-3β، وتراكم بروتينات مرتبطة بالالتهام الذاتي. عكس تريبتوليد جزئيا هذه الشذوذات السلوكية والنسيجية والجزيئية، بينما LY294002 خفف من تأثيراته. تدعم هذه النتائج نموذجا يحمي فيه التريبتولايد البروتينات المرتبطة بالمشبك العصبي المثبط للحصين، على الأقل جزئيا، من خلال تنظيم فسفرة الجفيرين والتغيرات في البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي بواسطة PI3K/Akt/GSK-3β. يجدر بالذكر أن نموذج الحقن داخل البطين Aβ1-42 يعكس بشكل أساسي السمية العصبية الناتجة عن Aβ والأمراض الشبيهة بمرض الزهايمر بدلا من التقدم الكامل المزمن متعدد العوامل لمرض^{AD 21} البشري.

الجيفيرين والكوليبيستين هما مكونان مركزيان في تنظيم التشابك المثبط. يثبت الجيفيرين مستقبلات الناقلات العصبية المثبطة في مواقع ما بعد المشبك، بينما يعزز كوليبستين تجمع الجيفيرين وتحديد موقع الأغشية. لذلك، قد يؤدي انخفاض تعبير هذه البروتينات إلى اضطراب استقرار التشابك المثبط ويساهم في ضعف وظيفة شبكة الحصين⁸. في هذه الدراسة، قلل Aβ1-42 من تعبير الجيفيرين والكوليبيستين في الحصين، بينما أعاد التريبتولايد البروتينين. توفر زيادة الجيفيرين المفسفر آلية معقولة لفقدان الجيفيرين، حيث تم ربط الفسفرة عند Ser270 بانتشار الجيفيرين، وتقليل التجمع، وعدم استقرار البروتين. يشير الانخفاض الموازي في التعبير عن PI3K، وفسفرة Akt، والفسفرة المثبطة ل GSK-3β إلى أن Aβ1-42 يضعف إشارات PI3K/Akt وقد يزيد من نشاط GSK-3β، وهو ما يتوافق مع تعزيز فسفرة الجيفيرين. وعلى العكس، أعاد التريبتولايد فسفرة الأكت، وزاد من الفسفرة المثبطة ل GSK-3β، وتقليل فسفرة الجيفيرين، بينما أضعف LY294002 هذه التأثيرات. تشير هذه النتائج إلى أن تريبتولايد قد يحافظ على تعبير الجيفيرين والكوليبيستين من خلال تنظيم فسفرة الجفيرين المرتبط ب PI3K/Akt/GSK-3β. ومع ذلك، نظرا لاستخدام محللات الحصين الكاملة، تعكس هذه النتائج تغيرات في وفرة البروتينات والفسفرة أكثر من كونها دليلا مباشرا على تحديد مواقع التشابك العصبي ^22,23.

قد تساهم الشذوذات المرتبطة بالالتهام الذاتي أيضا في التغيرات الجزيئية التي لوحظت في هذا النموذج. الالتهام الذاتي مهم للبروتوستوس العصبي، لكن تدهور الالتهام الذاتي الضعيف في مرض الزهايمر قد يؤدي إلى تراكم الملعوم الذاتي وركائز البروتين المرضية^24,25. في هذه الدراسة، زاد Aβ1-42 من نسبة LC3-II/I وتعبير p62، مما يشير إلى تراكم LC3-II المرتبطة بالبلعم الذاتي والركائز المرتبطة بالالتهام الذاتي. خفض التريبتولايد كلا العلامتين، بينما LY294002 عكس هذا التأثير جزئيا، مما يشير إلى أن تريتوليد قد يخفف من تراكم البروتينات المرتبطة بالال الذاتي عبر آلية تعتمد على PI3K/Akt. إلى جانب التغيرات في إشارات جيفيرين، كوليبيستين، وPI3K/Akt/GSK-3β، توسع هذه النتائج فهم تأثيرات الحماية العصبية للتريبتولايد إلى ما هو أبعد من التأثيرات المضادة للالتهابات أو الحماية العصبية العامة، مما يشير إلى أن التريبتولايد قد يؤثر أيضا على بروتينات السقالات المثبطة المرتبطة بالمشابك العصبية، وإشارات الكيناز، والمسارات المرتبطة بالبروتيوستاس في أمراض شبيهة ب AD المرتبطة ب Aβ²⁶.

تحدد عدة خطوات حاسمة نجاح هذا البروتوكول وقابليته للتكرار. أولا، يجب التحكم بعناية في حالة التجمع في Aβ1-42 والتحقق منها قبل الحقن، لأن تحضير الببتيدات يمكن أن يؤثر بشكل كبير على النتائج المرضية. ثانيا، الحقن المجسم الدقيق في البطينين الجانبيين أمر ضروري؛ قد يؤدي الارتجاع، أو وضع الإبر بشكل غير صحيح، أو سرعة الحقن الزائدة إلى تعرض Aβ متغير ونتائج سلوكية أو نسيجية غير متسقة. ثالثا، يتطلب اختبار متاهة الماء موريس إشارات بصرية مستقرة، ودرجة حرارة ماء ثابتة، ومراقبة سرعة السباحة لاستبعاد ضعف الحركة كعامل مربك. رابعا، يجب إجراء القياس النسيجي والكيميائي المناعي باستخدام مناطق محددة مسبقا من الحصين وتحليل أعمى. أخيرا، تعتمد نتائج البقعة الغربية على حمل البروتين المتساوي، وتركيز الجل المناسب، والنقل الفعال، واستخدام صور القطع غير المقطوعة لتأكيد خصوصية النطاق.

يجب النظر في عدة قيود. أولا، نموذج حقن Aβ1-42 لا يعيد إنتاج التقدم المزمن، أو أمراض التاو، أو التغيرات الوعائية، أو تعقيد المناعة العصبية لدى الزهايمر البشري. ثانيا، رغم أن الفئران الذكور والإناث كانت موزعة بالتساوي بين المجموعات، إلا أن الدراسة لم تكن مزودة بالتحليل الطبقي الجنسي²⁷. ثالثا، لا يمكن لتحللات الحصين الكاملة تحديد ما إذا كانت التغيرات في الجيفيرين والكوليبستين تحدث تحديدا عند المشابك المثبطة للخلايا. رابعا، تظل آلية PI3K/Akt/GSK-3β–Gephyrin المقترحة ارتباطية، لأن نشاط GSK-3β وفسفرة Gephyrin Ser270 لم يتم التلاعب به مباشرة. أخيرا، LC3-II/I و p62 هما قراءات ويسترن بلوت ثابتة ولا يمكنهما تعريف التدفق الذاتي الديناميكي بالكامل. يجب أن تستخدم الدراسات المستقبلية تجزئة المشبك العصبي، والتجمع المناعي الفلوري المشترك مع علامات ما بعد المشبك المثبطة، وطرق GSK-3β للكسب أو فقدان الوظيفة، وتركيبات الطفرات Gephyrin Ser270، واختبارات التدفق القائمة على مثبطات الليسوسوم. سيكون من الضروري أيضا التحقق من صحة نماذج الزهايمر المعدلة وراثيا المزمنة، والنماذج المرتبطة بالتاو، والأنظمة العصبية المشتقة من الإنسان لتحديد ما إذا كان هذا المسار ذا صلة واسعة بمرض مرض الزهايمر¹⁴. قيد إضافي هو أن حالة التجميع لتحضير Aβ1-42 الدقيق المستخدم في الحقن الستيريوتاكسي لم يتم التحقق منه بشكل مستقل بواسطة فلورة ثيوفلافين T أو SDS-PAGE/الصبغة الغربية أو المجهر الإلكتروني النفاذ. على الرغم من أن الببتيد تم تحضيره باستخدام إجراء حضانة مطول بزاوية 37 درجة مئوية يستخدم عادة لتعزيز تجمع Aβ1-42، إلا أن التغيرات في حالة التجمع من دفعة إلى دفعة قد تؤثر على النتائج المرضية. يجب أن تؤكد الدراسات المستقبلية هذا سير العمل في نماذج الزهايمر المعدلة وراثيا المزمنة، والنماذج المرتبطة بالتاو، والأنظمة العصبية المشتقة من الإنسان. يجب أن تشمل التجارب الإضافية التحقق المباشر من حالة تجمع Aβ1-42، وتقييم دقة الحقن المجسم باستخدام الصبغة أو التحقق التشريحي، وتجزئة المشبك العصبي، وتحديد الموقع المناعي الفلوري مع علامات ما بعد المشبك المثبطة، وطرق GSK-3β لزيادة أو فقدان الوظيفة، وتجارب الطفرات ب Gephyrin Ser270، واختبارات التدفق الذاتي القائمة على مثبطات الليسوسوم. كما أن هناك حاجة إلى دراسات استجابة الجرعة والسلامة للتريبتوليد قبل النظر في التطبيقات الانتقالية

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Anti-Gephyrin antibody	12681	Peoteintech	الجسم المضاد الأساسي لكشف الغيبيرين الكلي بواسطة Western blot.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  antibody	147011	Synaptic Systems	الجسم المضاد الأساسي لكشف الغيبيرين المفسفر بواسطة Western blot.
Anti-Collybistin antibody	ab316963	abcam	الجسم المضاد الأساسي لكشف الكوليبستين بواسطة Western blot.
Anti-PI3K antibody	27921	Peoteintech	الجسم المضاد الأساسي لكشف PI3K بواسطة Western blot.
Anti-Akt antibody	9272	Cell Signaling Technology	الجسم المضاد الأساسي لكشف Akt الكلي بواسطة Western blot.
Anti-phosphorylated Akt antibody	4060	Cell Signaling Technology	الجسم المضاد الأساسي لكشف Akt المفسفر بواسطة Western blot.
Anti-GSK-3β antibody	12456	Cell Signaling Technology	الجسم المضاد الأساسي لكشف GSK-3β الكلي بواسطة Western blot.
Anti-phosphorylated GSK-3β antibody	5558	Cell Signaling Technology	الجسم المضاد الأساسي لكشف GSK-3β المفسفر بواسطة Western blot.
Anti-β actin antibody	66009	Peoteintech	الجسم المضاد التحكم في التحميل لتنظيم Western blot.
Anti-LC3 antibody	11972	Cell Signaling Technology	الجسم المضاد الأساسي لكشف LC3-I وLC3-II بواسطة Western blot.
Anti-p62 antibody	5114	Cell Signaling Technology	الجسم المضاد الأساسي لكشف p62/SQSTM1 بواسطة Western blot.
Anti-Aβ1-42 antibody	ab150155	abcam	الجسم المضاد الأساسي لكشف Aβ1-42.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-mouse IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	الجسم المضاد الثانوي لمضادات الفئران الأساسية في Western blotting.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-rabbit IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	الجسم المضاد الثانوي لمضادات الأرانب الأساسية في Western blotting.
Anti-Aβ antibody	GT622,	Invitrogen,	الجسم المضاد الأساسي لكشف Aβ المناعي النسيجي.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	بيبتيد أميلويد-بيتا المستخدم لتحضير محلول الحقن المحفز للتجميع.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	مركب الاختبار المدار داخل الصفاق.
LY294002	ab120243	abcam	مثبط PI3K المستخدم لمجموعة العلاج المشترك.
paraformaldehyde	P0099	Beyotime	مثبت للنفث الوريدي والتثبيت النسيجي اللاحق.
xylene	108298	Merck	مزيل شمع وعامل تنقية الأنسجة.
ethanol	100983	Merck	عامل الترطيب وإزالة الماء لمقاطع البارافين.
propylene glycol	294004	Merck	مكون المركب لتحضير محلول الدواء.
protease and phosphatase inhibitors	P1045	Beyotime	مضاف لمحلول التحلل المستخدم للحفاظ على البروتينات وحالات الفسفرة.
RIPA lysis buffer	P0013	Beyotime	محلول التحلل لفصل البروتين الكلي من أنسجة الحُصين.
EDTA antigen retrieval buffer	ab93680	abcam	محلول استرجاع المستضد الحراري للمناعي النسيجي.
pentobarbital sodium	P3761	Sigma	مخدر يستخدم للجراحة وتجميع الأنسجة.
Goat serum	ZLI-9056	ZSGB-BIO	عامل سدادة للمناعي النسيجي.
PVDF membranes	ISEQ00010	Merck Millipore	الغشاء المستخدم لنقل Western blot.
Morris water maze	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	جهاز سلوكي ونظام تتبع الفيديو لتقييم التعلم المكاني والذاكرة.
chemiluminescence imaging system	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	نظام التصوير لتسجيل إشارة Western blot الكيميائي الضوئي.
stereotaxic apparatus	/	Stoelting Technology Co., Ltd	الجهاز المستخدم للحقن داخل البطين الدقيق.
BCA protein assay kit	P0006	Beyotime	مجموعة الفحص الملون لقياس تركيز البروتين الكلي.
microplate reader	Synergy2	Biotek	قارئ الامتصاص المستخدم لقياس الفحص BCA.
ImageJ	version 9.0.1	National Institutes of Health	برنامج تحليل الصور لعلم الأنسجة، والمناعي النسيجي، وقياس كثافة Western blot.
GraphPad Prism	version 8.5	GraphPad Software	برنامج التحليل الإحصائي وتوليد الرسوم البيانية.