يشرح هذا البروتوكول التصوير الكالسيمي في الجسم الحي لخلايا الوطاء باستخدام مجهر مصغر (miniscope) في الفئران التي تتصرف بحرية أثناء التلاعب بالحالة الاجتماعية (العزلة الاجتماعية والاجتماع الاجتماعي). تمكن هذه الطريقة من التصوير بدقة عصبية واحدة لنشاط تحت المهاد الذي يمثل الحاجة الاجتماعية والإشباع الاجتماعي، مما يمكن من الدراسات الميكانيكية للتوازن الاجتماعي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الحياة تصوير الكالسيوم باستخدام مجهر مصغر في منطقة تحت المهاد لفهم السلوكيات الاجتماعية لدى الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم تنظيم السلوك الاجتماعي لدى الفقاريات بدقة من خلال دوائر تحت المهاد. تم مؤخرا تحديد أنواع عصبية تحت المهاد المعرفة جزيئيا لتشميز الحاجة الاجتماعية بطريقة توازنية. هنا، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة لإجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في نواة ما قبل البصرية الوسطى تحت المهاد (MPN) باستخدام مجهر مصغر مثبت على الرأس (miniscope) في فئران حرة التصرف. تسمح هذه الطريقة بتسجيل طولي لديناميكيات سكان الخلايا العصبية أثناء العزلة الاجتماعية واللقاء الاجتماعي، مما يمكن من الدراسات الميكانيكية للحاجة الاجتماعية والرضا الاجتماعي عند حل الخلايا العصبية الفردية. على وجه التحديد، تتلقى الفئران البالغة حقن استيريوتاكسي لفيروس مرتبط باللجان (AAV) يعبر عن مؤشر كالسيوم مشفر وراثيا في MPN، تليها زرع عدسة مؤشر التدرج (GRIN) وقاعدة مينيسكوب. بعد التعافي، تعتاد الفئران على نظام التصوير المصغر وتخضع لعزلة اجتماعية مجدولة واجتماع مجدول، وخلال ذلك يتم تصوير الأنشطة العصبية. يتم مزامنة إشارات الكالسيوم مع سلوكيات الحيوانات لمزيد من التحليل. يوفر هذا البروتوكول إرشادات شاملة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي باستخدام المنظار المصغر في منطقة تحت المهاد في الفأر أثناء السلوكيات الاجتماعية. يمكن تكييفها بسهولة للتصوير في مناطق عميقة أخرى من الدماغ وعبر سياقات سلوكية مختلفة. يربط هذا النهج بين النشاط العصبي على مستوى الخلية والسلوك الاجتماعي، مما يعزز فهمنا للأساس العصبي للسلوك المعقد في الحيوانات الحرة الحرة.
المقدمة
القدرة على الحفاظ على الروابط الاجتماعية أساسية لبقاء الحيوانات 1,2,3. العزلة الاجتماعية الطويلة يسبب القلق، والنقص الإدراكي، والتغيرات الأيضية، بينما يعيد اللقاء التفاعل الاجتماعي والاحتياجات الاجتماعية 4,5,6. يشير الانتعاش الملحوظ في السلوك الاجتماعي بعد العزلة الاجتماعية قصيرة الأمد إلى وجود آلية توازنية7، مماثلة لتنظيم الجوع 8,9 أو العطش 10,11,12. ومع ذلك، لا تزال الركائز العصبية التي تتوسط التوازن الاجتماعي غير مفهومة جيدا.
كشفت الأعمال الحديثة أن مجموعات عصبية تحت المهاد المميزة ترمز للحاجة الاجتماعية والشبع الاجتماعي، على التوالي7. أظهر تصوير الكالسيوم في الجسم الحي أن مجموعة من الخلايا العصبية الجلوتاماتية المعرفة وراثيا في نواة ما قبل البصرية الوسطى (MPN) تصبح نشطة أثناء العزلة(خلايا العزل MPN)، في حين تصبح مجموعة أخرى من الخلايا العصبية GABAergic نشطة عند اللقاء (خلايا MPNReunion). التنشيط البصريلخلايا عزل MPN يحاكي حالة العزلة الاجتماعية، بينما التنشيط البصري لخلايا MPNReunion يقلل من الارتداد الاجتماعي، مما يشير إلى أدوارهما المتعارضة في تنظيم الحاجة الاجتماعية. تتفاعل هذه المجموعات بشكل متبادل وتتصل بدوائر عصبية على مستوى الدماغ، مكونة حلقة تغذية راجعة تعدل الحاجة الاجتماعية ديناميكيا.
هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا يهدف بشكل عام إلى تمكين الباحثين من تسجيل ديناميكيات الكالسيوم في أعماق الدماغ بدقة خلية واحدة في فئران تتحرك بحرية خلال سلوكيات اجتماعية ذات صلة بالحياة مثل العزلة الاجتماعية واللقاء13. يوفر الجمع بين هذه التقنية التصويرية والنماذج الاجتماعية ذات الصلة بالحياة الذاتية فرصة غير مسبوقة للتحقيق في التمثيل العصبي للحالات الاجتماعية المميزة. ينبع مبرر تطوير هذه الطريقة المعدلة من الحاجة إلى تصور كيف يتم تمثيل الحاجة الاجتماعية والشبع ديناميكيا في هياكل الدماغ العميقة مثل MPN. بينما تم وصف استخدام الميني سكوب سابقافي 14,15,16، فإن استخدامه خلال التفاعلات الاجتماعية غير المقيدة، خاصة تلك التي تتضمن انتقالات بين العزلة واللقاء من جديد، يتطلب تعديلات تقنية وسلوكية محددة للحفاظ على الاستقرار البصري، وتقليل التشوهات الحركية، وضمان التعبير السلوكي الطبيعي.
مقارنة بالفوتومترية الليافية، يوفر النهج القائم على المنظار الدقيق دقة خلوية، مما يسمح بالتمييز بين أنواع الخلايا العصبية الوظيفية المختلفة داخل نفس المنطقة. يسمح بتسجيلات طويلة الأمد للحيوانات التي تتفاعل بحرية، وهو أمر ضروري لدراسة الديناميكيات العصبية المدفوعة اجتماعيا. ركزت الدراسات السابقة التي استخدمت المنظار المجهري بفوتون واحد بشكل كبير على القشرة أو الحصين الظهري خلال المهام المكانية أو الحسية14، 15، 16. يوسع بروتوكولنا هذه التطورات إلى المناطق تحت القشرية العميقة أثناء السلوكيات الاجتماعية المعقدة، موفرا نموذجا لدراسة دوائر الحالة العاطفية في ظل الظروف الطبيعية.
تم تحسين البروتوكول لمناطق الدماغ حتى عمق ~5 مم، باستخدام زرع عدسة GRIN ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا. تشمل الاعتبارات الرئيسية الدقة الجراحية، ووضع العدسات، وتصميم النموذج السلوكي، وتحليل البيانات ذات الصلة. يمكن تكييف هذه الطريقة لتناسب مناطق عميقة في الدماغ وسياقات سلوكية أخرى. يوجه هذا البروتوكول المستخدمين عبر جميع المراحل الحرجة: التحضير الجراحي، توصيل الفيروس، زرع العدسات، التصميم السلوكي، التثبيت المصغر، التصوير، وتحليل البيانات (الشكل 1A-E). نتوقع أن هذا السير العملي المتاح والمفصل سيمكن دراسة مجموعات الأعصاب العميقة في الدماغ عبر مجموعة واسعة من السلوكيات الطبيعية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة ويستليك مع بروتوكول الحيوان #25-076-LD-9. أجريت جميع التجارب وفقا لإرشادات موارد الحيوانات المختبرية في جامعة ويستليك. جميع المعدات والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.
1. جراحة حقن الفيروس
- ضع الفأر في غرفة تحفيز تخدير تحتوي على 2-3٪ إيزوفلوران.
ملاحظة: يتم تأكيد نجاح تحفيز التخدير من خلال غياب رد فعل قرص إصبع القدم ووجود تنفس عميق وثابت. - بعد 2-3 دقائق، أو بعد فقدان رد فعل التصحيح، انقل الحيوان بسرعة إلى الجهاز الستيريوتاكسي. ثبت الأنف في مخروط الأنف المخدر وحافظ على التخدير بمقدار 1-1.5٪ من الإيزوفلوران طوال مدة الجراحة (الشكل 1B). عادة ما يتم ضبط معدل تدفق الأكسجين بين 0.8-1.2 لتر/دقيقة.
ملاحظة: راقب معدل تنفس الحيوان والعلامات الفسيولوجية الأخرى. إذا زاد معدل تنفس الحيوان وظهر عليه علامات اليقظة والشارب الأخرى، زد تركيز الأيزوفلوران إلى 2-3٪. - ثبت أسنان القاطع للفأرة من خلال قضيب القاطع الخاص بأداة الستيريوتاكسيك. شد مشبك الأنف لتثبيت الرأس.
- أدخل قضيب أذنين بعناية في القنوات السمعية الخارجية حتى يستقر بأمان، لضمان تثبيت الرأس المستقر والصلب (الشكل 1B).
ملاحظة: (1) الوضع غير الصحيح الذي يضغط أنسجة الرقبة قد يسبب ضيق تنفسي أو تثبيت غير مستقر. (2) إذا أظهر الحيوان علامات تنفس صعب أو صعوبة أثناء التثبيت، يجب تحرير قضبان الأذن فورا وإعادة وضعها، لأن ذلك يشير إلى احتمال ضغط مجرى الهواء. (3) تأكد من أن كلا قضيب الأذن على نفس الارتفاع. وهذا ضروري لتسوية الجمجمة بدقة لاحقة. - ضع مرهم العيون على كلتا عيني الفأر لمنع جفاف العين.
- أزل فراء الرأس باستخدام كريم إزالة الشعر. امسح المنطقة جيدا بمناديل إيثانول بنسبة 75٪ لإزالة بقايا الكريم والشعر.
- قم بتعقيم الجلد المكشوف بمناديل إيثانول بنسبة 75٪ وبيتادين. باستخدام مقص جراحي دقيق لعمل شق سهمي في منتصف فروة الرأس. اسحب الجلد لكشف الجمجمة بالكامل فوق منطقة الدماغ المستهدفة. نظف سطح الجمجمة بلطف بمسحة قطنية لإزالة الشاحاح.
ملاحظة: كشف مساحة كبيرة بما فيه الكفاية من الجمجمة ضروري لتوفير تثبيت قوي للأسمنت السني، مما يضمن الاستقرار طويل الأمد للزرعة. - قم بتركيب ماصة زجاجية على حامل الستيريوتاكسي لقياس سطح الجمجمة. تحت المجهر المجسم، حدد رأس الماصة إلى البريغما (تقاطع الغرز السهمية والإكليلية) وضبطها كأصل (X = 0، Y = 0، Z = 0، الشكل 1C).
- حرك طرف الماصة إلى المواقع ±2 مم جانبيا إلى البريغما واضبط مستوى الجمجمة حتى يصبح فرق الارتفاع بين هاتين النقطتين ضمن ±0.03 مم.
- ثم نقل الماصة إلى اللامبدا (تقاطع الغرز السهمية واللامبدويد) واضبط الميل الأمامي الخلفي حتى يصبح فرق الارتفاع بين البريغما واللامبدا أقل من ±0.03 مم (الشكل 1C).
ملاحظة: (1) قد يؤدي التقييم البصري المسبق وتعديل الجمجمة إلى تبسيط عملية التسوية الدقيقة بشكل كبير. (2) تجفيف سطح الجمجمة بالهواء المضغوط قبل التسوية يحسن رؤية الغرز القحفية. - استخدم مثقاب يدوي برأس مثقاب 0.8 مم لإجراء عملية فتح الجمجمة فوق منطقة الدماغ المستهدفة (مثلا للفئران C57BL6/J). الإحداثيات هي عند الأمام الخلفي (AP) 0 مم، والوسط الجانبي (ML) 0.3 مم، والظهر البطني (DV) -4.8 مم لاستهداف منطقة MPN؛ بالنسبة لفئران FVB/نيوجيرسي، يتم إجراء فتح الجمجمة عند AP +0.4 مم-+0.5 مم، ML 0.3 مم، وDV -4.8 مم) (الشكل 1C).
ملاحظة: في حالة النزيف، قم بزيادة تركيز الإيزوفلوران مؤقتا إلى 2-2.5٪. استخدم رأس قطني معقم أو إسفنجة دموية لامتصاص الدم، ثم ضع محلول ملحي معقم فورا. أعد الإيزوفلوران إلى مستوى الصيانة (1-1.5٪) بعد النزول والسوائل الزائدة. - بعد عملية قطع الجمجمة، قم بحقن الفيروس بشكل ستيريوتاكسي للتعبير عن مؤشر الكالسيوم في منطقة الدماغ المستهدفة.
- قم بتخفيف الفيروس AAV-hSyn-jGCaMP7f، وهو فيروس مرتبط بالأدينو، يستخدم للتعبير عن مؤشر كالسيوم مشفر وراثيا في الخلايا العصبية وللسماح بتصوير نشاط الخلايا العصبية عبر إشارات الكالسيوم، إلى عيار نهائي يقارب 5 × 10¹² جينومات فيروسية لكل ملليلتر قبل الحقن.
- املأ ماصة زجاجية بالزيت المعدني أولا، ثم المحلول الفيروسي لضمان غياب فقاعات الهواء. ضع الماصة عند إحداثيات الهدف على سطح الجمجمة وخفضها ببطء إلى عمق الهدف.
- حقن الفيروس أحادي الجانب بمعدل بطيء وثابت (مثلا 30 نانولتر/دقيقة)، بحجم إجمالي 400 نانولتر7، لضمان إصابة عدد كاف من الخلايا العصبية في منطقة MPN. يمكن تعديل هذا المقدار حسب أحجام مناطق الدماغ المحددة وما إذا كانت هناك قيود أخرى، مثل نظام Cre-loxP.
- عند الانتهاء، اترك الماصة في مكانها لمدة 10-15 دقيقة لتسهيل انتشار الفيروس بشكل كاف وتقليل الارتجاع على طول مسار الحقن، قبل سحبها تدريجيا.
ملاحظة: (1) الحصات الفيروسية ذات العدادات المناسبة والمتسقة ضرورية للتعبير الناجح والمتسق عبر الحيوانات. قد يسبب العيار العالي جدا سمية عصبية، بينما يؤدي نقص العيار إلى ضعف التعبير وضعف نسبة الإشارة إلى الضوضاء في التصوير. (2) بطء سرعة الحقن ووقت انتظار كاف قبل سحب الماصة أمران حاسمان لتقليل تلف الأنسجة ومنع ارتجاع الفيروس، مما يضمن تعبيرا دقيقا وقويا للفيروس في المنطقة المستهدفة. - بعد حقن الفيروس، قم بخياطة الجلد فوق الجمجمة بغرز قابلة للامتصاص.
- حقن الكاربروفين تحت الجلد (5 ملغ/كغ) مباشرة بعد الجراحة لتخفيف الألم، مع استمرار المراقبة وإعطاء إضافي حسب الحاجة خلال الأيام الثلاثة التالية.
- ضع الفأر في مكان واحد بعد جراحة حقن الفيروس لمدة لا تقل عن 2-3 أسابيع للسماح بتعافي الحيوانات والتعبير الكافي عن الفيروس.
ملاحظة: يمكن إجراء زرع عدسة GRIN (القسم 2) في نفس يوم الحقن الفيروسي أو بعد 2-3 أسابيع من الحقنة الفيروسية. في هذا البروتوكول، نصف الطريقة ذات الخطوتين، التي تتيح للمجرب تقييم تعبير الفيروسات أثناء زرع عدسة GRIN.
2. زرع عدسة GRIN
- كرر الخطوات 1.1-1.10 لإعادة فتح فتحة الجمجمة. اخدش سطح الجمجمة بمشرط لفهم الأسمنت السني بشكل أفضل في الخطوة 2.8. بالنسبة لعملية فتح الجمجمة الجديدة، يجب أن يكون القطر أكبر قليلا من عدسة GRIN (عادة ~1 مم) للسماح بالانغراس بسلاسة. نظف جميع بقايا العظام بدقة بعد الحفر.
- لتقليل ضغط الأنسجة أثناء زرع عدسة GRIN، أدخل ماصة زجاجية في منطقة الدماغ المستهدفة وحرك الماصة ببطء نحو الجانب المتوسط لتكوين شق. هذا القطع الدقيق يبلغ طوله ~1 مم لتوفير مساحة لزرع عدسة GRIN (الشكل 2A).
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لنجاح البروتوكول بأكمله. - قبل زرع عدسة GRIN، قم بتعقيم العدسة بنسبة 75٪ إيثانول، ثم اغسلها بمحلول ملحي معقم، وامسحها بلطف باستخدام نسيج العدسة.
- امسك عدسة GRIN بحامل العدسة وثبت المنظار المصغر في أعلى العدسة.
- ضع المجموعة بأكملها عند البريغما واضبط جميع الإحداثيات على الصفر (أي X = 0، Y = 0، Z = 0). ثم وضعه على إحداثيات X-Y المستهدفة فوق فتحة الجمجمة.
- بلل سطح الجمجمة بمحلول ملحي معقم. ببطء شديد، قم بخفض عدسة GRIN إلى نسيج الدماغ بمعدل يقارب 100 ميكرومتر/دقيقة حتى تصل إلى الهدف (الشكل 2B).
ملاحظة: (1) إذا تم إجراء زرع عدسة GRIN بعد 2-3 أسابيع من حقن الفيروس، أثناء إدخال العدسة، شغل المنظار المصغر لمراقبة تغيرات الفلورة في الوقت الحقيقي. عندما تقترب العدسة من المنطقة المستهدفة، تصبح الإشارة الفلورية الكلية في مجال الرؤية أكثر سطوعا، ويمكن قراءة هذا التغير مباشرة من مخطط الإشارة في الوقت الحقيقي باستخدام برنامج التصوير (الشكل 2C، D). (2) كن حذرا لتجنب النزيف أثناء الانغراس، لأن الجلطات الدموية تؤثر بشكل كبير على جودة الإشارة. (3) إذا كان النزيف حتميا وشديدا، اسحب عدسة GRIN، ونظف العدسة، وأعد زرعها بعد توقف النزيف. - بعد زرع العدسة، جفف سطح الجمجمة جيدا عن طريق امتصاص السائل المتبقي والنفخ بالهواء المضغوط.
- ضع إسمنت الأسنان بعناية لتثبيت قاعدة عدسة GRIN على الجمجمة وابن غطاء رأس كامل يغطي الجمجمة المكشوفة (الشكل 2B). كن حذرا من تجنب ملامسة الأسمنت للأنسجة العضلية المحيطة. ثم قم بفك حامل العدسة بعناية وأزله مع المنظار المصغر.
ملاحظة: (1) اخلط الأسمنت السني في لوح مبرد على الثلج لإبطاء عملية التصلب وتوفير وقت عمل أطول. (2) يوصى بإضافة قضيب رأس خلف العدسة لتثبيت الفأرة أثناء توصيل المنظار المصغر. (3) كن حذرا جدا في عدم تطبيق الأسمنت على حامل العدسة أو المنظار المصغر. - حضر لاصق السيليكون المكون من جزأين عن طريق خلط سائليه معا. ضعها على أعلى عدسة GRIN لتشكيل ختم واقي ضد الغبار والخدوش أثناء فترة التعافي.
- بعد زرع عدسة GRIN، ضع الفأر على حدة لتجنب الضرر المحتمل للعدسة من قبل زملائه في القفص أثناء التعافي.
3. تركيب قاعدة القاعدة
- بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من زرع عدسة GRIN، يتم تركيب قاعدة القاعدة. قم بتخدير وتثبيت الفأرة في الجهاز المجسم كما هو موضح أعلاه.
- أزل ختم السيليكون من أعلى عدسة GRIN ونظف سطح العدسة بلطف باستخدام قطعة من نسيج العدسة.
- ثبت لوحة القاعدة على المنظار المصغر. قم بتركيب كامل مجموعة المجهر والقاعدة على ذراع المناولة الستيريوتاكسي عبر حامل.
- قم بتوصيل المنظار المصغر بصندوق جمع البيانات وتشغيل التصوير المباشر.
- قم بمحاذاة هدف المنظار الصغير وعدسة GRIN المزروعة عن طريق ضبط المعالج بدقة لتحقيق محاذاة بصرية متزامنة دقيقة بين المنظار وعدسة GRIN.
- ضع هدف المنظار ليكون موازيا للسطح العلوي لعدسة GRIN وتأكد من أن حدود عدسة GRIN بالكامل مدرجة في نافذة التصوير بمظهر دائري مثالي، وأن مركز العدسة في مركز نافذة التصوير.
- خفض المنظار إلى مسافة عمل مثالية لالتقاط صور واضحة للخلايا العصبية في المستوى البؤري المستهدف.
- استخدم الأسمنت السني لجسر وتغليف لوحة القاعدة على غطاء الأسمنت الحالي (الشكل 2B).
ملاحظة: (1) خطوة حاسمة هي رفع المنظار المصغر بمسافة صغيرة محددة تجريبيا (حوالي 50-100 ميكرومتر) قبل التثبيت النهائي لتعويض احتمال انزياح مستوى البؤرة الناتج عن انكماش الأسمنت أثناء التصلب. (2) كن حذرا للغاية لمنع إسمنت الأسنان من ملامسة أي أجزاء من المنظار الصغير التي سيتم فصلها بعد تركيب لوحة الأساس. - بعد أن يتصلب الأسمنت السني بالكامل، قم بفك الحامل، وافصل المجهر بعناية عن لوحة الأساس، ثم ثبت غطاء على لوحة القاعدة لحماية الواجهة البصرية.
- احتفظ الفأر بكل واحد لمدة 3-5 أيام بعد تركيب قاعدة القاعدة ثم أعد توحيده برفاقه في القفص لمدة أسبوع على الأقل قبل التلاعب بالحالة الاجتماعية (مثل العزلة الاجتماعية).
4. إعداد معلمات التعود والتصوير
- اعتاد الفئران المزروعة على تثبيت مؤقت للرأس لتثبيت المنظار المصغر، وعلى إعداد التصوير 2-3 مرات قبل جلسات التصوير الرسمية.
- لتركيب المنظار المصغر على لوحة الأساس، قم بتقييد رأس الفئران المزروعة، وإزالة غطاء لوحة الأساس، وتثبيت المنظار المصغر في لوحة القاعدة عبر واجهة مغناطيس. ثم شد المسمار الجانبي لتثبيت المنظار المصغر. قم بإجراء تصوير الكالسيوم لمدة 10 دقائق، وخلالها يتحرك الحيوان بحرية في ساحة التسجيل أو القفص.
- قدم محفزات، مثل لمسة لطيفة وفأرة جديدة، خلال جلسة التصوير التجريبية هذه. حلل البيانات (انظر التفاصيل في القسم 6) للتحقق مما إذا كان بالإمكان استخراج إشارات خلية عصبية واحدة. خلال التعود، حدد إعدادات التصوير المثلى عن طريق ضبط مستوى البؤرة المصغر عبر مسافة عمله لتعظيم عدد الخلايا العصبية المرصودة ووضوح الصورة.
- اضبط قوة الإضاءة على ~10٪ من القيمة القصوى، وزيادة الحساس على ~10-20٪ من القيمة القصوى للحصول على إشارات واضحة دون تشبع. الصورة بدقة مكانية 1280 × 800 مع معدل أخذ عينات 20 هرتز. احفظ هذه الإعدادات لكل حيوان وأعد استخدامها خلال جلسات التصوير التالية.
5. الاختبارات السلوكية الاجتماعية لتصوير الكالسيوم بالمنظار المصغر
- اختبار اللقاء الاجتماعي (الشكل 3A)
- عزل الفأر المزروع في المنظار لمدة يوم أو ثلاثة أو خمسة أيام قبل التصوير. إجراء تصوير الكالسيوم أثناء الأساسيات، واللقاء وإعادة العزل.
- القاعدة الأساسية: وصل الفأرة بالمنظار الميني وسجل لمدة 10 دقائق يبقى فيها الفأرة معزولة.
- لم الشمل: أضف رفيق سابق إلى غرفة التسجيل وسجل لمدة 10 دقائق.
- إعادة العزل: أزل الكاجيمات بعد اللقاء الذي يستغرق 10 دقائق، والصورة لمدة 10 دقائق أخرى أثناء إعادة العزل.
- اختبار العزلة الاجتماعية (الشكل 3B)
- عزل الفأر المزروع في المنظار لمدة 6 ساعات، وسجل إشارات الكالسيوم في بداية كل ساعة لمدة 15 دقيقة.
- أضف عضوا سابقا إلى غرفة التسجيل وسجل لمدة 10 دقائق في نهاية جلسة التصوير بالكامل لتحديد الخلايا العصبية التي تتغير بشكل كبير بفعل اللقاء الاجتماعي (انظر التفاصيل في القسمين 6 و7).
ملاحظة: (1) يستخدم هذا الجدول التصويري المحدد لتقليل تبييض الإشارات الضوئي وتمكين مراقبة نشاط الخلايا العصبية خلال أول 6 ساعات من العزلة الاجتماعية. (2) يتم توصيل المنظار المصغر طوال العملية بأكملها. (3) يتيح هذا النهج تتبع نفس المجموعة العصبية على مدار جلسة التصوير بأكملها. (4) يتم توفير الطعام والهيدروجيل أثناء التصوير.
6. معالجة البيانات المسبقة
- استيراد فيديوهات التصوير الخام إلى برنامج معالجة البيانات.
- قم بتقليل عينات الفيديو الأصلي مكانيا وزمنيا، عند الضرورة لتقليل العبء الحسابي لتحليل البيانات.
ملاحظة: في هذا التحليل، يتم التقاط بيانات التصوير الخام بدقة مكانية 1280 × 800 عند 20 هرتز؛ قم بتقليل العينات المكانية من الفيديو بمقدار 4 أضعاف وتقليل العينات الزمنية بمقدار 2. - تطبيق مرشح تمرير النطاق المكاني مع طرح متوسط عالمي لتقليل الضوضاء عالية التردد وانحراف الخلفية منخفض التردد.
- صحح التشويهات الحركية باستخدام خوارزمية تصحيح الحركة في برنامج معالجة البيانات. افحص الفيلم المصحح بالحركة بصريا لضمان ثبات السوماتا العصبية وتقليل بقايا الحركة.
- انقر على زر "تحديد الخلايا" واختر "CNMFe" في القائمة لاستخراج آثار نشاط الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية باستخدام خوارزمية CNMF-E17 (تحليل المصفوفة غير السلبية المقيد للبيانات الميكروإندوسكوبية).
- انقر على زر المسطرة في برنامج معالجة البيانات وقس أقطار السوما (بالبكسل) من الخلايا العصبية الممثلة. أدخل متوسط الحجم في مربع "متوسط قطر الخلية (البكسلات)". ثم اضغط على زر التطبيق لتشغيل CNMF-E.
- قم بضبط إعدادات تهيئة CNMF-E عندما يكون اكتشاف الخلية غير كاف، أو ظهور مكونات غير خلوية زائدة، أو يحدث تقسيم زائد.
- فحص جميع المكونات المستخرجة وقبول/رفضها بناء على شكل الخلايا وديناميكيات الكالسيوم البيولوجية المعقولة. استبعد المكونات ذات الأشكال غير المنتظمة والشائكة. استبعد الآثار التي تهيمن عليها الضوضاء أو القطع الحركية.
ملاحظة: (1) الشكلان 2E و2F يظهران عصبتين عصبيين مقبولتين بشكل واضح للخلايا العصبية بالإضافة إلى العابرات النموذجية للكالسيوم. (2) تظهر الشكلان 2G و2H عصبتين عصبيتين مرفوضتين مع تقلبات واضحة في خط الأساس ونقص في العابرات النموذجية للكالسيوم. - تصدير آثار الفلورة للخلايا العصبية المقبولة من برنامج معالجة البيانات لتحديد الخلايا العصبية المعدلة في الحالة الاجتماعية لاحقا (القسم 7).
7. تحديد الخلايا العصبية المعدلة للحالة الاجتماعية
- استخدم MATLAB أو Python لتحليل البيانات المعالجة مسبقا بشكل أعمق.
- محاذاة آثار نشاط الكالسيوم للخلايا العصبية المقبولة مع الطابع الزمني السلوكي.
- ابحث عن نقطة الزمن للقاء اجتماعي من فيديو السلوك. لكل خلية عصبية، قسم النشاط إلى فترة عزلة اجتماعية قبل اللقاء مدتها 300 ثانية وفترة اجتماعية اجتماعية مدتها 300 ثانية.
- لكل عصبون، قم بقياس توزيعات نشاط الكالسيوم خلال فترات العزل واللقاء.
- قم بتحليل خصائص تشغيل المستقبل (ROC)18 لتقييم قدرة النشاط العصبي على التمييز بين حالات العزل واللقاء، مما ينتج قيمة AUC تحسب المساحة تحت منحنى ROC.
- قيم الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار التبادل. لكل عصبون، يتم خلط قيم نشاط الكالسيوم بشكل دائري عبر الحالات السلوكية في صناديق زمنية لمدة ثانية واحدة لمدة 1000 مرة لتوليد توزيع صفري لقيم AUC. تعتبر الخلايا العصبية التي تتجاوز قيم AUC التي تتجاوز النسبة المئوية 95 من توزيعها الخالي الخلط أنها معدلة بشكل كبير بواسطة الحالة الاجتماعية.
- تصنيف الخلايا العصبية التي تم تعديلها بشكل كبير بناء على اتجاه التعديل. صنف الخلايا العصبية التي تم تثبيطها بواسطة الاجتماع كخلايا العزل والنشطة باللقاء كعصبونات الاجتماع (الشكل 4).
8. التحقق بعد التجربة
- قم بتركيب الفئران وإجراء تحليل نسيج قياسي للتحقق من تتبع عدسة GRIN وتعبير الفيروس (انظر مثال تصوير الأنسجة في الشكل 2I).
- استخدم 4٪ PFA لتثبيت رأس الفأرة بالكامل مع الزرع، ثم أزل عدسة GRIN لرؤية مسار عدسة واضح.
ملاحظة: قم فقط بتضمين بيانات الحيوانات التي تم استهدافها بشكل صحيح.
9. استكشاف الأخطاء ونصائح عملية
- ثبت قضيب رأس مع إسمنت سني خلف المنظار لتسهيل تركيب وإزالة المنظار.
ملاحظة: يجب ألا يكون قضيب الرأس طويلا جدا ويمكن وضعه بزاوية مائلة قليلا لمنع التدخل في السلوك الاجتماعي. - احتفظ الفئران المزروعة بشكل فردي خلال فترة التعافي بعد الجراحة لمدة أسبوع على الأقل. يوفر هذا وقتا كافيا للفئران للتعافي ويمنع تلف الزرعة بواسطة فئران أخرى.
- إعادة جمع الفئران المزروعة مع رفيقاتها السابقة بمجرد أن تتعافى تماما. افحص وأشد أغطية الغطاء بانتظام. جهز بعض أغطية الغطاء الإضافية واستبدلها عندما تفقد أثناء صيانة الحيوانات.
- تحقق من إشارات الكالسيوم بعد 3-4 أسابيع من حقن فيروس GCaMP. إذا كانت الإشارات ضعيفة جدا أو غير واضحة، فإن فترة التعافي الأطول قد تحسن أحيانا جودة الإشارات.
- كن حذرا من أسطح العدسة سواء في جانب عدسة GRIN أو جانب المنظار المصغر. حافظ على نظافة العدسات وخالية من الخدش. غط العدسة عندما لا تستخدمه.
- قبل التصوير، اضبط طول كابل الإشارة ليكون طويلا بما يكفي ليصل الحيوان إلى زوايا ساحة التصوير وقصيرا بما يكفي للسماح بتفاعلات اجتماعية سلسة.
- احم الكابل بطبقة من المادة الصلبة عند الحاجة لمنع عض الفئران الأخرى أثناء التفاعلات الاجتماعية. تحقق من كابل الإشارة بانتظام لمراقبة ما إذا كان قد انحنى بسبب تفاعل اجتماعي مكثف.
- لتحديد نفس المجموعة العصبية من جلسات تصوير متتالية (على سبيل المثال، في الشكل 3B)، يمكن ربط مقاطع الفيديو الخام لاستخراج آثار الكالسيوم.
- لمزامنة إشارات متعددة، مثل الفيديوهات السلوكية وإشارات الكالسيوم، تستخدم عادة مدخلات TTL الشائعة والمصابيح المتزامنة لمحاذاة ملفات التسجيل المختلفة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحديد مجموعات الخلايا العصبية
قمنا بالتعبير عن فيروس GCaMP وزرعنا عدسة GRIN في MPN لفأر C57BL/6J. بعد الجراحة، تعافى الفأر بشكل فردي وعاد لجمعه مع زملائه في القفص لمدة أسبوع على الأقل. ثم تم وضع الفأر منفردا لمدة 3 أيام قبل جلسة تصوير الكالسيوم. أثناء التصوير، تم تسجيل نقطة العزل الأساسية لمدة 10 دقائق أولا، تلتها لقاء اجتماعي لمدة 10 دقائق مع زميل سابق في القفص. تم استخدام نشاط الكالسيوم المسجل قبل وبعد اللقاء الاجتماعي (300 ثانية لكل فترة) في تحليل ROC (انظر التفاصي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوضح هذا البروتوكول نهجا متكاملا يجمع بين تصوير الكالسيوم المصغر في الجسم الحي ونماذج السلوك الاجتماعي لتقييم ملف نشاط الخلايا العصبية تحت المهاد. يتيح ذلك تصوير الكالسيوم طويل الأمد بدقة خلوية من هياكل الدماغ العميقة أثناء التفاعلات الاجتماعية الطبيعية. تناقش الأقسام التالية الخطوات الحرجة، والأهمية المنهجية، والحدود، والإمكانات المستقبلية لهذا النهج.
يعتمد نجاح هذا البروتوكول على سلسلة من الإجراءات الجراحية والتجريبية الدقيقة والمترابطة. أولا، دقة ح...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يصرح المؤلفون بعدم وجود مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح. تم استخدام ChatGPT في عملية تحرير المخطوطات، مع تدقيق دقيق ومفصل من جميع المؤلفين.
شكر وتقدير
نود أن نشكر البروفيسورة كاثرين دولاك على دعمها للتدريب الأولي على تجارب المنظار المصغر، ويانغ سون على مساعدته في إجراء الجراحة. وقد دعم هذا العمل تمويل الشركات الناشئة من جامعة ويستليك وتمويل مؤسسة NOMIS، ومركز تان-يانغ لأبحاث التوحد في جامعة هارفارد، وجائزة جين كوفين تشايلدز للأبحاث الطبية إلى دكتور في القانون، وزمالة تشارلز أ. كينغ لما بعد الدكتوراه من مؤسسة تشارلز أ. كينغ إلى دكتوراه في اللاهوت. نشكر جميع أعضاء مختبر ليو على تعليقاتهم على المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pA | تايتول | S0587-9 | ناقلات الفيروس، الجراحة |
| إسفنجة الهلتين الهيموستاتية القابلة للكشف عن السيطرة | فوكانغسن | FKS-A | الجراحة |
| محلول بيتادين (10٪ ييود بوفيدون) 500 مل | هينوت | Q13702855HNW002 | الجراحة |
| كاميرا لفيديو سلوكي | داهينغ | MER2-160-227-U3C | السلوك |
| الكاربروفين | MCE | HY-B1227 | الجراحة |
| الآلات الستيريتاكسيك الرقمية | الدفع الخلفي | 68803 | الجراحة |
| الإيثانول (75٪) | شركة سينوفارم للمواد الكيميائية، LD | 801769610 | الجراحة |
| مرهم العين | فودو | H37022025 | الجراحة |
| برنامج معالجة بيانات إنسكوبيكس (IDPS) | إنسكوبيكس | 1000-006551 | تحليل البيانات |
| إيزوفلوران | الدفع الخلفي | R510-22-10 | الجراحة |
| حزمة لاصقة من 2 من كويك-سيل | وورلد بريسيجن إنسترومنتس | كويك-سيل | الجراحة |
| الميكرودريل | الدفع الخلفي | 78001 | الجراحة |
| جهاز سحب الماصات الدقيقة MP-1000 | الدفع الخلفي | MP-1000 | الجراحة |
| حلول تخدير الحيوانات متعددة الوظائف | الدفع الخلفي | تايجي-إي | الجراحة |
| مضخة الحقن الدقيق النانولتر | الدفع الخلفي | R-480 | الجراحة |
| nVista 3.0 miniscope | إنسكوبيكس | 1000-004323 | التصوير |
| الملقط البصري | الدفع الخلفي | F12006-10 | الجراحة |
| تشغيل المقص | الدفع الخلفي | S14001-15 | الجراحة |
| مجموعة زراعة ProView | إنسكوبيكس | 1000-004238 | الجراحة والتصوير |
| أسمنت الراتنج (سوبر-بوند) | صن ميديكال | سوبر بوند C& B | الجراحة |
| مجموعة من 5 أغطية قاعدة | إنسكوبيكس | 1050-004639 | التصوير |
| مجموعة من 5 ألواح أساس | إنسكوبيكس | 1050-004638 | التصوير |
| مجموعة من 5 عدسات GRIN، قطر 0.6 مم، وطول 7.3 مم | إنسكوبيكس | 1050-004626 | الجراحة والتصوير |
| مجهر ستيريوتاكسيس | مرزيدر | MSD205A | الجراحة |
| محلول ملحي معقم | كيدوكلين | R1B25071902 | الجراحة |
المراجع
- Beery, A. K. Frank Beach award winner: Neuroendocrinology of group living. Horm Behav. 107, 67-75 (2019).
- Krause, J., Ruxton, G. D. Living in groups. , Oxford University Press. (2002).
- Riters, L. V., Kelm Nelson, C. A., Spool, J. A. Why do birds flock? A role for opioids in the reinforcement of gregarious social interactions. Front Physiol. 10, 421(2019).
- Panksepp, J. B., Lahvis, G. P. Social reward among juvenile mice. Genes Brain Behav. 6 (7), 661-671 (2007).
- Matthews, G. A., Tye, K. M. Neural mechanisms of social homeostasis. Ann N Y Acad Sci. 1457 (1), 5-25 (2019).
- Lee, C. R., Chen, A., Tye, K. M. The neural circuitry of social homeostasis: Consequences of acute versus chronic social isolation. Cell. 184 (6), 1500-1516 (2021).
- Liu, D., et al. A hypothalamic circuit underlying the dynamic control of social homeostasis. Nature. 640 (8060), 1000-1010 (2025).
- Luquet, S., Perez, F. A., Hnasko, T. S., Palmiter, R. D. NPY/AgRP neurons are essential for feeding in adult mice but can be ablated in neonates. Science. 310 (5748), 683-685 (2005).
- Balthasar, N., et al. Leptin receptor signaling in POMC neurons is required for normal body weight homeostasis. Neuron. 42 (6), 983-991 (2004).
- Zimmerman, C. A., et al. Thirst neurons anticipate the homeostatic consequences of eating and drinking. Nature. 537 (7622), 680-684 (2016).
- Augustine, V., et al. Hierarchical neural architecture underlying thirst regulation. Nature. 555 (7695), 204-209 (2018).
- Allen, W. E., et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 357 (6356), 1149-1155 (2017).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), (2017).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. J Vis Exp. (162), (2020).
- Burrows, R., Ma, C. H., Sun, Y. J. Long-term imaging of identified neural populations using microprisms in freely moving and head-fixed animals. J Vis Exp. (203), (2024).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, e28728(2018).
- Britten, K. H., Shadlen, M. N., Newsome, W. T., Movshon, J. A. The analysis of visual motion: a comparison of neuronal and psychophysical performance. J Neurosci. 12 (12), 4745-4765 (1992).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
