مقالة منهجية

تشريح الدماغ والأمعاء في تجمعات الأسماك السطحية وأسماك الكهف في أستياناكس مكسيكانوس

713 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70412

⸱

فبراير 24, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, UPR- Medical Sciences Campus, 2Molecular Sciences Research Center

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا لتشريح واستخراج مكونات الدماغ والأمعاء الكاملة من النماذج السطحية والكهفية لأستياناكس مكسيكانوس. يمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك علم النسخ، وعلم الأيض، وتحليل ميكروبيوم الأمعاء.

الملخص

تستخدم أسماك التيلوست للإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية التي تتراوح من التطور إلى علم الوراثة وعلوم الأعصاب، ومؤخرا لفهم تعقيدات محور الأمعاء والدماغ، وحتى في سياق أوسع، محور الأمعاء والدماغ والكبد. تم استخدام التترا المكسيكية، Astyanax mexicanus، بشكل متزايد في أطر التطور المقارن والتطوري بسبب توفر أنماط شكلية وفسيولوجية مميزة، بما في ذلك الأسماك السطحية التي تعيش في الأنهار والأسماك الكهفية العمياء المتكيفة مع الكهوف. يرتبط التكيف مع مواطن الكهوف بتغيرات في الصفات الشكلية والسلوكية وتنوع ميكروبيوتا الأمعاء التي توجد أيضا في ظروف المختبر. وقد فتح هذا المجال إمكانية طرح أسئلة حول التفاعلات بين الميكروبيوم، والنشاط الأيضي، والتكيف العصبي، والمخرجات السلوكية المعقدة. يمكن الآن معالجة هذه التفاعلات من خلال دراسات رسم خرائط الدماغ الكامل باستخدام تسلسل الدماغ النظيف وميكروبيوتا الأمعاء لاكتشاف التنوع البكتيري المرتبط بالأنماط الظاهرية المتكيفة مع السطح والكهوف. ومع ذلك، فإن معظم هذه الدراسات ستستفيد من الأعضاء والأنسجة الكاملة السليمة، المفككة بعناية والمحفوظة، مما يسمح بالمعالجة اللاحقة في التطبيقات اللاحقة. يصف هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتشريح الدماغ والأمعاء، حيث يتم إزالة وعزل كامل أعضاء الدماغ والبطن لكل من نماذج الأسماك السطحية وأسماك الكهف.

المقدمة

نماذج الحيوانات، بما في ذلك الأسماك الفقارية، هي أدوات حاسمة لنمذجة الظواهر البيولوجية والأمراض المعقدة في أنظمة أبسط نسبيا وأكثر سهولة في الوصول. على سبيل المثال، سمكة الزرد، دانيو ريريو، هي واحدة من أكثر نماذج أسماك التليوست استخداما، مع العديد من الطرق المطبقة لدراسة تطورها وجيناتها وفسيولوجيتها وسلوكها، مع تأثير كبير في العلوم الطبية الحيوية والسلوكيةالعصبية 1,2,3,4,5,6,7,8 . ميزة كبيرة لاستخدام سمك الزرد في الوقت الحاضر هي توفر عدد من الطرق لدراسة نسيج الأعضاء والأنسجة والأمراض في خطوط الطفرات التي تفقد الوظيفة، والتي توجد لها بروتوكولات تشريح خطوة بخطوة 3,9,10.

ومع ذلك، فإن عددا من نماذج الأسماك التيليوستية الأخرى شهدت تصاعدا خلال العقود الماضية وهي مناسبة لطرح أنواع أخرى من الأسئلة، بما في ذلك تلك ضمن مجالات علم الأحياء التطوري 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21، الآليات البيولوجية التي تكمن وراء الشيخوخة2,22، علم السموم23,24، والآخرون25,26. مثال على ذلك هو حالة التيترا المكسيكية، Astyanax mexicanus، وهي سمكة تيلوست تنحدر من شمال شرق المكسيك، ولديها تجمعات أسلاف من الأسماك السطحية التي تعيش في الأنهار وأكثر من 30 مجموعة من أسماك الكهف العمياء التي تعيش في الكهوف (الشكل 1)12.

تكيفت أسماك الكهف مع مجموعة من الخصائص الشكلية الطبيعية، بما في ذلك فقدان العين12,27، فقدان التصبغ28، توسع الأنظمة الحسية 17,29,30، وزيادة تخزين الدهون12,31، مما سمح لها بالبقاء في مواطن الكهوف المعادية. كما تكيفت هذه الأسماك مع مجموعة من الصفات السلوكية، بما في ذلك انخفاض النوم19، 20، القلق32، التجمع33، والعدوانية13، 18، 19، 20، 29، 34، 35، 36، 37، مقارنة بأسماك السطح الأسلافية. من المرجح أن تكيف معظم هذه الصفات كان نتيجة مزيج من التنوع الجيني والضغوط البيئية 35,36,28، والتي تشمل اختلافات الموائل بين الأنهار والكهوف. نموذج متزايد الفائدة لطرح أسئلة حول تأثير التنوع الجيني على تكيف الصفات الشكلية والسلوكية 16,18,19,20,35,38,39 ومؤخرا، على تنوع ميكروبيوتا الأمعاء 14,15، أسئلة قد تتطلب جمع أعضاء مثل الدماغ، والأمعاء، والكبد، وغيرها، هناك حاجة إلى بروتوكول موحد لتشريح التشريح الكبير يمكن استخدامه من قبل المجتمع بشكل عام. بينما تم إجراء تشريح كامل للدماغ وتشريحات الأعضاء في A. mexicanus من قبل، هناك نقص في طريقة شاملة وشاملة تتيح فهم كيفية إجراء هذه الأنواع من التشريحات بطريقة فعالة من حيث الوقت، وهو أمر حاسم للعديد من أنواع المشاريع، بما في ذلك تلك التي تتطلب جمع عينات لاختبارات الميتابولومكس40، والميتاجينومكس41. أو تصوير كامل الأعضاء16، 38. هدفنا هو إزالة حاجز استكشاف الأخطاء أمام الوصول إلى الأعضاء في هذا النموذج للمعالجة اللاحقة، مما يسمح للمستخدمين في المجتمع بالتركيز بسلاسة على أبحاثهم.

في هذا البروتوكول، نحدد طريقة خطوة بخطوة لتشريح الدماغ والجهاز الهضمي في الأسماك السطحية البالغة وأسماك الكهف Pachón من نوع Astyanax mexicanus. يمكن تكييف هذه المنهجية لمجموعة متنوعة من البروتوكولات اللاحقة، بما في ذلك تلك المرتبطة بميكروبيوم الأمعاء، واستقلاب الأنسجة، وتنظيف الدماغ لتصوير الدماغ الكامل على مجهر الألواح الضوئية. هذه التقنية قابلة أيضا للتكيف مع التطبيق المتزامن على نفس العينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم تنفيذ هذا البروتوكول وفقا للبروتوكولات المعتمدة من الاتحاد الدولي للعلوم الجنائية 2024-0004 A790125 في مركز العلوم الجزيئية وحرم العلوم الطبية بجامعة بورتو ريكو.

1. إعداد ما قبل التشريح

  1. إذا كنت تستخدم طبق سيلغارد بتتري (SP) للتحليل، تأكد من تحضيرها مسبقا قبل الإجراء، مع الأخذ في الاعتبار أنها قد تستغرق عدة أيام لتتجمع.
  2. لتحضير طبق SP، استخدم سيلغارد 184 وإلاستومر 184 بنسبة 10:1. اخلط 200 جرام من قاعدة سيلغارد 184 مع 20 جرام من الإلاستومر في كوب يمكن التخلص منه. اسكب في أطباق بتري بعمق حوالي ثلث إلى نصف العمق. انقر على الطبق لإزالة الفقاعات والغطاء. تأكد من ملء الصحون وتركها على سطح مستو. اترك المعالج لمدة أسبوع واحد على الأقلو42.
    ملاحظة: إذا كنت تجمع عينات لتسلسل 16s rRNA أو علم الميتاجينوميات، امتنع عن استخدام أطباق SP. بدلا من ذلك، استخدم ألواح بتري معقمة للاستخدام مرة واحدة واتبع تقنية المعقمة تحت غطاء تدفق طبقي. إذا كنت تتبع تقنية التعقيم (التعميم)، ينصح بتنظيف غطاء التدفق الطبقي بنسبة 70٪ إيثانول، ومسحوق مبيد للجراثيم، ويفضل تعريض الغطاء لمصباح فوق بنفسجي مبيد للجراثيم لمدة 15 دقيقة. يجب القيام بذلك قبل وضع المواد/الأدوات المعقمة والمتعقمة داخل غطاء التدفق الطبقي.
  3. ضع مجهر تشريح مع مناشف ورقية على كلا الجانبين. خصص جانبا لتخزين النفايات (مثل الأنسجة الأعضاء الزائدة) والجانب الآخر لوضع أدوات التشريح المعقمة. اقطع قطعا صغيرة من منشفة الورق لتنظيف الأدوات بين عمليات التشريح.
  4. حضر 1 PBS واحتفظ به في خليط ثلج بارد وفي متناول اليد في حال احتجت لتنظيف المناطق أو العينات لتحسين الرؤية. اعتمادا على البروتوكول، اختر عدم استخدام 1PBS.
    ملاحظة: ينصح بعدم استخدامه، على سبيل المثال، أثناء جمع العينات لتسلسل الميتاجينومي43. إذا استخدمت 1PBS في هذا النوع من الأسلوب، ينصح بجمع عينة 1PBS للتسلسل لفحص التلوث المحتمل.
  5. ضع جهاز SP (أو طبق بترى معقم للاستخدام مرة واحدة) تحت المجهر وتأكد من وجود جميع الأدوات (مجموعة التشريح، أنابيب الطرد المركزي الدقيق لجمع الأنسجة على الثلج، إلخ).
  6. ضع 1 PBS وأنابيب ميكرو طرد مركزي معنونة في دلو ثلج قريب. لدي قطارة بلاستيكية في يدك بسعر 1 PBS.
  7. أنشأ محطة قتل الأسماك بالقرب منك. جهز حمام ثلج بوضع خليط ثلج في حوض يحتوي على شبكة بلاستيكية بداخله، ثم املأه بماء نظام الأسماك (من نظام الحوض المنزلي أو الحوض المنزلي).
    ملاحظة: قد يستخدم MS-222 أيضا، اعتمادا على البروتوكولات التالية (احتياجات معالجة ما بعد العينة).

2. تشريح الدماغ في الأسماك السطحية البالغة والأسماك الكهفية

  1. قتل الأسماك في خليط جليدي. تأكد من عدم وجود أي حركة، وأن تغوص السمكة إلى القاع دون أي حركة عملية. الوقت يعتمد على الحجم. الأسماك الأكبر ستستغرق وقتا أطول لتتوقف عن الحركة التشغيلية.
    ملاحظة: الأسماك الصغيرة تحتاج حوالي 2-5 دقائق لتوقف الحركة التشغيلية (القتل الرحيم)، بينما قد تستغرق الأسماك البالغة والكبيرة حوالي 10-15 دقيقة. توجد اختلافات قائمة على النمط النموذجي. قد تستغرق بعض مجموعات أسماك الكهف وقتا أطول من الأسماك السطحية للتخدير أو القتل الرحيم. توصي بروتوكولات التربية والتجارب بالتحقق من صحة إجراءات التخدير والقتل الرحيم عبر الفئات السكانية، حيث قد تختلف الاستجابات بين الأشكال والسكان11.
  2. انقل السمك إلى صحن بتري معقم للاستخدام مرة واحدة داخل الغطاء، وباستخدام قطارة، استحم ب PBS بارد جدا 1x (الشكل 1).
  3. افصل الرأس عن الجسم عن طريق القطع بمشرط على بعد حوالي 2 مم خلف الخياشيم (الشكل 2). هذا سيحمي جزءا من الدماغ المتوسط ويسمح بالتلاعب بالدماغ بعد التشريح دون التسبب في ضرر. انقل الجثة نحو منطقة النفايات باستخدام منشفة ورقية، ثم ضعها في كيس مخاطر بيولوجية داخل حاوية النفايات البيولوجية للتخلص منها.
  4. باستخدام الملقط الدقيق أو الهيموستات، تمسك جيدا بالجزء الخلفي من رأس السمكة. باستخدام المقص الدقيق، اقطع حواف الفم باتجاه مؤخرة الرأس وخياشيم (الشكل 3).
  5. كرر ذلك في الجانب الآخر. أزل الفك السفلي ثم نظف الجانب السفلي جيدا بملقط ناعم أو فائق الناعم.
    ملاحظة: اتبع الشكل الداخلي للخياشيم.
  6. في هذه المرحلة، استمر في الإمساك برأس السمكة بقوة باستخدام الهيموستات أو ثبتها بدبوس T على ال SP (إذا كنت تستخدمه)، بحذر من طرف الفم.
  7. افصل كلتا العينين باستخدام ملقط فائق النقة أو مقص. أدخل الطرف في حافة العين ثم اسحب أو اقص العين برفق (الشكل 4).
    ملاحظة: لا ينطبق على سمك الكهف (كشط الجلد عن منطقة العين).
  8. اخدش خطا سهميا في أعلى الرأس يمتد بين العينين من الأمام إلى الخلف ويقسم الرأس إلى يمين ويسار. بعد ذلك، استخدم المقص الدقيق لقطع الخط بشكل سطحي (الشكل 5).
  9. باستخدام ملقط دقيق، ابدأ بسحب جانبي الرأس بحذر، مع الحرص الشديد على عدم كسر الدماغ تحت الأنسجة الضامة. بمجرد أن يصبح الدماغ مرئيا، افصل الدماغ عن الجمجمة باستخدام طرف الملقط فائق النقة.
    1. تجنب سحق الدماغ بالسحب باستخدام الملقط. بدلا من ذلك، أمسكها من الدماغ الخلفي أو الحبل الشوكي إذا كان هناك بقايا منها للحفاظ على سلامتها.
    2. إذا كان الدماغ لا يزال على جانب واحد من الرأس، استخدم الملقط فائق النقة لفصله بعناية عن جمجمة السرير عن طريق إدخال الأطراف خلف الدماغ ورفعه بلطف. تجنب السحب في جميع الأوقات، لأن ذلك قد يكسره.
  10. بعد استخراج الدماغ، نظف بلطف باستخدام ملقط فائق النقة، لإزالة الدهون أو الأنسجة المحيطة. وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق أو تخزين مناسب لبروتوكول التدفق. في هذه المرحلة، حافظ على كامل الدماغ أو اجمع مناطق فرعية من الدماغ (مثل الدماغ التيلينيسيفوني، التكتل البصري، البصيلات الشمية) (الشكل 7).
  11. عزل التلينسيفالون: لاستخراج التيلينيفالون، اضغط عند القاعدة بين الدماغ الدماغي والجدع البصري باستخدام ملقط فائق الدقة وافصل التيلينيفالون عن بقية الدماغ. انقله إلى أنبوب التخزين المناسب.
  12. عند استخدامه لعلم الميتاجينوميات، يجمع العينات بالتجمد السريع في النيتروجين السائل ويخزن عند -80 درجة مئوية. قم بذلك عن طريق غمس أنبوب الطرد المركزي الدقيق في النيتروجين السائل لمدة 5 ثوان.

الشكل 1
الشكل 1: نماذج أستياناكس المكسيكية . (أ) أسماك سطحية. (ب) سمك الكهف باتشون. شريط المقياس: 10 مم يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: فصل الرأس. (أ) الأسماك السطحية. (ب) سمك الكهف باتشون : يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: إزالة الفك من رأس سمكة منفصل. (أ) السمك السطحي. (ب) سمك الكهف باتشون : يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4
الشكل 4: إزالة العين من رأس سمكة منفصل. في أسماك الكهف، يمكن كشط المنطقة لتخفيف الأنسجة. (أ) أسماك سطحية. (ب) سمك الكهف باتشون : يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5
الشكل 5: شق الساجيتال الجانب العلوي من رأس السمكة. (أ) أسماك سطحية. (ب) سمك الكهف باتشون. شريط المقياس: 5 مم يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6
الشكل 6: فصل الأجزاء الجانبية للرأس وتعرض الدماغ داخل تجويف الجمجمة. (أ) الأسماك السطحية. (ب) سمك الكهف باتشون. (C,D) إزالة الدماغ من الجمجمة. شريط المقياس: 5 مم يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7
الشكل 7: تشريح الدماغ الإقليمي لألبوم المكسيكي . (أ) أسماك سطحية. (ب) سمك الكهف باتشون. شريط المقياس: 5 مم يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تشريح الأمعاء في الأسماك السطحية البالغة وأسماك الكهوف

  1. اتبع طريقة القتل الرحيم كما هو موضح أعلاه.
  2. جفف السمك بمسح خال من الوبر قبل وضعه على SP نظيف وتغطيه بماء بارد جدا 1 PBS (أو ماء النظام، حسب التطبيق في اتجاه الآخر) باستخدام القطارة للحفاظ على رطوبة الأنسجة.
  3. ثبت السمك على SP (إذا كنت تستخدمه) باستخدام دبابيس T.
    1. إذا لم تكن تستخدم شمع الشفاط، فإن استخدام دموية تمسك بقوة من الفم أثناء إجراء الجروح سيكون كافيا. ضع الدبوس أمامي داخل محجر العين (وهو أمر صحيح أيضا لأسماك الكهف)، لضمان وصوله إلى الشفط البصري.
    2. دبوس خلفي عبر الذيل إلى اللوحة. تأكد من بقاء السمكة ساكنة أثناء الإجراء.
      ملاحظة: إذا كنت تجري تشريح الجهاز الهضمي على نفس العينة التي تقضي عليها تشريح الدماغ، قم بقطع الرأس بسرعة بمشرط قبل بدء التشريح وتثبيت السمكة على سطح الطبق. قم بعمل قطع مائل أمامي خلف الأوبكولوم يحافظ على أعلى الرأس ويتجنب الأمعاء. من المثالي تقسيم الرأس والجسم وجعل اثنين من المفككين ذوي الخبرة يعملون على كل منهما لكفاءة الوقت. يمكن وضع الدبوس الأمامي في الجزء الأمامي الأعلى من الجسم بعد قطع الرأس، بينما يبقى الدبوس الخلفي في نفس الموقع (الشكل 8).
  4. باستخدام مقص دقيق للقطع، اقطع الجلد والعضلة الأساسية على طول الخط الأوسط البطني من الزعنفة الشرجية/الشرج نحو الأوبركولوم (الغطاء الصلب فوق الخياشيم) في خط نصف دائري يتبع منحنى السمكة السفلي (الشكل 9).
  5. أزل الأوبركولوم وزعنفة الصدر باستخدام المقص الدقيق والملاقط الدقيقة.
    ملاحظة: تساعد هذه الخطوة في جعل إزالة الجلد أكثر كفاءة، لكنها قد تبطئ عملية التشريح وقد يتم تخطيها حسب الحاجة.
  6. اقطع الجلد والعضلة الأساسية من أعلى الزعنفة الشرجية ثم اقطع أمامي نحو الخياشيم، مع تمديد الشق البطني حسب الحاجة (الشكل 10). وهذا في النهاية يخلق نافذة نافذة.
  7. افتح الشق بمساعدة ملقط دقيق لكشف تجويف الجسم. استخدم الملقط الرقيق للإمساك بالجلد ورفعه برفق لإزالته (الشكل 11).
  8. اقطع كل من الوصلات الأمامية والخلفية للأمعاء وقم بإزالة جميع الأعضاء الداخلية بعناية - إزالة الجهاز الهضمي من الجسم وضعه على منطقة نظيفة من ال SP (أو صحن بترى معقم للاستخدام مرة واحدة) (الشكل 12 والشكل 13).
  9. أولا، افصل الكبد عن بقية أعضاء البطن باستخدام الملقط فائق النقة. إذا كنت تعزل الكبد، ضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق أو استخدم طريقة تخزين مناسبة وفقا للبروتوكول أو الحاجة. قم بتمديد الأمعاء بحذر وحدد أجزاء المعدة والأمعاء الوسطى/الخلفية (الشكل 14).
  10. افصل المعدة عن الأمعاء الوسطى/الخلفية.
  11. امسك الأطراف الأمامية والخلفية للأمعاء الوسطى/الخلفية باستخدام ملقط دقيق وقم بتمديده بلطف لتمديده إلى طوله الكلي.
  12. اجمع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي دقيق وخزنها بشكل مناسب.
  13. عند استخدامه لعلم الميتاجينوميات، يجمع العينات بالتجمد السريع في النيتروجين السائل ويخزن عند -80 درجة مئوية. يتم ذلك عن طريق غمس أنبوب الطرد المركزي الدقيق في النيتروجين السائل لمدة 5 ثوان.

الشكل 8
الشكل 8: وضع الدبابيس لتشريح الجهاز الهضمي. (أ) أسماك سطحية. (ب) سمك الكهف باتشون : يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 9
الشكل 9: القطع السفلي إلى التشريح الأولي. (أ) أسماك سطحية. (ب) سمك الكهف باتشون : يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 10
الشكل 10: إزالة الأوبراكولوم وإنشاء نافذة. (أ) أسماك سطحية. (ب) سمك الكهف باتشون : يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 11
الشكل 11: إزالة الجلد الجانبي السطحي والعضلات. (أ) الأسماك السطحية. (ب) سمك الكهف باتشون : يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 12
الشكل 12: الأعضاء في مكان تجويف جسم السمكة البالغة بعد إزالة العضلات والجلد. (أ) أنثى الأسماك السطحية التي مكشوفة في البطن وتم إزالة البيض لكشف الأعضاء. (ب) ذكور الأسماك السطحية التي تتعرض لتجويف البطن وأعضاء مكشوفة. (ج) أنثى سمك الكهف باتشون مع تجويف بطني مكشوف وبيض أزيلت لكشف الأعضاء. (د) ذكر سمك الكهف باتشون ذو تجويف بطني وأعضاء. تشير الأسهم السوداء إلى المنطقة التي توجد فيها حزمة الجهاز الهضمي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 13
الشكل 13: حزمة الجهاز الهضمي التي أزيلت من تجويف جسم السمكة. (أ) أسماك سطحية. (ب) سمك الكهف باتشون. شريط المقياس: 10 مم يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 14
الشكل 14: الأعضاء المعزولة المعزولة لأسماك السطح وأسماك الكهف. (أ) أسماك سطحية. (ب) سمك الكهف باتشون. شريط المقياس: 10 مم يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وفقا لهذا البروتوكول، تم استخراج محتويات الدماغ والأمعاء، وتم أخذ قياسات لطول الأمعاء والدماغ التيلينيفالون والتيكتوم البصري ومقارنة بين نماذج الأسماك السطحية ونماذج أسماك الكهف باتشون (الشكل 15). استخدمنا اختبارات t لويلش ذات العينة المستقلة للمقارنات الإحصائية، حيث كان حجم العينة n = 6 من الأسماك السطحية وn = 6 من أسماك الكهف Pachón. كان لأسماك السطح أبعاد بصرية أكبر بكثير من أسماك الكهف الباتشون، بما يتماشى مع بروتوكولات تسجيل الدماغ المنشورةسابقا 16،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تزايد أهمية A . mexicanus كنموذج بحثي في عدة مجالات، بدءا من التطور إلى علم الأعصاب الطبي الحيوي وعلم الأحياء الدقيقة، يتطلب طريقة موحدة لتشريح الأعضاء وجمعها. بينما تم دراسة وتوثيق الهياكل المعزولة سابقا، بما في ذلك التكتومالبصري 16،38، والقلبالبالغ 11، وغيرها11،44، إلا أن هناك إرشادات منهجية تسمح بنتائج قابلة للتكرار من الأعضاء المفصولة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب مصالح. جميع الإجراءات تتبع البروتوكول المعتمد من IACUC 2024-0004.

شكر وتقدير

يتم تمويل هذا العمل من خلال منحة NIH رقم 5R16EY037336-02، ومنحة RCMI U54 MD007600، ومنحة NIH 1P20GM156713-01 (مركز COBRE بورتو ريكو لعلوم الميكروبيوم).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حوض تكاثر سمك الزبرا بسعة 1.0 لترتكنيبلاستhttps://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tankلتحضير خليط الثلج الناتج عن القتل الرحيم. يملأ الخزان نصف بالثلج ثم يوضع الخزان الداخلي المثقوب فوقه. ثم يملأ بالماء حتى الأعلى.
حوض ثلج بولي يوريثان بسعة 4 لتريو إس إيه ساينتيفكالعنصر #2328-7242
أكياس النفايات البيولوجية الخطرةفيشربراند14-828-244
مركز سائل Calbiochem OmniPur PBS 10x، درجة علم الأحياء الجزيئي، معقمميليبورسيغما65074L
المجهر التشريحي أوليمبوس SZ51أوليمبوس  OLSZ51NPS-LED/R
ملقط تشريح الأنسجةفيشربراند08-953G
دبابيس التشريح، علبة 100أدوات العلوم المنزليةhttps://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2
GzkNBlnOJ3vUKor5
rFCJvVxPN9xRlpc
الملقط، الحساس، الأطراف الحادة الدقيقة جدا  موبيكAB132
الملقط، المناديل، الطرف الدقيق جداموبيكAB047
الهيموستات، 12.5 سم، مستقيمأجهزة وورلد بريسيجنhttps://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
ملقط الصائغة، دومونت رقم 5ميليبورسيغماhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
كيموايب EX-Lكيمبرلي-كلارك34155
النيتروجين السائلمقدم من المؤسسة
مقص Noyes Micro Scissors، 12 سمأجهزة وورلد بريسيجن500228
مناديل الورقمقدم من المؤسسة
أطباق بتري مع غطاء شفاف، 95 مم، 15 مم، دائريفيشربراندFB0875714G
سكابل بليدز، #22، 10 عبوةأدوات العلوم الرئيسيةhttps://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
مقبض المشرط #4سيرتكسhttps://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
مقص، تشريح القزحيةموبيكAA146
مقص، فائق الدقيقموبيكAA152
المنابت القياسية القابلة للنقل ذات الاستخدام الواحدثيرمو ساينتفيك13-711-9D
الطرد المركزي الدقيق المعقم من نوع إبندورف 1.5 وميكرو؛ أنابيب Lإبندورف05-402-25
سيلغارد 184علوم المجهر الإلكتروني24236-10
القارورة الحراريةشركة لاب-لاين إنسترومنتس إنك.2119
المقص فائق النقةنيوميد إنسترومنتسNM-DI-206023
ماء مناسب للرحلان الكهربائي، PCRسيغما-ألدرتشW4502-1L

المراجع

  1. Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds. J Vis Exp. (139), e58366(2018).
  2. Örling, J., Kosonen, K., Villman, J., Reichard, M., Paatero, I. Impaired fin regeneration and angiogenesis in aged zebrafish and turquoise killifish. Biol Open. 12 (4), bio059622(2023).
  3. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Dev Methods Protoc. 1082, 197-214 (2014).
  4. Barbosa, A., et al. Western Blotting Assay for egr-1 Immediate Early Gene in Brain Tissue of Zebrafish Applied to Neuroethological Study. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  5. Corradi, L., Zaupa, M., Sawamiphak, S., Filosa, A. Using perk immunostaining to quantify neuronal activity induced by stress in zebrafish larvae. STAR Protoc. 3 (4), 101731(2022).
  6. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  7. Leigh, S. C., Nguyen-Phuc, B. -Q., German, D. P. The effects of protein and fiber content on gut structure and function in zebrafish (danio rerio). J Comp Physiol B. 188 (2), 237-253 (2018).
  8. Sassen, W. A., et al. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Dev Biol. 430 (1), 18-31 (2017).
  9. Jie, J., et al. Adult zebrafish intestine dissection: a technique to analyze compound absorption. J Vis Exp. (10), e20199(2023).
  10. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), e1717(2010).
  11. Baumann, D. P., Ingalls, A. Mexican Tetra (astyanax mexicanus): Biology, Husbandry, and Experimental Protocols. Laboratory Fish in Biomedical Research. , Academic Press. (2022).
  12. Gross, J. B., Meyer, B., Perkins, M. The rise of Astyanax cavefish. Dev Dyn. 244 (9), 1031-1038 (2015).
  13. Carlson, B. M., Gross, J. B. Characterization and comparison of activity profiles exhibited by the cave and surface morphotypes of the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 208, 114-129 (2018).
  14. Riddle, M., et al. Evolution of the Mexican cavefish gut microbiome. Curr Biol. 23, 01307(2023).
  15. Riddle, M. R., et al. Host evolution shapes gut microbiome composition in Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11192(2024).
  16. Jaggard, J. B., et al. Cavefish brain atlases reveal functional and anatomical convergence across independently evolved populations. Sci Adv. 6 (38), eaba3126(2020).
  17. Rodríguez-Morales, R. Sensing in the dark: constructive evolution of the lateral line system in blind populations of Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11286(2024).
  18. Rodriguez-Morales, R., et al. Convergence on reduced aggression through shared behavioral traits in multiple populations of Astyanax mexicanus. BMC Ecol Evol. 22 (1), 116(2022).
  19. Duboué, E. R., Borowsky, R. L., Keene, A. C. β-adrenergic signaling regulates evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Brain Behav Evol. 80 (4), 233-243 (2012).
  20. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biol. 13, 15(2015).
  21. Forberg, J. Temperature effects on the development of the axial skeleton and body shape in Astyanax mexicanus (teleostei: characidae) [Master's Thesis]. , College of Science and Health Theses and Dissertations. https://via.library.depaul.edu/csh_etd/514 (2022).
  22. Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
  23. Blackwell, B. R., et al. Effects of metformin and its metabolite guanylurea on fathead minnow (Pimephales promelas) reproduction. Environ Toxicol Chem. 41 (11), 2708-2720 (2022).
  24. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquat Toxicol. 78 (1), 91-102 (2006).
  25. Butler, J. M., Whitlow, S. M., Roberts, D. A., Maruska, K. P. Neural and behavioural correlates of repeated social defeat. Sci Rep. 8 (1), 6818(2018).
  26. Norton, W. H. J., Gutiérrez, H. C. The three-spined stickleback as a model for behavioural neuroscience. PLoS ONE. 14 (3), e0213320(2019).
  27. Espinasa, L., Jeffery, W. R. Conservation of retinal circadian rhythms during cavefish eye degeneration. Evol Dev. 8 (1), (2006).
  28. Jeffery, W., Ma, L., Parkhurst, A., Bilandzija, H. Pigment Regression and Albinism in Astyanax Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press, Elsevier. (2015).
  29. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). J Exp Biol. 217 (Pt 6), 886-895 (2014).
  30. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line-dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Dev Biol. 441 (2), 328-337 (2018).
  31. Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Dev Biol. 441 (2), 297-304 (2018).
  32. Chin, J. S. R., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Dev Biol. 441 (2), 319-327 (2018).
  33. Kowalko, J. E., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Curr Biol. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  34. Espinasa, L., et al. Divergent evolutionary pathways for aggression and territoriality in Astyanax cavefish. Subterr Biol. 43, 169-183 (2022).
  35. Kowalko, J. Utilizing the blind cavefish Astyanax mexicanus to understand the genetic basis of behavioral evolution. J Exp Biol. 223 (Suppl_1), jeb208835(2020).
  36. Sekulovski, B., Miller, N. Mechanisms of social behaviour in the anti-social blind cavefish (Astyanax mexicanus). Proc Biol Sci. 292 (2043), 20250052(2025).
  37. Chin, J. S. R., et al. Analysis of stress responses in Astyanax larvae reveals heterogeneity among different populations. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 334 (7-8), 486-496 (2020).
  38. Kozol, R. A., et al. A brain-wide analysis maps structural evolution to distinct anatomical module. eLife. 12, e80777(2023).
  39. Ra, K., et al. Evolution of a central dopamine circuit underlies adaptation of light-evoked sensorimotor response in the blind cavefish, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2024).
  40. Medley, J. K., et al. The metabolome of Mexican cavefish shows a convergent signature highlighting sugar, antioxidant, and ageing-related metabolites. eLife. 11, e74539(2022).
  41. Yen, S., Johnson, J. S. Metagenomics: a path to understanding the gut microbiome. Mamm Genome. 32 (4), 282-296 (2021).
  42. Marder, E. Marder lab website - Sylgard dishes. , https://sites.google.com/brandeis.edu/marder-lab/experimental-resources/sylgard-dishes (2026).
  43. Hallmaier-Wacker, L. K., Lueert, S., Roos, C., Knauf, S. The impact of storage buffer, DNA extraction method, and polymerase on microbial analysis. Sci Rep. 8, 6292(2018).
  44. Riddle, M. R., et al. Evolution of gastrointestinal tract morphology and plasticity in cave-adapted Mexican tetra, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2020).
  45. Garduño-Sánchez, M., et al. Phylogeographic relationships and morphological evolution between cave and surface Astyanax mexicanus populations (de Filippi 1853) (actinopterygii, characidae). Mol Ecol. 32 (20), 5626-5644 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة