تشريح الدماغ والأمعاء في تجمعات الأسماك السطحية وأسماك الكهف في أستياناكس مكسيكانوس

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا لتشريح واستخراج مكونات الدماغ والأمعاء الكاملة من النماذج السطحية والكهفية لأستياناكس مكسيكانوس. يمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك علم النسخ، وعلم الأيض، وتحليل ميكروبيوم الأمعاء.

الملخص

تستخدم أسماك التيلوست للإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية التي تتراوح من التطور إلى علم الوراثة وعلوم الأعصاب، ومؤخرا لفهم تعقيدات محور الأمعاء والدماغ، وحتى في سياق أوسع، محور الأمعاء والدماغ والكبد. تم استخدام التترا المكسيكية، Astyanax mexicanus، بشكل متزايد في أطر التطور المقارن والتطوري بسبب توفر أنماط شكلية وفسيولوجية مميزة، بما في ذلك الأسماك السطحية التي تعيش في الأنهار والأسماك الكهفية العمياء المتكيفة مع الكهوف. يرتبط التكيف مع مواطن الكهوف بتغيرات في الصفات الشكلية والسلوكية وتنوع ميكروبيوتا الأمعاء التي توجد أيضا في ظروف المختبر. وقد فتح هذا المجال إمكانية طرح أسئلة حول التفاعلات بين الميكروبيوم، والنشاط الأيضي، والتكيف العصبي، والمخرجات السلوكية المعقدة. يمكن الآن معالجة هذه التفاعلات من خلال دراسات رسم خرائط الدماغ الكامل باستخدام تسلسل الدماغ النظيف وميكروبيوتا الأمعاء لاكتشاف التنوع البكتيري المرتبط بالأنماط الظاهرية المتكيفة مع السطح والكهوف. ومع ذلك، فإن معظم هذه الدراسات ستستفيد من الأعضاء والأنسجة الكاملة السليمة، المفككة بعناية والمحفوظة، مما يسمح بالمعالجة اللاحقة في التطبيقات اللاحقة. يصف هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتشريح الدماغ والأمعاء، حيث يتم إزالة وعزل كامل أعضاء الدماغ والبطن لكل من نماذج الأسماك السطحية وأسماك الكهف.

المقدمة

نماذج الحيوانات، بما في ذلك الأسماك الفقارية، هي أدوات حاسمة لنمذجة الظواهر البيولوجية والأمراض المعقدة في أنظمة أبسط نسبيا وأكثر سهولة في الوصول. على سبيل المثال، سمكة الزرد، دانيو ريريو، هي واحدة من أكثر نماذج أسماك التليوست استخداما، مع العديد من الطرق المطبقة لدراسة تطورها وجيناتها وفسيولوجيتها وسلوكها، مع تأثير كبير في العلوم الطبية الحيوية والسلوكية^{العصبية} 1,2,3,4,5,6,7,8

البروتوكول

يتم تنفيذ هذا البروتوكول وفقا للبروتوكولات المعتمدة من الاتحاد الدولي للعلوم الجنائية 2024-0004 A790125 في مركز العلوم الجزيئية وحرم العلوم الطبية بجامعة بورتو ريكو.

1. إعداد ما قبل التشريح

1. إذا كنت تستخدم طبق سيلغارد بتتري (SP) للتحليل، تأكد من تحضيرها مسبقا قبل الإجراء، مع الأخذ في الاعتبار أنها قد تستغرق عدة أيام لتتجمع.
2. لتحضير طبق SP، استخدم سيلغارد 184 وإلاستومر 184 بنسبة 10:1. اخلط 200 جرام من قاعدة سيلغارد 184 مع 20 جرام من الإلاستومر في كوب يمكن التخلص منه. اسكب في أطباق بتري بعمق حوالي ثلث إلى نصف العمق. انقر على الطبق لإزالة الفقاعات والغطاء. تأكد من ملء الصحون وتركها على سطح مستو. اترك المعال....

النتائج

وفقا لهذا البروتوكول، تم استخراج محتويات الدماغ والأمعاء، وتم أخذ قياسات لطول الأمعاء والدماغ التيلينيفالون والتيكتوم البصري ومقارنة بين نماذج الأسماك السطحية ونماذج أسماك الكهف باتشون (الشكل 15). استخدمنا اختبارات t لويلش ذات العينة المستقلة للمقارنات الإحصائية، حيث كان حجم العينة n = 6 من الأسماك السطحية وn = 6 من أسماك الكهف Pachón. كان لأسماك السطح أبعاد بصرية أكبر بكثير من أسماك الكهف الباتشون، بما يتماشى مع بروتوكولات تسجيل الدماغ المنشورة^{سابقا 16،.......}

المناقشة

تزايد أهمية A . mexicanus كنموذج بحثي في عدة مجالات، بدءا من التطور إلى علم الأعصاب الطبي الحيوي وعلم الأحياء الدقيقة، يتطلب طريقة موحدة لتشريح الأعضاء وجمعها. بينما تم دراسة وتوثيق الهياكل المعزولة سابقا، بما في ذلك التكتوم^{البصري 16،38}، والقلب^{البالغ 11}، وغيرها^11،44، إلا أن هناك إرشادات منهجية تسمح بنتائج قابلة للتكرار من الأعضاء المفصولة .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حوض تكاثر سمك الزبرا بسعة 1.0 لتر	تكنيبلاست	https://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tank	لتحضير خليط الثلج الناتج عن القتل الرحيم. يملأ الخزان نصف بالثلج ثم يوضع الخزان الداخلي المثقوب فوقه. ثم يملأ بالماء حتى الأعلى.
حوض ثلج بولي يوريثان بسعة 4 لتر	يو إس إيه ساينتيفك	العنصر #2328-7242
أكياس النفايات البيولوجية الخطرة	فيشربراند	14-828-244
مركز سائل Calbiochem OmniPur PBS 10x، درجة علم الأحياء الجزيئي، معقم	ميليبورسيغما	65074L
المجهر التشريحي أوليمبوس SZ51	أوليمبوس	OLSZ51NPS-LED/R
ملقط تشريح الأنسجة	فيشربراند	08-953G
دبابيس التشريح، علبة 100	أدوات العلوم المنزلية	https://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2 GzkNBlnOJ3vUKor5 rFCJvVxPN9xRlpc
الملقط، الحساس، الأطراف الحادة الدقيقة جدا	موبيك	AB132
الملقط، المناديل، الطرف الدقيق جدا	موبيك	AB047
الهيموستات، 12.5 سم، مستقيم	أجهزة وورلد بريسيجن	https://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
ملقط الصائغة، دومونت رقم 5	ميليبورسيغما	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
كيموايب EX-L	كيمبرلي-كلارك	34155
النيتروجين السائل			مقدم من المؤسسة
مقص Noyes Micro Scissors، 12 سم	أجهزة وورلد بريسيجن	500228
مناديل الورق			مقدم من المؤسسة
أطباق بتري مع غطاء شفاف، 95 مم، 15 مم، دائري	فيشربراند	FB0875714G
سكابل بليدز، #22، 10 عبوة	أدوات العلوم الرئيسية	https://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
مقبض المشرط #4	سيرتكس	https://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
مقص، تشريح القزحية	موبيك	AA146
مقص، فائق الدقيق	موبيك	AA152
المنابت القياسية القابلة للنقل ذات الاستخدام الواحد	ثيرمو ساينتفيك	13-711-9D
الطرد المركزي الدقيق المعقم من نوع إبندورف 1.5 وميكرو؛ أنابيب L	إبندورف	05-402-25
سيلغارد 184	علوم المجهر الإلكتروني	24236-10
القارورة الحرارية	شركة لاب-لاين إنسترومنتس إنك.	2119
المقص فائق النقة	نيوميد إنسترومنتس	NM-DI-206023
ماء مناسب للرحلان الكهربائي، PCR	سيغما-ألدرتش	W4502-1L