مقالة منهجية

عزل وتنقية جزر البنكرياس من فئران لويس باستخدام الهضم الإنزيمي وفصل الكثافة والتدرج

DOI:

10.3791/70414

⸱

أبريل 3, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for BioNanoengineering, Houston Methodist Research Institute, 2School of Medicine and Health Sciences, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Applied Science and Technology, Politecnico di Torino, 4Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Houston Methodist Hospital, 6Department of Radiation Oncology, Houston Methodist Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة موحدة للحصاد الجراحي، والهضم الإنزيمي، وتنقية جزر لويس البنكرياسية بالتدرج الكثافتي، مما يتيح من استخدام التحضيرات عالية الإنتاجية والنقاوة للاستخدام المباشر في الدراسات الزرعية أو في المختبر .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جزر البنكرياس ضرورية لكل من زراعة الجزر السريرية والدراسات ما قبل السريرية التي تهدف إلى فهم آليات وتقدم مرض السكري. ومع ذلك، غالبا ما يكون التقدم في هذه المجالات محدودا بتوفر الجزر عالية الجودة، حيث تتطلب الاستراتيجيات العلاجية الناشئة تحضيرات أكبر وأنظف وأكثر توحيدا. تقدم هذه المقالة بروتوكولا عالي الإنتاجية وموحدا للحصاد الجراحي، والهضم الإنزيمي، وتنقية جزر البنكرياس بتدرج الكثافة من فئران لويس. تجمع الطريقة بين تروية البنكرياس داخل القنوات مع مزيج إنزيمات محدد، وهضم مشترك لعدة بنكرياس، وفصل قائم على الكثافة لتعظيم المحصول مع تقليل التجزئة والقضاء على الحاجة إلى القطف اليدوي الروتيني. يتم قياس عائد الجزر باستخدام نهجين تكميليين: طريقة عد تقليدية تعتمد على الأليكوت وتستخدم عادة في البيئات السريرية، وطريقة تصوير شبه آلية تعتمد على التحضير الكامل. في العزل التمثيلي من 12 بنكرياس، أسفر العد اليدوي عن حوالي 3,300 مكافئ لجزر صغيرة (IEQ) و2,700 جزيرة مطلقة لكل بنكرياس (~39,600 إجمالي)، مع توزيع حجم 62٪ (50-100 ميكرومتر)، 17٪ (100-150 ميكرومتر)، 10٪ (150-200 ميكرومتر)، 5٪ (200-250 ميكرومتر)، و6٪ (>250 ميكرومتر). بالمقارنة، أبلغ التحليل الآلي للتحضير الكامل عن 16,350 معادلة إجمالية (1,362 IEQ/بنكرياس)، مما يبرز التباين الكامن في القياس القائم على الأليكوت. كانت التحضيرات نقاء بنسبة 98٪ من خلال صبغ الديثيزون، وتم الحفاظ على حيوية الجزر عند 98٪ في المختبر في اليومين الثالث والسابع بعد العزل. أظهر التقييم الوظيفي بواسطة إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز الساكن زيادة بمقدار 10 أضعاف في إفراز الأنسولين بعد تحفيز لمدة ساعة واحدة بجلوكوز 16.7 ملليمولر. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول نهجا قابلا للتكرار وفعالا لتوليد تحضيرات جزر صغيرة عالية النقاء وسليمة وظيفيا يمكن استخدامها فورا دون تنظيف إضافي. تحتفظ الجزر الصغيرة بوظيفة قوية في الزراعة لمدة تصل إلى سبعة أيام، مما يتيح مرونة للاختبارات المخبرية واسعة النطاق وكذلك دراسات زراعة الزرع في الجسم الحي .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل زراعة جزر البنكرياس استراتيجية قابلة للتطبيق لاستعادة إنتاج الأنسولين الداخلي لدى الأفراد المصابين بداء السكري من النوع الأول (T1D)1. بعيدا عن مرض السكري الأول، أصبح علم الأحياء الجزيري ذا صلة متزايدة بمرض السكري من النوع الثاني (T2D)، وهو حالة تتميز بخلل وفقدان الخلايا β تدريجيا، وكذلك للمرضى الذين يخضعون لاستئصال جزئي أو كامل للبنكرياس بسبب التهاب البنكرياس المزمن أو أورام البنكرياس أو الإصابات الرضحية. في هذه السياقات، يعد الوصول إلى الجزر عالية الجودة أمرا ضروريا لتطوير العلاجات الخلوية، ونمذجة فشل الخلايا β، ودراسة التفاعلات المناعة بين الجزر والجزر والجزر-البثية، وتطوير أساليب تجديدية ناشئة2. وبالتالي، فإن إجراءات عزل الجزر القوية والقابلة للتكرار ضرورية لدعم كل من البحث الميكانيكي والتطوير الانتقالي عبر مجموعة واسعة من اضطرابات الغدد الصماء في البنكرياس.

على الرغم من أن الجزر الصغيرة تشكل أقل من 2٪ من كتلة البنكرياس، إلا أنها تلعب دورا غير متناسب في توازن الجلوكوز. تجعلها حساسيتها الذاتية لنقص الأكسجين، فرط الهضم الإنزيمي، الإجهاد التأكسدي، والقطع الميكانيكي بشكل خاص لإصابة العزل 3,4,5. حتى الانحرافات الطفيفة في درجة الحرارة أو الأكسجة أو التعامل مع الأنسجة يمكن أن تعيق اقتران المنبه والإفراز بين الخلايا β أو تحفز الاستماتة المبرمجة، بسبب محدودية الدفاعات المضادة للأكسدة وارتفاع الطلب الأيضي 6,7. نتيجة لذلك، تركز معظم البروتوكولات التقليدية على الاستخدام السريع في المرحلة اللاحقة، عادة خلال 24-48 ساعة من الحصاد في كل من البيئات السريرية والتجريبية8،9،10،11،12. بينما يقلل هذا الإطار "الاستخدام الفوري" من التدهور، فإنه يقيد المرونة التجريبية، ويعيق الدراسات الطولية، ويعقد الجهود لجمع أعداد كافية من الجزر لإجراء اختبارات كبيرة في المختبر أو تجارب زراعة الزرع في الجسم الحي.

من بين نماذج القوارض، تستخدم فئران لويس على نطاق واسع في أبحاث الجزر بسبب خلفيتها الجينية المتزاوجة داخليا، وملفها المناعي المستقر، وخصائصها الفسيولوجية القابلة للتكرار14. الفروق المعتمدة على السلالات في إنتاج الجزر والاستجابة والمرونة موثقة جيدا. أظهر دي جروت وآخرون أن جزر لويس الصغيرة تظهر إفراز أعلى للأنسولين المحفز بالجلوكوز مقارنة بسلالات أخرى، مما يؤكد ملاءمتها للدراسات الوظيفية والتمثيلية والزراعة15. أكدت أبحاث إضافية موثوقيتها في أبحاث المناعة والزراعة الغريبة/الزينوزركاليست 14,15,16. ومع ذلك، تظل التغيرات في إنتاج الجزر ونقائها ووظيفتها عائقا كبيرا. ينبع الكثير من هذا التباين من عدم اتساق في مزيج الإنزيمات، وتقنيات التروية عبر القنوات، والتعامل مع البنكرياس، وتوقيت الهضم، واستراتيجية التنقية17.

ولمعالجة هذه القيود، طورنا بروتوكولا قابلا للتكرار خطوة بخطوة للحصاد الجراحي، والهضم الإنزيمي، وتنقية جزر البنكرياس من فئران لويس باستخدام تدرج الكثافة. تم تحسين هذا السير لتعظيم الإنتاجية، وتقليل التجزئة، والحفاظ على القدرة على الاستمرار الوظيفي. ومن المهم أن تضع معايير واضحة، بما في ذلك مكافئات الجزر الصغيرة (IEQ)، وقابلية البقاء مع مرور الوقت، والنقاء، وإفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز، مما يمكن الباحثين من التمييز بشكل موثوق بين العزلات الناجحة وغير المثالية 18,19,20. من خلال تحسين كل من الإنتاج وطول العمر، يعزز البروتوكول مرونة التجارب وقد يقلل عدد الحيوانات المتبرعة المطلوبة، مما يدعم تصميم تجارب أكثر أخلاقية وقابلية للتوسع.

على عكس العديد من الأساليب التقليدية، تظهر الطريقة الحالية أن جزر لويس الصغيرة يمكن الحفاظ عليها في الزراعة لمدة تصل إلى 7 أيام مع الحفاظ على قابلية الحياة والوظيفة، مما يوسع فائدتها في الدراسات الممتدة في المختبر . يتضمن البروتوكول أيضا استراتيجية معالجة مجمعة مبسطة قادرة على التعامل مع ما يصل إلى 30 بنكرياس في دفعة واحدة، مما يتيح هضما موحدا ويقلل من التغير بين العينات. مع وصول نقاء الغدد الصماء إلى 98٪، يلغي الإجراء الحاجة إلى الانتقاء اليدوي المكثف ويقلل من فرص التلوث الميكروبي. مقارنة بطرق الهضم الأحادية أو الجماعية التي تنتج غالبا تحضيرات غير نقية أو متأثرة ميكانيكيا13، ينتج هذا السير عالي الإنتاجية أعدادا كبيرة من الجزر الصغيرة النظيفة وذات الجودة الزرعية المناسبة للاختبارات المختبرية ، والتحليل الأيضي، ودراسات الزراعة في الحي .

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في هيوستن الميثودية (IACUC، بروتوكول #IS00007362) وأجريت وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية وقانون رفاهية الحيوان.
ملاحظة: يمكن العثور على المواد والأدوات المستخدمة في جميع أنحاء البروتوكول في جدول المواد.

1. التحضير قبل يوم الحصاد والعزل

  1. جهز المحاليل التالية تحت ظروف معقمة داخل خزانة السلامة الحيوية (انظر الجدول 1) وتخزين جميع المحاليل عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    محلول شطف البنسلين-ستربتوميسين (Pen-Strep).
    غسل الوسط.
    مخزن التبريد.
    ثقافة الجزر الإعلامية.
    حاجز كريبس.
  2. قم بتعقيم الأدوات والمعدات باستخدام التعقيم الافتراضي.
    1. حقيبة جراحية لحصاد البنكرياس من جهاز المعقم: ستائر جراحية، شاش، ملقط نسيج أسنان الفئران، ملقط مسطح، ملقط منحني دقيق، مقص جلدي واحد، مقص دقيق، اثنان من الهيموستاتات الصغيرين، وواحد هيموستات منحني.
      ملاحظة: استخدم معقمين اثنين من عبوات البنكرياس الجراحية إذا كان هناك مشغلان جراحيان.
    2. حقيبة جراحية لتنظيف البنكرياس بنظام المعقيم: ملقط منحني دقيق ومقص دقيق التشريح.
    3. استخدم معقم واحدة من ورق الألمنيوم بحجم 30 سم × 30 سم.
    4. المعقم 1-6 كؤوس بسعة 600 مل و1 لتر، حسب عدد البنكرياس المراد معالجته (انظر الجدول 2).
    5. جهاز الأوتوكلاف بمصفاة بحجم 500 ميكرومتر.
    6. استخدم إبرتين شوكيتين بسعة 14 جرام، في حال انسدت إحداهما بأنسجة البنكرياس غير المهضومة.
    7. استخدم أنبوب حقنة واحد لكل حقنة بسعة 50 مل مطلوبة (انظر الجدول 3).
  3. جهز حمام الماء للهضم.
    1. املأ حوض الماء المجهز بهزاز مداري بماء فائق نقي معقم حتى يصل إلى 3/4 بوصة فوق مستوى المنصة.
    2. أضف محلول مضاد للميكروبات بسعة 3 مل وأبق الغطاء مغلقا لتقليل التلوث.

2. التحضيرات في يوم الحصاد والعزل

  1. جهز الحقن التدرجية.
    1. إزالة محاليل تدرج الجزر 1.108 جم/سم³، 1.096 جم/سم³، و1.069 جم/سم³ المحضرة والمستخدمة في الخطوات التالية وخطوة "تطهير الجزر" 5.2، من تخزين بدرجة حرارة 4 درجات مئوية، والسماح لها بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة (حوالي ساعة واحدة).
      ملاحظة: حجم التدرج المطلوب يختلف حسب عدد البنكرياس المراد معالجته؛ راجع الجدول 3 لضمان كميات كافية من التدرجات المختارة المذابة.
    2. قم بتحميل ووضع علامة على المحاقن بسعة 50 مل بتدرجات 1.096 جم/سم³ و1.069 جم/سم³.
      1. امزج بقوة محاليل تدرج الكثافة 1.069 و1.096 جم/سم³.
      2. تحميل الأحجام المناسبة، حسب الجدول 3، في حقن بسعة 50 مل مزودة بأنابيب جراحية وإبرة 16 جيلون.
      3. بعد التعبئة، أغلق الإبر للحفاظ على التعقيم وضع الحقن جانبا للاستخدام لاحقا في "تنقية الجزر" الخطوة 5.5.
    3. احتفظ بتدرج 1.108 جرام/سم3 عند درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام لاحقا.
  2. اصنع محلول إنزيمي من وسط تفكيك العمل (WDM)، ثم أضعه في الحقن لتدفق التروية والكؤوس المعبدة بعقم.
    1. اعمل في ظروف معقمة في خزانة أمان حيوي وحافظ على جميع الحلول في حالة تجمد.
    2. إذابة كميات الكولاجيناز، الثيرموليزين، وDNase I على الثلج.
    3. تخفف كواشف الإنزيم في كأس معقم بسعة 1 لتر باستخدام WDM لتحقيق التركيزات النهائية التالية: الكولاجناز 0.15 ملغ/مل، الثيرموليزين 5 ميكروغرام/مل، وDNase I 0.1 ملغ/مل (الجدول 2).
    4. اخلط WDM بلطف باستخدام حركة دوامة 10 مرات. لا تخلط مع الماصة؛ حافظ على نشاط الإنزيمات عن طريق الدوران بلطف.
    5. واحدا تلو الآخر، قم بتحميل 10 مل من محلول إنزيم WDM في كل حقنة بسعة 10 مل باستخدام إبرة 16 جرام للتعبئة السريعة، ثم استبدلها بإبرة مغلفة بحجم 25 G × 1/2" بوصة لتدخيم البنكرياس لاحقا.
    6. لف الحقن المحملة بورق ألمنيوم معقم وضعه على الثلج حتى الاستخدام.
    7. وزع فائض WDM بالتساوي في كؤوس معقمة بسعة 600 مل لاحتجاز البنكرياس المحصود وفقا للجدول 2. غط كل كأس بورق ألمنيوم معقم وابق عليه على الثلج (الجدول 2).
  3. جهز مساحة عمل زراعة الخلايا.
    1. شغل جهاز هزاز حمام الماء المداري، مضبوطا على 130 دورة في الدقيقة و37 درجة مئوية. اتركه هكذا أثناء حصاد البنكرياس.
    2. ضع العناصر التالية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية لمدة ساعة واحدة لمزيد من التعقيم.
      منخل معقم بقطر 500 ميكرومتر.
      كأس معقم بسعة 1 لتر.
      مضخة حقنة.
    3. تأكد من ضبط حاضنة زراعة الخلايا على 25 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    4. اضبط جهاز الطرد المركزي على 4 درجات مئوية، مع التسارع والتباطؤ عند 9.
  4. اجمع المواد للحصاد وتوجه إلى غرفة العمليات.
    1. منظف البنكرياس المخصص:
      1. اجمع دلو ثلج كبير واحد ليحتوي العدد المطلوب من كؤوس WDM بسعة 600 مل ومحلول شطف البنكرياس (انظر الجدولين 1 والجدول 2).
      2. اجمع صحن بتري معقم واحد لكل 6 بنكرياس يتم معالجته.
      3. اجمع مقصا معقما دقيقا وملقطين صغيرين منحنيين ودقيقين.
    2. حصاد البنكرياس المحدد:
      1. اجمع حقيبة جراحية معقمة للحصاد.
      2. اجمع قفازات جراحية معقمة.
      3. اجمع صينية ثلج بها محاقن WDM محشوة مسبقا بسعة 10 مل مغلقة بورق ألمنيوم معقم الجهاز.
  5. في غرفة الجراحة، جهز محطة حصاد البنكرياس.
    1. شغل معقم الخرز الزجاجي لتعقيم الأدوات الجراحية عن طريق غمرها لمدة دقيقة واحدة في المعقم بين كل حيوان. يمكن تبريد الأجهزة بسرعة بالغمر في PBS معقم 1x.
    2. ضع وسادة ماصة تحت مجال رؤية المجهر لأي دم أو محلول إنزيم WDM مسرب للدلال.
    3. اضبط المجهر على تكبير إجمالي يبلغ 6.3x بين العدسات العينية والموضوعية.
    4. افتح حقيبة الجراحة وارتد قفازات جراحية معقمة باستخدام تقنية المعقمات.
    5. تابع عملية الحصاد الجراحي.
  6. في غرفة العمليات، جهز محطة تنظيف البنكرياس.
    1. صب كمية كافية من محلول Pen-Strep لملء نصف طبق بتري بسمك 100 مم (حوالي 6 مل) لغمر البنكرياس المعزول ووضعه على الثلج.
    2. افتح حقيبة الجراحة وارتد قفازات جراحية معقمة باستخدام تقنية المعقمات.
  7. في غرفة الجراحة، جهز غرفة القتل الرحيم.
    1. ضع صواني الخزان في قفص فئران فارغ ونظيف وقابل لإعادة الإغلاق.
    2. املأ الصواني نصف ممتلئ بالإيزوفلوران.
    3. ضع الصينية المثقبة فوق الخزانات لمنع الانسكاب، بينما توضع الفئران بالداخل.
    4. أغلق غطاء الغرفة بغطاء القفص.
  8. تابع إلى حصاد البنكرياس.

3. حصاد البنكرياس

  1. ضع الفئران واحدة تلو الأخرى في غرفة القتل الرحيم فوق الصينية لجرعة زائدة سريعة من الأيزوفلوران.
    ملاحظة: زمن القتل الرحيم المطلوب للفأر سيختلف، خاصة مع تبخر الأيزوفلوران.
  2. أكد غياب النبض والتنفس لكل فأر.
  3. أكد القتل الرحيم بطريقة ثانوية لا تزعج تجويف البطن (مثل ثقل القلب).
    ملاحظة: طرق القتل الرحيم الأولية الأخرى مقبولة؛ ومع ذلك، يفضل استخدام جرعة زائدة من الإيزوفلوران، حيث يقلل القتل الرحيم السريع من نقص الأكسجين في الجزر.
  4. رش فراء بطن كل فأر بنسبة 70٪ إيثانول لتثبيت الشعر ومنع تساقط الشعر في مجال الجراحة.
  5. ضع الفأر المقتل تحت المجهر مع الرأس بعيدا عن المشغل. تأكد من أن تجويف البطن العلوي تحت مجال رؤية المجهر.

الشكل 1
الشكل 1: التعرض الجراحي والتروية عبر القنوات لبنكرياس الجرذ . توضيح للخطوات الرئيسية في تعرض البنكرياس والتروية عبر المصرة في أودي. (أ) قتل فأر لويس الرحيم مع فتح تجويف البطن. (آ) وضع مشبك القناة الصفراوية المشتركة والوريد الكبدي. (ب) رؤية مكبرة للاثني عشر تظهر وجود موستاتات دموية تحدد منطقة المصرة في أودي. (بي بي) إبرة التروية موضوعة داخل القناة الرئيسية للبنكرياس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. حصاد البنكرياس (دور حصاد البنكرياس):
    1. قم بعمل شق على شكل حرف V باستخدام مقص جلدي، بدءا من الارتباط الجنسي العانة نحو كل قفص صدري جانبي للوصول إلى تجويف البطن (انظر الشكل 1A).
    2. اسحب الأمعاء الصغيرة والغليظة إلى الجانب الأيسر من الحيوان باستخدام ملقط مسطح لتنظيف "مكان العمل" في تجويف البطن.
    3. افرد الاثني عشر باستخدام الملقط المسطح ومنظمات الدم المنحنية. تأكد من وجود القناة الصفراوية المشتركة والوريد المدخل الكبدي في مجال رؤية المجهر.
    4. اسحب الرأس الكبدي وثبت القناة الصفراوية المشتركة والوريد الكبدي باستخدام الهيموستاتات المنحنية. اثبت 1-2 مم من الكبد (انظر الشكل 1Aa).
      ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات 3.6.1-3.6.4 و3.6.8 من خلال التصور المباشر. استخدم المجهر في جميع الخطوات الأخرى لضمان التلاعب الدقيق بالأنسجة.
    5. تحت نظر المجهر، باستخدام الملقط المسطح والهيموستاتات المسطحة، تحرك المحتويات في الاثني عشر بلطف لإزالة المصرة من أودي.
      ملاحظة: تأكد من إزاحة محتويات الاثني عشر من موقع إدخال الإبرة المقصود.
    6. عزل المنطقة المحيطة بمصرة أودي عن طريق تثبيت الاثني عشر بلطف باستخدام العضلات المسطحة على بعد حوالي 5 مم من كل جانب من جانبي المصرة. تأكد من تقليل الضغط للحفاظ على سلامة الأنسجة (انظر الشكل 1B).
    7. باستخدام حقنة WDM معقمة، أدخل الإبرة بحذر عبر جدار الاثني عشر، ثم مررها عبر المصرة في أودي، وتقدم إلى القناة الرئيسية للبنكرياس للتروية (انظر الشكل 1Bb).
      1. بمجرد مرور الإبرة عبر مصرة أودي، مع الحفاظ على ضغط ثابت، يتم ضخ 7-10 مل من WDM في البنكرياس بمعدل حوالي 500 ميكرولتر/ثانية حتى ينتفخ البنكرياس بالكامل.
        ملاحظة: تأكد من أن الحافة مرفوعة وأن الإبرة موازية لقناة البنكرياس لتقليل الصدمة. ابدأ الحقن فور الإدخال. سيساعد ذلك في توسيع المصرة والقناة النارية، مما يسهل تقدم الإبرة. يعتبر البنكرياس منتفخا بالكامل عندما يصبح ذيل البنكرياس، الواقع بالقرب من الطحال، مثقبا بشكل واضح.
    8. قم باستئصال البنكرياس بلطف بتشريحه من الهياكل المحيطة بالترتيب التالي: الطحال، المعدة، الأمعاء الغليظة، الاثني عشر، والميزنيريا.
      ملاحظة: استخدم القطع العريض لتقليل تلف الأنسجة. تابع التتابع للحفاظ على التوجيه التشريحي وتقليل التوتر على الوصلات الوعائية والقنوات.
      1. أزل كلا الموستاتات المسطحة من الاثني عشر.
      2. استخدم الملقط المسطح لتثبيت رباط الطحال والبنكرياس (الذي يربط البنكرياس بالطحال) وطبق شد لطيف.
      3. باستخدام ملقط التشريح المنحني الدقيق، تحرك البنكرياس بعناية وافصله عن الوصلات المجاورة للطحال.
      4. افصل البنكرياس عن المعدة عن طريق رفع نسيج البنكرياس باستخدام ملقط منحني دقيق وتطبيق شد معاكس لطيف باستخدام ملقط مسطح.
      5. ثم، باستخدام الملقط المسطح، طبق شد قوي لفصل الأمعاء الغليظة عن البنكرياس.
      6. ارفع الأمعاء الدقيقة باستخدام الملقط المسطح وقم بتقشير المساريق من البنكرياس باستخدام الملقط المنحني الدقيق.
      7. ارفع البنكرياس المثقوب بلطف باستخدام الملقط المسطح واستخدم المقص الدقيق لقطع أي وصلات متبقية للأنسجة الضامة.
    9. انقل البنكرياس المقطوع فورا إلى طبق بترى يحتوي على محلول شطف مثلج وبدأ فورا في جمع البنكرياس التالي، بينما يبدأ منظف البنكرياس في تنظيف البنكرياس.
  2. تنظيف البنكرياس (دور منظف البنكرياس):

الشكل 2
الشكل 2: تنظيف بنكرياس الفئران المثقوب. التصور المتسلسل للبنكرياس قبل وبعد إزالة الأنسجة غير الأساسية. (أ) بنكرياس مثقوب فور التشريح، مع رؤية الأنسجة الدهنية المجاورة، والعقد اللمفاوية، والهياكل الضامة. (ب) بنكرياس مثقوب مع علامات تشريحية رئيسية معنونة. (ج) تنظيف البنكرياس بعد إزالة الأنسجة الزائدة، مع إظهار المظهر النهائي قبل الهضم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. استخدم الملقط المنحني الدقيق والمقص الشقيح الدقيق لقطع العقد اللمفاوية، والأنسجة الدهنية، والمضنيريا، والأوعية الدموية الكبيرة من البنكرياس المندمج بعناية، إذا وجدت، إذا كانت موجودة ( انظر الشكل 2).
  2. انقل البنكرياس المنظف إلى كأس معقم بسعة 600 مل يحتوي على 25 مل من WDM البارد. غط الكأس بورق ألمنيوم معقم للحفاظ على النظافة بين الانتقال من مكان الجراحة إلى مساحة زراعة الخلايا.
    1. استبدل محلول الشطف في طبق بتري كل 6 بنكرياس لمنع التلوث.
    2. سجل الوقت الذي يوضع فيه أول بنكرياس على الثلج. سيتم استخدام هذا لتوثيق وقت نقص التروية الباردة.
  1. بمجرد الحصول على جميع البنكرياس وتنظيفه، انتقل بسرعة إلى مرحلة الهضم في مساحة زراعة الخلايا.

4. هضم البنكرياس

  1. أوقف دوران الهزاز المداري وثبت الكأس المغطاة التي تحتوي على البنكرياس في حوامل الحمام المائية المخصصة.
  2. أعد تشغيل جهاز الهزاز المداري المضبوط على 130 دورة في الدقيقة بسرعة وابدأ مؤقتا لمدة 10 دقائق لوقت الهضم (انظر الشكل 3A).
    ملاحظة: سجل هذه النقطة كنهاية فترة نقص التروية الباردة. سجل كل حصاد من جزر مع إجمالي وقت نقص الدم البارد المقابل في سجل مختبري.
  3. عند علامة الخمس دقائق، قم بتدوير الكأس يدويا باتجاه عقارب الساعة، ثم عكس عقارب الساعة للمساعدة في تفكك الأنسجة.
  4. عند علامة 8 دقائق، استرجع محلول التبريد من التخزين البارد ونقله إلى خزانة السلامة البيولوجية للاستخدام الفوري لاحقا (انظر الجدول 1).
  5. عند علامة الدقيقة 10، نقل وغمر الكؤوس بسرعة في الجليد لإبطاء نشاط الإنزيم (انظر الشكل 3B).
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، تعامل مع جميع الأنسجة والخلايا والمحاليل على الثلج للحفاظ عليها حتى الخطوة 4.20 عند استخدام تدرجات كثافة درجة حرارة الغرفة.
  6. انقل الجزء الخارجي من الكأس وصينية الخزانة إلى خزانة أمان بيولوجي.
  7. أضف محلول التبريد بنسبة 1:1 مع المحلول في الكأس لإيقاف الهضم (حوالي 75-100 مل لكل كأس).
  8. استنشق وطرد تعليق الأنسجة بلطف وبشكل متكرر باستخدام حقنة 50 مل مزودة بإبرة شوكية 14 جرام لتفكيك شظايا الأنسجة الكبيرة (انظر الشكل 3C).
  9. انقل نظام التعليق إلى أنابيب مخروطية بحجم 200 مل.
  10. اشطف الكأس ب 5 مل من وسط الغسيل ثم قم بإخراج الأنبوب المخروطي بحجم 200 مل الذي يحتوي على هضم الجزر لجمع أي هضم متبق.
  11. تهضم الطرد المركزي عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تأكد من استخدام محولات وسائد مناسبة لزجاجات الطرد المركزي للسلامة.
  12. قم بتفريغ السوبرناتينت بعناية وأعد تعليق الحبيبة في 100 مل من وسط الغسيل باستخدام نفس إبرة الشوك 14 جالون كما في السابق.
  13. قم بترشيح التعليق عبر منخل معقم بحجم 500 ميكرومتر موضوع فوق كأس معقم بسعة 600 مل لإزالة أي نسيج كبير غير مهضوم.
    ملاحظة: إذا تم إجراء تفريغ وتنظيف البنكرياس بشكل مثالي، فلن يبقى نسيج دهني قليل جدا ولا يبقى البنكرياس غير المثقوب على المنخل.
  14. شطف المنخل ب 10 مل من وسط الغسيل لاستعادة الأنسجة المحبوسة.
  15. انقل الفلترة إلى أنابيب مخروطية جديدة بسعة 200 مل.
  16. الطرد المركزي عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  17. قم بتفريغ السوبرناتينت وأعد تعليق الحبيبات في وسط غسيل بسعة 100 مل باستخدام ماصة سيولوجية بحجم 10 مل.
    ملاحظة: تأكد من تقليل فقدان الخلايا عن طريق ترطيب أطراف الماصة مسبقا باستخدام عازل يحتوي على FBS قبل التعرض للجزر.
  18. الطرد المركزي عند 600 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  19. استنشق السائل الفائق بعناية للحصول على حبيبات جافة.
  20. اضبط درجة حرارة الطرد المركزي على 22 درجة مئوية استعدادا لفصل التدرج.
    ملاحظة: يمكن تسريع ذلك بتشغيل الطرد المركزي بقوة 2000 × g لمدة 15 دقيقة عند 22 درجة مئوية، بدون عينات.

5. تطهير الجزر الصغيرة

  1. راجع الجدول 3 لتحديد عدد الأنابيب المخروطية المطلوبة بسعة 50 مل.
    ملاحظة: راجع الجدول 3 لتوزيع حجم الحبيبات الكلي بشكل متساو، مع ضمان تقسيم حوالي 2-3 مل من هضم الحبيبات إلى كل أنبوب تدرج. إذا تم ملاحظة فصل ضعيف لشريط الجزر لاحقا، استخدم أنابيب تدرج إضافية لتعزيز دقة الفصل.
  2. قم بترطيب رأس ماصة سيولوجية بحجم 10 مل مسبقا باستخدام محلول تدرج كثافة 1.108 جم/سم³ لمنع التصاق الجزر الصغيرة بالسطح الداخلي للطرف.
  3. أعد تعليق كل حبيبة نسيجية في محلول تدرج 1.108 جم/سم³ لكل 2 مل من حجم الحبيبات باستخدام الماصة المصلية المبللة مسبقا بحجم 10 مل. على الرغم من أن الحجم الكلي يتجاوز 10 مل، إلا أن عرض الماصة الأصغر يسهل خلطا أكثر تحكما وتفكك الحبيبات بكفاءة. اخلط بلطف حتى يتوحد.
  4. قم بتوزيع 15 مل من تعليق الخلية في أسفل كل أنبوب مخروطي بحجم 50 مل بحذر، مع تجنب ملامسة جدران الأنبوب لضمان مستويات تدرج نظيفة.
  5. باستخدام المحاقن التدرج المحملة مسبقا، يتم وضع 10 مل بتدرج 1.096 جم/سم³ بشكل متسلسل، يليه 10 مل بتدرج 1.069 جم/سم³.
  6. قم بتوزيع كل تدرج بمعدل 5 مل/دقيقة باستخدام مضخة الحقنة، مع وضع طرف إبرة 16 جيلون مقابل الجدار الداخلي للأنبوب لمنع اختلاط التدرج.
  7. قم بطرد المركزي بالأنابيب عند 700 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 22 درجة مئوية، مع ضبط تسارع الطرد المركزي على 3 والتباطؤ على 0 لمنع اختلاط التدرج.
    ملاحظة: نظرا لوقت التباطؤ الممتدد، تستغرق دورة الطرد المركزي بأكملها حوالي 45 دقيقة. راقب الوقت عن كثب، حيث يجب جمع الجزر الصغيرة بسرعة لمنع اختلاط التدرج وتلف الخلايا المحتمل. إذا لزم الأمر، جهز أنابيب أو أنابيب التوازن حسب الوزن وليس الحجم، لمراعاة اختلافات الكثافة. بعد إزالة الأنابيب، قم بإعادة ضبط جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية، والتسارع والتباطؤ إلى 9 درجات مئوية للخطوات القادمة.
  8. بعد الطرد المركزي، حدد طبقة الجزر الواقعة عند واجهات طبقات التدرج 1.069-1.096 جم/سم³ و1.096-1.108 ج/سم³ (انظر الشكل 3D).
  9. استنشق وتخلص من أي نسيج جمع في الطبقة العليا بعناية باستخدام ماصة باستور مبللة مسبقا بوسط غسيل.
  10. بلل ماصة باستور أخرى، اجمع طبقة الجزيرة، وانقلها إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا بحجم 200 مل يحتوي على 5 مل من وسط الغسيل.
  11. ارفع حجم الأنبوب المخروطي المبرد مسبقا 200 مل إلى 200 مل باستخدام وسط الغسيل.
  12. الطرد المركزي عند 600 × جرام لمدة 5 دقائق ثم تفريغ السوبرناتانت.
  13. أعد تعليق الحبيبة في وسط غسيل بحجم 30 مل باستخدام طرف مصلي مبلل مسبقا بسعة 10 مل.
  14. نقل التعليق المجدد إلى أنبوب مخروطي جديد بحجم 50 مل باستخدام رأس مصلي مبلل مسبقا بسعة 10 مل لتحسين تكوين حبيبات الجزر.
  15. اشطف نفس الأنبوب المخروطي بحجم 200 مل مع 20 مل من وسط الغسيل وانقله إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل يحتوي على الجزر المتبقية.
  16. قم بطرد مركزي بأنبوب مخروطي بسعة 50 مل مع جزر صغيرة ووسائط غسيل على حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  17. قم بتفريغ المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الجزيرة في 50 مل من وسط زراعة الجزر (انظر الجدول 1).
    ملاحظة: قم بإزالة 100 ميكرولتر أليكوات خلال هذه الخطوة إذا كنت تعد الجزر الصغيرة باستخدام طريقة القياس اليدوي.
  18. قم بتوزيع الجزر بشكل متساو إلى أطباق بتري بحجم 100 مم غير معالجة بزراعة الأنسجة، باستخدام طبق واحد لكل خمسة بنكرياس لويس المعالجة.
    1. احسب الحجم الكلي المطلوب لوسط الجزر باستخدام الصيغة (عدد البنكرياس ÷ 5 × 10 مل).
    2. أعد تعليق حبيبة الجزيرة في نصف حجم الوسائط المحسوبة، ثم وزع التعليق بشكل متساو على عدد الألواح المحدد.
    3. اشطف أنبوب مخروطي بحجم 50 مل يحتوي على جزر متبقية مع النصف المتبقي من الوسط المحسوب، ثم استخدم هذا الغسيل عبر نفس الألواح بأنبوب الماصة للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 10 مل لكل طبق (انظر الشكل 3E).
  19. حضن الليلة عند 25 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أضف 3 مل من وسط زراعة الجزر كل 24 ساعة على جانب كل طبق بتري ثم قم بتدوير الوسط بلطف لتجديد الوسط.
  20. تابع إلى عد الجزر الصغيرة (الخطوة 6).

الشكل 3
الشكل 3: هضم البنكرياس وتنقية الجزر المعزولة. صور تمثيلية للخطوات المتسلسلة من هضم البنكرياس المتجمع إلى تنقية الجزر. (أ) تجمع البنكرياس المثقوب قبل الهضم الإنزيمي. (ب) البنكرياس المجزأ بعد الهضم الإنزيمي. (ج) تعليق الأنسجة الموحد، ما بعد الميكانيكي. (د) أنابيب تدرج الكثافة قبل الطرد المركزي (يسار) وبعد الطرد المركزي (يمين)، مع شريط جزر مرئي عند واجهة التدرج المحاطة بدائرة. (ه) صورة برايتفيلد لجزر اليوم صفر مباشرة بعد الجمع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. عد الجزر الصغيرة

  1. اجمع القياس اليدوي للجزر.
    1. خلال الخطوة 5.16، اسحب ثلاث أليكوات بسعة 100 ميكرولتر من تعليق الجزيرة باستخدام ماصة بسعة 200 ميكرولتر وأرؤوس عادية بسعة 200 ميكرولتر.
      ملاحظة: تأكد من تعليق الجزر الصغيرة بشكل متساو في الوسط عبر خلط الماصة، عند أخذ القيود للقياس.
    2. انقل كل أليكوت إلى طبق بتري شبك خاص به بحجم 2 مم × 2 مم يحتوي على 1 مل من 1× PBS.
    3. يعد الجزر تحت المجهر المقلوب، ويقوم بتصنيفها حسب القطر باستخدام عدسة عدسة عدسة العين الشبكية.
      ملاحظة: ليست كل الجزر الصغيرة دائرية؛ التزم بقياسات أفقية أو عمودية طوال فترة العد.
    4. احسب العدد الكلي لجزر صغيرة بحجم 150 ميكرومتر باستخدام جدول التحويل الموحد (انظر الجدول 4).
      ملاحظة: قارن بين IEQ لكل عينة. إذا اختلفت IEQ للأليكوات بأكثر من 30٪، تابع بمتوسط أكثر الأليكوات تشابها.

7. احتياطات السلامة

  1. قم بإجراء جميع العمليات الجراحية وإجراءات التعامل مع الأنسجة تحت ظروف معقمة داخل خزانة السلامة البيولوجية عند الحاجة. استخدم معدات الحماية الشخصية (PPE)، بما في ذلك نظارات السلامة، ومعاطف المختبر، والقفازات، والأقنعة الجراحية، أثناء التعامل مع المواد الكيميائية والأنسجة.
  2. قم بحصاد البنكرياس في ظروف معقمة باستخدام الأدوات الجراحية المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. التعامل مع الإيزوفلوران وغيره من المخدرات وفقا لإرشادات المؤسسة لمنع التعرض للاستنشاق.
  3. التخلص من أنسجة الحيوانات والأدوات الحادة والنفايات البيولوجية الخطرة وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية المؤسسية. الحفاظ على الكواشف الإنزيمية والمواد البيولوجية على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك للحفاظ على النشاط والقابلية للحياة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل النتائج التالية عزلا نموذجيا لجزر صغيرة يتم إجراؤه باستخدام الطريقة الموصوفة، مع معالجة اثني عشر بنكرياس لجرذ لويس بالتوازي.

توزيع العائد والحجم

العد اليدوي للنقاط وتحويل IEQ

تم الحصول على عليقتين مستقلتين بسعة 100 ميكرولتر من تعليق الجزر المختلطة، كما هو موضح في القسم "عد الجزر"، الخطوة 6.1، وتم عدهما بواسطة صناديق قطرية (50-100 ميكرومتر، 100-150 ميكرومتر، 150-200 ميكرومتر، 200-250 ميكرومتر، 250-300 ميكرومتر، 250-300 ميكرومتر). تم تحويل العد إلى مكافئات جزر صغيرة (IEQ؛ مرجع 150 ميكرومتر) باستخدام جداول تكافؤ قياسية واستقراء إلى حجم التعليق الكلي (انظر الشكل 4A). عبر العزل التجريبي (n = 12)، كان الناتج 3330 IEQ/بنكرياس مع متوسط قطر جزر في صندوق 50-100 ميكرومتر. تم الاتفاق على الاقتباسات المكررة بنسبة 18.8٪ لكل صندوق (معامل التغير)، مما يشير إلى تباين معتدل لكنه متوقع باستخدام طرق العد اليدوي. خلال 14 عزلة سابقة للجزر، أنتجت هذه الطريقة متوسط 1353 (SD 607) من IEQ/البنكرياس.

القياس الآلي للصفيحة الكاملة

لمقارنة IEQ اليدوي، تم التقاط صور الحقل السbrightfield عند D1 باستخدام مجهر وخيطها لتوليد مركبات كاملة (4× هدف؛ تعريض 1/100 ثانية). تم إجراء قياس حجم وكمية الكائنات بشكل آلي باستخدام فيجي والترميز مع عتبة حجم محددة مسبقا تتراوح بين 50-600 ميكرومتر. تمت معالجة الصور مسبقا أولا لتقليل تباين الخلفية وتعزيز توحيد التباين. تم تحديد هياكل الجزر بناء على فروق الشدة بالنسبة للأنسجة المحيطة، مما أدى إلى توليد أقنعة كائنات ثنائية. تم فصل الجزر المجاورة أو التي تلامس جزئيا لتجنب التقليل من تقدير عدد الأجسام. تم استبعاد الأجسام خارج نطاق الحجم المحدد لإزالة الحطام والأنسجة غير الجزيرة. لكل جسم محتجز، تم استخراج معاملات مورفومترية تشمل المساحة وأقطار المحوري x وy. ثم تم تقسيم الجزر حسب القطر، وتم حساب IEQ بضرب عدد الجزر الصغيرة في كل صندوق بحجم في عامل التحويل المقابل. أسفر التكبير الآلي عن 98,832 جسما إجماليا، بمتوسط قطر محوري x و y يبلغ 117 ميكرومتر و116 ميكرومتر على التوالي، وإجمالي تقديري ب 16,350 IEQ، وهو ما يرتبط ارتباطا قويا بمقياس IEQ اليدوي عند D0 (سبيرمان r = 0.937، p = 0.0048؛ انظر الشكل 4A-C).

تساقط الخلايا الصغيرة

تم التقاط صور الصفيحة الكاملة بعد ساعتين من التنقية ومرة أخرى في اليوم الأول (D1)، باستخدام نفس المنهجية في "القياس الآلي للصفيحة الكاملة" لتقييم تثبيت الجزر المبكر ("التساقط"). تغير عدد الأجسام بنسبة 0.9٪ وعدد الأجسام بنسبة -6.11٪ من ساعتين إلى D1 (انظر الشكل 4D). أظهرت المقارنة المزدوجة لأقطار الجزر بين D0 و D1 انخفاضا متوسطا ذا دلالة إحصائية بمقدار 2 ميكرومتر (اختبار الرتبة الإشارة في ويلكوكسون، p = 0.0136، n = 2820). ومع ذلك، من غير المرجح أن يكون حجم هذا التغير الصغير ذا معنى بيولوجي أو سريري.

الشكل 4
الشكل 4: التقييم الكمي لتوزيع حجم الجزر، والارتباط، والتساقط المبكر. ملخص بياني لقياسات الجزر الصغيرة تم الحصول عليه من خلال تحليلات يدوية وآلية. (أ) توزيع حجم الجزر في اليوم 0 (D0) بناء على القياس اليدوي عبر صناديق حجم IEQ الموحدة المكافئة للجزر. (ب) توزيع حجم الجزر في اليوم الأول (D1) يتم تحديده بواسطة قياسات آلية قائمة على الصور عبر نفس صناديق حجم IEQ الموحدة. (ج) ارتباط العد بين D0 اليدوي والقياس الآلي ل D1 عبر صناديق حجم IEQ. (د) مخطط صندوق لتوزيع أقطار الجزر بين D0 و D1 للقياسات الآلية لنفس اللوحة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النقاء (محتوى الغدد الصماء مقابل المواد الخارجية الخارجية)

صبغة الديثيزون (DTZ)

على D1، تم صبغ عدد من الجزر الصغيرة (n = 451) ب DTZ لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة وتم تصويره فورا باستخدام مجهر الحقل الساطع (4× هدفي؛ تعريض 1/20 ثانية). في فيجي، تمت إزالة البكسلات الخلفية بحيث تتوافق مساحة البكسل المتبقية مع مساحة الجزر الكلية. تم اختيار مناطق الأنسجة الخارجية السلبية ل DTZ، والتي تم تحديدها بواسطة تباين لون أغمق، يدويا باستخدام أداة الحبل، وتم تسجيل منطقة كل منطقة محل اهتمام تلقائيا بالبكسل. تم حساب نقاء الغدد الصماء كنسبة البكسلات الموجبة ل DTZ مقارنة بإجمالي بكسلات الجزر، مما أدى إلى نقاء 98.56 ± 0.38٪ (الشكل 5A).

الجدوى والأداء الوظيفي

إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS)

في كل نقطة زمنية (D1، D3، D7)، تم اختيار 15 جزيرة صغيرة متطابقة بالحجم ووضعها يدويا في آبار فردية من صفيحة مكونة من 24 بئرا، معدة في رباعية. تم حضنة الجزر الصغيرة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في مخزن كريبس تحت بروتوكول تحفيز الجلوكوز منخفض-عالي-منخفض: أولا في انخفاض الجلوكوز (2.8 ملم، 60 دقيقة)، تلاها ارتفاع الجلوكوز (16.7 ملم، 60 دقيقة، انظر الجدول 1). تم جمع كسور الصرف في نهاية كل فترة حضانة، وتم قياس تركيزات الأنسولين باستخدام اختبار ELISA الخاص بإنسولين الفئران. تم حساب مؤشرات التحفيز كنسبة إفراز الأنسولين خلال حالات ارتفاع إلى انخفاض الجلوكوز. كانت مؤشرات التحفيز 9.37، 8.34، و6.7 في الأيام 1 و3 و7 على التوالي، دون فروق ذات دلالة إحصائية (الشكل 5B).

صبغة حية/ميتة

في D1 وD3 وD7، تم اختيار 15 جزيرة صغيرة وصبغها يدويا بمجموعة الصلاحية الحية/الميت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لفترة وجيزة، تم حضن الجزر الصغيرة في محلول التلوين الحي/الميت لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية، ثم تم تصويرها تحت إعدادات مجهرية متسقة لضمان المقارنة عبر نقاط زمنية (4X هدف؛ تعريض 1/30 ثانية، مرشحات تكساس ريد وGFP). تم قياس قابلية التشغيل باستخدام سكريبت بايثون يستخدم صورة scikit لتقسيم الجزر وقياس التألق. تم تحديد الجزر الصغيرة من خلال دمج قناتي الفلورة الخضراء والحمراء، وتطبيق طريقة العتبة لي لإنشاء قناع ثنائي، واستخدام تقسيم حوض التصريف لفصل الجزر المتلامسة. تم تصفية الأجسام حسب المساحة لاستبعاد الحطام والقطع الأثرية. لكل جزيرة، تم حساب قابلية الاستمرار كنسبة الكثافة المتكاملة الحية (البكسلات الخضراء) مقارنة بالكثافة المتكاملة الكلية (بكسلات خضراء مع حمراء). أظهرت النتائج قابلية البقاء بنسبة 68 ± 9٪ عند D1، و98.2 ± 0.6٪ عند D3، و100٪ عند D7. أظهرت عينة ضابطة إيجابية عولجت بنسبة 70٪ إيثانول لمدة 10 دقائق 2.7٪ ± 7.2٪ (انظر الشكل 5C-F).

الشكل 5
الشكل 5: تقييم نقاء الجزيرة، وقابليتها، والاستجابة الوظيفية. صور تمثيلية وملخصات كمية لخصائص الجزر المعزولة عبر الزمن. (أ) صورة ممثلة 10× للجزر المصبوغة بالديثيزون (DTZ)، تظهر جزر غدد صماء مصبوغة باللون الأحمر وأنسجة خارجية غير مصبوغة. (ب) قيم إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) لمؤشر التحفيز عالي الجلوكوز/منخفض الجلوكوز (HG/LG) للأيام 1 و3 و7. (C-E) صور فلورية حية/ميتة للجزر الصغيرة في اليوم الأول (C)، اليوم الثالث (D)، واليوم السابع (E). (و) صورة فلورية حية/ميتة لجزر موجبة التحكم المعالجة بالإيثانول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

(أ) وسائط الغسيل
المكونالتركيز النهائيالكمية (مل)
RPMI 1640-500 مل
مصل الأبقار الجنيني10%50 مل
العقدة العقدية (10,000 U/mL)1%5.5 مل
هيبس25 مللي موتر12.5 مل من مخزون 1M
إل-جلوتامين2 مللي مول5 مل من مخزون 200 مللي متر
(ب) وسائل الإعلام الثقافية للجزر
المكونالتركيز النهائيالكمية (ملليتر أو ج)
RPMI 1640، لا يوجد جلوكوز-500 مل
مصل الأبقار الجنيني10%50 مل
العقدة العقدية (10,000 U/mL)1%5.5 مل
هيبس20 مللي مولار11 مل من مخزون 1M
بيروفيات الصوديوم1 مللي مولار5.5 مل من مخزون 100 مللي متر
الجلوكوز5.5 مللي مولار2.75 مل من مخزون 200 جم/لتر
(ج) محلول شطف البنسلين-ستريبتوميسين
المكونالتركيز النهائيالكمية (ملليتر أو ج)
محلول ملحي، 0.9٪-500 مل
البنسلين ستريبتوميسين (10,000 U/mL)2%10 مل
(د) مخزن التبريد
المكونالتركيز النهائيالكمية (ملليتر أو ج)
HBSS-500 مل
مصل الأبقار الجنيني20%100 مل
هيبيس (1 ذكر)2.50%2.5 مل
(ه) مخزن كريبس
المكونالتركيز النهائيالكمية (ملليتر أو ج)
dH2O-975 مل
NaCl115 مللي مولار6.72 جرام
NaHCO324 مللي مولار2.02 جرام
KCl5 مللي مولار0.3728 ج
هيبيس (1 ذكر)25 مللي موتر25 مل
إم جي سيإل 21 مللي مولار0.0952 جرام
BSA0.10%1 ج
CaCl22.5 مللي مولار0.2775 ج

الجدول 1: قائمة الحلول. تفاصيل التركيب والتحضير لجميع المحاليل المستخدمة طوال بروتوكول عزل وتنقية الجزر. يسرد كل قسم مكونات، وتركيزات نهائية، ومجلدات تحضير، وأرقام الكتالوج. (أ) وسائط الغسيل، تستخدم لغسل وغسل المناديل أثناء الهضم والتنقية. (ب) وسائط ثقافة الجزر، المستخدمة في صيانة الجزر بعد العزل وقابليتها للبقاء في الجزيرة. (C)محلول شطف البنسلين-ستريبتومايسين، المستخدم لتعقيم وشطف البنكرياس المحصود. (د) مخزن التبريد، يستخدم لإنهاء الهضم الإنزيمي والحفاظ على بقاء الخلية. (ه) مخزن كريبس، المستخدم أثناء اختبارات إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS).

عدد البنكرياسكولاجناز (15.38 ملغ/مل)الثيرموليزين (1 ملغ/مل)دعد الحمض النووي (100 ملغ/مل)المخزن العاملكؤوس 600 مل للاستخدامالحجم/الكأس
304.5 مل2.25 مل450 ميكرولتر450 مل525 مل
243.6 مل1.8 مل360 ميكرولتر360 مل425 مل
203 مل1.5 مل300 ميكرولتر300 مل325 مل
162.4 مل1.2 مل240 ميكرولتر240 مل225 مل
121.8 مل0.9 مل180 ميكرولتر180 مل225 مل
101.5 مل0.75 مل150 ميكرولتر150 مل225 مل
الحكم النهائي.0.15 ملغ/مل5 ملغ/مل0.1 ملغ/مل

الجدول 2: محلول إنزيم الجهاز الهضمي حسب كمية البنكرياس. كميات من الكولاجيناز، وثيرموليزين، وDNase I المطلوبة لتحضير وسط التفكك العامل (WDM) لأعداد متفاوتة من بنكرياس الفئران. التركيزات النهائية لكل إنزيم مدرجة في أسفل الجدول.

عدد البنكرياسأنابيب رقم 50 ملالحجم/الحقنةعدد الحقن 1.096عدد الحقن 1.068
3010 أنابيب50 مل22
248 أنابيب40 مل22
206 أنابيب30 مل22
164 أنابيب40 مل11
124 أنابيب40 مل11
10أنبوبان20 مل11

الجدول 3: كمية التحميل التدرج حسب البنكرياس. عدد الأنابيب المخروطية بحجم 50 مل وأحجام التدرج المقابلة المطلوبة لتنقية الجزر بناء على عدد البنكرياس المعالجة.

نطاق قطر الجزر (ميكرومتر)عدد جسيمات الجزر (AI)عامل تحويل IEQIEQ لكل نطاق
50-100a* 0.167a * 0.167
101-150b* 0.648b * 0.648
151-200c* 1.685c * 1.685
201-250d* 3.500d * 3,500
251-300e* 6.315e * 6.315
301-350f* 10.352f * 10.352
> 350g* 15.833g * 15.833

الجدول 4: تحويل تكافؤ الجزر. تحويل نطاقات قطر الجزر إلى مكافئات جزر موحدة (IEQ). يسرد الجدول صناديق قطر الجزر المرصودة، وعدد جزيئات الجزر في النطاق، وعامل تحويل IEQ المقابل لكل نطاق حجم، والمساهمة الناتجة في IEQ لكل نطاق.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول نهجا عالي الإنتاجية لعزل وتنقية جزر البنكرياس من فئران لويس. يعتمد نجاح الطريقة على عدة خطوات حاسمة تحافظ معا على سلامة ووظيفة الجزيرة. من بين هذه العوامل التروية الدقيقة والكاملة للبنكرياس، والتنظيف الدقيق للبنكرياس المثقوب، والوقت الدقيق للهضم الإنزيمي. يعد تدفق الدم المتسق للأعضاء بأكملها أمرا بالغ الأهمية لتحقيق انتفاخ منتظم للبنكرياس وضمان توزيع متساو لمزيج الكولاجيناز-ثيرموليزين-DNase، الذي يعمل على التوالي على هضم المصفوفة خارج الخلية، وتعزيز اختراق الإنزيمات، وتقليل اللزوجة التي يصدرها الحمض النووي21,22. يمكن أن يؤدي نقص التروية إلى هضم الأنسجة غير الكامل وفقدان جزء كبير من الجزر، حيث يتم تصفية الأنسجة غير المهضمة بالغربال. وبالمثل، فإن إزالة غير كافية للأنسجة الدهنية أو الأوعية الدموية قبل الهضم قد تسبب شوائب غير صماء تقلل من النقاء. أخيرا، يؤدي الهضم المطول إلى فك فصل الجزر بسبب كسر مفرط لمصفوفة الخلايا الخارجية، بينما يؤدي الهضم غير المثالي إلى إنتاج نسيج غير مهضم مقاوم للهضم الميكانيكي عبر الإبرة الشوكية. تمثل هذه الخطوات أكثر الأخطاء التقنية شيوعا ويجب مراقبتها بعناية أثناء التدريب والتحسين.

على الرغم من أن هذه الطريقة صممت خصيصا لفئران لويس، إلا أنه من المحتمل أن تتكيف مع سلالات أو أنواع أخرى من خلال إعادة تحسين طفيفة لوقت الهضم ونسبة الإنزيمات 23,24,25,26. قد تختار بعض المختبرات تعديل نسبة الكولاجيناز، الثيرموليزين، وإنزيم DNase I في وسط التفكك العامل (WDM) لتحسين الإنتاجية لخصائص الإنزيمات أو الأنسجة الخاصة بهم. للقيام بذلك، قد تتبع المختبرات بعناية دليل الشركة المصنعة خطوة بخطوة لتحسين الإنزيمات والأنسجة، وفي جميع الحالات تجنب إضافة مكونات مثل 0.1 M EDTA، السيستين، ميركابتوإيثانول، مثبطات البروتياز، المصل، أو الألبومين، حيث قد تثبط هذه المكونات نشاط إنزيمات الكولاجناز، الثيرموليزين، وإنزيم DNase 127. على الرغم من عدم نشر وقت عمل محدد لمزيج الإنزيم قبل التفكك، إلا أن البيانات السابقة تظهر أن الحفاظ الممتد على برودة البنكرياس يؤثر سلبا على إنتاج ووظيفة الجزر28. تجريبيا، وجدنا أنه في بروتوكولنا، تم تحقيق عزلات ناجحة باستمرار عندما تم الحفاظ على زمن نقص التروية الباردة الكلي، المعرف بأنه الفترة بين وضع أول بنكرياس على الثلج للتنظيف ونقله إلى حمام الماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، تحت 1.5 ساعة. قد يكون من الضروري تحسين إضافي لهذا المعامل اعتمادا على تطبيق المستخدم النهائي.

على الرغم من قوته، إلا أن لهذا البروتوكول عدة قيود عملية وتقنية. أولا، مزيج الإنزيمات (الكولاجيناز، الثيرموليزين، وDNase I) وتدرجات الكثافة ضرورية لتفكك الأنسجة وعزل الجزر بكفاءة، لكنها تفرض تكلفة كبيرة. استند اختيارنا لتركيبة الإنزيمات إلى الخصائص البنيوية لمصفوفة البنكرياس خارج الخلية والحاجة إلى موازنة التفكك الفعال للأنسجة والحفاظ على سلامة الجزيرة. كل مكون إنزيمي يسهل دورا مميزا: الكولاجيناز يستهدف الكولاجينات الليفية والأغشية القاعدية لتحرير الجزر الصغيرة؛ الثيرموليزين، وهو بروتيز محايد، يقطع البروتينات المصفوفة غير الكولاجينية وجزيئات التصاق الخلية-الخلية، مما يقلل من التعرض المطلوب للكولاجناز؛ ويقلل DNase I من اللزوجة الناتجة عن الحمض النووي المنبعث من الخلايا المتحللة 29,30,31. على الرغم من توفر تركيبات إنزيمات الهضم منخفضة التكلفة تجاريا، إلا أن نقاءها متغير وقد يؤثر على الأداء الإنزيمي13,23. نظرا لأن الكولاجيناز معزول من المزارع البكتيرية، فإن خطوات التنقية الإضافية تقلل من تلوث السموم الداخلية لكنها تزيد التكلفة بشكل كبير13,23.

بالنسبة للكولاجناز، نوصي بتحضيرات بنشاط يقارب 2000 إلى 4000 وحدة وونش لكل زجاجة، مما يدعم التفكك الفعال عند الجرعة المعتدلة مع تجنب الهضم المطول. ومن الجدير بالذكر أن المزيج يجب أن يتضمن نسبة متوازنة بين الكولاجناز من الفئة الأولى إلى الفئة الثانية، مما يتوافق مع نسبة كولاجناز II/إجمالي الكولاجنازات بمقدار حوالي 0.3-0.5. توفر هذه النسبة نشاطا كولاجنوليتيكيا قويا مع الحد من التحلل المفرط لمصفوفة الخلايا خارج الكولاجين. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكمل خليط الكولاجيناز بمستوى معتدل من نشاط البروتيازات المحايد (حوالي 150,000-250,000 وحدة) وDNase، لأسباب ذكرت سابقا.

من منظور مراقبة الجودة، يجب أن تتضمن كل دفعة توثيقا لانخفاض عبء السموم الداخلية (≤50 EU/mg)، ونقاء إنزيم عالي (≥85٪ بواسطة HPLC)، ونشاط موثق من دفعة إلى دفعة، حيث يمكن أن تختلف نقاء وتركيب الإنزيمات بشكل كبير حسب الشركة المصنعة. أخيرا، قد تؤثر التغيرات في تركيب القطع على قوام الهضم وإنتاج الجزر، مما يستلزم إجراء تحقق داخلي خاص بالقطعة. يمكن تحقيق هذا التحقق من خلال اتباع شروط الهضم الموحدة الموصوفة في هذا البروتوكول ثم تقييم كفاءة الهضم وشكل الجزر. تشمل مؤشرات أداء الإنزيمات غير الأمثل تفكك الأنسجة غير الكامل، أو جزر ذات حدود غير منتظمة أو خشنة، أو الحاجة إلى قص ميكانيكي مفرط لتحقيق الفصل، وفي هذه الحالة قد يكون من الضروري تعديل وقت الهضم.

تنطبق اعتبارات مماثلة على تدرجات الكثافة. اخترنا تدرجا قائما على البولي سكاروز، وهو كوبوليمر غير أيوني شديد الهيدروكروز مكون من السكروز-إبيكلوروهيدرين يشكل تدرجات مستقرة تصل إلى 1.2 جرام/مل وله سجل طويل في عزل الجزر32,33. اليوديكسانول بديل موثق جيدا، وتظهر الدراسات في الجزر البشرية أن التدرجات القائمة على اليوديكسانول يمكن أن تحسن تعافي الجزر مع الحفاظ على قابلية العيش والوظيفة34،35،36،37. ومع ذلك، فإن بيانات القوارض غير حاسمة، حيث أبلغت بعض الدراسات عن نتائج أفضل باستخدام اليوديكسانول، بينما أظهرت دراسات أخرى فعالية ووظيفة أفضل مع تدرجات قائمة على البوليسوكروز32,35. والأهم من ذلك، يوصى باستخدام حلول تدرج تجاري متحكم بها لتحسين قابلية التكرار عبر المختبرات. تتوفر التدرجات القائمة على البوليسوكروز على نطاق واسع عند الكثافات المثلى لعزل الجزر، بينما عادة ما يتم إعداد تدرجات اليوديكسانول عن طريق التخفيف الداخلي، مما يضيف تباينا إضافيا. القيد الثاني هو أن الحصاد الجراحي يتطلب مستوى عاليا من الكفاءة التقنية، خاصة في التروية داخل القنوات عبر مصرة أودي واستئصال البنكرياس السريع. حتى التأخيرات الطفيفة أو عدم المحاذاة يمكن أن تؤدي إلى تلف الأنسجة، أو تسرب الماء، أو فقدان التروية الدافئ، أو نقص التروية الدافئ لفترة طويلة، مما قد يؤثر على إنتاجية الجزر الصغيرة وصلاحيتها. لتخفيف هذا القيد، يتضمن البروتوكول أوصافا إجرائية مفصلة ومساعدات رسومية أصلية مع معالم تشريحية ملونة لتسهيل الفهم. يشجع المشغلون الجدد على الشعور بالراحة مع تقنية التروية قبل إجراء العزل الكامل، وينصح بممارسة الحصاد على الجثث قبل محاولة الحصاد الحي.

ثالثا، لتحقيق أقصى كفاءة، يتطلب هذا البروتوكول تعاونا منسقا. خلال حصاد البنكرياس وهضمه الإنزيمي، عادة ما يطلب ثلاثة مشغلين مدربين: واحد يجري جراحة معقمة، وآخر ينظف البنكرياس في ظروف معقمة، وآخر يدور ويقتل الحيوانات في ظروف غير معقمة. بعد الهضم، يمكن عادة تنفيذ خطوات التنقية اللاحقة بواسطة عدد أقل من المشغلين بمجرد تحقيق الكفاءة. بينما يمثل هذا التنسيق طلبا لوجستيا أوليا، فإنه يتيح عزل العديد من الجزر الصغيرة من عدة حيوانات خلال فترة زمنية قصيرة نسبيا، مما يحسن الإنتاجية العامة مقارنة بسير العمل الأقل تنسيقا. على الرغم من أن هذا البروتوكول يتطلب طلبا تقنيا ويستهلك مواردا كبيرة، إلا أن هذه القيود مشتركة في جميع طرق عزل الجزر. من خلال التركيز على ظروف الهضم الموحدة، والتدريب المنظم، والتنفيذ المنسق، يمكن لهذا النهج عالي الإنتاجية تقليل الوقت والجهد لكل عزل وتحقيق نتائج متسقة وقابلة للتكرار عند تنفيذها من قبل فريق مدرب.

مقارنة ببروتوكولات عزل جزر القوارض التقليدية، تقدم هذه الطريقة مزايا كبيرة في معدل الإنتاجية، وقابلية التكرار، والاتساق. تعتمد عمليات الهضم التقليدية ذات الأرغن الواحد بشكل كبير على العزف اليدوي وغالبا ما تعطي نقاوة متغيرة13. على النقيض من ذلك، يستخدم بروتوكولنا الهضم المجمع وتنقية تدرج الكثافة، مما يقلل بشكل كبير من وقت التحضير والتنوع بين العينات مع الحفاظ على قابلية عالية للجزرية والاستجابة الوظيفية. تم توصيف الجزر المعزولة بشكل شامل من حيث الشكل (تلوين الديثزون)، والبقاء (اختبار حي/ميت)، ووظيفتها (إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز)، مما أكد متانة الطريقة. بشكل عام، يتيح هذا السير الموحد توليد تحضيرات جزر صغيرة وفيرة ونظيفة وعملية مناسبة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك التغليف، والزراعة، والنمذجة الفسيولوجية الدقيقة 38,39,40. ومن المهم أن جزر لويس المعزولة بهذه التقنية عكست مرض السكري في النماذج ما قبل السريرية، مما يؤكد أهمية ترجمة هذا النهج القابل للتكرار والتوسع41.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أ. ج. هو مؤسس مشارك ومستشار علمي رئيسي لشركة Continuity Biosciences, LLC. أ.ج.، ج.ب-م.، وسي.و.إكس.سي هما مخترعا للملكية الفكرية مرخصة من قبل شركة Continuity Biosciences, LLC. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01DK133610-01 (A.G., N.K.) وNIH NIDDK R01DK132104 (A.G.)، وBreakthrough T1D SRA-2021-1078-S-B (AG) وSRA-2022-1224-S-B (A.G., N.K.)، ومؤسسة فيفيان إل. سميث.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
21 G × 2 بوصة. إبرة BD PrecisionGlideBD305129
500 وميكرو؛ إطار نحاسي وشاشة من الفولاذ المقاوم للصدأ 304، قطرها 3 إنش × 1 بوصة (رقم غربال 35)ماكماستر-كار34735K525
حقن معقمة من نوع Air-Tite، قفل Luerفيشر ساينتيفك14-817-178
بيوجيل بي آي ألتراتاتش إمMö إنليكه42665
مقص بون؛ مستقيم؛ نقاط حادة؛ طول الشفرة 15 مم؛ الطول الإجمالي 3 1/2"روبوزRS-5840
برينتري ساينتيفك جرميناتور 500 دراي ستيريلفيشر ساينتيفكNC9956482
سلسلة Cell-IQ 5.8 قدم مكعب. حاضنة مختبر ثاني أكسيد الكربونPHCBIMCO-170AICUVHL-PA
طبق زراعة كورنينج 100 مم غير معالج ب TCكورنينغ430591
سيروم كورنينج الجنين البقري، 500 مل، عادي، تم اختبار السلامة من وزارة الزراعة الأمريكية (معطل حرارة)كورنينغ35011CV
تدرج جزر كورنينج 1.069 (كثافة 1.069 جم/سم<سوب>3)كورنينغ99-815-CISيتطلب طلبا خاصا من الشركة
تدرج جزر كورنينج 1.096 (الكثافة 1.096 جم/سم<سوب>3)كورنينغ99-691-CISيتطلب طلبا خاصا من الشركة
تدرج جزر كورنينج 1.108 (الكثافة 1.108 جم/سم<سوب>3)كورنينغ99-692-CISيتطلب طلبا خاصا من الشركة
وسادات كوفيدين Tendersorbفيشر ساينتيفك22-225-102
DNase I الدرجة الثانيةروش10104159001
فالكون  أنابيب الطرد المركزي المخروطية عالية الوضوح بسعة 50 ملفيشر ساينتيفك14-432-22
رقائق الألمنيوم من فيشربراند، لفة قياسيةفيشر ساينتيفك01-213-100
فيشربراند   إسفنجيات الشاش غير المنسوجةفيشر ساينتيفك22-028-559
كؤوس فيشربراند الزجاجية القابلة لإعادة الاستخدام منخفضة الشكلفيشر ساينتيفكFB101600
الميكروسكوب الفلوري  BZ-X810كينسBZ-X810
محلول الجلوكوزجيبكوA2494001
حامل الإبر الدقيقي هالسيأدوات العلوم الدقيقة12500-12
هيدبول إس إس، كالسيوم، مغنيسيوم، بدون فينول أحمرجيبكو14025092
هيبيس (1 ذكر)جيبكو15630080
ملقط دموي كلاسيكي كريل بطول 5-1/2 بوصةماكيسون1231217
ملقط هدسون (إيوالد)روبوزRS-5238
إبرة تحت الجلد أحادية الوجوكت بطول 1-1/2 بوصة وقياس 16 جدار عادي بدون أمانماكيسون43481
إل-جلوتامين (200 ملليمتر)جيبكو25030081
ليبيريس تي-فليكس، درجة بحثيةروش5989132001
مجموعة الصلاحية الحية/السمية للخلايا الحية/الميتة، لخلايا الثديياتإنفيتروجين  L3224
حزمة برامج ماتلابماث ووركسhttps://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
مضخة حقنة قابلة للبرمجة ذات قناتين NE-4000مضخة الحقنNE-4000-US
إبرة، HYPOSTR DISP 27GX1/2" (100/BX) إكسبينتماكيسون408877
زراعة خلايا النونك/أطباق بتيريالعلم الحراري174926
مجهر التباين العكسي Olympus CKX41أوليمبوسCKX41-B
PBS، pH 7.4جيبكو10010023
بنسيلين' ستريبتوميسين (10,000 U/mL)جيبكو15140122
RPMI 1640جيبكو11875093
RPMI 1640، بدون جلوكوزجيبكو11879020
بيروفيات الصوديوم (100 ملم متر)جيبكو11360070
بيروفيات الصوديوم (مخزون 100 ملليمتر)جيبكو11360070
سورفال ST 16Rالعلم الحراري75004381
إبرة حقنة من الفولاذ المقاوم للصدأ 304ميليبور سيغماZ117013-1EA
الستائر الجراحي، قابل للتخلص مرة واحدة، 36 بوصة × 100 ياردةكوفيتروس10408
المقص الجراحي - ToughCutأدوات العلوم الدقيقة14054-13
ملقط ضمادة الإبهام 4.5 بوصة مسننة دقيقة بعرض طرف 1.3 ممروبوزRS-8120
أنبوب الطرد المركزي Thermo Scientific Nunc بسعة 200 ملالعلم الحراري14-962-17
محولات وسائد زجاجات الطرد المركزي من Thermo Scientific Nuncالعلم الحراري12-565-283B
TSDUB15 حوض ماء اهتزاز من دبنوف بسعة 15 لترفيشر ساينتيفك300610298
دوار دلو متحرك TX-400 بسعة 400 ملالعلم الحراري75003181
تايجون S-50-HLتايجونAAXoooo3
مجموعة ELISA من أنسولين الفئران فائقة الحساسيةكيمياء الكريستال90060

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grattoni, A., et al. Harnessing cellular therapeutics for type 1 diabetes mellitus: progress, challenges, and the road ahead. Nat Rev Endocrinol. 21 (1), 14-30 (2025).
  2. Páez-Mayorga, J., et al. Emerging strategies for β cell transplantation to treat type 1 diabetes mellitus. Cell Transplant. 31, 963689721004(2022).
  3. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets and its relevance to β-cell function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  4. Brissova, M., et al. Pancreatic islet microvasculature and blood flow. J Clin Invest. 124 (4), 1871-1883 (2014).
  5. Jiang, F. X., Morahan, G. Pancreatic islet architecture and function. Cell Death Discov. 10, 170(2024).
  6. Sato, Y., et al. Hypoxia induces β-cell apoptosis and functional suppression in isolated islets. PLoS One. 9 (12), e114868(2014).
  7. Tiedge, M., Lortz, S., Drinkgern, J., Lenzen, S. Relation between antioxidant enzyme gene expression and antioxidative defense status of insulin-producing cells. Diabetes. 46 (11), 1733-1742 (1997).
  8. Ichii, H., et al. Shipment of human islets for transplantation. Am J Transplant. 7 (4), 1010-1020 (2007).
  9. Carobbio, S., et al. Rapid GSIS kinetics in freshly isolated mouse islets. Diabetologia. 47 (9), 1652-1662 (2004).
  10. Zawalich, W. S., Zawalich, K. C., Kelley, G. G. Immediate perifusion of fresh rat and mouse islets. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (2), E444-E450 (2008).
  11. Wassmer, C. H., et al. Clinical use of freshly isolated islets transplanted within 48 h. Transplant Proc. 53 (6), 1907-1912 (2021).
  12. Tai, D. S., et al. Immediate autotransplantation of islets following total pancreatectomy. JAMA Surg. 150 (5), 472-479 (2015).
  13. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  14. Emamaullee, J. A., et al. Lewis rats in transplantation studies. Diabetes. 65 (5), 1350-1359 (2016).
  15. de Groot, M., et al. Rat islet isolation yield and function are donor strain dependent. Lab Anim. 38 (2), 200-206 (2004).
  16. Moazenchi, A. M., et al. Strain variability in islet yield and isolation. Islets. 2 (5), 283-289 (2010).
  17. Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. Isolation variability limits reproducibility in rat islet studies. PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).
  18. Stehno-Bittel, L. The flaws and future of islet volume measurements. Cell Transplant. 27 (4), 571-578 (2018).
  19. Kissler, H. J., et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets. Cell Transplant. 18 (6), 611-620 (2009).
  20. Papas, K. K., et al. Islet assessment for transplantation. Cell Transplant. 18 (6), 519-528 (2009).
  21. Dono, K., et al. Low temperature collagenase digestion for islet isolation from 48-hour cold-preserved rat pancreas. Transplantation. 57 (1), 22-26 (1994).
  22. Shapiro, A. M. J., et al. High yield of rodent islets with intraductal collagenase distension and warm incubation. Cell Transplant. 5 (6), 631-638 (1996).
  23. Corbin, K. L., Hughes, J. W., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment revisited. Biol Proced Online. 23, 10(2021).
  24. de Haan, B. J., et al. Factors influencing isolation of functional pancreatic rat islets. Pancreas. 29 (1), e15-e22 (2004).
  25. Kenyon, N. S., et al. Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in baboons treated with humanized anti-CD154. Diabetes. 48 (7), 1473-1481 (1999).
  26. Kenyon, N. S., et al. Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-CD154. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (14), 8132-8137 (1999).
  27. Liberase T-Flex Research Grade - Method Sheet. eLabDoc. , Roche Diagnostics GmbH. (2025).
  28. Miyazaki, Y., et al. Strategy towards tailored donor tissue-specific pancreatic islet isolation. PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).
  29. Cross, S. E., et al. Key matrix proteins within the pancreatic islet basement membrane are differentially digested during human islet isolation. Am J Transplant. 17 (2), 451-461 (2017).
  30. O'Gorman, D., Kin, T., Pawlick, R., Imes, S., Senior, P. A., Shapiro, A. J. Clinical islet isolation outcomes with a highly purified neutral protease for pancreas dissociation. Islets. 5 (3), 111-115 (2013).
  31. Wang, W., et al. Adjustment of digestion enzyme composition improves islet isolation outcome from marginal grade human donor pancreata. Cell Tissue Bank. 8, 187-194 (2007).
  32. McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3 (4), 144-149 (2011).
  33. Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes. 37 (4), 413-420 (1988).
  34. BenchChem Technical Support Team. An in-depth technical guide to cell separation using iodixanol. BenchChem. , (2026).
  35. Dellê, H., Saito, M. H., Yoshimoto, P. M., Noronha, I. L. The use of iodixanol for the purification of rat pancreatic islets. Transplant Proc. 39 (2), 467-469 (2007).
  36. Noguchi, H., et al. Iodixanol-controlled density gradient during islet purification improves recovery rate in human islet isolation. Transplantation. 87 (11), 1629-1635 (2009).
  37. Min, T., et al. Superiority of Visipaque (iodixanol)-controlled density gradient over Ficoll-400 in adult porcine islet purification. Transplant Proc. 42 (5), 1825-1829 (2010).
  38. Paez-Mayorga, J., et al. Neovascularized implantable cell homing encapsulation platform with tunable local immunosuppressant delivery for allogeneic cell transplantation. Biomaterials. 257, 120232(2020).
  39. Paez-Mayorga, J., et al. Implantable niche with local immunosuppression for islet allotransplantation achieves type 1 diabetes reversal in rats. Nat Commun. 13, 7951(2022).
  40. Piemonti, L., et al. Islet transplantation. Endotext. , (2022).
  41. Patel, S. N., et al. The foundation for engineering a pancreatic islet niche. Front Endocrinol. 13, 881525(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة