Method Article

مقارنة نتائج تحليل الحمض النووي المنوي باستخدام استراتيجيات بوابة مختلفة في قياس انسيابية الخلايا

DOI:

10.3791/70417

⸱

July 10th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Reproductive Center, The Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital of Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد البوابات المتعددة الزوايا (PGG) والبوابات الصليبية (CFG) من أساليب قياس التدفق الخلوي لاكتشاف سلامة الحمض النووي الموجود في الحيوانات المنوية. تقيس البوابات المتعددة الزوايا (PGG) مؤشر تجزئة الحمض النووي (DFI) ومؤشر التلطيخ العالي للحمض النووي (HDS). تقدم البوابات الصليبية (CFG) تقريرًا عن تجزئة الحمض النووي الشديدة (DFI) وتجزئة الحمض النووي المعتدلة (DFI) وتجزئة الحمض النووي الإجمالية (DFI). يهدف هذا الدراسة إلى مقارنة النتائج والارتباطات فيما بينها.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية هي عامل أساسي لضمان الإخصاب الناجح وتطور الجنين واستمرار الحمل. يعتبر تقييم بنية الكروماتين المنوي (SCSA) باستخدام التدفق الخلوي بعد انحلال الحمض النووي وتلطيخ الأكريدين أورانج هو المنهج المعياري الذهبي لتقييم الحمض النووي للحيوانات المنوية. تم الإبلاغ عن استراتيجيتين للتدفق الخلوي لتقييم مؤشر تجزئة الحمض النووي المنوي (DFI) في الأدبيات: البوابة المضلعيّة (PGG) والبوابة الصليبية (CFG). كان هدف الدراسة الحالية هو مقارنة علاقات نتائج الاختبار بين PGG وCFG، وتحليل ارتباطها بمعلمات تحليل السائل المنوي الأساسي. تمت مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها بشكل مستقل من قبل الطريقتين باستخدام التحليل الإحصائي، بما في ذلك مخططات Bland-Altman وتحليل الانحدار. تم اختيار ما مجموعه 121 مريضًا من الذكور الذين يخضعون لتقييم الخصوبة في مركز الإنجاب في مستشفانا باستخدام طريقة أخذ العينات العشوائية الكاملة. تم اكتشاف مؤشر تجزئة الحمض النووي المنوي (DFI) والمؤشرات ذات الصلة عن طريق التدفق الخلوي باستخدام PGG وCFG، على التوالي. أظهرت النتائج أن قيم DFI التي تم الحصول عليها من الطريقتين تظهر توافقًا جيدًا. كانت معاملات الارتباط بين DFIp من طريقة PGG وDFIm وDFIs وDFIc من طريقة CFG 0.6497 و0.9404 و0.9667، على التوالي (جميع p < 0.01). أظهر مؤشر التلطيخ العالي للحمض النووي (HDS) ارتباطًا سلبيًا بسيطًا مع DFIs (r = -0.3042, p < 0.05). كان معدل النسبة المئوية للحيوانات المنوية المنطفئة بشكل مستمر مرتبطًا سلبًا مع DFIp وDFIs وDFIc (r = -0.3824، -0.3794، -0.3574، على التوالي، جميع p < 0.05). لم يتم ملاحظة أي ارتباط كبير بين HDS وحجم السائل المنوي، وتركيز الحيوانات المنوية، والعدد الكلي للحيوانات المنوية، أو PR (%). تشير هذه النتائج إلى أن DFIs مرتبطة بشكل وثيق بالخصوبة الذكورية، مما يشير إلى أن طريقة CFG، التي توفر هذا المعلمة، قد تكون أكثر ملاءمة لتقييم الحمض النووي للحيوانات المنوية في السياق السريري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية إلى سلامة واستقرار وظيفي لبنية الحمض النووي الجزيئية في نواة الحيوانات المنوية. على وجه التحديد، يتميز بتكوين الكروماتين الطبيعي، وتسلسل القواعد السليمة بدون كسر أو تلف مؤكسد، والقدرة على نقل المعلومات الوراثية بدقة إلى النسل. أثناء تكوين الحيوانات المنوية، عندما يزيد الإجهاد المؤكسد1، يكون إعادة تشكيل الكروماتين غير طبيعي2، أو تتأثر الحيوانات المنوية بالسموم البيئية3، سيتم تلف سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية، مما يؤدي إلى عدم توافق القاعدة، والفقد، والتعديل، وإضافة الحمض النووي، والتشابك، والكسور المفردة والمزدوجة، إلخ. علاوة على ذلك، يمكن أن يضعف الحمض النووي للحيوانات المنوية التالف خصوبة الذكور ويؤثر سلبًا على نتائج الحمل في تقنيات الإنجاب المساعد (ART)4، بينما يزيد أيضًا من خطر تكرار فقدان الحمل5. في عام 2021، أوصت الرابطة الأوروبية لجراحة المسالك البولية بضم اختبار DFI في نظام تقييم خصوبة الذكور6.

في الوقت الحاضر، يتم تقييم سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية بشكل أساسي عن طريق الكشف عن مؤشر تجزئة الحمض النووي للحيوانات المنوية (DFI). يعتبر تحليل بنية كروماتين الحيوانات المنوية (SCSA) بواسطة قياس التدفق الخلوي هو الطريقة الرئيسية لتقييم DFI7. تم الإبلاغ عن طريقتين لقياس التدفق الخلوي لكشف DFI للحيوانات المنوية في الأدب. إحداهما طريقة البوابات المتعددة الزوايا (PGG)، والتي يمكنها الإبلاغ في وقت واحد عن مؤشرين رئيسيين، مثل DFI للحيوانات المنوية و HDS8. PGG هي نهج SCSA كلاسيكي يتميز بمعامل انحراف اكتشاف أصغر وقابلية متكررة أعلى9. ومع ذلك، لا يمكنها التمييز بين شدة تلف الحمض النووي. النوع الآخر هو طريقة البوابات الصليبية (CFG)، والتي يمكنها الإبلاغ عن علامة تلف شديد للحمض النووي للحيوانات المنوية (DFIs)، وعلامة تلف معتدل للحمض النووي للحيوانات المنوية (DFIm)، وإجمالي DFI لطريقة البوابات الصليبية (DFIc). DFIc يساوي مجموع DFIs و DFIm. بالمقارنة مع التقنيات الحالية لتقييم سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية، يمكن لطريقة CFG أن تعكس شدة تلف الحمض النووي للحيوانات المنوية10.

لتحديد أي طريقة أكثر ملاءمة لتقييم جودة الحيوانات المنوية، استخدمت هذه الدراسة كلاً من طريقة PGG وطريقة CFG لقياس DFI والمعايير ذات الصلة في الحيوانات المنوية. تمت مقارنة العلاقة بين نتائج هاتين الطريقتين ومعلمات تحليل السائل المنوي التقليدية. إلى حد علمنا، هذه هي الدراسة الأولى التي تحلل ارتباط نتائج الكشف بين المنهجيتين، PGG و CFG.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية بمستشفى هواي'ان الأول التابع لجامعة نانجينغ الطبية (رقم الموافقة: KY-2024-181-01). تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى الذين استخدمت عيناتهم في هذه الدراسة. مخطط تخطيطي شامل لسير العمل المعروض في الشكل 1. يتم توضيح تفاصيل المواد والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

إعدادات CFG لعداد الخلايا المتدفقة
بعد العلاج بالحمض، يظهر الكروماتين النووي للحيوانات المنوية التي تضررت الحمض النووي على شكل حمض نووي أحادي الجديلة، بينما يحتفظ الكروماتين النووي للحيوانات المنوية التي لم تتعرض للضرر بهيكله المزدوج السلاسل السليم. يرتبط الصبغة الفلورية الأكريدين أورانج (AO) بالحمض النووي أحادي الجديلة وينبعث منه ضوء فلوريسنت أحمر عند إثارة بواسطة ليزر 488 نانومتر. عند الارتباط بالحمض النووي مزدوج الجديلة، ينبعث منه ضوء فلوريسنت أخضر عند إثارة بواسطة ليزر 488 نانومتر. بناءً على عدد الإشارات الفلورية الحمراء والخضراء التي التقطها عداد الخلايا المتدفقة، يتم حساب نسبة الضوء الفلوريسنت الأحمر إلى إجمالي الضوء الفلوريسنت الأحمر والأخضر، مما يمثل مؤشر تلف الحمض النووي في الحيوانات المنوية.

تم تنفيذ إعدادات CFG وفقًا للنظرة العامة التي قدمها Yang et al.10. يجب تكوين عداد الخلايا المتدفقة باستخدام أقل نسبة من الضوء الفلوريسنت الأخضر وأعلى نسبة من الضوء الفلوريسنت الأحمر المقاسة في الحيوانات المنوية الطبيعية الملطخة بـ AO كمراجع حد (الشكل 2). فيما يلي قائمة بالخصائص الخلوية لكل ربع في CFG:
الربع Q1 يشير إلى الحيوانات المنوية الطبيعية. لوحظ أن الحمض النووي للحيوانات المنوية سليم، وكانت كمية ربط AO ضئيلة، مما أدى إلى ظهور الضوء الفلوريسنت الأخضر.
الحيوانات المنوية في الربع Q2 لها حمض نووي جزئي مجزأ وتظهر باللون البرتقالي تحت المجهر الفلوري. قد يكون هذا الحمض النووي قابلاً للإصلاح، وتصنف هذه الحيوانات المنوية على أنها حمض نووي مجزأ بدرجة معتدلة (DFIm)10.
الربع Q3 يعرف بأنه الفلورة غير المحددة التي خضعت للطرح.
الحيوانات المنوية في الربع Q4 لها حمض نووي مجزأ وتظهر باللون الأحمر تحت المجهر الفلوري، مما يشير إلى تجزئة شديدة للحمض النووي (DFIs).

يُقترح أن الحيوانات المنوية في الربع Q2 و Q4 تحتويان على الحمض النووي المجزأ، ومجموعهما يعرف باسم DFIc.

إعدادات PGG لعداد الخلايا المتدفقة
تم إنشاء البوابة متعددة الزوايا لتحليل التدفق الخلوي وفقًا للطريقة التي وصفها Evenson et al.8. كما هو موضح في الشكل 3, الخصائص الخلوية المرتبطة بكل بوابة هي كما يلي:
P3 يشير إلى نسبة الخلايا ذات الحمض النووي المتحلل.
P4 يمثل الحيوانات المنوية ذات القابلية العالية للتلطيخ بالحمض النووي (HDS). هذه المجموعة من الحيوانات المنوية تفتقر إلى تبادل الهستونات الطبيعي إلى البروتايمين.
تتكون المجموعات السكانية الخلوية السائدة الواقعة خارج بوابات P3 و P4 من الحيوانات المنوية العادية، وتظهر نسبة فلوريسنت حمراء منخفضة وتصدر بشكل أساسي الضوء الفلوريسنت الأخضر.

جمع عينات السائل المنوي والتحليل
جميع عينات السائل المنوي البالغ عددها 121 كانت من الرجال الذين زاروا مركز الإنجاب بمستشفى هواي'ان الأول التابع لجامعة نانجينغ الطبية. تم جمع عينات السائل المنوي عن طريق الاستمناء بعد فترة امتناع تتراوح من 2-7 أيام. تم إجراء تحليل السائل المنوي الروتيني بدقة وفقًا لمتطلبات دليل مختبر منظمة الصحة العالمية لفحص ومعالجة السائل المنوي البشري11,12. تم إجراء تحليلات تركيز الحيوانات المنوية والحركة باستخدام نظام تحليل الحيوانات المنوية المساعد بالحاسوب (CASA).  تم تحليل كل عينة مرتين. تم الإبلاغ عن النتائج كمتوسط فقط عندما كان الفرق بين النتيجتين ضمن مدى الثقة 95٪؛ وإلا، تم إجراء إعادة أخذ العينات والتحليل.

تحليل DFI
احسب حجم العينة المطلوبة لعينة السائل المنوي بحيث تكون التركيز النهائي للحيوانات المنوية في المتفاعل A من مجموعة عداد الخلايا المتدفقة هو 2-3 × 106/مل. طريقة الحساب: بافتراض أن تركيز الحيوانات المنوية في عينة السائل المنوي الأصلية هو M × 106/مل، يكون حجم السائل المنوي المطلوب (µل) = 150/M. أضف حجم السائل المنوي المحسوب إلى أنبوب عداد الخلايا المتدفقة، ثم أضف 50 µل من المتفاعل A واخلط برفق. أضف 100 µل من المتفاعل B، واخلط برفق، وقم بالحضانة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. أضف فوراً 300 µل من المتفاعل C واخلط برفق. اكتشف العينة باستخدام CFG و PGG على عداد الخلايا المتدفقة، وحلل ما لا يقل عن 5000 حيوان منوي.

التحليل الإحصائي
تم إخضاع البيانات للتحليل الإحصائي باستخدام GraphPad Prism 6.0. تم إنشاء مخططات Bland-Altman لتقييم مستوى التوافق بين PGG و CFG عن طريق حساب المتوسط والاختلافات. تم رسم الاختلافات بين الطريقتين ضد متوسط قيمها. علاوة على ذلك، تم استخدام طريقة Pearson لتحليل الارتباط بين PGG و CFG. تم تحديد أن قيمة p أقل من 0.05 كانت ذات دلالة إحصائية.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من بين 121 مشاركًا في الدراسة (متوسط العمر: 32.5 ± 4.9 سنة؛ المدى: 26–44 سنة)، تم تشخيص 28 حالة بضعف حركة الحيوانات المنوية و4 حالات بانخفاض عدد الحيوانات المنوية. تم تلخيص الخصائص الديموغرافية الأساسية ومعايير تحليل السائل المنوي في الجدول 1.

كما هو موضح في الشكل 4، أظهر مخطط بلاند-التمان أن نتائج مؤشر تلف الحمض النووي للحيوانات المنوية التي تم الحصول عليها بواسطة طرق PGG وCFG أظهرت اتساقًا عاليًا (r = 0.9667، p = 0.0000). أظهرت عينة واحدة فقط اختلافات أكبر من +10٪، وعينة واحدة فقط أظهرت اختلافات أقل من -10٪، وكانت النسب 1.7٪ و2.5٪، على التوالي.

الجدول 2 يُظهر ارتباطًا إيجابيًا قويًا بين DFIp من PGG وكل من المعايير الثلاثة المشتقة من CFG: DFIm، DFIs، وDFIc. وكانت معاملات الارتباط 0.6497، 0.9404، و0.9667، على التوالي، وكانت قيم p جميعها أقل من 0.05. أظهرت نتائج HDS التي تم اكتشافها بواسطة طريقة PGG ارتباطًا سلبيًا كبيرًا مع DFIs وDFIc التي تم اكتشافها بواسطة طريقة CFG. كانت معاملات الارتباط -0.3042 و-0.2120، على التوالي، وكانت قيم p جميعها أقل من 0.05. لم تُظهر الدراسة أي ارتباط بين HDS وDFIm (كانت قيمة p أكبر من 0.05).

كما هو موضح في الجدول 3، كان معدل الحيوانات المنوية سريعة الحركة إيجابيًا سلبيًا مع DFIp، وDFIm، وDFIs، وDFIc (جميع قيم p كانت أقل من 0.05)، ولكن لم يكن مرتبطًا بـ HDS (كانت قيمة p أكبر من 0.05). أظهر حجم السائل المنوي ارتباطًا إيجابيًا كبيرًا مع DFIp، وDFIs، وDFIc (جميع قيم p كانت أقل من 0.05)، ولكن لم يكن مرتبطًا بـ HDS (كانت قيمة p أكبر من 0.05). لم يتم العثور على أي ارتباط بين تركيز الحيوانات المنوية والعدد الإجمالي للحيوانات المنوية مع نتائج تحليل PGG وCFG (كانت قيمة p أكبر من 0.05).

تظهر طريقة CFG اتساقًا عاليًا مع PGG لتقييم DFI. CFG تمكن من التمييز بين درجة تلف الحمض النووي، ومعلمات DFI الخاصة بها مرتبطة بشكل كبير مع حركة الحيوانات المنوية. مؤشرات تلف الحمض النووي الشديد للحيوانات المنوية، والمعروفة باسم DFIs، هي أكثر ملاءمة للاستخدام الواسع في الممارسة السريرية الروتينية.

توافر البيانات:
تتضمن المجموعات البيانات التي تم إنتاجها و/أو تحليلها خلال هذه الدراسة البيانات السريرية على مستوى المريض ولا يتم الكشف عنها للجمهور بسبب الاعتبارات المؤسسية والأخلاقية. عند تقديم طلب معقول والحصول على موافقة من لجنة الأخلاقيات في مستشفى الشعب رقم واحد التابع لجامعة نانجينغ الطبية في هوايآن، يُسمح للمؤلف المراسل بتقديم البيانات التي تم إزالة هوية الأفراد منها والنتائج التحليلية. لم تتضمن هذه الدراسة تطوير أي شيفرة مخصصة.

الشكل 1
الشكل 1: المخطط البياني الشامل لسير العمل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: بوابة الصليبي (CFG) لقياس التدفق لاكتشاف DFI. Q1 – الحيوانات المنوية الطبيعية. Q2 – تكسير الحمض النووي الخفيف (DFIm). Q3 – توهج غير محدد تم طرحه. Q4 – تكسير الحمض النووي الشديد (DFIs). تقع الحيوانات المنوية ذات التلف الحمض النووي في كل من Q2 وQ4. يمثل مجموعهما إجمالي الحيوانات المنوية ذات الحمض النووي المتكسر (DFIc). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: بوابة مضلعية (PGG) لقياس التدفق لاكتشاف DFI. P3: الحيوانات المنوية ذات الحمض النووي المتحلل. P4: تلون الحمض النووي المرتفع (HDS) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4
الشكل 4: مخططات بلاند-التمان لنتائج PGG وCFG لـ DFI. X - المحور: متوسط نتائج القياس التي تم الحصول عليها بواسطة طريقة PGG وطريقة CFG. Y - المحور: الفرق في نتائج القياس بين طريقة PGG وطريقة CFG يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البندالمتوسط±SDالمدى
العمر(سنوات)32.5±4.926-44
أيام الامتناع(يوم)4.1±1.33-7
حجم السائل المنوي(مل)3.8±1.60.5-6.8
تركيز الحيوانات المنوية(×106/مل)52.0±35.510.3-185.1

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصي الطبعة السادسة من دليل مختبر منظمة الصحة العالمية لفحص ومعالجة السائل المنوي البشري12 بأربع طرق لتقييم سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية: تسمية نهاية الفجوة بالنوكليوتيدات المحللة لنقل ثنائي الأكسجين (dUTP)، ومقايسات الرحلان الكهربائي على هلام الخلية الواحدة (Comet)، وتحليل الكروموسومات المنوية (SCSA)، واختبار تشتت الكروماتين المنوي (SCD). ومن بين هذه الطرق، تم استخدام طريقة SCSA على نطاق واسع في مختبرات الذكورة نظرًا لاستخدامها لقياس التدفق الخلوي في التحليل، مما يوفر كفاءة عالية وفاعلية وموضوعية، بالإضافة إلى القدرة على الإبلاغ في الوقت نفسه عن معايير مثل DFI وHDS7. وفقًا لمسح عالمي7، اختير SCSA من قبل ما يقرب من ربع (24.1٪) من أطباء التكاثر المتخصصين في جميع أنحاء العالم كطريقة لتقييم سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية.

الخطوة الأكثر أهمية في إجراء SCSA هي تحديد البوابات المناسبة لقياس التدفق الخلوي. يمكن أن يكشف طريقة PGG التقليدية عن كل من الأجزاء المكسورة (DFI) من خيوط الحمض النووي والحيوانات المنوية ذات التلطيخ غير الطبيعي للحمض النووي (HDS)، والتي تتميز بعدم وجود تبادل طبيعي للهستون والبروتامينات13. ومع ذلك، لا يمكنها التمييز بين التمزقات الأحادية والثنائية للخيوط في الحمض النووي للحيوانات المنوية. في السنوات الأخيرة، أنشأ Yang et al.10 طريقة CFG لتحليل DFI للحيوانات المنوية باستخدام قياس التدفق الخلوي، والتي يمكنها التمييز بين شدة تلف الحمض النووي للحيوانات المنوية. تتمثل الخطوة الرئيسية لهذه الطريقة في إعداد بوابة صليبية لقياس التدفق الخلوي. تتميز طريقة CFG بالتكرار الممتاز (كان معامل الاختلاف أقل من 5٪) ومجال خطي لكشف DFI من 8.93٪ إلى 53.90٪. تكشف هذه الطريقة عن ثلاثة مؤشرات—DFIm وDFIs وDFIc—ولكنها لا تقدم نتائج HDS10.

وجدت هذه الدراسة أن إجمالي DFI لطريقة CFG (DFIc) كان في اتفاق جيد مع طريقة PGG (DFIp). كشفت تحليلات الارتباط أن معاملات الارتباط بين DFIs وDFIp كانت أعلى بكثير من تلك الخاصة بـDFIm. لم يرتبط تركيز الحيوانات المنوية أو العدد الإجمالي للحيوانات المنوية بنتائج طريقة CFG أو طريقة PGG. كان PR (%) وأنواع DFI الأربعة (DFIm وDFIs وDFIc وDFIp) جميعها مرتبطة ارتباطًا سلبيًا كبيرًا. كان PR (%) مرتبطًا ارتباطًا سالبًا كبيرًا بجميع أنواع DFI الأربعة (DFIm وDFIs وDFIc وDFIp). كان الارتباط مع DFIm (r = -0.1975) أضعف بكثير من الارتباط مع DFIs وDFIc وDFIp (r = -0.3794، -0.3574، -0.3824، على التوالي). تتوافق هذه النتائج مع تلك التي أبلغ عنها Yang et al.10. علاوة على ذلك، أظهرت DFIs وDFIc ارتباطًا جيدًا مع حجم السائل المنوي، بينما لم يحدث ذلك مع DFIm. على الرغم من أن الفائدة السريرية لمؤشر يتوافق بشكل وثيق مع معلمات السائل المنوي الأساسية قد تكون محدودة، إلا أن هذا الاكتشاف يشير إلى أن مؤشر التلف الشديد للحمض النووي للحيوانات المنوية (DFIs) قد يعكس جوانب مرضية مميزة في تكوين الحيوانات المنوية. والأهم من ذلك، كما هو موضح في تحليل الارتباط لدينا، أظهر DFIs ارتباطًا أقوى بكثير مع نسبة الحيوانات المنوية المتحركة بشكل تقدمي مقارنة بـDFIm، مما يدعم بشكل أكبر إمكانيته كمؤشر تكميلي في تقييمات الخصوبة الذكورية إلى جانب التحليل التقليدي للسائل المنوي.

تمثل HDS نسبة الحيوانات المنوية غير الناضجة التي تفتقر إلى تبادل هيستون وبروتامينات طبيعي. يحتفظ السلف البروتامين 1 في الحيوانات المنوية HDS بالأحماض الأمينية الطرفية التي يتم فصلها عادةً8، مما قد يمنع التكثيف المناسب للكروماتين ويؤدي إلى زيادة تلطيخ الـacridine orange لـdsDNA. أشارت الدراسات السابقة إلى أهمية HDS في وصف عيوب الكروماتين في الحيوانات المنوية. تشير الأبحاث التي أجراها Lin et al.14 وVirro et al.15 إلى أن معدل الإجهاض في الإخصاب في المختبر (IVF) أعلى بكثير عند الرجال الذين لديهم HDS > 15٪. ومع ذلك، تشير النتائج الحديثة إلى أن HDS قد لا يشير بشكل موثوق إلى عدم النضج النووي بسبب ارتباطه الضعيف بنتائج تلطيخ CMA3 وAB وTB16. وبالتالي، قد لا تكون HDS مناسبة كمؤشر للخصوبة الذكورية17. تظهر هذه الدراسة أيضًا عدم وجود ارتباط كبير بين HDS ومعلمات السائل المنوي الأساسية، بما في ذلك حجم السائل المنوي وتركيز الحيوانات المنوية والحركة. لذلك، لا يوصى باستخدام HDS كعلامة لسلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية18.

خلال عملية كشف DFI، قد تظهر عدم اتساق في حدود التألق. يعزى هذا الظاهرة في المقام الأول إلى الاختلافات الكبيرة في تركيز الحيوانات المنوية وحركاتها بين العينات المختلفة. لمعالجة هذه المشكلة، يوصى باستخدام البوابات المناسبة لاستبعاد الحيوانات المنوية الميتة والحطام والإشارات غير المحددة الأخرى. يعمل هذا النهج على تحسين دقة البيانات ويقلل من مشكلة عدم اتساق حدود التألق.

على حد علمنا، هذه هي أول دراسة تقارن نتائج تحليل طريقتي PGG وCFG. تتمثل إحدى قيود هذه الدراسة في تصميمها من مركز واحد وعينة صغيرة، وتتطلب استنتاجاتها التحقق الإضافي من خلال دراسات متعددة المراكز وعينة كبيرة. تشمل الاتجاهات المستقبلية للبحث ضمان الاتساق في نتائج اختبار DFI للحيوانات المنوية عبر أجهزة قياس التدفق الخلوي المختلفة وتحديد ما إذا كان يمكن أن يتوقع DFIs للحيوانات المنوية نتائج تقنية المساعدة على الإنجاب.

في الختام، توفر طريقة CFG المزيد من المعلمات لسلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية. على وجه التحديد، تعكس DFIm وDFIs نسب الحيوانات المنوية ذات التلف الخفيف والشديد في الحمض النووي، على التوالي. تظهر نتائج DFIc وDFIp اتساقًا جيدًا. تعتبر طريقة CFG مناسبة للتطبيق السريري والترويج.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نظام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوترشركة بيجين سويجيا للبرمجيات المحدودةSA-II 
عداد الخلايا السيتومترية شركة شنتشن ميندراي للإلكترونيات الطبية الحيوية المحدودةCyto E6
مجموعة قياس الخلايا السيتومتريةشركة شنتشن بيريد للتكنولوجيا الحيوية المحدودة
غرفة عد ماكليرسيفي للأدوات الطبية
مجموعة سلامة الحمض النووي لنواة الحيوانات المنويةشركة شنتشن بيريد للتكنولوجيا الحيوية المحدودة-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vaughan, D. A., Tirado, E., Garcia, D., Datta, V., Sakkas, D. DNA fragmentation of sperm: a radical examination of the contribution of oxidative stress and age in 16 945 semen samples. Hum Reprod. 35 (10), 2188-2196 (2020).
  2. Štiavnická, M., et al. H3K4me2 accompanies chromatin immaturity in human spermatozoa: an epigenetic marker for sperm quality assessment. Syst Biol Reprod Med. 66 (1), 3-11 (2020).
  3. Jeng, H. A., et al. Mixture analysis on associations between semen quality and sperm DNA integrity and occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Arch Environ Occup H. 78 (1), 14-27 (2023).
  4. Li, F., Duan, X., Li, M., Ma, X. Sperm DNA fragmentation index affect pregnancy outcomes and offspring safety in assisted reproductive technology. Sci Rep. 14 (1), 356(2024).
  5. Zhu, X. B., et al. Sperm DNA fragmentation in Chinese couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Asian J Androl. 22 (3), 296-301 (2020).
  6. Minhas, S., et al. European Association of Urology Guidelines on Male Sexual and Reproductive Health: 2021 Update on Male Infertility. Eur Urol. 80 (5), 603-620 (2021).
  7. Agarwal, A., et al. Technical Aspects and Clinical Limitations of Sperm DNA Fragmentation Testing in Male Infertility: A Global Survey, Current Guidelines, and Expert Recommendations. World J Mens Health. 42 (1), 202-215 (2023).
  8. Evenson, D., Jost, L. Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment. Meth Cell Sci. 22 (2-3), 169-189 (2000).
  9. B, V. L., et al. Sperm chromatin structure assay versus sperm chromatin dispersion kits: Technical repeatability and choice of assisted reproductive technology procedure. Clin Exp Reprod Med. 47 (4), 277-283 (2020).
  10. Yang, F., et al. Establishment and evaluation of a flow cytometry technique reflecting the severity of human sperm DNA damage. Zhonghua Nan Ke Xue. 26 (11), 989-995 (2020).
  11. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 5th ed., World Health Organization. Geneva. (2010).
  12. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 6th ed., World Health Organization. Geneva. (2021).
  13. Evenson, D. P. The Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci. 169 (6), 56-75 (2016).
  14. Lin, M. H., et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates. Fertil Steril. 90 (2), 352-359 (2007).
  15. Virro, M. R., Larson-Cook, K. L., Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril. 81 (5), 1289-1295 (2004).
  16. Mohammadi, Z., Tavalaee, M., Gharagozloo, P., Drevet, J. R., Nasr-Esfahani, M. H. Could high DNA stainability (HDS) be a valuable indicator of sperm nuclear integrity. Basic Clin Androl. 30, 12(2020).
  17. Shen, L., et al. High sperm DNA stainability might not be an accurate predictive indicator of male fertility and assisted reproductive technology outcomes. Front Endocrinol (Lausanne). 16, 1510114(2025).
  18. Lu, J. C. High DNA stainability (HDS) should not be recommended as a marker for the detection of sperm DNA damage. Andrologia. 54 (7), e14442(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Medicine

Related Articles