مقالة بحثية

مقارنة نتائج تحليل الحمض النووي للحيوانات المنوية باستخدام استراتيجيات البوابات المختلفة في قياس تدفق الخلايا

DOI:

10.3791/70417

⸱

يوليو 10, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Reproductive Center, The Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital of Nanjing Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البوابات متعددة الأضلاع (PGG) والبوابة الصليبية (CFG) هما طريقتا قياس تدفق الخلايا للكشف عن سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية. يقيس PGG مؤشر تجزئة الحمض النووي (DFI) ومؤشر تلوين الحمض النووي العالي (HDS). تقرير CFG يفيد بوجود DFI شديد، وDFI خفيف، وDFI بشكل عام. تهدف هذه الدراسة إلى مقارنة النتائج والترابطات بينهما.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية عامل رئيسي لضمان نجاح الإخصاب، وتطور الجنين، والحمل المستمر. يعتبر تقييم بنية كروماتين الحيوانات المنوية (SCSA) باستخدام قياس التدفق الخلوي بعد إزالة الطبيعة من الحمض النووي وتلوين الأكريدين البرتقالي الطريقة القياسية لتقييم حمض الحيوانات المنوية. تم الإبلاغ عن استراتيجيتين للبوابة لتقييم مؤشر تجزئة الحمض النووي للحيوانات المنوية (DFI) المعتمدة على التدفق الخلوي في الأدبيات: البوابات متعددة الأضلاع (PGG) والبوابة الصليبية (CFG). كان هدف هذه الدراسة هو مقارنة علاقات نتائج التحليل بين PGG وCFG، وتحليل ارتباطاتها مع معايير تحليل السائل المنوي الأساسي. تمت مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها بشكل مستقل باستخدام الطريقتين باستخدام تحليل إحصائي، بما في ذلك مخططات بلاند-ألتمان وتحليل الانحدار. تم اختيار ما مجموعه 121 مريضا خارجيا ذكرا يخضعون لتقييم الخصوبة في مركز التكاثر بمستشفانا من خلال طريقة أخذ عينات عشوائية تماما. تم اكتشاف DFI للحيوانات المنوية والمؤشرات ذات الصلة بواسطة قياس تدفق الخلايا باستخدام PGG وCFG على التوالي. أظهرت النتائج أن قيم DFI التي تم الحصول عليها من الطريقتين أظهرت توافقا جيدا. كانت معاملات الارتباط بين DFIp من طريقة PGG وDFIm وDFIm وDFIs وDFIc من طريقة CFG هي 0.6497، 0.9404، و0.9667 على التوالي (جميع p < 0.01). أظهر مؤشر تلوين الحمض النووي المرتفع (HDS) ارتباطا سلبيا طفيفا مع DFIs (r = -0.3042، p < 0.05). كانت نسبة الحيوانات المنوية المتحركة بشكل تدريجي مرتبطة سلبا مع DFIp وDFIs وDFIc (r = -0.3824، -0.3794، -0.3574، على التوالي، جميعها p < 0.05). لم يلاحظ ارتباط ذي دلالة كبيرة بين متلازمة الانسجام العالي وحجم السائل المنوي، أو تركيز الحيوانات المنوية، أو إجمالي عدد الحيوانات المنوية، أو نسبة الPR (٪). تشير هذه النتائج إلى أن DFIs مرتبطة بشكل أوثق بخصوبة الذكور، مما يشير إلى أن طريقة CFG، التي توفر هذا المعامل، قد تكون أكثر ملاءمة للتقييم السريري لتلف الحمض النووي للحيوانات المنوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية إلى سلامة واستقرار الوظيفة للبنية الجزيئية للحمض النووي في نواة الحيوانات المنوية. ويتميز تحديدا بتكوين طبيعي للكروماتين، وتسلاسل قاعدية سليمة دون كسر أو تلف تأكسدي، والقدرة على نقل المعلومات الجينية بدقة إلى النسل. أثناء تكوين الحيوانات المنوية، عندما يزداد الإجهاد التأكسدي1، أو يكون إعادة تشكيل الكروماتين غير طبيعي2، أو يتأثر الحيوانات المنوية بالسموم البيئية3، فإن سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية تتضرر، مما يؤدي إلى عدم تطابق القاعدة، فقدان، تعديل، إضافة وربط الحمض النووي، كسور في خيط واحد وثنائي الخيط، وغيرها. علاوة على ذلك، يمكن أن يؤثر الحمض النووي التالف للحيوانات المنوية على خصوبة الذكور ويؤثر سلبا على نتائج الحمل في تقنيات الإنجاب المساعدة (ART)4، مع زيادة خطر فقدان الحمل المتكرر5. في عام 2021، أوصت الجمعية الأوروبية لجراحة المسالك البولية (EAU) بإدراج اختبار DFI في نظام تقييم الخصوبة للرجال6.

حاليا، يتم تقييم سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية بشكل رئيسي من خلال اكتشاف مؤشر تجزئة الحمض النووي للحيوانات المنوية (DFI). اختبار بنية كروماتين الحيوانات المنوية (SCSA) عبر قياس تدفق الخلايا هو الطريقة الأساسية لتقييم DFI7. تم الإبلاغ عن طريقتين لقياس تدفق الخلايا لاكتشاف DFI للحيوانات المنوية في الأدبيات. أحدهما هو طريقة البوابات متعددة الأضلاع (PGG)، التي يمكنها الإبلاغ عن مؤشرين رئيسيين في نفس الوقت، مثل DFI للحيوانات المنوية وHDS8. PGG هو نهج SCSA كلاسيكي يتميز بمعامل كشف أصغر للتغير وتكرار متفوق9. ومع ذلك، لا يمكنه التمييز بين شدة تلف الحمض النووي. نوع آخر هو طريقة البوابة الصليبية (CFG)، التي يمكنها الإبلاغ عن علامة تلف شديدة في حمض الحيوانات المنوية (DFIs)، وعلامة تلف خفيفة في حمض الحيوانات المنوية (DFIm)، وDFI الكلي لطريقة البوابة الصليبية (DFIc). DFIc يساوي مجموع DFIs و DFIm. مقارنة بالتقنيات الحالية لتقييم سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية، يمكن لطريقة CFG أن تعكس شدة تلف الحمض النووي للحيوانات المنوية10.

لتحديد أي طريقة أكثر ملاءمة لتقييم جودة الحيوانات المنوية، استخدمت هذه الدراسة كلا من طريقة PGG وطريقة CFG لقياس DFI والمعلمات ذات الصلة في الحيوانات المنوية. تمت مقارنة العلاقة بين نتائج هاتين الطريقتين ومعايير تحليل السائل المنوي التقليدية. حسب معرفتنا، هذه هي أول دراسة تحلل العلاقة بين نتائج الكشف بين المنهجيتين، PGG وCFG.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى هوايآن الأول للشعب التابع لجامعة نانجينغ الطبية (رقم الموافقة: KY-2024-181-01). تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى الذين استخدمت عيناتهم في هذه الدراسة. مخطط عام لسير العمل مقدم في الشكل 1. تفاصيل المواد والكواشف المستخدمة موضحة في جدول المواد.

إعدادات CFG لمقياس التدفق الخلوي
بعد معالجة الحمض، يظهر الكروماتين النووي للحيوانات المنوية ذات الحمض النووي التالف حنويا أحادي السلسلة، بينما يحتفظ الكروماتين النووي للحيوانات المنوية ذات الحمض النووي غير التالف بتركيبه المزدوج السلاسل سليما. يرتبط الصبغة الفلورية الأكريدين أورانج (AO) بالحمض النووي أحادي السلسلة ويصدر فلورة حمراء عند تحفيزها بواسطة ليزر بقطر 488 نانومتر. عند ارتباطه بحمض نووي مزدوج السلسلة، يصدر فلورة خضراء عند تحفيزها بواسطة ليزر بقطر 488 نانومتر. استنادا إلى عدد إشارات الفلورسنت الحمراء والخضراء التي يلتقطها جهاز قياس التدفق، يتم حساب نسبة الفلورية الحمراء إلى إجمالي الفلورة الحمراء والخضراء، والتي تمثل مؤشر الفلورة الشعاعية للحيوانات المنوية.

تم تنفيذ إعدادات CFG وفقا للنظرة العامة التي قدمها يانغ وآخرون. يجب تكوين مقياس التدفق باستخدام أدنى فلورة خضراء وأعلى فلورة حمراء مقاسة في الحيوانات المنوية الطبيعية المصبوغة ب AO كمراجع حدودية (الشكل 2). فيما يلي قائمة بخصائص الخلايا لكل ربع في CFG:
الربع الأول يدل على وجود حيوانات منوية طبيعية. لوحظ أن الحمض النووي للحيوانات المنوية كان سليما، وكمية ارتباط AO كانت ضئيلة، مما أدى إلى فلورة خضراء.
الحيوانات المنوية في الربع الثاني تحتوي على حمض نووي مجزأ جزئيا وتظهر برتقالية تحت المجهر الفلوري. قد يكون هذا الحمض النووي قابلا للإصلاح، وتصنف هذه الحيوانات المنوية على أنها تحتوي على تجزئة خفيفة في الحمض النووي (DFIm)10.
يعرف الربع Q3 بأنه الفلورية غير النوعية التي خضعت للطرح.
الحيوانات المنوية في الربع الرابع تحتوي على حمض نووي مجزأ وتظهر حمراء تحت المجهر الفلوري، مما يشير إلى تجزئة شديدة في الحمض النووي (DFIs).

يقترح أن الحيوانات المنوية في الربع Q2 و Q4 تحتوي كلتاهما على حمض نووي مجزأ، ويعرف مجموعها ب DFIc.

إعدادات جهاز PGG لمقياس تدفق الخلايا
تم إنشاء بوابة المضلعات لتحليل التدفق الخلوي وفقا للطريقة التي وصفها إيفنسون وآخرون. كما هو موضح في الشكل 3، الخصائص الخلوية المرتبطة بكل بوابة هي كما يلي:
P3 يشير إلى نسبة الخلايا التي تحتوي على حمض نووي مشوه.
يمثل P4 الحيوانات المنوية ذات قابلية عالية للثبات في الحمض النووي (HDS). تفتقر هذه المجموعة من الحيوانات المنوية إلى التبادل الطبيعي بين الهيستون والبروتامين.
تتكون مجموعات الخلايا السائدة خارج بوابات P3 وP4 من حيوانات منوية طبيعية، تظهر انخفاضا في الفلورة الحمراء وتصدر بشكل رئيسي فلورة خضراء.

جمع عينات السائل المنوي وتحليلها
جميع عينات السائل المنوي ال121 كانت من الرجال الذين زاروا مركز التكاثر في مستشفى هوايآن الأول التابع لجامعة نانجينغ الطبية. تم جمع عينات السائل المنوي عن طريق الاستمناء بعد فترة من 2-7 أيام من الامتناع. تم إجراء تحليل روتيني للسائل المنوي وفقا لمتطلبات دليل مختبر منظمة الصحة العالمية لفحص ومعالجة السائل المنوي البشري11,12. تم إجراء تحليلات تركيز الحيوانات المنوية وحركتها باستخدام نظام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الحاسوب (CASA). تم تحليل كل عينة مرتين. تم الإبلاغ عن النتائج كمتوسط فقط عندما يكون الفرق بين النتيجتين ضمن فترة الثقة 95٪؛ وإلا، تم إجراء إعادة أخذ عينات وتحليل.

تحليل DFI
احسب حجم العينة المطلوب لعينة السائل المنوي بحيث يكون التركيز النهائي للحيوانات المنوية في المادة A من مجموعة قياس التدفق الخلوي 2–3 × 106/مل. طريقة الحساب: بافتراض أن تركيز الحيوانات المنوية في عينة السائل المنوي الأصلية هو M × 106/مل، فإن حجم السائل المنوي المطلوب (μL) = 150/M. أضف حجم السائل المنوي المحسوب إلى أنبوب قياس تدفق السايتومتر، ثم أضف 50 ميكرولتر من المادة A وامزج بلطف. أضف 100 ميكرولتر من مادة B، وامزج بلطف، ثم حضن لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. أضف فورا 300 ميكرولتر من المادة C وامزج بلطف. اكتشف العينة باستخدام CFG وPGG على جهاز قياس تدفق السيل، وتحليل ما لا يقل عن 5000 حيوان منوي.

التحليل الإحصائي
تم إجراء تحليل إحصائي للبيانات باستخدام GraphPad Prism 6.0. تم بناء مخططات بلاند-ألتمان لتقييم مستوى التوافق بين PGG وCFG من خلال حساب المتوسط والفروقات. تم رسم الفروق بين الطريقتين مقابل القيم المتوسطة بينهما. علاوة على ذلك، تم استخدام طريقة بيرسون لتحليل العلاقة بين PGG وCFG. تم تحديد أن قيمة p أقل من 0.05 كانت ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من بين 121 مشاركا في الدراسة (متوسط العمر: 32.5 ± 4.9 سنوات؛ النطاق: 26–44 سنة)، تم تشخيص 28 منهم بمرض النزو السبيرميا و4 بقلة القصص الأولية. يتم تلخيص الخصائص الديموغرافية الأساسية ومعايير تحليل السائل المنوي في الجدول 1.

كما هو موضح في الشكل 4، كشف مخطط بلاند-ألتمان أن نتائج DFI للحيوانات المنوية التي تم الحصول عليها بواسطة طريقتي PGG وCFG أظهرت اتساقا ممتازا (r = 0.9667، p = 0.0000). أظهرت عينتان فقط فروقات أكب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصي الطبعة السادسة من دليل مختبر منظمة الصحة العالمية لفحص ومعالجة السائل المنويالبشري 12 بأربع طرق لتقييم سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية: إنزيم الانتقال الذاتي النهائي للنيوكسينيوكليوتيديل (dUTP) ووضع العلامات على نهاية الطرف (TUNEL)، اختبارات الرحلان الكهربائي الهلامي أحادي الخلية (Comet)، اختبار SCSA، واختبار تشتت الكروماتين للحيوانات المنوية (SCD). من بين هذه المواد، تم اعتماد SCSA على نطاق واسع في مختبرات الأندرولولوجيا بسبب استخدامه لقياس تدفق الخلايا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الحاسوبشركة Beijing Suijia للبرمجيات المحدودةSA-II 
مقيس التدفق الخلوي شركة Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics المحدودةCyto E6
مجموعة السيتومترية التدفقيةشركة Shenzhen BRED Biotechnology المحدودة
غرفة عد MaklerSefi Medical Instruments
مجموعة سلامة الحمض النووي لنواة الحيوانات المنويةشركة Shenzhen BRED Biotechnology المحدودة-

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vaughan, D. A., Tirado, E., Garcia, D., Datta, V., Sakkas, D. DNA fragmentation of sperm: a radical examination of the contribution of oxidative stress and age in 16 945 semen samples. Hum Reprod. 35 (10), 2188-2196 (2020).
  2. Štiavnická, M., et al. H3K4me2 accompanies chromatin immaturity in human spermatozoa: an epigenetic marker for sperm quality assessment. Syst Biol Reprod Med. 66 (1), 3-11 (2020).
  3. Jeng, H. A., et al. Mixture analysis on associations between semen quality and sperm DNA integrity and occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Arch Environ Occup H. 78 (1), 14-27 (2023).
  4. Li, F., Duan, X., Li, M., Ma, X. Sperm DNA fragmentation index affect pregnancy outcomes and offspring safety in assisted reproductive technology. Sci Rep. 14 (1), 356(2024).
  5. Zhu, X. B., et al. Sperm DNA fragmentation in Chinese couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Asian J Androl. 22 (3), 296-301 (2020).
  6. Minhas, S., et al. European Association of Urology Guidelines on Male Sexual and Reproductive Health: 2021 Update on Male Infertility. Eur Urol. 80 (5), 603-620 (2021).
  7. Agarwal, A., et al. Technical Aspects and Clinical Limitations of Sperm DNA Fragmentation Testing in Male Infertility: A Global Survey, Current Guidelines, and Expert Recommendations. World J Mens Health. 42 (1), 202-215 (2023).
  8. Evenson, D., Jost, L. Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment. Meth Cell Sci. 22 (2-3), 169-189 (2000).
  9. B, V. L., et al. Sperm chromatin structure assay versus sperm chromatin dispersion kits: Technical repeatability and choice of assisted reproductive technology procedure. Clin Exp Reprod Med. 47 (4), 277-283 (2020).
  10. Yang, F., et al. Establishment and evaluation of a flow cytometry technique reflecting the severity of human sperm DNA damage. Zhonghua Nan Ke Xue. 26 (11), 989-995 (2020).
  11. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 5th ed., World Health Organization. Geneva. (2010).
  12. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 6th ed., World Health Organization. Geneva. (2021).
  13. Evenson, D. P. The Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci. 169 (6), 56-75 (2016).
  14. Lin, M. H., et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates. Fertil Steril. 90 (2), 352-359 (2007).
  15. Virro, M. R., Larson-Cook, K. L., Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril. 81 (5), 1289-1295 (2004).
  16. Mohammadi, Z., Tavalaee, M., Gharagozloo, P., Drevet, J. R., Nasr-Esfahani, M. H. Could high DNA stainability (HDS) be a valuable indicator of sperm nuclear integrity. Basic Clin Androl. 30, 12(2020).
  17. Shen, L., et al. High sperm DNA stainability might not be an accurate predictive indicator of male fertility and assisted reproductive technology outcomes. Front Endocrinol (Lausanne). 16, 1510114(2025).
  18. Lu, J. C. High DNA stainability (HDS) should not be recommended as a marker for the detection of sperm DNA damage. Andrologia. 54 (7), e14442(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233 JoVE

مقالات ذات صلة