قياس منشأة الخروج والامتثال للعين في عيون الفأر خارج الجسم الحي باستخدام نظام مضخة الحقنة

ملخص

دمج الأساليب التحليلية من طرق التروية المسيطر عليها بالضغط المعتمد أدى إلى تحسين نظام مضخة الحقنة بسيط ومنخفض التكلفة لتقييم مرافق التدفق الخارجي والامتثال البصري في عيون الفئران.

الملخص

الحفاظ على ضغط داخل العين (IOP) عند مستوى مناسب ومستقر أمر ضروري لصحة العين. تلعب الخصائص البيوميكانيكية لشبكة الترابيكولار (TM)، وقناة شليم (SC)، والصدفة القرنية الكاملة دورا حيويا في توازن الأنبوب الداخلي (IOP). تعد مرفق التدفق الخارجي (C) معاملا رئيسيا لتقييم فعالية TM و SC في تصريف الخلط المائي، بينما يعكس الامتثال البصري (φ) مرونة القشرة القرنية والتدفق العابر عبر TM وSC. سابقا، تم تطوير نظام مضخة حقنة بسيط وفعال من حيث التكلفة لتقييم C. ومع ذلك، فإن استخدام الانحدار الخطي البسيط لتحليل البيانات في الجسم الحي له قيود في توصيف دالة TM وSC. في هذه الدراسة، تم تحسين نظام مضخة الحقنة من خلال تطبيق أساليب تحليلية تم تطويرها لأنظمة تروية العين المسيطر عليها بالضغط. تمت مقارنة قيم C و φ المقاسة في العيون خارج الجسم الحي مع قيم نظام التروية المنشورة سابقا، وكانت متوافقة مع تلك النطاقات المبلغ عنها. باختصار، يسهل هذا النظام البسيط ومنخفض التكلفة لمضخة الحقنة تقييم الخصائص البيوميكانيكية ل TM و SC.

المقدمة

الحفاظ على مستوى مناسب ومستقر من ضغط العين (IOP) أمر ضروري لصحة العين¹. الارتفاع المستمر في المكثف المكثف هو عامل الخطر الأساسي للإصابة بالجلوكوما^2،3. تقلبات اللواء المكثف طويلة الأمد على مدى أشهر أو سنوات تساهم أيضا في فقدان البصر^4،5. حددت الدراسات الحديثة نوعا آخر من تقلبات اللوكوما، وهو التقلبات العابرة الناتجة عن الأنشطة اليومية، والتي قد تسرع أيضا من تقدم الزرق ^6,7. على سبيل المثال، رجل يبلغ من العمر 46 عاما لديه تاريخ يمتد لعشرين عاما في فرك الجفون، ورجل يبلغ من العمر 52 عاما كان يفرك عينيه لمدة 10 سنوات، أظهرا كلاهما تلف متسارع في قرص البصر ^8,9. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية الاستجابات المناسبة وفي الوقت المناسب للتغيرات في اللواء المكثف لتقليل خطر فقدان البصر.

يتم تنظيم الأنبوب المائي بواسطة التوازن بين إنتاج الهيموس المائي (AH) وتصريفها¹⁰. يخرج AH من العين بشكل أساسي عبر المسارات التقليدية والمسارات التصلب العنبية¹¹. في كل من العيون الطبيعية والعيون الزرقاء (الزرق)، المسار التقليدي الذي يتكون من شبكة الترابيكولار (TM) وقناة شليم (SC) هو المصدر الرئيسي لمقاومة التدفق الخارجي التي تؤثر على توازن IOP 12,13,14. لذلك، فإن الخصائص البيوميكانيكية ل TM و SC ضرورية لتكيف العين مع التغيرات في IOP 15,16,17.

ساعدت التطورات التكنولوجية الحديثة في تقييم أكثر دقة لتدفق الأشعة الهوائية الخارجة. تم تطوير طرق غازية، مثل التروية المعتمدة على الجاذبية ونظام مضخة الحقنة، لحساب مرفق الخروج (C)، الذي يشير إلى كيفية تنظيم TM وSC للتدفق الخارج في الحالة^{المستقرة} 18,19,20,21,22,23,24. تم استخدام طرق غير جراحية، مثل التونغرافيا²⁵ والتصوير الفلوري²⁶، سريريا لتحديد C لدى مرضى الجلوكوما. ومع ذلك، فإن معظم الطرق غير قادرة على تقييم وظيفة TM وSC بشكل محدد. على سبيل المثال، في نظام مضخة الحقنة، يتم تركيب بيانات معدل التدفق والضغط في الحالة المستقرة باستخدام الانحدار الخطي البسيط، ويتم تفسير الميل على أنه C معتمد على الضغط. ومع ذلك، لا يمكن لهذا الحساب C في الفئران الحية أن يعكس بدقة سعة تدفق AH عبر المسار التقليدي لأنه يتأثر بإفراز AH، وتدفق الجسم، والضغط الوريدي فوق التصلب كما هو موصوف في معادلة جولدمان.

لمعالجة هذا القيد، حسب ميلار وآخرون تدفق الهوم الداخل، والتدفق التقليدي، والتدفق العصبي العصبي في نفس عين الفأر من خلال قياسات تدفق ثابت متعددة بناء على افتراض غياب تدفق الهو، وعدم وجود ضغط وريدي فوق التصلب الصلبي، وتدفق الإطار العصبي العصبي دون تغيير بعد القتل الرحيم²². في عام 2016، أفاد شيروود وآخرون أن تدفق التصلب اليفي هو 0 في العيون خارج الجسم عند 0 ملم زئبق، ثم أجابوا على نفس السؤال من خلال تقديم نموذج قانون القدرة باستخدام iPerfusion (نظام تفريغ يتحكم فيه بالضغط يسمى لاحقا نظام التبريخ)²⁷. وقد أوضحت التطورات المنهجية الأدوار المميزة ل TM وSC، مما عزز فهم وظائفهما الفسيولوجية في الحفاظ على تدفق AH المستقر في الحالة المستقرة.

بالإضافة إلى ذلك، فإن الاستجابة المؤقتة ل TM وSC لتقلبات اللوح الداخلي ضروري للحفاظ على توازن الداخل المكثف. لتتبع هذه الحركة، طور شين وآخرون التصوير المقطعي البصري التماسكي الحساس للطور (OCT)، الذي يتيح الملاحظة على مقياس زمني^{يبلغ 28} ثانية. يمكن للمجهر الإلكتروني الماسح ثلاثي الأبعاد الماسح ذو الوجه الكتلي دراسة هذه الحركة على مستوى فائق البنية²⁹. ومع ذلك، تقدر الطرق القائمة على الصور فقط الخصائص البيوميكانيكية ل TM و SC ولا تعطي قيما فعلية لتصريف AH العابر. في عام 2019، وبعد تطوير iPerfusion، حسب شيروود وآخرون الامتثال العيني (φ) كمؤشر رئيسي لكل من مرونة القرنية الصلبة والاستجابة العابرة ل TM و SC³⁰. يوفر هذا التقدم معاملة كمية لتقييم السلوكيات العابرة ل TM وSC استجابة لتقلبات IOP.

استنادا إلى هذه التطورات في تقييم وظائف TM وSC، حسنت هذه الدراسة نظام مضخة الحقنة من خلال دمج نموذج قانون القدرة لحساب C ودمج منهجيات جديدة لحساب φ. تمت مقارنة هذه القياسات مع البيانات المنشورة التي تم الحصول عليها باستخدام نظام التروية لتقييم ما إذا كان نظام مضخة الحقنة المحسن مناسبا لتقييم مرافق التدفق الخارجي والامتثال العيني في عيون الفئران خارج الجسم الحي .

البروتوكول

أجريت جميع التجارب وفقا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية وإرشادات العناية واستخدام الحيوانات المختبرية في مركز تشينغداو الطبي الجامعي (QDU-AEC-2022069).

1. اختيار الحيوانات والتعامل معها

1. استخدم فئران عمرها 5 أشهر ذات خلفية وراثية 50٪ من C57BL/6 و50٪ BALB/c. لا تأخذ الجنس في الاعتبار في التصميم التجريبي.
2. حافظ على الفئران تحت دورة 12 ساعة لكل 12 ساعة من الضوء إلى الظلام عند 23 ± 2 درجة مئوية ورطوبة 50 ± 5٪.

2. قياس IOP

1. تخدير الفئران باستخدام 2.5٪ إيزوفلوران مع 80٪ (حجم/حجم) أكسجين في غرفة محكمة الإغلاق لمدة 3.5 دقيقة.
   تحذير: الإيزوفلوران مخدر متطاير. إجراء التخدير في منطقة جيدة التهوية أو في نظام احتواء مناسب.
2. نقل الفئران إلى منصة تشغيل. حافظ على التخدير باستخدام القناع لمدة 30 ثانية إضافية.
3. قم بجميع القياسات بين الساعة 9:00 و12:00. سجل ثلاث قياسات لكل عين. احسب القيمة المتوسطة لكل نقطة بيانات.

3. إعداد النظام (الشكل 1)

1. وصل حقنة بسعة 100 ميكرولتر بمضخة حقنة.
2. وصل الحقنة بحساس ضغط تدفق.
3. وصل المستشعر بنظام جمع البيانات.
   ملاحظة: تأكد من أن حساس الضغط وحامل العين مصطفان على نفس الارتفاع لتجنب تشوهات الضغط.
4. املأ النظام بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) × واحد. أزل جميع فقاعات الهواء.
5. ضع العين في حامل ذو تجويف دائري (قطر 4–6 مم). تأكد من استقرار العين أثناء التنوين. ضع حساس الضغط وحامل العين على نفس الارتفاع.
   ملاحظة: قد يؤدي عدم المحاذاة إلى حدوث أخطاء في قياس الضغط. ملف تصميم STL لحامل العين المخصص مقدم كملف تكميلي 1.

4. تشغيل البرمجيات

1. معايرة حساس الضغط
   1. افتح برنامج جمع البيانات. قم بتحميل ملف إعداد المعايرة. اختر دالة المعايرة .
   2. ربط النظام بخزان مياه على ارتفاعين محددين.
   3. الضغوط المقاسة والفعلية باستخدام التحويل:
      1 سم H₂O = 0.735 ملم زئبق
2. إعداد المضخة
   1. افتح إعدادات الوحدة. قم بتحميل ملف تكوين المنظم.
   2. اختر جهاز المضخة. أدخل الحد الأقصى لمعدل التدفق وقطر الحقنة.
3. تسجيل البيانات
   1. ابدأ التسجيل.
   2. توقف عن التسجيل بعد كل خطوة ضغط.
   3. أدخل قيمة الضغط التالية.
   4. أعد تشغيل التسجيل.

5. تحضير الإبرة

1. اسحب ميكروبايبت زجاجية وفقا لبروتوكول معتمد⁸.
2. قم بطحن الطرف حتى يصل قطر داخلي إلى 80–100 ميكرومتر. قم بتلميع طرف الإبرة.
   تحذير: تعامل مع الإبر الزجاجية بحذر لتجنب الإصابة.
3. ثبت الإبرة على جهاز تحكم دقيق. وصل الإبرة بمحول الضغط.
4. املأ الإبرة ب PBS.
5. ضع رأس الإبرة على نفس ارتفاع حساس الضغط.
6. قياس المقاومة
   1. ضع ضغطا بمقدار 1 ملم زئبق. سجل معدل التدفق.
   2. حساب مقاومة الإبر:
      
   3. استخدم إبر بمقاومة بين 0.01 و0.5 ملم زئبق/(ميكرولتر/دقيقة).

6. مرافق النظام والامتثال

1. قياس المنشأة
   1. قم بدمج النظام باستخدام PBS. أغلق النظام باستخدام صمام ثلاثي الاتجاهات.
   2. طبق خطوات ضغط بحجم 6، 8، 10، 12، 14، و16 مم زئبق.
   3. سجل P وQ لمدة 10 دقائق في كل خطوة. احسب القيم المتوسطة من آخر 5 دقائق.
   4. قم بإجراء الانحدار الخطي. فسر الميل كمرفق نظامي.
2. التحقق من الصحة
   1. كرر القياسات ثلاث مرات.
   2. تأكد من أن منشأة النظام أقل من 0.2 نانولتر/دقيقة/مليمتر زئبق.
3. قياس الامتثال
   1. أدخل أنبوب سيليكون بقطر 35 سم في النظام.
   2. قس الامتثال مع وبدون أنابيب تفلون.
   3. احسب تغير الحجم باستخدام طريقة حجم متقطع¹⁴.
   4. حدد التزام النظام بأنه 4 نانولتر/ملم زئبق.
4. فحص الحساسية
   1. تأكد من أن امتثال النظام القابل للكشف أكبر من 9.9 نانولتر/ملم زئبق.

7. التكتل

1. قتل الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ بمعدل تدفق 0.7 لتر/دقيقة لمدة 3 دقائق.
   تحذير: يجب اتباع إرشادات مؤسسية لضمان وجود نقاط نهاية إنسانية.
2. قم بتشريح العضلات الخارجية للعين والأعصاب البصرية باستخدام أدوات معقمة. ازرع العيون.
3. ثبت عين واحدة فورا في الحامل عند 35.5 درجة مئوية.
4. خزن العين المقابلة عند 4 درجات مئوية.
5. قس كلتا العينين باستخدام نفس النظام.

8. التقنية

1. إدخال الإبرة
   1. أدخل الإبرة عبر القرنية المركزية بزاوية 45°.
   2. ادفع الإبرة إلى عمق 0.3–0.5 مم داخل الحجرة الأمامية.
2. التحقق من الصحة
   1. استقر النظام. أكد تقلب الضغط ≤ 0.4 ملم زئبق خلال آخر 5 دقائق.

9. العين C_r

1. ثبت العين عند 8 ملم زئبق لمدة 30 دقيقة.
2. طبق خطوات ضغط بحجم 6، 8، 10، 12، 14، و16 مم زئبق.
3. طبق خطوة أخيرة عند 8 ملم زئبق.
4. جمع البيانات
   1. اضبط معدل التدفق الأقصى إلى 4 ميكرولتر/دقيقة.
   2. سجل P وQ لمدة 10 دقائق في كل خطوة.
5. التحليل
   1. رسم منحنيات P–T و Q–T. احسب القيم المتوسطة من آخر 5 دقائق.
   2. ملاءمة البيانات إلى نموذج قانون القوة²⁷:
      
6. تعريف C_r (بعد طرح مرفق النظام) كمرفق خروج بصري.
7. اضبط P_r = 8 ملم زئبق.
8. عرف β كمعامل غير خطي.

10. العين Φ_r

1. تحليل منحنيات P–T و Q–T أثناء زيادات الضغط. حدد زيادة التدفق إلى Q_max والتباطؤ اللاحق.
2. احسب تغير الحجم بين t_p وt_max باستخدام طريقة الحجم المتقطع³⁰.
3. ملاءمة البيانات إلى معادلة فريدنوالد^{المعدلة رقم 30}:
   
4. التعيين P_r = 13 ملم زئبق. عرف Φ_r (بعد طرح امتثال النظام) كالتزام بصري Φ_r، _عين و γ كمعامل مادي.

النتائج

تم تقييم أداء نظام مضخة الحقن المحسن من خلال مقارنة C-φ في فئران عمرها 5 أشهر مع قيم منشورة سابقا من دراسات تروية العين المتحكم بها بالضغط. تم تقييم طبيعية مجموعات البيانات في الشكل 2F باستخدام اختبار شابيرو-ويلك، وأجريت مقارنات إحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الذليل من نوع Student's.

كما هو موضح في الشكل 2A–C، كانت مؤشرات العين السطحية (C_{) ونقطة} العين (C) والعين، ...

المناقشة

تقدم هذه الدراسة نظام مضخة محقنة محسن لتقدير منشأة التدفق الخارجي والامتثال العيني في عيون الفئران، مما يمنحها قيم متوافقة مع تلك المبلغ عنها باستخدام أنظمة تروية العين المتحكم بالضغط. يحسن النهج الحالي دقة القياسات المعتمدة على الحقنة مع الحفاظ على إعداد تجريبي بسيط وسهل الوصول. قد يسهل هذا المزيج من التحسين المنهجي وسهولة الوصول اعتماده بشكل أوسع في المختبرات حيث لا تتوفر أنظمة أكثر تقدما بسهولة.

الميزة الأساسية لهذا النظام هي تحسين دقة البيانات، مما يمكن من...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
المادة الكيميائية	1× مخزن PBS	ثيرمو فيشر العلمي	10010023
إيزوفلوران	شركة شينزين ريوود لايف ساينسز المحدودة، الصين	R640
المادة	100 μ إل عالي الدقة حقنة	هاميلتون	1710
زجاج البوروسيليكات	ساتر، نوفاتو، كاليفورنيا	BF100-50-10
حقنة معقمة ذات مرة واحدة	شركة فنغلين للأجهزة الطبية، المحدودة، جيانغشي، الصين	10 مل
حساس الضغط	IcuMedical	PX26-015G
أنبوب السيليكون	شركة رونزه للفلوئد المحدودة، نانجينغ، الصين	لا يوجد
أنبوب PTFE شفاف	شركة رونزه للفلوئد المحدودة، نانجينغ، الصين	لا يوجد
المعدات	جهاز سحب الماصة المشتعل/البني	ساتر، نوفاتو، كاليفورنيا	P-97
المعالج الدقيق اليدوي	وورلد بريسيجن إنسترومنتس (WPI)	M3301
حمام معدني	بيفر بيولوجيا، سوتشو، الصين	2016C
المايكروفورج	مختبر ناريشيغي للأدوات العلمية، طوكيو، اليابان	MF830
مطحنة ميكروبايبت	شركة MPInstrument المحدودة، ووهان، الصين	KDG-02
المجهر المنصف PZMIII ستيريو زووم	وورلد بريسيجن إنسترومنتس (WPI)	PZMIII
مضخة الحقنة	وورلد بريسيجن إنسترومنتس (WPI)	AL-1000