مقالة منهجية

تشريح صغير النطاق وتلوين الأجسام المضادة للأقراص التخيلية للعين والجناح من ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر

132 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70434

⸱

مايو 15, 2026

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المقالة بروتوكول تقطيع القرص التخيلي الفعال وتلوين الأجسام المضادة الاقتصادي، وهو اقتصادي مع المواد التفاعلية ويسهل التعامل مع الأقراص التخيلية بأعداد قليلة.

الملخص

لطالما درست أقراص ذبابة الفاكهة التخيلية كنماذج لتطور الظهارة ونماطها وتجديدها. يعد تصنيف الأجسام المضادة وتصويرها للأقراص التخيلية المفككة أمرا مهما لتصور أنماط تعبير البروتينات كعلامات على العمليات التطورية والفسيولوجية. تم تطوير هذه الطريقة لتحليل الأقراص التخيلية ووضع العلامات عليها في الأصل للمجهر الإلكتروني المناعي لأقراص العين والهوائيات التخيلية بواسطة توملينسون وريدي. باستخدام ألواح 60 ميكروويل، ومن خلال نقل الأنسجة بين المحاليل بدلا من نقل المحاليل، يمكن الحصول على اهتمام فردي بعينات الأنسجة مع هدر قليل جدا. حتى الأقراص الخيالية المفردة يمكن معالجتها. تتطلب الطريقة كميات صغيرة فقط من الأجسام المضادة والكواشف الأخرى. كمثال على تطبيق هذه الطريقة على الأنسجة الصغيرة الأخرى، يوضح المقال أيضا كيف يمكن تشريح وتصنيف أقراص الأجنحة التخيلية بنفس الطريقة. يمكن تطبيق نهج مشابه على أي نسيج صغير ذو أبعاد مشابهة، وكذلك على إجراءات نسيجية وتصنيفية أخرى بجانب صبغ الأجسام المضادة.

المقدمة

الأقراص التخيلية لذبابة الفاكهة هي أنسجة سلفية يتم التخلي عنها أثناء تكوين الجنين وتنمو داخل اليرقة دون تمايز وتساهم في البنية الجلدية البالغة خلال المرحلةالأولى من العذراء. قدمت دراستهم العديد من الرؤى حول آليات الأنماط التطورية، حيث تم دراسة أقراص العين والجناح التخيلية بشكل جيدبشكل خاص 2,3,4,5,6. الكيمياء المناعية مفيدة بشكل خاص لدراسة أنماط التعبير المكاني والزماني للجينات في الأقراص التخيلية، وكذلك لتوصيف سلوكيات الخلية، بما في ذلك انقسام الخلايا وموت الخلايا.

لتسهيل المتطلبات الإضافية للتحليل المجهري الإلكتروني لأقراص العين التخيلية الموسومة بالأجسام المضادة، طور توملينسون وريدي بروتوكولا صغيرا الحجم اقتصاديا بشكل خاص مع المواد الكيميائية ويوفر درجة عالية جدا من الموثوقية والتخصيص. يتم وصف طريقتهم في المطبوعات، لكن لا يوجد فيديو متوفر3،8،9. يمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة لوضع علامات على الأقراص التخيلية الأخرى (أو الأنسجة الأخرى) ويمكن تطبيقها على أقراص الخيال الجنحية بالإضافة إلى الأقراص التخيلية للعين-الهوائيات.

تتبع وسم الأجسام المضادة لأقراص ذبابة الفاكهة التخيلية المخطط العام المناسب لأي نسيج10 (الشكل 1). يجب تشريح النسيج وتثبيته قبل الحضانة باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالبروتينات المعنية. بعد غسل الجسم المضاد غير المرتبط، يضاف جسم مضاد ثانوي موسوم (غالبا فلوري)، يرتبط بالجسم المضاد الأولي، الذي يرتبط بنفسه بالبروتين المعني في النسيج الثابت. بعد الغسل لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المربوطة، يمكن تركيب الأنسجة للفحص المجهري، ويمكن رؤية البروتينات المعنية. تتوفر العديد من الأوصاف العامة لهذه العملية ويمكن تطبيقها على الأقراص التخيلية وأنسجة ذبابة الفاكهة الأخرى11. هنا، تم توفير بروتوكول لطريقة توملينسون & ريدي، حيث يتم نقل عينات الأنسجة بشكل فردي بين آبار حضانة صغيرة على صفيحة ميكروبئر وتلاحظ بواسطة مجهر ستيريو في كل خطوة (الشكل 2). تعمل هذه الطريقة بشكل أفضل لتلوين أعداد أقل من الأنسجة في كل مرة (عشرات العينات) وليست مثالية للدفعات الكبيرة (أي المئات). يتطلب هذا النهج فقط حجم محلول صغير يبلغ 13 ميكرولتر في كل بئر، وبالتالي يمكن تنفيذه بقليل جدا من الأجسام المضادة. نظرا لفقدان الأنسجة البسيط، لا يوجد حد أدنى لحجم العينة، وحتى الأقراص التخيلية الفردية يمكن معالجتها بشكل موثوق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. صنع أداة النقل

  1. استخدم كماشة لقطع ~2.5 سم من سلك التنجستن بقطر 0.005". استخدم الملقط لتشكيل أحد طرفي السلك على شكل خطاف أو حلقة (الشكل 3). أدخل الطرف الآخر في حامل الإبرة. سيستخدم هذا لنقل الأقراص مع انتقال سائل قليل أو معدوم. قد تكون الحلقة أسهل في الاستخدام، لكن الخطاف ينقل سائلا أقل بين المحاليل.

2. تشريح وتثبيت الأقراص التخيلية بين العين والهوائيات

  1. شطف اليرقات بمحلول حاجز فوسفات الصوديوم ~7.5 مل 0.1 مليون (pH7.2) في طبق بتري (قطر 60 مم) لإزالة أي وسط ذبابة أو مخلفات أخرى. انظر الخطوة 6 لتحليل أقراص الجناح التخيلية بدلا من أقراص العين والهوائيات. كلا القرصين التخيليين يقعان داخل الجزء الأمامي من الجسم (الشكل 4).
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام PBS بدلا من مخزن الفوسفات في الخطوات 2.1–2.3.
  2. نقل اليرقات إلى طبق بترى يحتوي على محلول نفخ طازج.
    ملاحظة: يفضل بعض العمال تشريح اليرقات الفردية في قطرات عازل واحدة في طبق بتري بقطر 60 مم؛ وآخرون يستخدمون شرائح بئر الاكتئاب.
  3. أثناء الملاحظة تحت مجهر تشريح، امسك اليرقات ~50٪ من طول الجسم باستخدام الملقط. استخدم زوجا ثانيا من الملقط الدقيق للإمساك بخطاطيف الفم والسحب. تخرج أقراص العين والهوائيات متصلة بأجزاء الفم. قد يبقى الدماغ أيضا مرتبطا بأقراص العين.
  4. استخدم أداة السلك لنقل النسيج المفكك إلى طبق بتري صغير (قطر 35 مم) يحتوي على ~3 مل من المثبت، مثل الفورمالديهايد 3.7٪ في محلول فوسفات الصوديوم بحجم 0.1 مليون (pH7.2)، يتم إنتاجه عن طريق تخفيف محلول الفورمالديهايد بنسبة 37٪ في المخزن المؤقت.
    ملاحظة: اتبع إجراءات السلامة المحلية المعتمدة للتعامل مع الفورمالديهايد. الفورمالديهيد بنسبة 3.7٪ هو مثبت بسيط سيكون مرضيا في كثير من الحالات، لكن بعض المثبتات الأخرى قد تكون مثالية لبعض المستضدات. يمكن استخدام PBS أو PEM (0.1 M أنابيب pH 7.0، 2 mM MgSO4، 1 mM EGTA) كمحلول تثبيت بدلا من فوسفات الصوديوم 0.1 مل، أو يمكن الحصول على محلول فورمالديهايد عن طريق إذابة بارافورمالديهايد صلب، بدلا من محلول مركز. يجمع البارافورمالديهايد-ليسين-الدوري الثابت (PLP) بين تثبيت البروتين الخفيف مع الترابط المتقاطع للكربوهيدرات، ويحافظ بشكل أفضل على هياكل الغشاء12. على سبيل المثال، يبقى بروتين ذبابة الفاكهة السكريبروس مستضدا بعد تثبيت PLP، ولكن ليس بعد تثبيت الفورمالديهايد. حضر PLP طازجا كما يلي: (1) أضف 2 جرام من مسحوق البارافورمالديهايد إلى 25 مل من الماء منزوع الأيونات في قارورة مخروطية داخل غطاء بخار وتحريك على نار منخفضة؛ (2) اغمس ماصة في محلول هيدروكسيد الصوديوم 50٪ وانقل أثر من السائل (أقل بكثير من قطرة واحدة) إلى الخليط. يجب أن يذوب البارافورمالديهايد خلال بضع دقائق دون أن يغلي المحلول. أثناء تبريد محلول الفورمالديهايد بنسبة 8٪، قم بإذابة 0.36 جرام ليسين في 10 مل ماء منزوع الأيون، و7.5 ملليتر 0.1 مل، درجة حموضة فوسفات الصوديوم 7.2، 2.5 مل، 0.1 مل، نيوم2HPO4 ، واحتفظ بالجليد. اخلط 15 مل من محلول الليسين البارد مع 5 مل من الفورمالديهيد الطازج 8٪ و50 ملغ من الصوديوم في أنبوب بسعة 50 مللتر بغطاء لولبي، اخلط بالدوامة واستخدم عندما يكون طازجا.
  5. بعد 15–20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، انقل النسيج المفصول إلى طبق بترى آخر يحتوي على محلول فوسفات الصوديوم 0.1 مليون (pH 7.2).
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام PBS بدلا من مخزن الفوسفات. قد يكون التثبيت على الثلج مفضلا لبعض المستضدات، أو عندما يرغب في تصوير التألق الداخلي ل GFP أو RFP المعبر عنه في الأنسجة. التركيز على PLP دائما لمدة 45 دقيقة على الجليد.

3. الحجب والحضانة باستخدام الأجسام المضادة الأولية

  1. انقل الأنسجة إلى طبق بتري بحجم 35 مم يحتوي على ~3 مل من غسيل الأجسام المضادة NSG للحجب. حضن طبق بتري على الثلج لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. NSG يحتوي على 0.1 مليون محلول فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 7.2)، 0.1٪ سابونين، 5٪ مصل الماعز العادي. يتم تخزين مخازن الغسل المعقمة بالفلتر عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: قد تكون مخازل الغسيل المختلفة مثالية للأجسام المضادة المعينة. على سبيل المثال، بينما السابونين هو منظف خفيف غير أيوني يذيب غشاء البلازما بشكل خاص، قد تكون منظفات أخرى مفضلة للكشف عن المستضدات داخل النواة. كمثال إضافي، الجسم المضاد الذي تم تطويره ضد البروتين الناغمي النووي بواسطة جارمان وآخرون هو الأكثر نشاطا مناعيا في المخازن التي تحتوي على NP40 كمنظف. راجع جدول المواد للحصول على وصفات لمخازن الغسيل البديلة: PDT، PBT، أو NSG. عند استخدام المصل العادي كبروتين حاصر، من المثالي أن يكون من النوع الذي ينتج فيه الجسم المضاد الثانوي، مثل مصل الماعز العادي إذا كان من المقرر استخدام الأجسام المضادة الثانوية للماعز، أو مصل الحمار العادي إذا كان من المقرر استخدام الأجسام المضادة الثانوية للحمار. في الواقع، هذا لا يحدث فرقا كبيرا.
  2. أزل أي نسيج غير مرغوب فيه من أقراص العين والهوائيات التخيلية أثناء الحجب باستخدام ملقط دقيق، باستثناء خطاطيف الفم. اترك أجزاء الفم متصلة حاليا لتسهيل النقل.
    ملاحظة: يمكن ترك الأنسجة الزائدة، مثل الدماغ، حتى تركيب الشريحة (الخطوة 5.4)، طالما أنها لا تعيق التلوين أو الرؤية.
  3. أثناء الحصب، حضر تخفيفا بنسبة 1:100 من محلول الأجسام المضادة mAb40-1a في NSG، مثل 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة في 100 ميكرولتر NSG. امزج عن طريق الماصة، وليس عن طريق الدوامة.
    ملاحظة: mAb40-1a هو جسم مضاد وحيد النسيلة يرفع ضد بيتا-جالاكتوسيداز. سيختلف تخفيف الأجسام المضادة المثلى ومخزن الغسيل حسب الأجسام المضادة المستخدمة.
  4. أضف 13 ميكرولتر محاليل الأجسام المضادة لكل واحد من ما يصل إلى ستة آبار في العمود الأول من صينية صغيرة تضم 60 بئرا صغيرة. تعد الآبار المخروطية ذات الجوانب المستقيمة مهمة للوضوح البصري. إذا كان هناك حاجة لأكثر من ستة آبار، ابدأ صينية صغيرة ثانية.
  5. نقل أقراص تخيلية للعين، ويفضل أن تكون متصلة بأجزاء الفم، إلى محلول الأجسام المضادة الأولي واحدة تلو الأخرى باستخدام حلقة السلك أو الخطاف.
    ملاحظة: عدد الأقراص الوهمية التي يمكن إضافتها إلى كل بئر يعتمد على الجسم المضاد. الكثير من الأنسجة يمكن أن يستنزف بعض الأجسام المضادة إلى درجة أن وضع العلامات يقل. عادة ما يكون 5 أزواج في كل بئر مرضيا. وبالتالي، يمكن بسهولة تصنيف ~60 قرصا باستخدام 6 صفوف من ألواح الميكروتيتر ذات 60 بئئر. يمكن استخدام أجسام مضادة مختلفة لكل صف. ما إذا كان يمكن إعادة استخدام محاليل الأجسام المضادة يتطلب اختبارا تجريبيا لكل حالة؛ هذا ليس روتينا في مختبرنا.
  6. أغلق اللوح بالغطاء وأغلقه بطبقة باراغليفة للحد من التبخر. حضن على الثلج أو عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات حتى الليل. الهزاز ليس ضروريا.
    ملاحظة: الوقت ودرجة الحرارة الأمثلان لحضانة الأجسام المضادة يعتمدان على الجسم المضاد. في كثير من الحالات، يكفي 1–2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، لكن بعض الأجسام المضادة تعطي نتائج محسنة بعد الحضانة عند 4 درجات مئوية، وغالبا ما يكون من الملائم الحضانة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. في حالات قليلة جدا، قد تكون حضانة الأجسام المضادة الأولية لمدة 2-3 أيام هي الأمثل. إغلاق غطاء البئر الصغير ضروري فقط للحضانات التي تتجاوز ~4 ساعات.

4. الغسل والحضانة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية

  1. أضف 13 ميكرولتر من مخزن NSG إلى الأعمدة الثلاثة التالية من الآبار بعد كل بئر أجسام مضادة، حيث سيتم غسل العينات ثلاث مرات. انقل العينات للغسل لمدة 5 دقائق في كل بئر بشكل متتالي.
  2. أثناء الغسيل، حضر تخفيفا بنسبة 1:200–400 للأجسام المضادة الثانوية المتقاربة فلورية في مخزن NSG، مثل 0.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة في 100 ميكرولتر NSG. امزج عن طريق الماصة، وليس عن طريق الدوامة. يقوم بالطرد المركزي بمحلول مخزون الأجسام المضادة الثانوي لمدة 60 ثانية (بأقصى سرعة) قبل التخفيف، حيث يمكن أن ترتبط تجمعات الأجسام المضادة بشكل غير محدد بسطح النسيج.
    ملاحظة: قد يختلف تخفيف الأجسام المضادة الثانوي الأمثل حسب الشركة المصنعة. تتوفر أجسام مضادة متقاربة أليكسا أو سيانين مطرحة لأنواع أخرى لتسهيل وضع علامات متعددة.
  3. أضف 13 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى العمود التالي (الخامس) من الآبار.
  4. نقل العينات إلى الجسم المضاد الثانوي باستخدام الحلقة أو الخطاف.
  5. أغلق اللوح بالغطاء وأغلقه بطبقة باراغليفة للحد من التبخر. حضن الأكسجين على الثلج لمدة 4 ساعات طوال الليل.
    ملاحظة: الوقت ودرجة الحرارة الأمثلان لحضانة الأجسام المضادة يعتمدان على الجسم المضاد. في كثير من الحالات، يكفي 1–2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، لكن بعض الأجسام المضادة تعطي نتائج محسنة بعد الحضانة عند 4 درجات مئوية، وغالبا ما يكون من الملائم الحضانة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. إغلاق غطاء البئر الصغير ضروري فقط للحضانات التي تتجاوز ~4 ساعات.

5. غسل وتركيب المناديل للمجهر

  1. جهز الأعمدة الثلاثة التالية من الآبار بعد بئر الأجسام المضادة الثانوية ب 13 ميكرولتر NSG. انقل العينات عبر كل بئر لمدة 5 دقائق.
  2. نقل العينات إلى غسل نهائي في البئرالتاسع باستخدام 13 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 0.1M (pH 7.2). يكون هذا الغسل بالمخزن ضروريا عندما تحتوي مخازن الغسيل على مكونات تترسب في وسط التثبيت.
  3. . أضف 13 ميكرولتر من وسط التثبيت إلى العمود النهائي (العاشر) من الآبار. يتم صنع وسط التثبيت عن طريق إذابة 2٪ n-بروبيل جالات في 75٪ جليسرول و25٪ 0.1 مولار من فوسفات الصوديوم، بدرجة حموضة 7.2. حضر وسط تركيب جديد كل أسبوع عن طريق خلط المكونات على منصة دوارة. اترك أي فقاعات هواء تتلاشى قبل الاستخدام.
    ملاحظة: وسائط التثبيت متوفرة أيضا تجاريا.
  4. مقطعة 20 ميكرولتر من وسط التثبيت على شريحة مجهر نظيفة. انقل العينات إلى الوسط على الشريحة. هذه فرصة أخيرة لإزالة الأنسجة غير المرغوب فيها. يجب إزالة أجزاء الفم الجلدية من أقراص قرون العين.
  5. لترتيب العينات بحيث لا تنجرف عند وضع الزجاج الغطائي، استخدم أداة السلك لسحب العينات من القطرة الرئيسية للتركيب. أنزل زجاج غطاء نظيف #1.5 بسماكة 22 مم × 40 مم على السلايد باستخدام الملقط، دون إدخال فقاعات هواء.
  6. دع الشرائح تجلس لمدة ساعة واحدة في حامل شرائح من الورق المقوى لتستقر وسائط التثبيت. تجنب إزعاج الشرائح لأن العينات الهشة قد تتلف إذا تحرك زجاج الغطاء.
  7. بمجرد أن يستقر غطاء الزجاج، أغلق الحواف باستخدام طلاء الأظافر. لا تحرك أو تضغط على زجاج الغطاء أثناء القيام بذلك. اترك طلاء الأظافر ليجف لمدة ساعة على الأقل قبل التصوير.
    ملاحظة: للأسف، معظم طلاء الأظافر التجميلي الآن يستخدم مذيبات لا تنتشر بشكل متساو على شرائح الزجاج وليست مفيدة، لذا يجب الحصول على طلاء أظافر علمي.
  8. خزن الشرائح عند 4 درجات مئوية. عادة ما يمكن تصوير العينات وإعادة تصويرها لعدة أشهر.
    ملاحظة: يمكن أيضا تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية.

6. تشريح وتثبيت الأقراص الخيالية للأجنحة

  1. لتشريح أقراص الخيال الجنحية بدلا من أقراص العين والهوائيات التخيلية، اتبع الخطوات أدناه بدلا من الخطوات 2.3–2.5 أعلاه.
  2. تحت المجهر التشريحي، أمسك أجزاء فم اليرقات بملقط دقيق. باستخدام مقص التشريح الدقيق، اقسم اليرقات إلى قسمين بنسبة 30٪ إلى 40٪ من الأسفل من الأمام الخارجية.
  3. قلب الجزء الأمامي من اليرقة عن طريق نشر الطرف المفتوح والمقطوع من اليرقات باستخدام زوج ثان من الملقط ودفع الرأس وأجزاء الفم من خلاله، بطريقة مشابهة لقلب الجورب
  4. استخدم الملقط لنقل اليرقات الأمامية المقلوبة إلى مادة تثبيت إلى طبق بتري صغير (قطر 35 مم) يحتوي على ~2.5 مل ثبيت، مثل الفورمالديهيد 3.7٪ في محلول فوسفات الصوديوم بحجم 0.1 مليون (pH 7.2)، يصنع عن طريق تخفيف محلول فورمالديهايد بنسبة 37٪ في PBS.
    ملاحظة: إذا رغبت، يمكن نقل الجثث المقلوبة إلى 400 ميكرولتر من المثبت في أنبوب ميكروفوج، مما يسهل التثبيت في غطاء البخار. تنطبق نفس الخيارات المثبتة المتاحة لتثبيت القرص الخيالي بالعين أيضا على تثبيت قرص الجناح (انظر ملاحظة في الخطوة 2.4). عادة ما يكون التثبيت الأمثل ووضع علامات على أقراص العين والهوائيات التخيلية متساوين لأقراص الأجنحة.
  5. بعد 15–20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، انقل النسيج المفصول إلى طبق بترى آخر يحتوي على محلول فوسفات الصوديوم 0.1 مليون (pH 7.2).
    ملاحظة: نفس خيارات مخزن الغسيل المتاحة لتثبيت القرص الخيالي للعين تنطبق أيضا على تثبيت قرص الجناح (انظر ملاحظة في الخطوة 2.4). عادة ما يكون المخزن الأمثل لوضع علامات على أقراص العين والهوائيات التخيلية هو نفسه لأقراص الأجنحة.
  6. أزل أقراص الأجنحة من اليرقات باستخدام ملقط دقيق. إذا كان لا يزال موجودا، يمكن إزالة قرص الهالتر الأصغر وقرص الساق الآن أو البقاء ملتصقين بأقراص الجناح لتسهيل النقل.
    ملاحظة: قد لا تكون أقراص الأجنحة مرئية بسهولة داخل الجثة حتى يتم سحب الجسم الدهن أو الأنسجة الأخرى بعيدا (دائما حدد النسيج قبل إزالته). أقراص الأجنحة هي أكبر الأقراص التخيلية وترتبط بجدار الجسم، مرتبطة ارتباطا وثيقا بالقصبة الهوائية. لها شكل دمعة، مثل الخطوط الخارجية لأمريكاالجنوبية 1 (الشكل 4).
  7. تابع الخطوات من 3 إلى 5 كما في الأعلى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إجراء توملينسون وريدي ينتج بانتظام نتائج ممتازة في صبغ الأجسام المضادة. هنا، تم توضيح أقراص تخيلية للعين والهوائيات والأجنحة التي تحمل ثلاث علامات. في الشكل 5A، تم تصنيف قرص تخيلي من العين والهوائيات الثلاثية للكشف عن عامل النسخ Senseless (الأزرق)، والعلامة العصبية السلفية Elav (الأحمر)، وتصنيف Anti-GFP لنسخ الخلايا التي تعبر عن RNAi لنسخة Ocho (الأخضر). في الشكل 5B، تم تصنيف قرص تخيلي في الجناح الثالث باستخدام نظام TIE...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

صبغ الأجسام المضادة لأنسجة ذبابة الفاكهة باستخدام صفائح مخروطية بعمق 60 بئر باستخدام طريقة توملينسون وريدي ينتج نتائج ممتازة وموثوق للغاية، حيث يتبع كل قرص تخيلي تحت المجهر التشريحي أثناء كل عملية تلاعب. تتطلب الطريقة كميات صغيرة فقط من كواشف الأجسام المضادة، وتتبادل الحلول بشكل أكثر اكتمالا مع كل خطوة لأن العينات تنقل مع كمية قليلة جدا من السائل المرتبط. وهو مناسب بشكل خاص للتعامل مع أعداد متواضعة من العينات التي قد تفقد أو تتلف بسهولة في الطرق الجماعية التي لا تلاحظ فيها العين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تشكر NEB أندرو توملينسون على مشاركته الطريقة ولوسي فيرث على التحسينات. نشكر أبهيشيك بهاتاشاريا على مساهمته في الشكل 5A. نشكر جوينر كروز، جوناثان غونزاليس، تشيلسي نغوين، وجنسن نورثروب. يتم تمويل البحث في مختبر المؤلفين من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (GM120451 و CA284362). تم إنشاء الشكل 2 والشكل 4 باستخدام Biorender.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فوسفات ثنائي الصوديومفيشر7558-79-4Na2HPO4 - فوسفات الصوديوم لامائي الأساسي. يمكن استخدام حالات ترطيب أخرى ولكن تغير الوزن الجزيئي
الملقط: دومونت #5 ملقط بيولوجيأدوات العلوم الدقيقة11252-20الأسلوب: #5
           شكل الطرف: مستقيم
               الطول: 11 سم
           خزنة الأوتوكلاف: نعم
           نصائح: علم الأحياء
           أبعاد النصيحة:
         0.05 × 0.02مم
           سبيكة / المادة: إينوكس
الفورمالديهايدفيشرBP531-500درجة علم الأحياء الجزيئي، 37٪ فورمالديهايد. 500 مل
تثبيت الفورمالديهايدفيشرBP531-5003.7٪ فورمالديهيد في محلول فوسفات الصوديوم pH7.2 بمقدار 0.1 مليون مصنوع عن التخفيف من مخزون 37٪.
الجلسرولكواشف فيشر الحيويةBP229-1
آيستفضيل المستخدم
إل-ليسين، 98٪العلم الحراريJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-sإنتر-بيتا جالاكتوسيداز
أنابيب الطرد المركزي الدقيقالولايات المتحدة العلمية1615-5520أنابيب بسعة 1.5 مل لتخزين العينات.
مقص التشريح الدقيقأدوات العلوم الدقيقة15003-08حافة قطع 5 مم، طرف مستقيم، 8.5 سم
فوسفات أحادية الصوديومفيشر7558-80-7NaH2PO4 - فوسفات الصوديوم أحادي الأساس اللامائي. إذا استخدمت الشكل المرطب، فإن الوزن اللازم لصنع محلول 0.1 متر سيتغير.
وسيط التركيبمحلول الجليسرول بنسبة 75٪ في محلول فوسفات الصوديوم بدرجة pH7.2 بتركيز 0.1M مع 2.5٪ n-بروبيل جالات. اخلط بالعكس لتقليل الفقاعات.
NSG0.1 مليون محلول فوسفات الصوديوم pH 7.2، 0.1٪ سابونين، 5٪ NGS
جالات N-بروبيلMP Biomedicals210274780
طلاء الأظافرتيد بيلا، تم شراؤه من فيشرNC0381432لإغلاق الشرائح
حامل الإبرفيشرNC0099380لإبر التشريح الدقيق. فولاذ أجوف؛ طول المقبض: 4 3/4" طوله
صينية نيونك ميكروويل الصغيرةثيرمو ساينتفيك12565155MicroWell MiniTray للتطبيقات المصلية. العد 60
بارافيلممختبر الإحصاءPM996فيلم StatLab ParaFilm M المرن ذاتيا الإغلاق
بارافورمالديهايدبوليساينسز، إنك.00380-250
10 مرات PBSتفضيل المستخدمحضر 800 مل من الماء المقطر في وعاء مناسب.
           أضف 1.37 مليون من كلوريد الصوديوم إلى المحلول.
             أضف 26.8 ملليمو من كلوريد البوتاسيوم إلى المحلول.
             أضف 101 ملليمولار من فوسفات الصوديوم ثنائي البازي إلى المحلول.
         أضف 18.0 ملليمول من فوسفات البوتاسيوم مونوبيسيكي إلى المحلول.
         قم بضبط المحلول حسب الرقم الهيدروجيني المطلوب (عادة pH وasymp؛ 7.4).
           أضف الماء المقطر حتى يصبح الحجم 1 لتر.
PBTتفضيل المستخدم0.1 مليون محلول فوسفات الصوديوم pH 7.2، 0.1٪ ألبومين مصل البقري، و0.2٪ ترايتون X-100.
PDTتفضيل المستخدم0.1M من محلول فوسفات الصوديوم (pH = 7.2)، 0.3٪ ديوكسيكولات، و0.3٪ ترايتون x-100
بيتري ديشفالكونكورنينج 351007بيتري ديش؛ 60 ملم؛ غير معالج
بيتري ديشفالكونكورنينج 351008بيتري ديش؛ 35 ملم؛ غير معالج
كماشةتفضيل المستخدم
PLPلا يوجد2٪ بارافورمالديهايد، 1.35٪ ليسين في محلول فوسفات الصوديوم 0.05M pH7.2
الأجسام المضادة الثانويةجاكسون إيمينوريسيرش715-545-1510.5 ملغ أليكسا فلور 488 حمار مضاد للفأر IgG.
أغطية الشرائحVWR48393-172VWR Coverglass #1.5 22x40 (الهيكل)
الشرائحفيشر125442شرائح زجاج فيشر 10bx/CS
ديوكسولات الصوديومعلوم الديناميكا الحرارية89904منظف الصوديوم ديوكسولات؛ 5 ملغ
دورة الصوديومسيغما ألدريتش71859-25Gالصوديوم بريديت – 25 جرام
مخزن فوسفات الصوديوم0.1 ميغاوات في ذاكرة NaPO4 pH 7.2. اخلط 28 مل من مخزون فوسفات أحادية الصوديوم 0.1 مليون (11.998 جرام NaH2PO4 إلى 1 لتر من الماء المقطر) مع 72 مل من مخزون فوسفات ثنائي الصوديوم الخالي من الماء 0.1M (14.196 جرام Na2HPO4 إلى 1 لتر من الماء المقطر) لتوليد 100 مل من محلول نفاذي 0.1 مليون من محلول NaPO4. بدلا من ذلك، يمكن استخدام PBS.
سلك التنغستنتيد بيلا27-11.005" ديا.
ترايتون X-100علوم الديناميكا الحراريةA16046AE
الدوامةتفضيل المستخدم

المراجع

  1. Bate, M., Martinez Arias, A. The development of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. 747-841 (1993).
  2. Tripathi, B. K., Irvine, K. D. The wing imaginal disc. Genetics. 220 (4), iyac020(2022).
  3. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  4. Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
  5. Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
  6. Held, L. I. J. Imaginal discs: The genetic and cellular logic of pattern formation. , Cambridge University Press. (2002).
  7. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Developmental Biology. 120, 366-376 (1987).
  8. Rubin lab methods book. , Wellcome Collection. https://wellcomecollection.org/works/u7msrkak (1990).
  9. Rubin lab manual. , The Rubin Lab. https://www.yumpu.com/en/document/view/12357776/rubin-lab-manual-jfly-home-page (1990).
  10. Mitchison, T. J., Sedat, J. Localization of antigenic determinants in whole Drosophila embryos. Dev Biol. 99 (1), 261-264 (1983).
  11. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  12. Mclean, I. W., Nakane, P. K. Periodate-lysine-paraform-aldehyde fixative a new fixative for immunoelectron microscopy. J. Histochem. Cytochem. 22, 1108-1077 (1974).
  13. Jarman, A. P., Grell, E. H., Ackerman, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Atonal is the proneural gene for Drosophila photoreceptors. Nature. 369, 398-400 (1994).
  14. Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Tie-dye: A combinatorial marking system to visualize and genetically manipulate clones during development in Drosophila melanogaster. Development. 140 (15), 3275-3284 (2013).
  15. Blanco, J., Cooper, J. C., Baker, N. E. Roles of c/ebp class bzip proteins in the growth and cell competition of rp ('minute') mutants in Drosophila. Elife. 9, e50535(2020).
  16. Jennings, B., Preiss, A., Delidakis, C., Bray, S. The notch signalling pathway is required for enhancer of split bhlh protein expression during neurogenesis in the Drosophila embryo. Development. 120 (12), 3537-3548 (1994).
  17. Kiparaki, M., Baker, N. E. Protocol for assessing translation in living Drosophila imaginal discs by o-propargyl-puromycin incorporation. STAR Protoc. 4 (4), 102653(2023).
  18. Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (91), e51792(2014).
  19. Yan, S. J., Li, W. X. Using Drosophila larval imaginal discs to study low-dose radiation-induced cell cycle arrest. Methods Mol Biol. 782, 93-103 (2011).
  20. Klein, T. Immunolabeling of imaginal discs. Methods Mol Biol. 420, 253-263 (2008).
  21. Phalle Bde, S. Immunostaining of whole-mount imaginal discs. Methods Mol Biol. 247, 373-387 (2004).
  22. Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and diagnosis of tumors in Drosophila imaginal disc epithelia. J Vis Exp. (125), e55901(2017).
  23. Brown, N. L. Confocal microscopy methods and protocols. Methods in molecular biology. Paddow, S. W. , Humana Press. 75-91 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

60

مقالات ذات صلة