يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

التأثير التنظيمي للموكسيبوسشن على استقطاب وهجرة البلاعم في فئران نموذج الروماتويديوم ودور TIM-3

175 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70436

⸱

مارس 27, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تفحص هذه الدراسة التأثيرات التنظيمية للموكسيبوستن على استقطاب وهجرة البلعم في نماذج الفئران لالتهاب المفاصل الروماتويدي، مع التركيز على دور الغلوبولين المناعي في الخلايا التائية والبروتين 3 المحتوي على مجال الموسين (TIM-3)، في توضيح الآليات العلاجية للموكسيبوسشن في هذا المرض.

الملخص

هدفت هذه الدراسة إلى دراسة التأثيرات التنظيمية للموكسيبوستن على استقطاب وهجرة البلاعم في نموذج الفئران لالتهاب المفاصل الروماتويدي، بالإضافة إلى دور الغلوبولين المناعي في الخلايا التائية والبروتين 3 المحتوي على مجال المخاط (TIM-3) في هذه العملية. في اليوم الأول من التجربة، تم تقسيم فئران سبراج-داولي (SD) إلى خمس مجموعات. تم حقن مساعد فرويند الكامل (CFA) في وسادات القدم الخلفية لتأسيس نموذج التهاب المفاصل الروماتويدي. بالإضافة إلى ذلك، تم حقن تداخل LV-Havcr2-RNAi المصنوع من فيروس العدس في وسادات القدم الخلفية لتثبيط تعبير TIM-3. ابتداء من اليوم السابع، خضعت الفئران لعلاج التوكسيبوسشن على دورات تتكون من ستة أيام من العلاج ويوم راحة واحد، ليصبح المجموع ثلاث دورات كاملة. بعد الانتهاء من علاج العضلات، تم تقييم الحالة الالتهابية من خلال التحليل النسيجي وقياس سمك الأفظ. تم تقييم العلامات الظاهرية للبلاعم M1 وM2 بواسطة اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) والفلورة المناعية. تم اكتشاف تعبير TIM-3 عبر تفاعل بوليميراز متسلسل كمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ونقطة ويسترن. علاوة على ذلك، تم عزل البلاعم المفرزة الصهارية (PEMs) من فئران SD إضافية، وتم فحص هجرة البلعم باستخدام اختبار ترانسويل. وجدت الدراسة أنه بعد حقن CFA، أظهرت الفئران احمرارا وتورما ملحوظين في الأقدام، إلى جانب خلل في التعبير عن النمط الظاهري للبلاعمية. بالإضافة إلى ذلك، كشفت اختبارات الهجرة عبر الترانسويل أن فئران النماذج المستحثة ب CFA أظهرت زيادة في هجرة البلاعم مقارنة بالعينات الضابطة. ومع ذلك، خفف علاج التوكسيبوسشن من هذه التغيرات. كما أظهرت النتائج أن التوكسيبوسشن زاد من تعبير TIM-3، وبعد التدخل الفيروسي العدسي، انخفضت مستويات TIM-3 بشكل ملحوظ، مما أدى إلى تفاقم المظاهر الالتهابية واختلال توازن البلعميات. تشير هذه النتائج إلى أن TIM-3 يعمل كوسيط رئيسي في تنظيم استقطاب وهجرة البلعم في التوكسيبوستن.

المقدمة

التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو اضطراب مناعية ذاتي جهازي شائع يظهر سريريا مع التهاب التهاب متماثل. يستهدف الالتهاب بشكل أساسي الغشاء الزليلي والغضرويف والعظم، مما يؤدي إلى تدمير الأنسجة وينتهي بتشوه لا رجعة فيه في المفاصل1. تعتمد الإدارة الدوائية الحالية لالتهاب المفاصل الروماتويدي بشكل أساسي على أدوية مضادة للروماتيزم المعدلة للمرض (DMARDs)2، والتي غالبا ما تتطلب الإعطاء مدى الحياة. ومع ذلك، ترتبط هذه العوامل العلاجية بآثار جانبية متنوعة. وبالتالي، يسعى عدد كبير من المرضى إلى علاجات تكميلية آمنة وفعالة لتخفيف الأعراض السريرية وربما تقليل اعتمادهم على الأنظمة الدوائية التقليدية. وباعتباره عنصرا أساسيا في الطب الصيني التقليدي، قد يكون التوكسيبوسشن علاجا تكميلا واعدا لالتهاب المفاصل الروماتويدي. يمارس تأثيره العلاجي من خلال آليات مضادة للالتهاب وتعديل المناعة الجهازية3. تشير الأدلة إلى أن العضلة يمكن أن تخفف الأعراض وتحمي هياكل المفاصل4. علاوة على ذلك، مقارنة بسمية الكبد المحتملة، ومخاطر العدوى، والتكاليف العالية المرتبطة بدواء DMARDs، يوفر التوكسيبوسشن أمانا أفضل وتكلفة أقل. ومع ذلك، فإن المقاومة المقاومة ليست علاجا سحريا ولا يمكن أن تحل محل DMARDs لإدارة التهاب المفاصل الروماتويدي بالكامل. عادة ما يتطلب العلاج العضلي جلسات علاجية متكررة وطويلة الأمد لتحقيق تأثيراته. خلال التفاقم الحاد لالتهاب المفاصل الروماتويدي، قد لا يوفر السيطرة السريعة على الأعراض. علاوة على ذلك، تعتمد النتيجة العلاجية للموكسيبوسشن بشكل كبير على مهارة وخبرة الممارس، مما يسبب تفاوتا. وبالتالي، يجب النظر في دمج التوكسيبوستن مع DMARDs لتحقيق تأثير تآزري "فعالية معززة مع تقليل السمية"، مما يجعله استراتيجية قابلة للتطبيق لإدارة RA5 على المدى الطويل.

على الرغم من أن العديد من الدراسات أكدت فعالية الدواء العلاجي للروماتيوبوستنفي الحمض النووي الروماتويدي 6,7,8، إلا أن آلياته الدقيقة لتأثيره لا تزال غير واضحة. تبحث هذه الدراسة في تأثيرات التوكسيبوستن على استقطاب وهجرة البلاعم في الحمض النووي الروماتويدي، باستخدام الغلوبولين المناعي في الخلايا التائية والبروتين 3 المحتوي على مجال الموسين (TIM-3) كنقطة دخول آلية. تم تصميم هذا النهج لتوضيح مسار تعديل مناعي محتمل يمارس من خلاله تأثير الماكسيبوستن مضادا لالتهاب المفاصل.

باعتبارها خلايا مناعية محورية، تلعب البلاعم دورا مركزيا في التسبب وتقدم حمض روماتويك 9,10. عند بداية الالتهاب، تفرز البلعم المقيمة في الأنسجة مجموعة متنوعة من السيتوكينات والكيميائيات. تعمل هذه الجزيئات الإشارة على الخلايا البطانية الوعائية، مما يعزز تمايز الخلايا الأحادية المنتشرة إلى بلاعم ثم تجنيدها لاحقا إلى الأنسجة الملتهبة11,12. تزيد هذه البلاعم المتسللة من الاستجابة الالتهابية من خلال إنتاج وسطاء إضافيين، مما يؤدي بدوره إلى تجنيد المزيد من البلاعم وتفاقم تسرب الأنسجة، مما يخلق دائرة مفرغة من الالتهاب وتسلل الأنسجة.

اعتمادا على المنبهات البيئية، تظهر البلاعم مرونة كبيرة من خلال الاستقطاب إلى أنماط وظيفية مميزة، خاصة حالات M1 (المنشطة كلاسيكيا) وM2 (المنشطة بديلة)13. في الظروف الفسيولوجية، يحافظ استقطاب البلاعم على توازن ديناميكي بين الأنماط الظاهرية M1 وM2. ومع ذلك، في التهاب المفيدوس الروماتويدي الروماتويدي، يتم اضطراب هذا التوازن، ويتميز بزيادة استقطاب M1 مع زيادة إطلاق وسطاء مؤيدة للالتهابات، بما في ذلك الإنترفيرون (IFN)-γ وسينثاز أكسيد النيتريك المحفز (iNOS)، مما يزيد من استجابات الالتهاب. في الوقت نفسه، يضعف استقطاب M2، مصحوبا بانخفاض في إطلاق العوامل المضادة للالتهابات، بما في ذلك الإنترلوكين (IL)-4 وCD206، مما يؤثر على قدرتها على تثبيط تنشيط وتكاثر الخلايا التائية، مما يزيد من تطور المرض14. كشفت عدة تحقيقات أن تعديل توازن البلعم M1/M2 قد يخفف من تقدم الروماتويديا15,16.

يعرف TIM-3 كجليكوبروتين سطحي للخلايا التائية، ويعبر عنه على نطاق واسع على طيف من خلايا المناعة، بما في ذلك الخلايا التائية، والبلاعميات، والخلايا القاتلة الطبيعية، حيث يرتبط بروابط محددة لممارسة وظائف تنظيمية مناعية17. تؤثر إشارات TIM-3 بشكل حاسم على تعبير السيتوكين الالتهابي في البلعم واستقطابها. ومن الجدير بالذكر أن TIM-3 يعبر عنه بشكل كبير على البلاعم M2، حيث يعزز النمط الظاهري M2 مع كبح النمط الظاهري ل M1. وعلى العكس، تشير الأبحاث إلى أن تثبيط TIM-3 ينتج تأثيرا معاكسا، حيث يدفع استقطاب M1 ويخفف استقطاب M2 18,19,20. بالإضافة إلى ذلك، تبرز الأدلة TIM-3 كمنظم رئيسي لسلوك هجرة البلاعم21,22. لذلك، يظهر التدخل العلاجي الذي يستهدف TIM-3 للتحكم في استقطاب البلاعم وديناميكيات هجرة الروماتيود واعدا كبيرا كاستراتيجية علاجية لالتهاب المفاصل الروماتويدي.

استنادا إلى المنطق المذكور أعلاه، أجريت هذه الدراسة للمساهمة في تزايد المعرفة حول الآليات التي يمارس بها الموكسيبوسشن تأثيراته العلاجية في التهاب المفيدوس الروماتويدي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان أخلاقي واحتياطات السلامة
تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات في جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (2024029). خلال جميع إجراءات الحقن، بما في ذلك إعطاء CFA وفيروسات العدس، يجب على المشغلين ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) التي تتكون من قفازات ذات استخدام مرة واحدة، ونظارات واقية، ومعاطف مختبرية. يجب أن تجرى هذه الإجراءات داخل خزانة سلامة حيوية أو بيئة جيدة التهوية. يجب التخلص من جميع الشوائب الحادة التي تلامست مع المواد الكيميائية فورا في حاويات مخصصة للمواد الحادة. خلال علاج التوكسيبوستين، راقب المشغل عن كثب استجابة الحيوان. تم استبدال مخروط الموكسا بسرعة لمنع الإصابة الحرارية بالجلد. علاوة على ذلك، يجب الحفاظ على المواد القابلة للاشتعال بعيدا عن الموكسا المحترق للقضاء على مخاطر الحريق.

1. تأسيس نموذج RA

تم تقسيم ثلاثين ذكرا من جرذ SD (الوزن: 200 ± 20 جرام)، بعمر ستة أسابيع (رقم الترخيص: SCXK 2020-030)، عشوائيا إلى خمس مجموعات (n = 6): مجموعة الضابطة، مجموعة نموذج الروماتويديا (مجموعة الروماتويد)، مجموعة علاج الروماتيون + الحقن الروماتويدي (مجموعة موكس)، مجموعة تداخل فيروس العدس الروماتويدي الروماتويدي + TIM-3 (مجموعة RA + TIM-3)، ومجموعة تداخل فيروس العدس RA + TIM-3 + مجموعة العلاج بالتدخين (RA + TIM-3– + مجموعة Mox). قبل التجربة، كانت الفئران تتكيف مع البيئة لمدة سبعة أيام في بيئة محكمة بدرجة حرارة تتراوح بين 22–24 درجة مئوية، ورطوبة 20٪، ودورة طبيعية من الضوء والظلام، مع إمكانية الوصول المجاني للطعام والماء. في اليوم الثالث والعشرين من التجربة، تم شراء خمسة فئران SD ذكور إضافية تبلغ من العمر ثلاثة أسابيع من نفس الشركة. تم تأقلم هذه الفئران لمدة خمسة أيام تحت ظروف سكن متطابقة قبل استخدامها لاستخراج PEM. يظهر مخطط تخطيطي يلخص الإجراء التجريبي والصور الإجرائية الممثلة في الشكل 1.

في اليوم الأول من التجربة، تم حقن 0.5 مل/كجم من CFA في وسادات الأقدام الخلفية لجميع الفئران باستثناء المجموعة الضابطة لتحفيز التهاب المفاصل الروماتويدي. تم إعطاء نفس كمية المحلول الملحي في نفس الموقع في فئران مجموعة الضابطة. تم استخدام سمك الأقدام كمعيار لتقييم نجاح تأسيس نموذج RA23.

2. حقن اللينتيفيروس

تلقت الفئران في مجموعات RA + TIM-3- و RA + TIM-3- + Mox حقن LV-Havcr2-RNAi (94435-1) في وسادات الأقدام الخلفية (3.5 × 107 TU/mL؛ 10 ميكرولتر لكل وسادة) في اليوم الأول من التجربة. جميع الفئران الأخرى تلقت حقن متطابقة من المحلول الملحي الطبيعي في نفس الموقع التشريحي24.

3. التحرك الكهربائي

في اليوم السابع من التجربة، تلقت الفئران في مجموعتي Mox و RA + TIM-3- + Mox علاج التوكسيباستين. لتسهيل الإجراء، تم حلق الشعر ضمن منطقة تقريبية بين 1 × 1 سم حول نقاط الوخز BL23 وST36 (وقد تم إجراء هذا الإجراء أيضا للفئران في المجموعات المتبقية). خلال التوكسيبوسشن، كان يثبت كل فأر بلطف على كتلة خشبية أكبر قليلا من حجم جسمه باستخدام شريطين مطاطيين لكشف مناطق العلاج بالكامل (وكانت الفئران في مجموعات أخرى مقيدة بنفس الطريقة). لاحقا، تم تطبيق مخاريط موكسا على شكل حبيبات على كلا نقطتي الإبر. لضمان اتساق التحفيز الحراري بين الأفراد، تم تحضير كل مخروط موكسا (القطر: 2 مم؛ الارتفاع: 5 مم؛ محتوى صوف الموكسا: 60٪) من كمية موحدة من صوف الموكسا بمقدار 5 ملغ فقط. كل يوم، يتم تطبيق خمسة مخاريط على نقطتي الإبرة على جانب واحد من الجسم، مع تناوب العلاج على الجانب المقابل في اليوم التالي. تم الحفاظ على هذا البروتوكول العلاجي المتناوب لمدة ثلاثة أسابيع، مع فترة راحة لمدة يوم واحد كل سبعة أيام.

بعد ثلاث دورات من علاج التوكسيبوستين، تم تخدير الفئران باستخدام الإيزوفلوران (4٪ تحفيز، 2٪ صيانة، استنشاق)، وتم جمع 5 مل من الدم الشرياني من الشريان الأورطي البطني. بعد الطرد المركزي (2000 × جم، 15 دقيقة، 4 درجات مئوية)، ينقل المصل الفائق إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق ويخزن عند −20 درجة مئوية. بعد أخذ عينات الدم، تم القتل الرحيم للفئران بسبب خلع عنق الرحم. تم تشريح مفاصل الكاحل بعناية وتثبيتها في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪. تم تجميد الأنسجة الزلية والطحال بسرعة باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها عند −80 درجة مئوية.

4. قياس سمك مخلب الجرذ

تم تمييز منتصف أقدام الفئران الخلفية بقلم ماء لضمان تحديد موضع قياسي متسق. تم قياس سمك الأرجل باستخدام مقابض فيرنييه قبل النمذجة، وبعد النمذجة الناجحة، وبين كل دورة علاج (في الأيام 0، 7، 14، 21، و28 من التجربة).

5. التحليل النسيجي

بعد التثبيت في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪، وضعت مفاصل كاحل الفئران في أنابيب طرد مركزي تحتوي على كمية كبيرة من محلول إزالة الكالسية (حمض الفورميك 10٪). تم تركيب الأنابيب على جهاز هزاز وخضوع لتحريك خفيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ساعة. خلال هذه الفترة، تم استبدال محلول إزالة الكالسية على فترات منتظمة، وتمت مراقبة حالة الأنسجة لمنع الإفراط في إزالة الكالسية. بعد ذلك، تم نقل الأنسجة إلى محلول ثيوسلفات الصوديوم بنسبة 5٪ للتعادلها لمدة 6 ساعات، تلاها شطف شامل لمدة 4 ساعات تحت ماء الصنبور الجاري25 ساعات. ثم تم تجفيف الأنسجة ووضعها في كتل البارافين. تم قطع المقاطع عرضيا بسماكة 5 ميكرومتر. بعد إزالة البارافين والترطيب، تم صبغ الأجزاء بالهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق، ثم شطفت بالماء، ثم تم تمييزها لفترة وجيزة (5 ثوان)، ثم شطفت مرة أخرى، ثم تم تلوينها بالبلوق لمدة 5 ثوان، تلتها شطف كامل تحت ماء الصنبور الجاري. بعد ذلك، تم تجفيف المقاطع بإيثانول بنسبة 95٪ لمدة دقيقة واحدة وصبغها بالإيوزين لمدة 15 ثانية. وأخيرا، تم تجفيف الأقسام وتنظيفها وتركيبها بغطاء للمراقبة تحت المجهر الخفيف. مع هذا التلوين، ظهرت النوى زرقاء، بينما ظهرت السيتوبلازم وألياف الكولاجين وخلايا الدم الحمراء بدرجات مختلفة من اللون الوردي؛ عادة ما تكون الطبقة المكيراتينية مصبوغة باللون الأحمر الفاقع.

6. إليسا

وفقا لبروتوكول المصنع، تمت إضافة 100 ميكرولتر من كل عينة مصل (مخففة مسبقا بنسبة 1:2) إلى الآبار المخصصة. تم تضمين آبار فارغة وقياسية بالتوازي. بعد الختم، تم حضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد خطوة الغسيل، أضيف الجسم المضاد للكشف وحضنته عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد غسل آخر، أضيف الترافق ستريبتافيدين–HRP. بعد الغسل الشامل، أضيف محلول الركيزة لتطوير اللون، والذي تم إيقافه بإضافة محلول التوقف. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر (OD₄₅₀). تم تحديد تركيزات عينات IL-4 و IFN-γ بواسطة الاستيفاء من المنحنى القياسي، وتم حساب التركيزات النهائية بضربها في عامل التخفيف المعني.

7. qRT-PCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من عينات المصل باستخدام كاشف تريزول وفقا لبروتوكول معدل. باختصار، تم تجانس 100 ميكرولتر من المصل مع 1 مل من كاشف ترايزول عن طريق التوصيل القوي. بعد ذلك، أضيف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم، وهز الخليط بقوة لمدة 15 ثانية، تلاها حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. ثم تم طرد العينة بحرارة 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتحقيق فصل الطور. تم نقل الطور المائي العلوي بعناية إلى أنبوب جديد، خلط ب 0.5 مل من الأيزوبروبانول، وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. لاحقا، تم تفريغ إجمالي الحمض النووي الريبي بواسطة الطرد المركزي بقوة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم غسل حبيبات RNA الناتجة مرة واحدة مع 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ (الطرد المركزي عند 8,000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) وجففها في الهواء قبل الذوبان النهائي. خضع الحمض النووي الريبي الموصول لنسخ عكسي باستخدام مجموعة تخليق cDNA. تم إجراء تحليل التعبير الجيني بواسطة qRT-PCR باستخدام برنامج نظام PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تم استخدام β-أكتين كجين للتنظيف المنزلي لتطبيع الجسم. تم حساب التعبير النسبي لmRNA في TIM-3 باستخدام طريقة 2−ΔΔCt . تمت إضافة تفاصيل البادئات في الجدول 1.

8. البقعة الغربية

تم غسل الطحال المستخرج ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات مبرد مسبقا (PBS)، ثم قطع إلى قطع صغيرة، ثم تم تحلله بإضافة حاجز تحلل بحجم أكبر بعشرة أضعاف حجم النسيج. تم إجراء التجانس باستخدام أنبوب التجانس. تم وضع الهوموجين على الثلج لمدة 30 دقيقة للتحلل، مع خمس إلى ست جولات من الدوامة لضمان تعطيل كامل للأنسجة. تم طرد العينات على حرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم جمع المادة الفائقة كمستخلص البروتين الكلي. تم قياس تركيزات البروتين المستهدف باستخدام اختبار حمض البيسينشونينيك (BCA) وفقا لبروتوكول KIT.

بعد الفصل بواسطة 10٪ من الرحلان الكهربائي الهلام الدوديسيل كبريت-بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS–PAGE)، تم نقل عينات البروتين المستخرجة إلى غشاء بولي فينيليدين ثنائي فلوريد (PVDF). تم حجب الغشاء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بتريس يحتوي على Tween 20 (TBST) مع إضافة حليب خالي الدسم بنسبة 5٪، تلاها حضانة ليلية عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية. بعد الغسل الشامل، تم حضنة الغشاء بأجسام مضادة ثانوية متقاربة من بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. وأخيرا، تم التقاط الصور باستخدام نظام تصوير كيميائي للضوء وتحليلها للكشف عن شدة التدرج الرمادي باستخدام برنامج تحليل ChemiScope. تفاصيل الأجسام المضادة الأولية والثانوية مدرجة في الجدول 1.

9. كشف التألق المناعي

تم غمر النسيج الزيلي المستخرج في 4٪ بارافورمالديهايد، وتجفيفه، وغرس في البارافين قبل تقطيعه إلى شرائح بسماكة 5 ميكرومتر. تم إزالة الشمع من الأقسام بشكل متسلسل في الزيلين I وXYLEN II وXYLEN III (10 دقائق لكل منها)، تلتها ثلاث غسلات بالإيثانول المطلق (5 دقائق لكل منها) وشطف نهائي بالماء المقطر.

بعد استرجاع المستضدات في حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)، تم غسل الشرائح ثلاث مرات في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (5 دقائق لكل منها) مع تحريك لطيف. ثم تم حجب الأقسام بالحضانة باستخدام ألبومين مصل البقري بنسبة 3٪ (BSA) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحصب، تم تطبيق الأجسام المضادة الأولية، بما في ذلك إنزيم أكسيد النيتريك المضاد التحفيزي (iNOS) (1:500) ومضاد CD206 (1:400)، وحضانته عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.

بعد ثلاث غسلات PBS لمدة 5 دقائق، تم حضن الأقسام لمدة 50 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام باستخدام جسم مضاد ثانوي (مضاد للأرانب Cy3 IgG، 1:300). تم إجراء التلوين النووي بغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS (5 دقائق لكل غسل)، تلتها معالجة محلول تلوين 4′,6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI) وحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم فحص الصور تحت مجهر فلوري.

10. عزل PEMs

بعد القتل الرحيم الناتج عن خلع عنق الرحم، تم تعقيم الفئران بإيثانول بنسبة 75٪ لمدة 10 دقائق ونقلها إلى خزانة أمان بيولوجي معقمة. تم شق جلد البطن بمقص معقم، تلاها حقن داخل الصفاق بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام حقنة. تم تدليك البطن بلطف قبل أن يتم سحب السائل البريتوني مرة أخرى إلى الحقنة ونقله إلى أنابيب الطرد المركزي للحصول على تعليق البلعمية.

تم غسل تعليق الخلية ثلاث مرات باستخدام PBS قبل أن يتم زراعته في وسط Eagle المعدل (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS). تم زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة في جو رطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. تم تحديد الخلايا الملتصقة التي تم الحصول عليها بعد فترة الحضانة هذه على أنها بلاعمية.

11. ترانسويل

تم إجراء اختبار الهجرة باستخدام ألواح بسعة 24 بئرا. بعد 24 ساعة من فقدان المصل، أضيفت 4 × 104 بلاعميات في 300 ميكرولتر من DMEM مع 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) و1٪ مضادات حيوية (50 U/mL بنسلين، 50 ميكروغرام/ملتر ستريبتومايسين) إلى الحجرة العلوية، بينما تم إدخال 700 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS و1٪ مضاد حيوي إلى الحجرة السفلية. تمت معالجة الخلايا مسبقا بمصل من مجموعات فئران مختلفة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، تم حضن الألواح عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في بيئة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد التلوين البنفسجي البلور، تم مسح الغرفة العلوية لإزالة الخلايا غير المهاجرة. تم قياس الخلايا المهاجرة عن طريق العد اليدوي عبر أربعة مجالات رؤية مختارة عشوائيا تحت المجهر البصري.

12. التحليل الإحصائي

تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام SPSS الإصدار 25.0. تم اختبار مجموعات البيانات أولا للكشف عن طبيعية وتجانس التباينات. عندما تم تحقيق هذه الافتراضات المعلمية، أجريت مقارنات بين المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تليه تحليل الفرق الأقل دلالة (LSD) بعد الحدث. بالنسبة للبيانات التي تنتهك هذه الافتراضات، تم تطبيق اختبار كروسكال–واليس غير المباراتي، تلاه اختبارات مان–ويتني U مع تصحيح مناسب للمقارنات المتعددة. تم التعبير عن جميع القيم كمتوسط ± انحراف معياري، واعتبر P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

توفر البيانات
البيانات الخام التي تم إنشاؤها خلال الدراسة الحالية متاحة في مستودع فيجشير (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31550197)

علم الأمراض المفاصل وسمك الكف في الفئران بعد علاج التوكسيبوسشن
ظهرت تورم واضح في مخالب واحمرار في الفئران التي حقنتها ب CFA. أظهرت صبغات الهيماتوكسيلين والإيوزين أن مجموعة الضابط أظهرت بنية مفاصل سليمة مع نسيج زليلي أملس ومنظم جيدا دون وج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعتمد الإدارة الحالية لتحليل الروماتويدز بشكل رئيسي على أنظمة DMARDs. ومع ذلك، غالبا ما تكون هذه العوامل الدوائية مكلفة جدا وترتبط بآثار جانبية لا يمكن تجاهلها، بما في ذلك ضعف الكبد البدائي والعدوىالشديدة، مما يفرض عبئا كبيرا على الأفراد وأنظمة الرعاية الصحية. على النقيض من ذلك، كعلاج خارجي، يظهر التوكسيبوستن ملف أمان إيجابي مع خطر طفيف من السمية الجهازية. تقنيته بسيطة نسبيا، مما يسمح بإمكانية الإدارة الذاتية للمرضى بعد التدريب المناسب. يمكن أن يعزز هذا الجانب من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82374587) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة سيتشوان (المنحة رقم 2024NSFSC2113). نشكر جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي على توفير مرافق المختبرات والدعم الفني. شكر خاص لمدرسة الوخز بالإبر ومدرسة توينا على إرشادهم في بروتوكولات التوكسيبوستين. كما نشكر فريق رعاية الحيوانات على مساعدتهم في صيانة نماذج الفئران. وأخيرا، نعبر عن تقديرنا لجميع الزملاء الذين ساهموا في التحليلات النسيجة والجزيئية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فروند الكامل مساعد (CFA)سيغما-ألدرتشF5881يستخدم لتحفيز نموذج التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) في الفئران
لينتي فيروس (TIM-3 RNAi)جينكيم للتكنولوجيا الحيوية، شنغهاي3.5&00; 107 TU/mLيستخدم لإسكات تعبير جين TIM-3
مخاريط موكسا (بحجم القمح)مورد الطب الصيني التقليديلا يوجديستخدم للاحتراق الكهربائي عند نقاط BL23 وST36

المراجع

  1. Gravallese, E. M., Firestein, G. S. Rheumatoid Arthritis - Common Origins, Divergent Mechanisms. N Engl J Med. 388 (6), 529-542 (2023).
  2. Di Matteo, A., Bathon, J. M., Emery, P. Rheumatoid arthritis. Lancet. 402 (10416), 2019-2033 (2023).
  3. Hao, F., et al. Effect of moxibustion on autophagy and the inflammatory response of synovial cells in rheumatoid arthritis model rat. J Tradit Chin Med. 42 (1), 73-82 (2022).
  4. Chen, Y., et al. Moxibustion of Zusanli (ST36) and Shenshu (BL23) Alleviates Cartilage Degradation through RANKL/OPG Signaling in a Rabbit Model of Rheumatoid Arthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2019, 6436420(2019).
  5. Shang, J., et al. The efficacy and safety of warming acupuncture and moxibustion on rheumatoid arthritis: A protocol for a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (34), e21857(2020).
  6. Gong, Y., et al. Effect of Moxibustion on HIF-1α and VEGF Levels in Patients with Rheumatoid Arthritis. Pain Res Manag. 2019, 4705247(2019).
  7. Liao, C., et al. The Effects and Potential Mechanisms of Moxibustion for Rheumatoid Arthritis-Related Pain A Randomized, Controlled Trial. J Pain Res. 16, 1739-1749 (2023).
  8. Tao, S., et al. The Efficacy of Moxibustion on the Serum Levels of CXCL1 and β-EP in Patients with Rheumatoid Arthritis. Pain Res Manag. 2021, 7466313(2021).
  9. Zheng, Y., et al. Macrophage polarization in rheumatoid arthritis: signaling pathways, metabolic reprogramming, and crosstalk with synovial fibroblasts. Front Immunol. 15, 1394108(2024).
  10. Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages in joint homeostasis, rheumatoid arthritis and disease remission. Nat Rev Rheumatol. 18 (7), 384-397 (2022).
  11. Kemble, S., Croft, A. P. Critical Role of Synovial Tissue-Resident Macrophage and Fibroblast Subsets in the Persistence of Joint Inflammation. Front Immunol. 12, 715894(2021).
  12. Huang, Q. Q., et al. Critical role of synovial tissue-resident macrophage niche in joint homeostasis and suppression of chronic inflammation. Sci Adv. 7 (2), eabd0515(2021).
  13. Mosser, D. M., Hamidzadeh, K., Goncalves, R. Macrophages and the maintenance of homeostasis. Cell Mol Immunol. 18 (3), 579-587 (2021).
  14. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: A systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  15. Liu, X., et al. KLF11 alleviates rheumatoid arthritis by regulating M1 macrophage polarization via downregulation of YAP1 expression. Arthritis Res Ther. 27 (1), 171(2025).
  16. Wen, Y., et al. Wuwei Ganlu and Myricetin alleviate rheumatoid arthritis by inhibiting M1 macrophage polarization through modulation of SHBG/SREBP1-mediated lipid metabolism. Phytomedicine. 146, 157167(2025).
  17. Zhao, L., Cheng, S., Fan, L., Zhang, B., Xu, S. TIM-3: An update on immunotherapy. Int Immunopharmacol. 99, 107933(2021).
  18. Du, X., et al. Increased Tim-3 expression alleviates liver injury by regulating macrophage activation in MCD-induced NASH mice. Cell Mol Immunol. 16 (11), 878-886 (2019).
  19. Ni, X., et al. Interrogating glioma-M2 macrophage interactions identifies Gal-9/Tim-3 as a viable target against PTEN-null glioblastoma. Sci Adv. 8 (27), eabl5165(2022).
  20. Yang, H., et al. Tim-3 aggravates podocyte injury in diabetic nephropathy by promoting macrophage activation via the NF-κB/TNF-α pathway. Mol Metab. 23, 24-36 (2019).
  21. Guo, Q., et al. Cancer cell intrinsic TIM-3 induces glioblastoma progression. iScience. 25 (11), 105329(2022).
  22. Li, G., et al. Peripheral Injection of Tim-3 Antibody Attenuates VSV Encephalitis by Enhancing MHC-I Presentation. Front Immunol. 12, 667478(2021).
  23. Haiyan, Z., et al. Efficacy of Moxa-burning heat stimulating Zusanli (ST36) and Shenshu (BL23) on expressions of macrophage migration inhibitory factor and macrophage apoptosis in rabbits with adjuvant-induced arthritis. J Tradit Chin Med. 42 (6), 980-987 (2022).
  24. Tang, Q., et al. RNAi Silencing of IL-1β and TNF-α in the Treatment of Post-traumatic Arthritis in Rabbits. Chem Biol Drug Des. 86 (6), 1466-1470 (2015).
  25. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  26. Miao, W., Yan, Z., Hui, Z., Hongfang, Z. Moxibustion enables protective effects on rheumatoid arthritis-induced myocardial injury transforming growth factor beta1 signaling and metabolic reprogramming. J Tradit Chin Med. 43 (6), 1190-1199 (2023).
  27. Tao, S. Y., et al. Moxibustion as an adjunctive treatment for rheumatoid arthritis and its effects on the serum levels of SOST and β-catenin. Zhongguo Zhen Jiu. 43 (12), 1384-1389 (2023).
  28. Hao, F., et al. [Effect of moxibustion on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in foot-pad synovium in rats with rheumatoid arthritis]. Zhongguo Zhen Jiu. 40 (11), 1211-1216 (2020).
  29. Zhong, Y. M., Zhang, L. L., Lu, W. T., Shang, Y. N., Zhou, H. Y. Moxibustion regulates the polarization of macrophages through the IL-4/STAT6 pathway in rheumatoid arthritis. Cytokine. 152, 155835(2022).
  30. Linlin, Z., et al. Moxibustion of Zusanli (ST36) and Shenshu (BL23) alleviates the inflammation of rheumatoid arthritis in rats through regulating macrophage migration inhibitory factor/glucocorticoids signaling. J Tradit Chin Med. 44 (2), 353-361 (2024).
  31. Zhu, L., et al. Effect of moxibustion at "Xinshu" (BL15) and "Feishu" (BL13) on expression of TRPV1 and CGRP in the myocardial tissue of chronic heart failure rats. Zhen Ci Yan Jiu. 49 (6), 551-557 (2024).
  32. Zhang, X. N., et al. Electroacupuncture and moxibustion-like stimulation activate the cutaneous and systemic hypothalamic-pituitary-adrenal axes in the rat. Acupunct Med. 40 (3), 232-240 (2022).
  33. Zhu, Y., et al. [Effect of moxibustion at "Zusanli"(ST36) and "Shenshu"(BL23) on miR-155-mediated TLR4/NF-κB signaling involving amelioration of synovitis in rheumatoid arthritis rats]. Zhen Ci Yan Jiu. 46 (3), 194-200 (2021).
  34. Wu, R., et al. Effects of Tim-3 silencing on the viability of fibroblast-like synoviocytes and lipopolysaccharide-induced inflammatory reactions. Exp Ther Med. 14 (3), 2721-2727 (2017).
  35. Nozaki, Y., et al. Inhibition of the TIM-1 and -3 signaling pathway ameliorates disease in a murine model of rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol. 218 (1), 55-64 (2024).
  36. Li, X., Zhao, Y. Q., Li, C. W., Yuan, F. L. T cell immunoglobulin-3 as a new therapeutic target for rheumatoid arthritis. Expert Opin Ther Targets. 16 (12), 1145-1149 (2012).
  37. Skejoe, C., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 3 is upregulated in rheumatoid arthritis, but insufficient in controlling inflammation. Am J Clin Exp Immunol. 11 (3), 34-44 (2022).
  38. Zhang, Y., et al. Tim-3 negatively regulates IL-12 expression by monocytes in HCV infection. PLoS One. 6 (5), e19664(2011).
  39. Kun, L., et al. Moxibustion inhibits the macrophage M1 polarization toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88/nuclear factor kappa B signaling pathway by regulating T-cell immunoglobulin and mucin-containing protein-3 in rheumatoid arthritis. J Tradit Chin Med. 44 (6), 1227-1235 (2024).
  40. Liu, X., et al. Tim-3 Regulates Tregs' Ability to Resolve the Inflammation and Proliferation of Acute Lung Injury by Modulating Macrophages Polarization. Shock. 50 (4), 455-464 (2018).
  41. Wang, F., et al. Overexpression of Tim-3 reduces Helicobacter pylori-associated inflammation through TLR4/NFκB signaling in vitro. Mol Med Rep. 15 (5), 3252-3258 (2017).
  42. Dixon, K. O., Lahore, G. F., Kuchroo, V. K. Beyond T cell exhaustion: TIM-3 regulation of myeloid cells. Sci Immunol. 9 (93), eadf2223(2024).
  43. Paul, S., Chhatar, S., Mishra, A., Lal, G. Natural killer T cell activation increases iNOS(+)CD206(-) M1 macrophage and controls the growth of solid tumor. J Immunother Cancer. 7 (1), 208(2019).
  44. Luo, M., Zhao, F., Cheng, H., Su, M., Wang, Y. Macrophage polarization: an important role in inflammatory diseases. Front Immunol. 15, 1352946(2024).
  45. Peng, Y., et al. Regulatory Mechanism of M1/M2 Macrophage Polarization in the Development of Autoimmune Diseases. Mediators Inflamm. 2023, 8821610(2023).
  46. Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-resident macrophages. Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).
  47. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  48. Chang, J. W., et al. Nesfatin-1 Stimulates CCL2-dependent Monocyte Migration And M1 Macrophage Polarization: Implications For Rheumatoid Arthritis Therapy. Int J Biol Sci. 19 (1), 281-293 (2023).
  49. Takayanagi, H. Osteoimmunology: shared mechanisms and crosstalk between the immune and bone systems. Nat Rev Immunol. 7 (4), 292-304 (2007).
  50. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Moxibustion TIM 3 Transwell ELISA Western Blot
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.