مقالة بحثية

عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية الغنية بالإكسوسومات من الخلايا الثديية المصابة بفيروس حمى الضنك من النوع الثاني

DOI:

10.3791/70437

⸱

مارس 27, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Medical Laboratory Science Program, Texas State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نصف عزل الحويصلات خارج الخلية الغنية بالإكسوسومات من السوبرناتانت المصاب بفيروس حمى الضنك من النوع الثاني، تليها توصيف سلامة الحويصلات وتوزيع حجمها، وتقييم عدم وجود فيروس معدي قابل للكشف عن طريق اختبار اللويحات تحت ظروف تجريبية محددة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات هي حويصلات تطلق من أنواع خلايا مختلفة إلى سوائل خارج الخلية مثل البلازما، البول، اللعاب، وسائط زراعة الخلايا، وسوائل الجسم الأخرى. تتراوح أقطارها بين 30 نانومتر إلى 150 نانومتر. لقد تم تورطها في عمليات خلوية مختلفة، بما في ذلك الاتصالات الخلوية وتعديل المناعة أثناء العدوى. استنادا إلى هذه التأثيرات، تم استخدامها لدراسة مسببات أمراض عدة فيروسات. من الصعب عزل المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات من الخلايا المصابة بالفيروس باستخدام تقنيات التنقية الحالية. ويرجع ذلك إلى التداخل في الحجم بين بعض الفيروسات والمركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسوم. هنا، نهدف إلى تنقية المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات من مادة الزراعة الخلوية المصابة من نوع حمى الضنك من النوع الثاني. تم عزل المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم باستخدام مجموعة عزل إكسوسومات تجارية. بالنسبة للفيروس الكهربائي المعزول المخصي بالإكسوسوم في هذا البروتوكول، لم يتم اكتشاف أي فيروس معدي بواسطة اختبار البلاك في الظروف التي تم اختبارها. تم توصيف المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات المنقاء باستخدام البلوتينغ الغربي للرباعيات السبانية، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية، ومجهر إلكتروني ناقل لتأكيد الحجم. أثبتنا أن التوكولات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات لدينا سليمة وضمن نطاق قطر الإكسوسوم الطبيعي من 30-150 نانومتر. بشكل عام، يوفر بروتوكولنا طريقة غير مكلفة لتنقية المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات من فائق الزراعة الخلوية المصابة بالفيروس، والتي يمكن استخدامها في الاختبارات الوظيفية اللاحقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات هي حويصيلات نانوية الحجم تطلقها كل خلية في الجسم. هي أنواع فرعية من الحويصلات خارج الخلية (EVs) ذات الأصل الداخلي. تم اكتشاف المركبات الكهربائية المغنية بالإكسوسومات لأول مرة في وسائط زراعة الخلايا الشبكية1. في العقود القليلة الماضية، تم تنقية المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات من عدة سوائل جسمية، بما في ذلك الدم، البول، اللعاب، حليب الأم، السوائل المنوية، والسوائل الأمنيوسية2،3،4،5. قطرها يتراوح من 30 نانومتر إلى 150 نانومتر6. يحدث إطلاقها في الحجرة خارج الخلية من خلال اندماج الأجسام متعددة الحويصلات (MVBs) مع غشاء بلازما الخلية. في سياق العدوى والاستجابة المناعية، من المعروف أن الEVs الغنية بالإكسوسومات تثير استجابة محددة في خلايا الثدييات. تشمل هذه الاستجابات إطلاق السيتوكينات أو تغييرات في قابلية الإصابة للعدوى 7,8,9.

يتأثر محتوى المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات بعدة عوامل، أهمها نوع وحالة الخلية التي تنتجها10,11. بالإضافة إلى ذلك، يحدد محتواها أيضا تأثيراتها على الخلايا المستلمة الساذجة. تستخدم حاليا عدة طرق لعزل المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسوم من السوائل البيولوجية. تشمل الطرق الشائعة الطرد المركزي الخارجي التفاضلي، الترسيب، التقاط الارتباط المناعي، كروماتوغرافيا استبعاد الحجم، العزل المغناطيسي، والعزل المعتمد على الميكروفلويد.

يعتبر الطرد المركزي الفائق التفاضلي من أكثر التقنيات استخداما 12,13,14. طريقة تنقية الطرد المركزي فوق الفائق مكلفة وتتطلب كفاءة تقنية كبيرة. تؤدي هذه الطريقة أيضا إلى فقدان كبير في المركبات الكهربائية بسبب عدة خطوات للطرد المركزي فوق السطحي. وأخيرا، فإن الجسيمات الخارجية الغنية بالإكسوسومات الناتجة ليست خالية من الجسيمات الفيروسية النشطة بسبب خصائصها الظاهرية المتشابهة. وقد جعل هذا تنقية المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات من الخلايا المصابة بالفيروس أمرا صعبا. لذلك من المهم تطوير بروتوكول محسن لتقليل مستويات فيروس الضنك (DENV) بشكل فعال إلى مستويات غير قابلة للكشف في محلول EV الغني بالإكسوسوم، لأن الفيروسات تشترك في أحجام وكثافات متشابهة مع الإكسوسومات15،16.

مقارنة بالتقنيات الشائعة الأخرى، يقدم هذا البروتوكول عدة مزايا، منها تقليل وقت التنقية، والاعتماد على معدات مختبرية رخيصة ومتاحة على نطاق واسع، والقدرة على عزل المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات دون وجود تلوث فيروسي حي يمكن اكتشافه. بالإضافة إلى ذلك، رغم أن طرق مثل الطرد المركزي بتدرج الكثافة والعزل المغناطيسي يمكن أن تقدم مزايا، بما في ذلك زيادة العائد والنقاء الأعلى، إلا أن هذه الطرق تتطلب خطوة أولية للطرد المركزي الفائق. هدف هذا المقال هو تقديم طريقة لعزل المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات من الكائنات المصابة التي لا يمكن اكتشافها بفيروس معدي بواسطة اختبار البلاك في الظروف المختبرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير وسائط خالية من الإكسوسومات

  1. قم بتثبيت فلتر بحجم 0.1 ميكرومتر على قاعدة المستقبل داخل خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية (BSC).
  2. اسكب مصل البقر الجيني المعطل بالحرارة (FBS) على الفلتر وثبته بمضخة التفريغ داخل الجهاز.
  3. كرر الخطوة 1.2 مع التدفق مرتين إضافيتين.
  4. جهز الوسائط الكاملة لتحتوي على 10٪ من FBS المصفاة ثلاثية، و1٪ بنسلين/ستربتومايسين، و1٪ إل-جلوتامين.
    ملاحظة: تستخدم طريقة الترشيح الثلاثي لتجنب الحاجة إلى أجهزة مثل الطرد المركزي الفائق.

2. عدوى فيروس حمى الضنك في خلايا الثدييات

  1. نما خلايا فيرو طوال الليل في قارورة زراعة T75 سم2 داخل حاضنة زراعة الأنسجة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. في اليوم التالي، تحقق من أن الخلية متلاقية بين 70٪ و80٪ وأصيب الخلايا ب 0.1 تعدد العدوى (MOI) من DENV-2 في 5 مل من وسط كامل واحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة ساعتين.
  3. بعد ساعتين، أزل المادة الفائقة واغسل القارورة ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي فوسفات معقم (PBS).
  4. أضف 50 مل من الوسط الكامل إلى القارورة وحضن على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 4 أيام (قبل ملاحظة التأثيرات السيتوباتية مباشرة).

3. تنقية الإكسوسومات المعتمدة على المجموعات

  1. انقل وسط زراعة الخلايا من القارورة إلى أنبوب مخروطي 50 مل وجهاز طرد مركزي بحرارة 200 × جرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. انقل الوسط إلى أنبوب مخروطي جديد. أضف 125 ميكرولتر من مادة الترسيبات الكهربائية (EV)، تليها 600 ميكرولتر من الراتنج. استخدم دوامة لمدة 10 ثوان واتركها واقفة لمدة 10 دقائق داخل جهاز BSC في درجة حرارة الغرفة.
  3. دوامة لمدة 10 ثوان أخرى وطرد مركزي عند حوالي 450 × جرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. انقله إلى BSC، تخلص من السوبرناتانت، وطبق 600 ميكرولتر من مخزن إعادة التعليق على الحبيبة.
  4. استخدمي دوامة لمدة 10 ثوان واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  5. دوامة لمدة 10 ثوان أخرى وطرد مركزي عند حوالي 25 × جرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
  6. انقل المادة الفائقة إلى عمود دوران الفلتر وجهاز الطرد المركزي عند حوالي 4,500 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اجمع التدفق الذي يحتوي على المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم سليمة وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
  7. تأكد من أن السائق الكهربائي المغني بالإكسوسوم خال من الفيروس الحي من خلال إجراء اختبار البلاك17.
  8. توصيف الجريء الكهربائي الغني بالإكسوسومات باستخدام المجهر الإلكتروني لتحليل الحجم وتتبع الجسيمات النانوية لتوزيع الحجم والتركيز18.

4. توصيف EV المغني بالإكسوسوم بواسطة البقعة الغربية

  1. حدد تركيز البروتين في الفيروس الكهربائي الغني بالإكسوسوم باستخدام اختبارات مثل BCA.
  2. اخلط أحجام متساوية من محلول EV المثري بالإكسوسوم ومخزن RIPA وأضف 4x مخزن تحميل LDS (4:1).
  3. افصل بروتينات EV الغنية بالإكسوسومات باستخدام جل بيس-تريس بنسبة 4-12٪.
  4. انقل البروتينات إلى غشاء نيتروسلولوز.
  5. قم بالتغلغل لمدة ساعة واحدة باستخدام حليب خالي الدسم 5٪ مذاب في محلول ملعقة كبيرة من Tween في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية باستخدام حليب جاف خالي من الدسم بنسبة 5٪ إلى تخفيف بنسبة 1:1,1000 وفحص الغشاء بحثا عن بروتينات إكسوسومات مثل CD63 وCD9 عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  7. أزل الجسم المضاد الأساسي واغسل 5 × 5 دقائق باستخدام 1x TBS-Tween buffer على جهاز هزاز.
  8. تخفيف الجسم المضاد الثانوي (مضاد Rabbit IgG HRP) باستخدام الحليب الجاف الخالي من الدسم إلى تخفيف بنسبة 1:5,000 وحضن الغشاء بهذا المحلول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  9. أزل الجسم المضاد الثانوي واغسل 5 × 5 دقائق باستخدام 1x TBS-Tween buffer على جهاز هزاز.
  10. تطوير الغشاء باستخدام كاشف كشف ECL واكتشاف إشارات البروتين باستخدام جهاز التصوير الكيميائي المضيء.

5. توصيف المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل

  1. أضف 5 ميكرولتر من عينات الإكسوسومات إلى شبكات النحاس المكونة من 200 شبكة مع طلاء فورمفار وكربون واتركها تجف بالهواء في درجة حرارة الغرفة.
  2. صبغ الشبكة بأسيتات اليورانيل المائي بنسبة 1٪ لمدة 60 ثانية وجفف الهواء بالهواء.
  3. التقط الصورة باستخدام TEM عند 80 كيلوفولت18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتحليل ال EV المعزول المغني بالإكسوسوم كما هو موصوف في البروتوكول باستخدام اختبار البلاك لتحديد ما إذا كان بإمكاننا اكتشاف جزيئات DENV-2 النشطة في الخليط. كما هو موضح في الشكل 1، لم يتم اكتشاف أي لويحات تحت الظروف التي تم اختبارها مقارنة بالحالة الإيجابية من الضابطين. تشير هذه النتائج إلى أن الفيروس المعدي كان أقل من عتبة الكشف في اختبار اللويحة. تم إجراء اختبار اللوح على نسخ ثلاثية بيولوجية ونسخ تقنية مكررة. تم تحديد تر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت التطورات الحديثة في أبحاث الأمراض المعدية أن المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسومات التي تطلق من خلايا ساذجة مصابة بالفيروس تلعب دورا حاسما في تعديل الاستجابة المناعية للمضيف 7,8,9. يمكن للأجهزة الكهربائية الغنية بالإكسوسومات أن تعزز الدفاع المناعي من خلال تعزيز استجابة مضادة للفيروسات مناسبة، أو على العكس، تسهل تهرب المناعة الفيروسية من خلال تثبيط آليات دفاع المضيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة منحة بحثية من الجمعية الأمريكية لعلوم المختبرات السريرية (ASCLS) وصندوق برنامج تعزيز البحث (REP) من جامعة ولاية تكساس

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة المرتبطة بمضاد IgG-HRP المضاد للأرانبالإشارات الخلوية7074Sالأجسام المضادة الثانوية
CD63الإشارات الخلوية52090sالجسم المضاد الأولي
CD9الإشارات الخلوية13174Sالجسم المضاد الأولي
مجموعة تنقية وسائط إكسوسوم لزراعة الخلايانورجن60600مجموعة تنقية الإكسوسوم
فيروس حمى الضنك 2ATCCVR-1584الفيروس
DMEMفيشر العلمي11-995-073الإعلام الثقافي
EMEMATCC30-2003الإعلام الثقافي
مجهر الإلكترون الناقل FEI Talos F200Xثيرموفيشر ساينتيفيك
إيروم البقري الجنينيعلم الأعصابFBS002الملحق الإعلامي
محلل تتبع الجسيمات النانومقياس الجسيمات
خلايا فيروATCCCCL-81خط الخلايا الثديية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation: Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262 (19), 9412-9420 (1987).
  2. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J Transl Med. 9, 86(2011).
  3. Lässer, C., et al. RNA-containing exosomes in human nasal secretions. Am J Rhinol Allergy. 25 (2), 89-93 (2011).
  4. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  5. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  6. Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cell Mol Life Sci. 75 (2), 193-208 (2018).
  7. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected cells stimulate production of pro-inflammatory cytokines through trans-activating response (TAR) RNA. J Biol Chem. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  8. Fleming, A., et al. The carrying pigeons of the cell: Exosomes and their role in infectious diseases caused by human pathogens. Pathog Dis. 71 (2), 109-120 (2014).
  9. Olanrewaju, A. A., Hakami, R. M. The messenger apps of the cell: Extracellular vesicles as regulatory messengers of microglial function in the CNS. J Neuroimmune Pharmacol. 15 (3), 473-486 (2020).
  10. Tauro, B. J., et al. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 587-598 (2013).
  11. Pallet, N., et al. A comprehensive characterization of membrane vesicles released by autophagic human endothelial cells. Proteomics. 13 (7), 1108-1120 (2013).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. Elife. 10, e70725(2021).
  15. Sampey, G. C., et al. Exosomes and their role in CNS viral infections. J Neurovirol. 20 (3), 199-208 (2014).
  16. Jeppesen, D. K., et al. Reassessment of exosome composition. Cell. 177 (2), 428-445.e18 (2019).
  17. Shi, L. Z., et al. N-butanol extract of Glycyrrhizae radix et rhizoma inhibits dengue virus through targeting envelope protein. Pharmaceuticals (Basel). 16 (2), 263(2023).
  18. Alem, F., et al. Exosomes originating from infection with the cytoplasmic single-stranded RNA virus Rift Valley fever virus (RVFV) protect recipient cells by inducing RIG-I mediated IFN-β response that leads to activation of autophagy. Cell Biosci. 11 (1), 220(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Exosome Enriched EVsExtracellular VesiclesDengue VirusVirus Infected CellsExosome IsolationCell Culture SupernatantWestern BlottingNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopyImmune Modulation

مقالات ذات صلة