مقالة منهجية

بروتوكول تفكك الخلايا الواحدة، وتسلسل الحمض النووي الريبي، وعزل الخلايا الظهارية العضلية والأرومات الليفية من الغدد الرملية واللعابية المتقدمة في السن

DOI:

10.3791/70441

⸱

أبريل 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة لفصل غدد دمع الفأر المسنة للحصول على خلايا منفردة قابلة للحياة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. يحافظ الهضم الإنزيمي المتسلسل والتعامل اللطيف على سلامة الخلايا، مما ينتج معلقات عالية الجودة مناسبة لعزل نوع الخلية وتحليل النسخ النصي للتغيرات المرتبطة بالشيخوخة في تجمعات الغدد الدمعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرتبط تقدم عمر الغدة الدمعية (LG) بانخفاض إفراز الدموع والالتهاب المزمن، مما يساهم في جفاف العين. تشمل التغيرات المرتبطة بالعمر تغلغل الخلايا المناعية، تلف الخلايا، تراكم الدهون في الخلايا الحارة الدماغية، ترسيب المصفوفة خارج الخلية، وتمدد القنوات. يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) نهجا قويا لتحديد التغاير الخلوي والتغيرات النسوخية أثناء التقدم في العمر؛ ومع ذلك، فإن توليد تعليق خلية واحدة قابلة للحياة من نسيج LG المتقدم في السن يمثل تحديا تقنيا بسبب زيادة التليف، وهشاشة الخلايا، وتراكم الدهون. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا محسنا وقابلا للتكرار لتفكيك الخلايا الأرضية المسنة للفئران وعزل أنواع الخلايا المتعددة، وهو مناسب لتحليل scRNA-seq لاحقا. ومن المهم أن هذا البروتوكول ينطبق أيضا على الغدد الدمعية الشابة، الملتحمة، والأنسجة الخارجية الأخرى. يستخدم سير العمل استراتيجية تفكك إنزيمي تدريجي باستخدام كولاجناز IV وDispase II وDNase I لهضم الأنسجة الأولي، تليها Accutaz لتفكيك تجمعات الخلايا المتبقية وعلاج نهائي DNase I للحصول على تعليق خلوي نظيف. لتقليل تلف الخلايا، يتم تغطية جميع الأدوات البلاستيكية مسبقا بألبومين مصل البقري المحتوي على PBS، وتجرى معالجة الأنسجة تحت ظروف حرارة وتحريك محكومة بالضغط. تحلل خلايا الدم الحمراء والترشيح المتسلسل عبر عدة مصفاة يعزز نقاء الخلية بشكل أكبر. يتم تحقيق العزل الخاص بنوع الخلية باستخدام خطوط فئران المراسلة مع فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). باستخدام فئران Acta2GFP وPdgfraEGFP، نجحنا في عزل خلايا الظهارة العضلية والأرومات الليفية على التوالي، بعد التلوين المناعي بجسم مضاد EpCAM. مكن FACS من فصل مجموعة الخلايا الظهارية EpCAM⁺/αSMA⁺، بينما مثلت خلايا EGFP⁺ من فئران PdgfraEGFPمجموعة الأرومات الليفية. ينتج هذا البروتوكول معلقات خلية واحدة عالية الجودة وقابلة للحياة من LGs المتقدمة في السن، ويمكن تكييفها بسهولة مع أنسجة ليفية أو خارجية أخرى تتطلب تفككا لطيفا وعزلا مستهدفا للخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدة الدمعية (LG) هي غدة حنجرة خارجية مسؤولة عن إفراز الطبقة المائية من طبقة الدموع. طوال الحياة، يتعرض سطح القرنية وغدة العين السطحية للعدوى البكتيرية والفيروسية، مما قد يؤدي إلى اضطراب جهازي في الخلايا الظهارية، وتحفيز استجابات التهابية مزمنة، وتسلل الخلايا المناعية إلى الغشاء الزائف، ونقص التجدد. يصاحب التقدم في العمر زيادة في حالات الأمراض الالتهابية المزمنة1. من بين هذه الأسباب يعد مرض جفاف العين (DED) واحدا من أكثر عشرة أسباب شيوعا لضعف البصر على مستوى العالم، وهو مساهم رئيسي في انخفاض الاستقلالية والحركة والأداء اليومي لدى كبار السن2. أحد الأسباب الرئيسية لاضطراب العين الزائفة هو خلل ال LG3.

مع تقدم العمر، يخضع الفأر والإنسان لتليف النسيج الخفيف لتغيرات بنيوية ووظيفية واضحة، بما في ذلك ضمور الخلايا الأسينارية، وتمدد القنوات، وتسرب الخلايا المناعية، والتليف، وترسيب الدهون 4,5,6,7. ترافق هذه التغيرات التنكسية أيضا التهاب مزمن في LG وتليف الأنسجة 3,5,8,9. على الرغم من الارتباط الواضح بين الشيخوخة وأمراض LG، إلا أن الآليات الجزيئية والخلوية التي تدفع هذه التغيرات لا تزال غير مفهومة جيدا.

يتيح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية التحليل الشامل لمجموعات الخلايا وتغيراتها في النسخ خلال سنالعاشرة. يتيح هذا النهج تحديد غير متحيز لأنواع وحالات الخلايا المميزة داخل الغدة الدمعية، كاشفا كيف يغير التقدم في العمر ملفات التعبير الجينية، وتسلل الخلايا المناعية، والتفاعلات الظهارية-الميزنكيمية.

حاليا، تتوفر العديد من طرق تفكك الأنسجة، بما في ذلك طرق التفكك الميكانيكي11 والبروتوكولات التي تتضمن الهضم الإنزيمي الدافئ عند 37 درجة مئوية باستخدام إنزيمات مثل الكولاجناز، ديسباز، أو التريبسين12. تم وصف استراتيجيات تفكك مختلفة لمجموعة واسعة من الأنسجة، بما في ذلك الكبد والرئة والكلى والقلب وأنواع الأورامالمتعددة 13، 14، 15. ومع ذلك، لا يزال تحضير معلقات خلية واحدة قابلة للحياة من نسيج الغدة الدمعية القديمة تحديا تقنيا بسبب زيادة التليف وهشاشة الخلايا. أيضا، كما ذكرنا سابقا، قد يكون استعادة الخلايا العجينية الهشة تحديا، حيث قد تزيد التغيرات المرتبطة بالتفكك في نفاذية الغشاء من إطلاق الحمض النووي الريبي المحيط من هذه الخلايا الكبيرة الإفرازية، مما يساهم في الإشارة الخلفية في مجموعات بيانات الخلايا المفردة في الأسفل16. على الرغم من أن عدة دراسات أبلغت عن أطلس scRNA-seq للغدد الدمعية المتقدمة في العمر، إلا أن جودة هذه البيانات محدودة بسبب طرق التفكك غير المثالية، مما أدى إلى انخفاض إنتاجية الخلايا الظهارية مقارنة بمجموعات الفأر. هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا ومحسنا لتفكيك الخلايا السطحية المبكرة للفأر وعزل مجموعات الخلايا المميزة لتحليلات sRNA-seq وكميات كبيرة (الشكل 1). يوفر هذا النهج أداة قوية لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء خلل الغدد الدمعية المرتبطة بالعمر.

يتيح البروتوكول توليد معلقات خلية واحدة عالية الجودة وقابلة للحياة من الغدد الدمعية المتقدمة في السن، مما يوفر أساسا موثوقا لتحليلات شاملة للنسخ الجسدي. يسمح بتحديد دقيق وتوصيف جزيئي لمجموعات خلايا متنوعة، بما في ذلك الخلايا الظهارية العضلية، والأرومات الليفية، وأنواع الخلايا الظهارية واللقطية الأخرى التي تمر بتغيرات مرتبطة بالعمر. يحافظ سير العمل المحسن على سلامة الخلايا ويقلل من التشويشات النتجية الناتجة عن الإجهاد، مما يضمن تمثيلا دقيقا للحالات الخلوية في الجسم الحي. علاوة على ذلك، فإن المنهجية قابلة للتطبيق على نطاق واسع ويمكن تكييفها مع غدد خارجية أخرى أو أنسجة ليفية، حيث يعد تفكك الأنسجة اللطيف والعزل الدقيق لمجموعات الخلايا المختلفة أمرا بالغ الأهمية للدراسات المفردة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في معهد سكريبس للأبحاث (البروتوكول رقم 08-0123؛ تمت الموافقة عليه في 29 أغسطس 2023). رعاية الحيوانات في معهد سكريبس للأبحاث معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد رعاية الحيوانات المختبرية الدولية (AAALAC). تم الحفاظ على الفئران وفقا لدورة قياسية من 12 ساعة ضوء و12 ساعة ظلام مع توفير الطعام والماء بإذن من. تم استخدام خطوط الفئران المعدلة وراثيا PdgfraEGFP وActa2GFP في التجارب. المعلومات التفصيلية حول خطوط الفئران متوفرة في قسم "جدول المواد".

1. اعتبارات عامة

  1. اتبع الاحتياطات الشاملة17 من NIH عند التعامل مع المواد البيولوجية الخطرة وأنسجة الحيوانات. قم بجميع أعمال الحيوانات وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة ومستويات السلامة البيولوجية المخصصة للحيوانات.
  2. اتباع ممارسات السلامة المختبرية القياسية بتجنب استخدام أنابيب الفم، وتقليل استخدام الحاد، واستخدام خزانة السلامة البيولوجية لإجراءات توليد الهباء الجوي، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، والتخلص من النفايات الحادة في حاويات مقاومة للثقب، ووضع العلامات وإزالة التلوث الصحيح لجميع النفايات الخطرة البيولوجية قبل التخلص منها.
  3. قم بتطهير أسطح العمل والمعدات بشكل روتيني باستخدام مطهرات مناسبة (مثل 10٪ مبيض).
  4. قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا للحفاظ على بقاء الخلايا وتقليل الإجهاد الناتج عن درجة الحرارة.
  5. تحسين إعدادات مقياس التدفق وجهاز فرز الخلايا لتكوين الجهاز المحدد وضبط المعلمات لكل اقتران من الأجسام المضادة والفلورية باستخدام عينات تحكم مناسبة. استخدم نفس جهاز القياس الخلوي وجهاز الفرز، مع إعدادات ثابتة ومحسنة، طوال سلسلة تجريبية لتقليل التباين.
  6. جهز الحلول المختارة قبل يوم واحد وتخزينها بشكل مناسب حتى الاستخدام. جهز جميع الحلول تحت ظروف معقمة في خزانة أمان حيوي.
  7. حافظ على محاليل تحتوي على Ca2+/Mg 2+ منفصلة عن المخازن التي تحتوي على EDTA لمنع الخلب أثناء خطوات الإنزيم. جميع المواد المستخدمة في هذا الإجراء موضحة في جدول المواد.

2. الأدوات البلاستيكية

  1. في الظروف المعقمة، قم بطلاء الأطباق والأنابيب والحقن مسبقا ب 1x PBS + 1٪ BSA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT). استنشق كل شيء وحافظ عليه معقما حتى الاستخدام.
  2. قم بطلاء رؤوس الماصة مسبقا. استنشق ووزع 1x PBS + 1٪ BSA ثلاث مرات مع كل طرف لتغطية السطح الداخلي. أعد الأطراف المطلية إلى صندوق الرؤوس المعقمة واتركها تجف طوال الليل في حاضنة معقمة. استخدم هذه الأطراف المطلية مسبقا في اليوم التالي أثناء عملية عزل الخلايا.

3. الحلول والمخازن

  1. DNase I Stock (5 ملغ/مل)
    1. جهز 150 ملليمولار من NaCl من مخزون 5M NaCl وفلتر المحلول بالتعقيم.
    2. أضف 1 M CaCl₂ إلى محلول NaCl المصفاة بقطر 150 ملليمول للحصول على تركيز نهائي 5 ملليمولار CaCl₂.
    3. أعد تعليق 100 ملغ DNase I في 20 مل من محلول 150 ملليموتر NaCl / 5 ملليمولار CaCl₂ للحصول على محلول مخزوني 5 ملغ/ملليتر DNase I.
    4. حضر 500 ميكرولتر أليكوات وتخزينها عند −20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان لمنع فقدان نشاط الإنزيم.
  2. وسط الهضم
    1. في اليوم السابق للتجربة، حضر خليط القاعدة المتوسطة بخلط DMEM/F12 مع 0.5٪ BSA وتصفيته.
    2. أضف 1M HEPES و1M CaCl₂ إلى الوسط الأساسي DMEM/F12 / 0.5٪ BSA للحصول على تركيزات نهائية 15 ملليمولار و3 ملليمولار على التوالي.
    3. أضف جميع الإنزيمات التالية قبل الاستخدام مباشرة: كولاجناز IV (1 ملغ/مل؛ 125 يورانيوم/مل)، ديسباز II (2.5 ملغ/مل؛ 1.25 يورانيوم/مل)، وDNase I (20 يورانيوم/مل؛ 0.05 ملغ/مل من مخزون 5 ملغ/مل).
  3. حجب المتوسط 1 (BM1)
    1. أضف 1M HEPES و0.5M EDTA إلى 1x HBSS للحصول على تركيزات نهائية 15 ملليمولار و3 مللي مولار على التوالي.
  4. حجب المتوسط 2 (BM2)
    1. أضف FBS و1M HEPES إلى DMEM/F12 للحصول على تركيزات نهائية تبلغ 10٪ و15 ملليمولار على التوالي.
  5. وسط علاج DNase
    1. في اليوم السابق للتجربة، حضر الوسط الأساسي بخلط 1x HBSS مع 0.5٪ BSA وتصفيته.
    2. أضف 1M HEPES، 1M CaCl₂، و1M MgCl₂ إلى الوسط الأساسي 1x HBSS / 0.5٪ BSA للحصول على تركيزات نهائية 10 ملليمولار، 1.5 ملميول، و2 ملمولار على التوالي.
    3. قبل الاستخدام مباشرة، أضف DNase I (200 U/mL؛ 0.5 mg/ml من مخزون 5 mg/mL) إلى الخليط المعزز.
  6. حجب المتوسط 3 (BM3)
    1. استخدم نفس الوسط الأساسي المصفاة 1x HBSS / 0.5٪ BSA وأضف 1M HEPES و0.5M EDTA للحصول على تركيزات نهائية تبلغ 10 مللي مولار و1 مللي مولار على التوالي.
  7. حجب المتوسط 4 (BM4)
    1. استخدم نفس الوسط الأساسي المصفاة 1x HBSS / 0.5٪ BSA وأضف 1M HEPES للحصول على تركيزات نهائية تبلغ 10 مللي مول.
  8. مخزن FACS
    1. في اليوم السابق للتجربة، حضر الوسط الأساسي بخلط 1x DPBS مع 0.5٪ BSA وتصفيته.
    2. أضف 1M HEPES و0.5M EDTA إلى 1x DPBS / 0.5٪ BSA للحصول على تركيزات نهائية 25 ملليمولار و1 مللي مولار على التوالي.
  9. الوسيط ل scRNAseq (MSC)
    1. في اليوم السابق للتجربة، حضر الوسط بخلط 1x DPBS مع 0.4٪ BSA وتصفيته.

4. جمع الأنسجة والتشريح الدقيق (~ 40 - 50 دقيقة)

  1. قم بتخدير الفأر بالأيزوفلوران ثم القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم وفقا لإرشادات IACUC المؤسسية.
  2. استخدم ملقطا دقيقا ومقصا لشق الجلد بين العين والأذن وسحبه بلطف لكشف الغدة الدمعية.
  3. لعزل الغدة، ارفعها قليلا باستخدام ملقط باهت الأطراف وافصل الأنسجة الضامة المحيطة بحذر عن طريق إبعادها بحركة دائرية لطيفة. حدود الغدة الدمعية واضحة للعيان، مما يسمح بالفصل بسهولة عن الأنسجة المجاورة، بما في ذلك الغدة النكفية.
  4. انقل الغدة الدمعية (كل غدة تزن حوالي 10-25 ملغ، حسب وزن الفأر والجنس والعمر) إلى طبق بترى بحجم 35 مم يحتوي على 2 مل من PBS بارد 1x على الثلج. تحت مجهر تشريح، قم بإزالة الدهون المتبقية وتقشير كبسولة الأنسجة الضامة بعناية باستخدام ملقطين.
  5. تأكيد وضع العلامات على الخلايا بفحص جزء صغير من النسيج تحت مجهر فلوري والتحقق من الإشارة المنتظرة أو الفلورية قبل الانتقال إلى الهضم الإنزيمي.
  6. ضع طبق بتري معقم بحجم 35 مم على الثلج وأضف 800-1000 ميكرولتر من PBS البارد 1x (الحجم المعدل حسب حجم الغدة) إلى وسط الطبق. انقل غدة دمعة واحدة إلى 1x PBS.
  7. باستخدام مشرطين معقمين، قم بتسوية الغدة إلى قطع صغيرة حتى تصل إلى قوام ناعم يشبه المعجون. تأكد من بقاء شظايا الأنسجة مغمورة في PBS طوال عملية التقطيع، لكن لا تسمح لها بالطفو بحرية عبر الطبق.
  8. اجمع شظايا الأنسجة من جانب واحد من الطبق، واسحب متلازمة زبدة الفول السوداني المتبقية، واغسل الشظايا ب 1 مل من متلازمة زبدة الفول السوداني الباردة الطازجة.
  9. انقل شظايا الأنسجة المغسولة إلى صفيحة ذات 6 آبار تحتوي على 2 مل لكل بئر من وسط الهضم المسخن مسبقا. احتفظ بالطبق على الثلج حتى تتم معالجة جميع العينات.

5. الهضم الإنزيمي الأول (~1.5 - ساعتان)

  1. حضن الطبق في حمام ماء مهز عند 37 درجة مئوية و60 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  2. قم بتقليص النسيج بلطف 15 مرة باستخدام رأس عريض بسعة 1 مل، ثم أعد اللوح إلى حمام الماء المهتز عند 37 درجة مئوية و60 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة إضافية.
  3. قم بتقليص العينة بلطف 10 مرات باستخدام رأس عادي بحجم 1 مل، ثم أعد اللوح إلى حمام الماء المهتز عند 37 درجة مئوية و60 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة إضافية.
  4. قم بتقليص العينة بلطف 10 مرات وانقل تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق Dolphin بحجم 2 مل.
  5. أضف 1 مل من BM1 البارد إلى كل بئر من الطبق لجمع وسط الهضم المتبقي الذي يحتوي على الخلايا المتبقية. ضع الطبق على الثلج حتى الخطوة التالية.
    ملاحظة: إذا كانت هناك مجموعات خلايا كبيرة أو شظايا أنسجة لا تزال ملحوظة في هذه المرحلة، قم بتمديد كل خطوة حضانة بمقدار 10-20 دقيقة إضافية. لا تتجاوز العدد المحدد لمرات الانقسام (الحد الأقصى 10-15 تمريرة لطيفة)، لأن الإجهاد الميكانيكي الإضافي سيؤثر على قدرة الخلية على البقاء.

6. إنهاء النشاط الإنزيمي والغسلات الأولية (~ 15 دقيقة)

  1. قم بعمل الطرد المركزي على الأنابيب التي تحتوي على تعليق الخلية عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. تخلص من الفائق. انقل ال BM1 من كل بئر في الصفيحة الأولية (التي تحتوي على خلايا متبقية) إلى الأنبوب المقابل وأعد تعليق الحبيبات الخلوية بلطف.
  3. اشطف كل بئر ب 600 ميكرولتر إضافية من BM1 البارد وادمج الغسيل مع الأنبوب المقابل لجمع جميع الخلايا المتبقية.
  4. أعد تعليق الخلية برفق، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتان.

7. علاج الأكيوتاز وDNase (~ 30 - 35 دقيقة)

  1. أضف 1 مل من أكوتاز إلى حبيبات الخلايا وأعاد تعليقها بلطف. حضن الأنبوب لمدة 5-10 دقائق فقط عند 37 درجة مئوية و60 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: ضع الأنبوب على جانبه أثناء الحضانة لمنع الخلايا من الاستقرار والالتصاق بالقاع.
  2. قم بعمل ماصة بلطف 10 مرات باستخدام رأس ماصة بسعة 1 مل.
  3. أضف 1 مل من BM2 البارد لإنهاء التفاعل الإنزيمي عن طريق تخفيف الأكوتاز.
  4. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.
  5. أعد تعليق الخلايا في الوسط لعلاج DNase، واملأ الأنبوب حتى الأعلى.
  6. حضن لمدة 10 دقائق عند RT، ثم أعد تعليقه بلطف مرة واحدة بعد 5 دقائق.
  7. وفي الوقت نفسه، تم ترطيب مصفاة خلية بحجم 70 ميكرومتر مع 1 مل من BM3 فوق أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
  8. انقل تعليق الخلية إلى المصفاة.
  9. اشطف أنبوب الجمع الأصلي بسعة 1 مل من BM3 وانقل الشطف إلى نفس المصفاة.
  10. اغسل المصفاة بكمية إضافية من 5 مل من BM3.

8. فحص عد الخلايا وصلاحية الاستمرار

  1. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المفلتر في BM3 وامزجه مع 10 ميكرولتر من تريبان بلو. حدد تركيز الخلية وقابليتها للبقاء باستخدام استبعاد تريبان بلو وقياسه عن طريق العد اليدوي أو عداد الخلايا الآلي (مثل عداد الخلايا الآلي كونتيس 3). تابع فقط إذا كانت الجدوى تحقق العتبة المطلوبة للتطبيقات اللاحقة (عادة ≥70-80٪).
    ملاحظة: ضع في اعتبارك الحجم الكلي ~7-9 مل الآن في أنبوب 15 مل عند حساب العائلة.
  2. تابع وفقا للتطبيق اللاحق. لمتابعة scRNA، استمر إلى القسم 9. لفرز الخلايا المعتمد على قياس تدفق الخلايا الخلوي، استمر إلى القسم 10.
    ملاحظة: يتضمن سير عمل scRNA-seq تحلل خلايا الدم الحمراء وإزالة الخلايا الميتة المغناطيسية لتقليل الحطام والحمض النووي الريبي المحيط وتحسين جودة البيانات. ومع ذلك، قد تؤدي هذه الخطوات إلى تحيز تمثيل أنواع الخلايا من خلال التأثير بشكل تفضيلي على تجمعات ظهارية هشة أو نادرة، بما في ذلك الخلايا الأسينارية. بالنسبة للفرز القائم على قياس تدفق الخلايا الخلوي، تم حذف هذه الخطوات لتعظيم الاسترداد والحفاظ على الحواتم على سطح الخلية. لذلك يجب توجيه اختيار سير العمل بأهداف تجريبية، مع إعطاء الأولوية لجودة البيانات لاسترداد الخلايا أو srena-seq وقابلية الاعتماد على التطبيقات الفرزية والتطبيقات التالية.

9. تحضير الخلايا لتحليل scRNA-seq (~ 1 - 1.5 ساعة)

  1. حضر محلول RBC واحد عن طريق إعادة تركيب محلول 10x بماء مليكيو.
  2. قم بطرد المركزي بأنبوب 15 مل الذي يحتوي على تعليق الخلية عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.
  3. أعد تعليق حبيبة الخلية في مخزن 5 مل واحد من CRIC واحتضن لمدة 5 دقائق عند التغذية الطبيعية.
  4. استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل بارد BM4.
  6. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المفلتر في BM4 وامزجه مع 10 ميكرولتر من تريبان بلو لتقييم تركيز الخلية وقابليتها للبقاء على قيد الحياة.
  7. قم بترطيب مصفاة MACS بحجم 30 ميكرومتر مسبقا مع 1 مل 1x HBSS وترشيح تعليق الخلية عبر المصفاة إلى أنبوب بسعة 15 مل.
  8. اشطف أنبوب التجميع السابق ب 2 مل من BM4 البارد ومرر الغسيل عبر نفس المصفاة إلى أنبوب 15 مل.
  9. اغسل المصفاة بكمية إضافية من 10 مل من BM4 البارد.
  10. قم بطرد المركزي بأنبوب 15 مل عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة السوبرناتانت تماما.
  11. أعد تعليق الحبيبة بلطف في 100 ميكرولتر من حبيبات MACS الدقيقة واحتضن القرص لمدة 15 دقيقة عند المعالجة.
  12. في هذه الأثناء، حضر 1x Binding Buffer (BB) من مجموعة إزالة الخلايا الميتة باستخدام ماء مقطر مزدوج معقم.
  13. اغسل عمود MACS MS بسعة 500 ميكرولتر 1x BB لتوازن الوضع.
  14. أضف 400 ميكرولتر BB إلى العينة، وأعد تعليق الخلايا باستخدام Microbeads وطبق الحجم الكامل على عمود MS المتساوي. اجمع التدفق عبر الأنبوب في أنبوب بسعة 15 مل.
  15. اغسل العمود أربع مرات باستخدام 500 ميكرولتر من BB لكل مرة، مع جمع جميع أجزاء التدفق عبر العمود.
  16. قم بعمل الطرد المركزي على تدفق المياه المجمع عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من الفائق الفائق.
  17. أعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من مخزن MSC وانقل التعليق إلى أنبوب بسعة 1.5 مل.
  18. اشطف الأنبوب السابق بمحلول MSC سعة 700 ميكرولتر وجمع الشطف مع العينة.
  19. الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.
  20. أعد تعليق الحبيبة الخلوية في مخزن MSC باستخدام رأس واسع القطر حتى حجم نهائي حوالي 1.5 مل.
  21. استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتان.
  22. اترك ~100 ميكرولتر من السوبرناتان، ثم أعد تعليق الحبيبة بلطف، وعد الخلايا مرة أخرى بخلط 6 ميكرولتر من الخلايا مع 6 ميكرولتر تريبان بلو.
  23. ضبط الحجم النهائي باستخدام مخزن MSC لتحقيق 700-1200 خلية/ميكرولتر وأعد عدد الخلايا لتأكيد تركيز الخلية.
  24. تأكد من بقاء الخلية بعد تحلل الخلية الحمراء وإزالة الخلايا الميتة ≥بنسبة 70٪ (عادة 70-95٪) قبل التحميل لمعالجة الكروم 10x (محلول الكروم أحادي الخلية 3' V3).
  25. تطبيق معايير التحكم الأساسية في جودة scRNA: nUMI > 500، nGene > 200، ونسبة جين الميتوكوندريا <15٪. استخدم عتبة ميتوكوندرية مسموح بها (15٪) للحفاظ على تجمعات الظهارة ذات النشاط الأيضي الأعلى. تضمين الخلايا فقط التي تستوفي جميع معايير مراقبة الجودة في التحليلات اللاحقة.
    ملاحظة: تمثل هذه العتبات للمراقبة جودة القيم النموذجية المستمدة من مجموعات بياناتنا (الشكل التكميلي 1) وقد تم الإبلاغ عنها في منشورنا السابقرقم 18.

10. تحضير الخلايا لفرز الخلايا المعتمد على التدفق الخلوي (~ 1 - 1.5 ساعة)

  1. لعزل MECs والأرومات الليفية باستخدام قياس التدفق الخلوي، تم استخدام خطوط الفئران PDGFRAEGFP وActa2GFP للإبلاغ عن الفئران، على التوالي، لتمكين تحديد دقيق لكل مجموعة.
  2. قم بطرد المركزي بأنبوب 15 مل مع تعليق خلوي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.
  3. أعد تعليق حبيبة الخلية في مخزن FACS البارد إلى تركيز نهائي 5 × 10⁵ إلى 2 × 10 خلايالكل 100 ميكرولتر.
  4. جهز الضوابط المطلوبة لتعويض FACS: التحكم السلبي - الخلايا غير المصبوغة من فأر بري، التحكم في الفلورة الخلفية - خلايا غير مصبوغة من فئران Acta2GFP وPdgfraEGFP ، التحكم بصبغة واحدة - خلايا من فأر بري تم صبغها بشكل فردي مع كل جسم مضاد مستخدم في التجربة.
    ملاحظة: لكل عينة تحكم، استخدم على الأقل خلية واحدة × 10⁵ معلقة في 100 ميكرولتر من مخزن FACS.
  5. أضف FcBlock (1:100) واحتضن لمدة 5 دقائق على الثلج.
  6. أضف الجسم المضاد وحيد النسيلة CD326 (EpCAM)-APC (1:100) أو الجسم المضاد وحيد النسيلة CD140a (PDGFRα) (1:100). حضانه لمدة 45 دقيقة على الثلج، محميا من الضوء.
  7. أعد تعليق الخلايا بلطف كل 15 دقيقة أثناء حضانة الأجسام المضادة.
  8. املأ كل أنبوب حتى الأعلى بمخزن بارد من FACS وجهاز طرد مركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. تحضير حل FxCycle العامل (1:1000) في مخزن FACS.
  10. إعادة تعليق العينات في 1 مل والتحكم في 500 ميكرولتر من مخزن FACS البارد باستخدام FxCycle.
  11. انقل جميع العينات إلى أنابيب FACS واحتفظ بها على البرد، محمية من الضوضاء.
  12. توجه فورا إلى نواة قياس التدفق الخلوي للفرز. اجمع الخلايا المصنفة في مخزن FACS، وسط الزرعة، مخزن التحلل، أو RNAlater، حسب التطبيقات التالية.
    ملاحظة: إعدادات الجهاز (مثل حجم الفوهة والضغط) ومعدلات الأحداث تعتمد على تكوين الفرز وعدد الخلايا المستهدف؛ لذلك، يوصى بإجراء تجربة أولية لتحديد المعلمات المثلى لكل تجربة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد انفصال الغدد الخارجية المتقدمة في السن تحديا بسبب تراكم الدهون وترسيب ECM المكثف. تظهر الغدد المسنة تسربا لمفاويا ملحوظا وتمدد واضح في القنوات مع المادة داخل اللمعيني، مما يعكس التغيرات الهيكلية والالتهابية التي تعقد تفكك الأنسجة. الغدة الدمعية هي عضو خارجي يتكون من ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا الظهارية: الخلايا الحارة القنية، القنية، والخلايا الظهارية العضلية. تنتج الخلايا الحارة المكونات المائية والبروتينية في طبقة الدموع التي تحافظ على ترطيب القرنية وتوفر وظائف مضادة للميكروبات و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، قمنا بتحسين وتقييم بروتوكول محسن بشكل كبير لتوليد تعليق خلية واحدة من الأنسجة الخارجية، مع التركيز على الغدة الدمعية. باستخدام هذا النهج، قمنا بإنتاج تعليقات خلية واحدة نظيفة وعالية الجودة من الأنظمة القديمة والشابة لكل من LGs، مناسبة لتسلسل الخلايا الواحدة والتطبيقات الأخرى في مرحلة لاحقة.

على الرغم من توفر العديد من بروتوكولات تفكك الأنسجة، كان من الضروري تعديلها وتحسينها لاستعادة تلك المجموعات الخلوية الأكثر عرضة للخطر أثناء العزل بكفاءة. نظرا لهشاشة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين يعلنون أنهم لا يملكون تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة، والمعهد الوطني للعيون (NEI)، الولايات المتحدة الأمريكية، منح 5R01EY026202، R01EY035333؛ ومنح المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والوجه (NIDCR) R01DE031044، 2R01DE014756، ومنحة المعهد الوطني للسرطان (NCI) 5R01CA271500.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>مادي
BSA سيغما-ألدرتشA4919
CaCl2 (1  حل M)بايوفيجنB1010-100
الكولاجيناز IVسيغما-ألدرتشC5138
مجموعة إزالة الخلايا الميتةميلتيني بيوتيك130-090-101
مجموعة إزالة الخلايا الميتةميلتيني بيوتيك130-090-101
ديسباسي IIروشC756V28
DNase Iسيغما-ألدرتشDN25-100MG
DPBS جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك14190-144
مصل البقر الجنيني، IgG منخفض جداجيبكو# 16250078
محلول الملح المتوازن لهانك (HBSS)كورنينج (ثيرمو فيشر ساينتيفيك)21-022-CV
HEPES (1  حل M)سيغما-ألدرتشH0887
محلول الإيزوفلورانكوفيرتوس# 11695067772
MACS® سمارت سترنرز (30 وميكرو؛ m)ميلتيني بيوتيك130-098-458
MACS® سمارت سترنرز (70 وميكرو؛ m)ميلتيني بيوتيك130-110-916
متوسط/F12 (DMEM/F12)ميليبورDF-042-B
MgCl2 1Mسيغما-ألدرتشM1028-100ML
أعمدة MSميلتيني بيوتيك130-042-201
NaCl (سهم 5M)إنفيتروجين والتجارة؛AM9759
أقراص المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS)سيغما-ألدرتشP8920-500ML
محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (10&00;)ميلتيني بيوتيك130-094-183
StemPro Accutase جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفكA1110501
محلول تريبان الأزرق، 0.4٪جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك15250061
EDTA فائق النقاء (0.5M، pH 8.0)إنفيتروجين15575020
<الأجسام المضادة القوية> < قوية>
CD140a (PDGFRA) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (APA5)، APC-eFluor والتجارة؛ 780، رات / IgG2a، كاباالعلوم الحيوية الإلكترونية47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (حاجب FC CD16/CD32)بكالوريوس العلوم الحيوية  553141; RRID:AB_394656
FxCycle&trade؛ فيوليت ستينثيرمو فيشر العلميF10347
فأر CD326 (EpCAM)-APC الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (G8.8)، الجرذ IgG2a، كاباالعلوم الحيوية الإلكترونية17-579182; RRID:AB_2716944
<قوي>فئران
Acta2GFP  هدية كريمة من الدكتور إيفو كالايجيتشPMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/Jمختبر جاكسونRRID:IMSR_JAX:007669
<قوي>معدات
إنفيتروجين والتجارة؛   كونتيسة وتجارة؛ 3 عداد الخلايا الآليفيشر ساينتيفكA49862; RRID:SCR_026963

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guo, J., et al. Aging and aging-related diseases: from molecular mechanisms to interventions and treatments. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 391(2022).
  2. Zhang, X., Wang, L., Zheng, Y., Deng, L., Huang, X. Prevalence of dry eye disease in the elderly: A protocol of systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (37), e22234(2020).
  3. Donthineni, P. R., et al. Aqueous-deficient dry eye disease: Preferred practice pattern guidelines on clinical approach, diagnosis, and management. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1332-1347 (2023).
  4. Yuksel, S., et al. Aging Affects Lipid Homeostasis in Lacrimal Glands by Upregulating Lipogenesis and Changing Its Specificity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 1(2025).
  5. Galletti, J. G., et al. Ectopic lymphoid structures in the aged lacrimal glands. Clin Immunol. 248, 109251(2023).
  6. Delcroix, V., et al. Lacrimal Gland Epithelial Cells Shape Immune Responses through the Modulation of Inflammasomes and Lipid Metabolism. Int J Mol Sci. 24 (5), 4309(2023).
  7. Mauduit, O., et al. Spatial transcriptomics of the lacrimal gland features macrophage activity and epithelium metabolism as key alterations during chronic inflammation. Front Immunol. 13, 1011125(2022).
  8. Prasad, D., et al. Assessing the Independent and Combined Effects of Hyperosmolarity and Inflammatory Stress on Human Corneal Epithelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 47(2025).
  9. Scholand, K. K., et al. Heterochronic Parabiosis Causes Dacryoadenitis in Young Lacrimal Glands. Int J Mol Sci. 24 (5), 4897(2023).
  10. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 13922(2025).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  12. Jankelow, A., Almeida-Porada, G., Atala, A., Sawyer, S. W., Porada, C. D. Recent advancements in tissue dissociation techniques for cell manufacturing single-cell analysis and downstream processing. Stem Cells Transl Med. 14 (11), szaf055(2025).
  13. Duong, A., et al. A Rapid Human Lung Tissue Dissociation Protocol Maximizing Cell Yield and Minimizing Cellular Stress. Am J Respir Cell Mol Biol. 71 (5), 509-518 (2024).
  14. Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. Single-Nucleus RNA-Sequencing Profiling of Mouse Lung: Reduced Dissociation Bias and Improved Rare Cell-Type Detection Compared with Single-Cell RNA Sequencing. Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).
  15. Ikeuchi, T., et al. Dissociation of murine oral mucosal tissues for single cell applications. J Immunol Methods. 525, 113605(2024).
  16. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  17. Kahwaji, N. Universal Precautions. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).
  18. Delcroix, V., et al. The First Transcriptomic Atlas of the Adult Lacrimal Gland Reveals Epithelial Complexity and Identifies Novel Progenitor Cells in Mice. Cells. 12 (10), 1435(2023).
  19. Mauduit, O., et al. A closer look into the cellular and molecular biology of myoepithelial cells across various exocrine glands. Ocul Surf. 31, 63-80 (2024).
  20. Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. P. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J Vis Exp. (148), e59602(2019).
  21. Montanari, M., et al. Automated-Mechanical Procedure Compared to Gentle Enzymatic Tissue Dissociation in Cell Function Studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  22. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. J Immunol Methods. 425, 69-78 (2015).
  23. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neurosci. 17 (1), 30(2016).
  26. Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Single Cell RNA SequencingLacrimal Gland DissociationMyoepithelial Cell IsolationFibroblast IsolationFlow CytometryAged Lacrimal GlandTissue DigestionCell SortingEpCAM ImmunostainingPDGFR Alpha Fibroblasts

مقالات ذات صلة