$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تحضير العينة
فصل البروتين عن دقيق الحمص (CF)
تم معالجة حمص كابولي (Cicer arietinum L.)، الذي تم حصاده خلال موسم الزراعة لعام 2025 والحصول عليه من جنوب شرق تركيا، باستخدام نظام طحن مصنف هوائي قائم على الصدمات، حيث تتعرض الجزيئات لقوى طرد مركزية وضربات متكررة على قرص الطحن وآلية الحلقة. بعد خطوة ما قبل الطحن الأولية، تم طحن الحصى الخشن لإنتاج الألياف الكيميائية باستخدام مطحنة مصنف هوائي. خلال عملية التفريز بالصدمات، تم تطبيق معدل تدفق هواء بين 40-45 متر3/س، وسرعة تصنيف بين 7000-8000 دورة في الدقيقة، ومعدل تغذية 200 كجم/س، وفقا لظروف التشغيل المبلغ عنها سابقا وبروتوكول تحسين داخلي كما هو موصوف في الأدبيات8.
تم الحصول لاحقا على كسور دقيقة غنية بالبروتين من CF عن طريق تصنيف الهواء عند درجة الحرارة المحيطة، باستخدام نفس نظام تصنيف الهواء. تم ضبط سرعة عجلة المصنف على 10,000 دورة في الدقيقة، بينما تم الحفاظ على معدل التغذية عند حوالي 200 كجم/س وتدفق الهواء عند 52 م³/س، كما تم الوصف سابقا8. قامت خطوة الفصل هذه بإثراء جزء البروتين بشكل انتقائي بناء على اختلافات في حجم الجسيمات وكثافتها وخصائصها الديناميكية الهوائية.
بعد تصنيف الهواء، أظهر المسحوق الناتج توزيع دقيق لحجم الجسيمات (d(0.9) = 20-22 ميكرومتر)؛ لذلك، لم يتم تطبيق خطوة غربال لتجنب فقدان المواد والإجهاد الميكانيكي غير الضروري. تم تغليف الجزء الغني بالبروتين مباشرة في أكياس بولي إيثيلين غازية بوزن 25 كجم وتم تخزينه عند 4 درجات مئوية لتقليل امتصاص الرطوبة والحفاظ على خصائصه الوظيفية حتى المعالجة التالية.
تحضير المستحلب النانوي
تم استخدام CPC كعامل مستحلب وحيد لتحضير NEs من الزيت في الماء (O/W) مستهدفا تركيز بروتين نشط بنسبة 3.0٪ w/v في التركيبة النهائية. تم اختيار هذا التركيز بناء على الفحوصات الأولية التي شهدت 1.0٪ w/v، 2.0٪ w/v، و3.0٪ w/v CPC، والتي أشارت إلى أن 3.0٪ وفرت أقل تقليل لحجم القطرات وأعلى استقرار جسدي قصير الأمد. استنادا إلى محتوى البروتين المقاس في مسحوق CPC (44.8٪ w/w)، تم حساب تركيز المسحوق المطلوب ليكون 6.67٪ w/v. عمل CPC كمستحل في الطور المائي المستمر، بينما استخدم زيت الدهون الثلاثية متوسطة السلسلة (MCT) حصريا كطور زيت مشتت بتركيز ثابت 5.0٪ v/v، وهو ما يعادل 5.0 مل زيت لكل تركيبة 100 مل. لم تستخدم أي مواد سطحية منخفضة الوزن جزيئيا في أي تركيبات9.
تم إعداد تشتت CPC المائي عن طريق إذابة الكمية المحسوبة من مسحوق CPC في مياه فائقة النقاء تحت التحريك المغناطيسي المستمر عند 800 دورة في الدقيقة لمدة 1800 ثانية لضمان الترطيب الكامل وتشتت البروتين المتجانس. تم تأكيد الترطيب الكامل بغياب الجسيمات المرئية أو الرواسب.
ثم يضاف طور الزيت ببطء إلى محلول CPC المرطب تحت التحريك المستمر، تليه توحيد عالي القص عند 12,000 دورة في الدقيقة لمدة 240 ثانية، مما ينتج مستحببا خشنا (تقليديا) يعرف بصريا بمظهر منتظم ومعتم دون فصل زيتي مرئي. تم اختيار هذه الظروف لتجنب تجمع البروتين مع ضمان اضطراب كاف في القطرات.
تم الحصول على NEs لاحقا عن طريق السونيكاشن المجساس للمستحلب الخشن عند سعة 30٪ لمدة 180 ثانية، وأجريت في حمام ماء مثلج للحفاظ على درجة حرارة العينة تحت 30 °م ومنع تجمع البروتينات. كانت درجة الحرارة تتم مراقبة متقطعة أثناء السونيكشن. قيمت تجارب التحسين الأولية (البيانات غير المعروضة) أوقات السونيك 60 ثانية، 120 ثانية، و180 ثانية، وتم اختيار 180 ثانية كأفضل حالة بناء على تكوين قابل للتكرار لجرعات NE بأقطار قطرات أقل من 200 نانومتر ومؤشر PDI منخفض. لذلك، تم إعداد جميع NEs التي تم الإبلاغ عنها في هذه الدراسة باستخدام زمن الصوت الأمثل البالغ 180 ثانية.
وقد دعم التكوين الشمالي الشمالي الناجح ظهور تشتت مستقر وقليل من التعتيم دون انفصال الطور بعد 1800 ثانية من الوقوف. تم استبعاد العينات التي أظهرت تعرضا مرئيا للانفصال أو الطور من التحليل الإضافي. تم تعديل جميع العينات إلى درجة حرارة الغرفة (25 ± 2 درجة مئوية) قبل التوصيف الفيزيائي-كيميائي9.
تحذير: تم التعامل مع المعدات عالية الطاقة (المتجانس والسونيكاتر) وفقا لإجراءات السلامة في المختبرات المؤسسية. تم استخدام حماية السمع وحماية من الرش أثناء التصويب. لم تستخدم أي أحماض أو قواعد أثناء تحضير المستحلب؛ لذلك، لم تكن هناك حاجة إلى إجراءات تحييد كيميائي أو التخلص من النفايات الخطرة.
التوصيف الغذائي والكيميائي الفيزيائي لدقيق الحمص (CF) ومركز بروتين الحمص (CPC)
التحليل التركيبي
تم تحديد التركيب الغذائي لعينات CF وCPC باستخدام طرق التحليل الرسمية لجمعية الكيميائيين التحليليين الرسميين (AOAC). تم تحليل الألياف الخام وفقا ل AOAC 991.43، والرماد الكلي وفقا ل AOAC 923.03، والدهون الخام وفقا ل AOAC 920.39، والبروتين الخام وفقا ل AOAC 984.13، باستخدام عامل تحويل النيتروجين إلى البروتين النيتروجين × 6.25. تم تحديد إجمالي محتوى الكربوهيدرات في جميع العينات عن طريق الفرق بطرح مجموع نسب الرطوبة والبروتين والدهون والرماد من 100٪3.
تحليل الألوان
تم قياس معايير ألوان العينات باستخدام مقياس ألوان على سطح الطاولة يعمل في وضع الانعكاس. قبل القياس، تم توحيد الجهاز باستخدام معايير المعايرة بالأبيض والأسود التي قدمتها الشركة المصنعة. لضمان قياسات موحدة وقابلة للتكرار، تم تحميل 5.0 جرام من العينة المطحونة بلطف في كوفيت زجاجي دائري (قطر داخلي 64.0 مم) لإنشاء سطح أملس ومتجانس. تم تطبيق سمك طبقة كاف (≥ 50.0 مم) لتقليل تأثير تأثيرات الركيزة والخلفية وجعل المسحوق الشفاف معتما فعليا تحت ظروف الانعكاس. تم إجراء جميع القياسات في وضع الانعكاس عند درجة حرارة الغرفة.
تم التعبير عن إحداثيات الألوان في فضاء ألوان CIELAB، حيث L* يمثل الإضاءة (0 = أسود، 100 = أبيض)، a* يمثل المحور الأحمر-الأخضر، وb* يمثل المحور الأصفر-الأزرق. تم حساب معلمات ألوان إضافية، بما في ذلك الفرق الكلي في اللون (ΔE*)، الكروما (C*)، زاوية اللون (H°)، ومؤشر اللون (CI)، وفقا للمعادلات الموضحة في11 (المعادلات 1–4) كما يلي:
(المعادلة 1)
(معادلة 2)
(معادلة 3)
(معادلة 4)
تحليل الرقم الهيدروجيني
تم تحديد درجة الحموضة لعينات CF وCPC باستخدام جهاز قياس pH رقمي مزود بقطب زجاجي عن طريق إدخال القطب مباشرة في تشتت العينة عند 25.0 ± 2.0 °C. قبل القياس، كان مقياس الرقم الهيدروجيني يضبط باستخدام محاليل المخزن القياسية (pH 4.0 و7.0). تم إجراء جميع القياسات بثلاث نسخ (n = 3) لضمان قابلية التكرار التحليلي.
محتوى الرطوبة
تم تحديد محتوى الرطوبة المتبقي في عينات CF وCPC باستخدام محلل رطوبة سريع يعمل تحت ظروف تسخين مضبوطة. تم إجراء جميع القياسات بثلاث نسخ (n = 3) لضمان قابلية التحليل للتكرار.
التوصيف الهيكلي والوظيفي ل CPC
تحليل XRD
تم إجراء تحليل XRD ل CPC باستخدام مقياس حيود أشعة إكس مختبر مزود بإشعاع Cu-Kα (λ = 1.5406 Å). تم تسجيل الحيود على نطاق 2θ من 10°-90° بمعدل مسح 2.5° دقيقة 1، وتعمل عند 40 مللي أمبير و45 كيلو فولت، وفقا لإجراء سابقمبلغ 12.
تم إجراء تحديد القمم، وطرح الخلفية، وتركيب المنحنى باستخدام برنامج تحليل XRD القياسي. تم حساب درجة التبلور كنسبة المساحة المتكاملة للانعكاسات البلورية إلى المساحة الكلية تحت مخطط الحيود، وفقا للطريقة الموضحةفي 13، كما هو موضح في المعادلة (5):
(معادلة 5)
تم تقدير حجم البلور الظاهر (D) من بيانات XRD باستخدام معادلة شيرر (المعادلة 6)، المطبقة على أعلى قمم الحيود الشديدة:
(معادلة 6)
حيث D هو الحجم الظاهر للبلورات (nm)، K هو عامل الشكل (يفترض أنه 0.9)، λ هو طول موجة الأشعة السينية، β هو العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM، بالراديان) لقمة الحيود المختارة، وθ هو زاوية براج.
تحليل القياس الحراري بالمسح التفاضلي (DSC)
تم إجراء تحليل القياس الحراري التفاضلي للمسح (DSC) للحمض الكيسي وCPC باستخدام مقياس سعرات حراري تفاضلي في المختبر. تم وزن حوالي 10.0 ± 0.1 ملغ من العينة بدقة وإغلاقها في بوتقة ألمنيوم مقعرة ذات غطاء مثقوب، بينما تم استخدام بوتقة ألمنيوم فارغة كمرجع. أجريت القياسات تحت غلاف جوي من النيتروجين (20 مل/دقيقة) لتقليل التأثيرات التأكسدية. تم تسخين العينات من 0 إلى 400 درجة مئوية بمعدل تسخين ثابت يبلغ 5 درجة مئوية على الأقل 1 تحت ظروف المسح الديناميكي. تم إجراء معايرة للدرجة حرارة والحساسية قبل التحليل لضمان دقة القياس وقابلية التكرار.
تم تمييز الانتقالات الحرارية بتحديد درجة حرارة البداية (To)، ودرجة الحرارة القصوى (Tp)، ودرجة حرارة النهاية (Te)، وتغير الإنثالبي (ΔH) المرتبط بكل انتقال. بالإضافة إلى ذلك، تم حساب عرض القمة المجهول للحرارة (EPW) ومؤشر ارتفاع الذروة (PHI) وفقا للمعادلات. (7) و(8)، على التوالي:
EPW= (Te−Tp) (معادلة 7)
PHI = ΔH/(Tp− To) (معادلة 8)
سعة الرغوة (FC) والثبات (FS)
تم تقييم سعة الرغوة (FC) واستقرار الرغوة (FS) لتشتت CPC المائي (3.0 جم/لتر) عند pH 7.0، وتم تعديلها حسب الحاجة باستخدام حمض الهيدروكلوريك 0.1 نيتروفن (HCl). تم نقل 30 مل من التشتت البروتيني إلى أنابيب طرد مركزي بولي بروبيلين بسعة 50 مل وتم توحيده باستخدام متجانس عالي السرعة يعمل عند 11,000 دورة في الدقيقة لمدة 120 ثانية لتوليد الرغوة. تم تأكيد تكوين الرغوة بصريا من خلال الزيادة السريعة في حجم العينة وتكوين طبقة رغوية مستقرة مباشرة بعد التجانس.
تم حساب FC كنسبة زيادة في الحجم مباشرة بعد التجانس، بينما تم تحديد FS بناء على حجم الرغوة المحتفظ به بعد 600 ثانية، 1800 ثانية، 3600 ثانية، و7200 ثانية. تم إجراء جميع القياسات بثلاث مرات (n = 3)، وتم حساب قيم FC وFS وفقا للمعادلات. (9) ومعادلات (10)، على التوالي14:
(معادلة 9)
(معادلة 10)
تحذير: تم التعامل مع حمض الهيدروكلوريك المخفف باستخدام احتياطات السلامة المختبرية المناسبة، بما في ذلك القفازات وحماية العين. تم التخلص من محاليل النفايات وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية.
الاستقرار الفيزيائي الكيميائي ل CPC وNEs المعتمدة على CPC
متوسط حجم الجسيمات وتوزيع حجم الجسيمات
تم تحديد توزيع حجم الجسيمات ومتوسط قطر العينات الهيدروديناميكي على مستوى Z باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS). تم تسجيل متوسط قطر الهيدروديناميكا في Z ومؤشر التشتت المتعدد (PDI) لوصف متوسط حجم القطرات وتجانس توزيع الحجم، على التوالي15,16.
قبل القياس، كانت العينات تخفف بالماء المقطر بنسبة 1:100 (v/v) لتقليل تأثيرات التشتت المتعددة وضمان قياسات تشتت الضوء الموثوقة. أجريت التحليلات عند درجة حرارة مضبوطة تبلغ 25 ± 2 درجة مئوية. تم استخدام مؤشر PDI كمؤشر لتجانس توزيع حجم القطرات، حيث تتوافق قيم PDI أقل مع توزيعات حجم أضيق. تم إجراء القياسات في اليوم 0 (NEs المحضرة حديثا) وبعد 7 أيام من التخزين لتقييم الاستقرار الفيزيائي قصير المدى لنظام NE16. تم استبعاد العينات التي أظهرت تدويرا مرئيا أو ترسبا أو انفصالا في الطور قبل القياس من تحليل DLS.
جهد ζ للجسيمات
تم تحديد جهد ζ للعينات لتقييم صافي الشحنة السطحية والاستقرار الكهروستاتيكي للقطرات باستخدام تشتت الضوء الكهروضوئي (ELS)، وفقا للمنهجيات الموصوفةسابقا 15,16. أجريت القياسات عند درجة حرارة مضبوطة تبلغ 25.0 ± 2 درجة مئوية، واستخدمت عينات غير مخففة للحفاظ على البيئة الأيونية الأصلية للمناطق الشمالية الشرقية.
تم حساب قيم متوسط ζ جهد والانحرافات المعيارية المقابلة لكل عينة لتقييم التفاعلات الكهروستاتيكية واستقرار المستحلبات الغروية. تم إجراء جميع القياسات باستخدام الماء كموزع، وفقا لما تم إثباته
إجراء التشغيل القياسي الداخلي15. تم استبعاد العينات التي أظهرت انفصال الطور المرئي أو التآكل قبل التحليل من قياسات ζ الجهد.
التحقق من صحة الطريقة والنتائج المتوقعة
تم تحقيق التحقق من الطريقة من خلال تقييم المعايير الفيزيائية الكيميائية الرئيسية، بما في ذلك متوسط قطر الهيدروديناميكا في Z، وPDI، و ζ-الجهد، والاستقرار الفيزيائي تحت الإجهاد. وقد دعم تنفيذ البروتوكول بنجاح التكوين القابل لإعادة إنتاج NEs بأحجام قطرات أقل من 200 نانومتر وPDI ≤0.30. ولمزيد من التحقق من الاستقرار خارج التخزين البسيط، تم إجراء اختبار إجهاد الطرد المركزي عند 4,000 دورة في الدقيقة لمدة 900 ثانية. غياب فصل الطور المرئي أو التدفئة بعد الطرد المركزي، إلى جانب ملفات ζ الجهد ودرجة الحموضة المتسقة على مدى 7 أيام من التخزين، يدعم بشكل جماعي القدرة القوية على الاستحلب في CPC وقابلية تكرار البروتوكول المقترح.
التحليل الإحصائي
أجريت القياسات التركيبية والوظيفية بثلاث نسخ (n=3)، بينما أجريت التحليلات الهيكلية (XRD و DSC) كقياسات مفردة وتمثيلية. تعرض النتائج كقيمة متوسطة ± الانحراف المعياري (SD). تم إجراء التقييمات الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) عبر برنامج SPSS. بالنسبة لجميع التحليلات، تم اعتبار قيمة p < 0.05 دلالة على الدلالة الإحصائية. في الحالات التي تم فيها تحديد فروق ذات دلالة، تم استخدام اختبار الفرق الصادق (HSD) الذي أجرته توكي في عدة مقارنات. تم اشتقاق الحروف الإحصائية المرتبطة (مثل a، b، c) المعروضة في الجداول والأرقام من نتائج اختبار Tukey HSD؛ يعني أن مشاركة نفس الحرف ليست مختلفة بشكل كبير عند مستوى الدلالة 5٪.