مقالة منهجية

التحضير الأمثل للأنسجة الرئوية الحاملة للورم في الفأر الكامل لقياس تدفق الخلايا وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

445 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70452

⸱

مايو 22, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, The Scripps Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول طريقة مفصلة لعزل المعلقات عالية الجودة أحادية الخلية من أنسجة رئة الفأر الصحية والحاملة للأورم. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على sRNA-seq، وتحليل تدفق القياس الخلوي، والعزل الأولي للخلايا.

الملخص

يمثل NSCLC حوالي 85٪ من سرطانات الرئة، وساركوما كيرستن الجرذية (KRAS) هو الجين الأكثر تحورا في NSCLC. على الرغم من أن إدارة NSCLC قد تطورت بشكل ملحوظ في السنوات الأخيرة، إلا أن تباين ومرونته لا تزال غير مفهومة بشكل كامل. أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) أداة أساسية لتحليل التباين الخلوي في الأنسجة المعقدة مثل الرئة. ومع ذلك، فإن توليد تعليق خلية واحدة عالية الجودة من نسيج رئوي حامل للورم يعد تحديا، خاصة أثناء تكون الورم عندما يصبح النسيج ليفيا وغير متجانس. من المتطلبات الأساسية لنجاح sRNA-seq هو تحضير خلايا منفردة قابلة للحياة مع أقل قدر ممكن من الإجهاد أو الضرر الناتج عن المعالجة. هنا، يقدم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لعزل التعليق عالي الجودة أحادي الخلية من أنسجة رئة الفئران الصحية والحاملة للأورام في KrasG12D؛ نموذج فأر مراسل tdTomatoes. تشمل العملية تروية الأنسجة، الهضم الإنزيمي المسيطر عليه، التفكك الميكانيكي اللطيف، تحلل خلايا الدم الحمراء، الترشيح، وتقييم القابلية للحياة، وتحقق >85٪ من الخلايا الحية قبل تسلسل الحمض النووي الريبي (scRNA). أخيرا، يتم عزل خلايا الورم tdTomato+ بكفاءة بواسطة FACS ويمكن اكتشافها كمجموعات مميزة بواسطة scRNA-seq باستخدام هذا البروتوكول.

المقدمة

يعد سرطان الرئة أحد الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان على مستوى العالم. يمكن تصنيفه بشكل عام إلى نوعين فرعيين رئيسيين: سرطان الرئة صغير الخلايا (SCLC) وسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). يمثل NSCLC حوالي 85٪ من جميع حالات سرطان الرئة، مع كون سرطان الغدة هو النوعالفرعي النسيجي 2 الأكثر شيوعا. على الرغم من أن الاستراتيجيات العلاجية ل NSCLC قد تحسنت بشكل كبير خلال العقود الماضية، إلا أن معدل الوفيات بسرطان الرئة لا يزال مرتفعا.3. العلاج الكيميائي والعلاج المناعي هما الطريقتان الرئيسيتان للعلاج المستخدمان في الممارسة السريرية؛ ومع ذلك، يعاني العديد من المرضى من مقاومة للأدوية أو لا يستجيبون للعلاج المناعي 4,5.

تلعب البيئة الدقيقة للورم (TME) دورا محوريا في بدء الورم، وتطوره، ومقاومته العلاجية6. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن تركيب TME يتغير ديناميكيا مع مرور الوقت7،8. عادة ما تثرى الخلايا المناعية المضادة للأورام في TME خلال المراحل المبكرة من تكون الأورام، بينما تصبح مجموعات الخلايا المثبطة للمناعة والمرتبطة بالسرطان هي الأكثر سيطرة مع تطور الورم9. لذلك، فإن فهم التغاير والمرونة في TME أثناء تقدم سرطان الرئة أمر ضروري لتوضيح آليات المرض وتحسين النتائج العلاجية.

يتيح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) التحليل عالي الدقة لتعبير الجينات على مستوى الخلية الفردية، مما يسمح بتوصيف شامل لنسخ الأنسجة المعقدة10. أصبحت هذه التقنية ضرورية لدراسة التغاير الخلوي وتحديد الآليات التي تكمن وراء تقدم الورم ومقاومة الأدوية في سرطان الرئة11. يعد تحضير تعليق خلية واحدة عالي الجودة عنصرا أساسيا لنجاح sRNA-seq، حيث يمكن أن يؤدي إجهاد الخلية أو التلف أثناء التفكك إلى نتائج غير دقيقة 12,13.

يتيح هذا البروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي من جميع الخلايا المفردة المنقاء من رئتين كاملتين حاملتين للأورم، لا يتوافق مع حجم الخلية ودون التخلص من أي مجموعات فرعية من الخلايا الحية. أفادت العديد من الدراسات السابقة بتسلسل خلوي واحد للرئتين الحاملتين للأورام التي ركزت إما على خلايا الورم وتم التخلص من خلايا CD45+ 14,15,16 أو ركزت على الخلايا المناعية أو أنواع خلايا محددة أخرى 17 والخلايا الورمية المهملة. يهدف هذا البروتوكول إلى فصل جميع أنواع الخلايا بكفاءة عن أنسجة الرئة الحاملة لورم الفأر الكامل، مع ضمان إطلاق الخلايا الخبيثة والحفاظ على بقاء الخلايا الطبيعية. من خلال تضمين جميع الخلايا الأحادية الحية، يمكن هذا البروتوكول دراسة جميع أنواع الخلايا ذات الصلة داخل البيئة الدقيقة للرئة الحاملة للأورم، بما في ذلك الخلايا الشبيهة بالبلاعم المرتبطة بالسرطان (CAMLs)18. تتضمن خطوات اختيارية لتصنيف الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لمراقبة الجودة وإثراء مجموعات الخلايا المحددة. يتم تقديم إرشادات إضافية لصبغ الأجسام المضادة، وتصنيف 4',6-دياميدينو-2-فينيليندويل (DAPI)، وإجراءات تثبيت قصيرة الأمد عندما لا يكون الفرز الفوري ممكنا.

من القيود المحتملة لهذا البروتوكول أنه تم تحسينه والتحقق منه للأنسجة الرئوية التي تحتوي على أورام في مراحلها المبكرة ومع عبء الورم أقل من 40٪. بالنسبة للرئتين التي تحتوي على أورام ذات درجة أعلى أو التي يتجاوز فيها عبء الورم 50٪، قد تتأثر كفاءة التفكك بوجود مكونات سمائية كثيفة والتليفالواسع 19,20، مما قد يمنع إطلاق الخلايا الخبيثة الكاملة.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب المتعلقة بالحيوانات وفقا لإرشادات سكريبس للأبحاث لرعاية واستخدام الحيوانات، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في سكريبس للأبحاث بموجب البروتوكول #10-0019. Kras LSL-G12D/+؛ تم توليد فئران TdTomato+/- عن طريق تهجين فئران KrasLSL-G12D/+ مع فئران TdTomato reporter. كراسLSL-G12D/+، عمره تسعة أو عشرة أسابيع؛ تم استخدام فئران TdTomato+/- كنماذج لسرطان الرئة. يصابون داخل القصبة الهوائية بفيروس لينتيفيروس يعبر عن Cre recombinase، بعيار فيروسي يبلغ 5 × 10 إلى5 وحدات مكونة لللويحات لكل فأر. تم جمع أنسجة الرئة الحاملة للأورم بعد 25 أسبوعا. المشاكل الهضمية المحتملة وحل المشكلات مدرجة في الجدول التكميلي 1. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المخازن

  1. متوسط DMEM/F12: جهز 2٪ (v/v) FBS غير منشط بالحرارة في وسط DMEM/F12.
  2. مخزن غسل الخلايا: جهز 2٪ (v/v) FBS غير منشط بالحرارة في PBS حر من Ca+/Mg+ (pH 7.4).
  3. مخزن التروية: PBS خالية من الكالسيوم+/ملغ+ المبرد مسبقا (pH 7.4).
  4. محاليل مخزون الإنزيم: إذابة 10 ملغ (1600 يوث/ملغ) من الكولاجناز IV في وسط DMEM/F12 بسعة 1 مل للحصول على محلول كولاجناز IV بسعة 16000 وحدة U/mL؛ قم بإذابة 42 ملغ (1.19 U/mg) من Dispase II في وسط DMEM/F12 بسعة 1 مل للحصول على محلول مخزن Dispase II بسعة 50 U/mL؛ قم بإذابة 5 ملغ من DNase I في وسط DMEM/F12 بسعة 1 مل للحصول على محلول مخزوني بسعة 5 ملغ/مل DNase I.
  5. وسط الهضم: اخلط 250 ميكرولتر من الكولاجناز IV، و200 ميكرولتر من Dispase II، و100 ميكرولتر من محاليل DNase I في وسط DMEM/F12 بحجم 5 مل للحصول على تركيز نهائي 800 U/mL كولاجناز IV، 2 U/mL Dispase II، و0.1 ملغ/مل DNase I.
  6. مخزن إعادة التعليق: اخلط 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (10 ميكرومول)، 1 مل من FBS غير منشط بالحرارة (2٪ v/v) في 50 مل من Ca+/Mg+ PBS حر (pH 7.4).
  7. محلول مخزون BSA: إذابة 0.5 جرام من BSA في 100 مل من PBS حر من Ca+/Mg+ للحصول على محلول مخزون BSA بنسبة 0.5٪ (مع الوزن).
  8. مخزن FACS: اخلط 2.5 مل من 1 مليون هيبيس، و200 ميكرولتر من 0.5 مليون EDTA في محلول مخزون BSA بسعة 100 مل للحصول على تركيز نهائي 25 ملليمول HEPES و1 ملليمتر EDTA.

2. جمع أنسجة رئة الفأر

ملاحظة: جميع الأدوات الجراحية يتم تعقيم بكمية 70٪ من الإيثانول بين العينات. تحفظ العينات على الثلج بين كل خطوة، وجميع أدوات البلاستيك معتمدة خالية من DNase/RNase.

  1. قتل الفأرفي غرفة ثاني أكسيد الكربون (وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). ضع الفأر على ظهره على وسادة تشريح وثبت قدميه. رش بسخاء بنسبة 70٪ إيثانول.
  2. قم بعمل شق منتصف بعرض 2–3 سم عبر الجلد وعضلات أسفل البطن. افتح الصدر بحذر وتجنب قطع الرئتين أو القلب.
  3. قم بتوصيل إبرة أمان متعددة الطيران بقوة 21 G على حقنة 50 مل واستنشق مخزن تغذية 30 مل.
  4. أدخل الإبرة في البطين الأيسر واقطع شقا صغيرا في الأذين الأيمن باستخدام المقص الحاد والمستقيم.
  5. استخدم جسم كامل21 مع مخزن تروية 15 مل.
    ملاحظة: تبييض الكبد يشير إلى أن التروية للجسم بالكامل قد اكتملت.
  6. قم بإزالة الرئتين من الصدر وقطع الأنسجة الزائدة المرتبطة بالرئتين22. ضع الرئتين في PBS خالية من Ca+/Mg+ مبردة مسبقا بسعة 10 مل لغسل الدم الزائد.
  7. انقل الرئتين إلى أنبوب بحجم 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من DMEM/F12 البارد جدا.

3. تحضير نظام تعليق الخلية المفردة للرئة

  1. اقطع نسيج الرئة إلى قطع صغيرة (1–2 مم3) باستخدام مقص مستقيم ضيق جدا لمدة 2–3 دقائق.
  2. انقل نسيج الرئة المفروم إلى طبق بحجم 6 سم يحتوي على وسط هضم بسعة 5 مل.
  3. ضع طبقا بقطر 6 سم على هزاز حراري عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اخلط نظام التعليق باستخدام ماصة بسعة 1 مل كل 8 دقائق.
  4. ضع مصفاة شبكية بحجم 100 ميكرومتر في طبق بحجم 10 سم. بلل المصفاة مسبقا ب 1 مل من DMEM/F12 متوسط.
  5. انقل التعليق المهضوم إلى المصفاة. ادفع النسيج عبر المصفاة باستخدام طرف المطاط من مكبس حقنة معقمة.
  6. ضع مصفاة شبكية بحجم 70 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل. بلل المصفاة مسبقا ب 1 مل من DMEM/F12 متوسط.
  7. فلتر تعليق الخلية عبر مصفاة وشطف المصفاة بمحلول 5 مل DMEM/F12 وسط.
  8. يتم ترشيح تعليق الخلية بواسطة الطرد المركزي عند 400 جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الفائقة بعناية. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول تحليل خلايا الدم الحمراء بحجم 1 مل لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
  9. أضف 14 مل مخزن غسيل خلية وجهاز طرد مركزي عند 400 جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: إذا كانت الحبيبة لا تزال حمراء بعد الغسيل، كرر الخطوات 8 و9.
  10. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في مخزن تعليق 20 مل.
  11. اخلط 10 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة مع حجم متساو من التريبان بلو وأضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى شريحة غرفة عد الخلية. تحقق من صلاحية الخلية الحية ورقم الخلية وحالة الخلية الفردية باستخدام عداد الهواتف.

4. تحليل قياس التدفق الخلوي

  1. أعد تعليق الخلايا في مخزن FACS البارد جدا وانقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنابيب بحجم 1.5 مل تحتوي على 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة كتلة Fc (1:100). حضن العينات لمدة 15 دقيقة على الثلج.
  2. أخذ عينات من الطرد المركزي عند 500 جرام لمدة 5 دقائق وتخلص من السوبرناتان. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD326-APC (1:100) وحضن الخلايا لمدة 45 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  3. أخذ عينات من الطرد المركزي عند 500 جرام لمدة 5 دقائق وتخلص من السوبرناتان. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من مخزن FACS الذي يحتوي على صبغة DAPI (1:5000).
  4. انقل جميع العينات إلى أنابيب FACS وحميها من الضوء.
  5. تحليل العينات باستخدام مقياس تدفق السيل. تم استخدام الفلوروفورات التالية: DAPI-V450، Tdtomato-YG585، CD326-APC. تظهر استراتيجية البوابة في الشكل 1.

النتائج

تم تحقيق بقاء عالية في نظام التعليق أحادي الخلية الذي أعد باستخدام هذا البروتوكول المحسن. شملت التغييرات التي حسنت قدرة الخلايا على البقاء في الرئتين الحاملة للأورم تحسين تركيز الإنزيمات (الجدول التكميلي 2)، وهز، وخلط العينات أثناء الحضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. علاوة على ذلك، تم إلغاء استخدام مصفاة شبكية إضافية بحجم 40 ميكرومتر في الخطوة 6 لتقليل إجهاد القص الميكانيكي الذي يزيد من احتمال تلف الخلية؛ قد يقلل تضمين المصفاة الإضافية من تكوين الأجزاء المتعددة. في المتوسط، تجاوزت قدرة الخلايا على قيد الحياة 85٪، مقارنة بأقل من 80٪ قبل التحسين (الجدول 1). نسبت التغيرات في تركيز الخلايا بشكل أساسي إلى الاختلافات في حجم الرئة ووسط التعليق المستخدم عبر النسخ المكررة.

في هذا النموذج المدفوع بفيروس كراسG12D لسرطان الغدة الرئية، توجد عقيدات أورامية، وتتراوح أعباء الأورام بين 10٪ و40٪ بعد خمسة وعشرين أسبوعا من بدء الورم23. تم تعريض تعليقين لخلية واحدة للرئة الكاملة ل scRNA-seq على منصة 10x Genomics. حدد تقييم جودة Cell Ranger وجود 23,488 و21,436 خلية مقدرة في العينتين على التوالي (الجدول 2). أشار مخطط الباركود إلى تلوث طفيف في الحمض النووي الريبي المحيط، مما يعكس على الأرجح القدرة العالية على البقاء الخلوي (الشكل 2A,B).

كشف تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وتقريب وإسقاط المتعدد الأبعاد المنتظم (UMAP) عن عناقيد محددة جيدا، مع تمثيل جميع أنواع خلايا الرئة الرئيسية (الشكل 3A). أكدت مخططات النقاط لجينات العلامات الممثلة أن المؤشرات الحيوية التقليدية كانت معبرا عنها بشكل كبير في أنواع الخلايا المقابلة لها (الشكل 3B). علاوة على ذلك، تم إثراء خلايا TdTomato+ في مجموعات مرتبطة بالظهارة، وتم عزل خلايا TdTomato+/EpCAM+ بنجاح بواسطة FACS (الشكل 1).

باختصار، يتيح هذا البروتوكول المحسن تفكيكا فعالا لأنسجة الرئة الحاملة للورم في الفأر، مما ينتج قدرة عالية على البقاء في الخلايا، وتلوث منخفض للحمض النووي الريبي، وتمثيلا خلاويا شاملا.

figure-results-1
الشكل 1: عزل خلايا TdTomato+/CD326 (EpCAM+) بواسطة قياس تدفق الخلية. استراتيجية بوابات التدفق الخلوي لتعليق خلية واحدة في رئة الفأر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: مخطط ترتيب الباركود ScRNA-seq للرئتين الحاملتين لأورام الفئران. كراسLSL-G12D/+؛ تم جمع رئتي الفئران TdTomato+/- بعد 25 أسبوعا من الإصابة بفيروس العدس-Cre. (أ، ب) مخطط تصنيف الباركود للرئة الحاملة للورم من تحليل سيلرينجر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تحليل النسخ الأحادي الخلية للرئتين الحاملتين للأورم في الفأر. (أ) إسقاط UMAP لمجموعات بيانات الرئة الحاملين للأورم كاملة. (ب) رسم نقطي للجينات الكلاسيكية المستخدمة في تعليقات العنقود. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

قبل التحسينبعد التحسين
كرر الحلقة الأولىكرر الحلقة الثانيةكرر الحلقة الأولىكرر الحلقة الثانية
الرقم الكلي للخلية1.3E+066.4E+051.8E+066.4E+05
الخلايا الحية9.8E+055.0E+051.5E+065.7E+05
نسبة الخلايا الحية76%77%83%89%

الجدول 1: قابلية بقاء خلايا تعليق الخلية الأحادية للرئة الحاملة للأورم قبل وبعد التحسين. يتم تحديد تركيز الخلايا ونسبة الخلايا الحية قبل وبعد استخدام هذا البروتوكول.

عينة 1عينة 2
العدد المقدر للخلايا23,48821,436
متوسط القراءات لكل خلية18,35420,542
الجينات الوسيطة لكل خلية2,5652,513
إجمالي الجينات المكتشفة30,89330,556
متوسط عدد وحدات الوحدة الوحدة لكل خلايا6,8646,583
الرموز الشريطية الصالحة95.90%95.80%
التشبع التسلسلي26.10%28.20%
قراءة الكسور في الخلايا94.10%95.40%

الجدول 2: تحليل مراقبة جودة ScRNA-seq بواسطة Cell Ranger. التقديرات الرئيسية لبيانات الخلية المفردة التي تم الحصول عليها من Cell Ranger

الجدول التكميلي 1: حلول استكشاف المشاكل. تقترح حلول لمعالجة المشاكل التي قد تحدث أثناء عملية الهضم. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: مكونات كوكتيل الإنزيمات قبل وبعد التحسين. التركيزات النهائية لكوكتيل الإنزيم المستخدمة قبل وبعد التحسين. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول إجراء تفصيليا خطوة بخطوة لتحضير معلقات عالية الجودة أحادية الخلية من نسيج رئة الفئران. هناك عدة خطوات حاسمة لتحقيق أفضل النتائج.

قبل الهضم الإنزيمي، يجب إجراء تفريغ الدم للجسم بالكامل لإزالة الدم من الرئتين. وهذا يضمن أن الخلايا المناعية التي يكتشفها scRNA-seq تنشأ من نسيج الرئة وليس الدم المتداول. أثناء التروية، من الضروري إدخال الإبرة في البطين الأيسر لمنع دخول البرفوسيت إلى الدورة الدموية الرئوية وإلحاق الضرر بخلايا الرئة. للحفاظ على حيوية الخلية، يجب تبريد جميع المخازن، بما في ذلك الغسيل، وإعادة التعليق، وحلول التصريف مسبقا على الثلج. نظرا للتغاير الفطري في نسيج الرئة24، يجب الاحتفاظ بالعينات في وسط DMEM/F12 قبل وأثناء الهضم، حيث يوفر هذا الوسط مغذيات أساسية تحافظ على بقاء الخلايا.

تؤكد القدرة العالية على بقاء الخلايا ومجموعات الخلايا المحددة جيدا في هذا البروتوكول أن تركيبة الإنزيمات خفيفة وفعالة في آن واحد. من المعروف أن أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم تعزز تكتل الخلايا وتعززالنشاط الإنزيمي. لذلك، يستخدم PBS الحر من Ca+/Mg+ لتحضير معظم المخازن لتقليل التكتل، بينما يستخدم DMEM/F12 الذي يحتوي على هذه الأيونات كوسط قاعدي لمخزن الهضم للحفاظ على كفاءة إنزيمية متوازنة.

بينما وصفت دراسات سابقة انفصال رئتي الفئران أو أنسجة الأورام، إلا أنها غالبا ما تظهر تباينا كبيرا أو وصفا غير كامل لاختيار وتركيز البروتياز 11,15,27. على سبيل المثال، استخدم هان وآخرون كوكتيلات إنزيمية دون الإبلاغ عن تركيزها، مما يجعل التكرار صعبا. وعلى العكس، فإن طريقة متخصصة للغاية وصفها تشين وآخرون فعالة في تفكك خلايا الحويخة من النوع الثاني (AT2) لكنها تتطلب سير عمل معقد، وهو أمر غير عملي إذا كان من الضروري جمع عدة فئران في نفس الوقت.

تحد حاسم في أبحاث أورام الرئة هو التباين الهيكلي للرئة الحاملة للأورم، والتي تتكون من خلايا طبيعية هشة وخلايا أورامية خبيثة. غالبا ما تصمم البروتوكولات القياسية أو المجموعات التجارية لعينات الأنسجة أو الأورام الطبيعية تحديدا. إما أن تؤدي إلى هضم غير مكتمل، أو فشل في تحرير خلايا السرطان من نواة الورم، أو الهضم الزائد، مما يسبب إجهادا كبيرا وموت الخلايا في الأنسجة الطبيعية الأكثر حساسية في عينات الرئة الحاملة للأورم.

يعالج هذا البروتوكول ذلك من خلال ضبط الكوكتيل الإنزيمي (كولاجناز IV، Dispase II، وDNase I) لتحقيق تفكك متوازن. يضمن هذا التحسين إطلاق الخلايا الخبيثة مع الحفاظ على بقاء الخلايا الطبيعية. يدعم ذلك تحليل قياس تدفق الخلايا الخلوي، حيث نجحنا في تحديد وحل خليتين ظهاريتين مختلفتين. الخلايا الظهارية مفصولة جيدا إلى خلايا TdTomato+ أو TdTomato- خلايا. هذا المستوى من الدقة يوضح أن هذه الطريقة مناسبة لدراسة البيئة الدقيقة الكاملة للرئة الحاملة للأورم دون التضحية بسلامة نسيج المضيف. من خلال تضمين جميع الخلايا الأحادية الحية في التحليل، يمكن هذا البروتوكول دراسة جميع أنواع الخلايا ذات الصلة داخل البيئة الدقيقة للرئة الحاملة للأورم، بما في ذلك الخلايا الشبيهة بالبلاعم المرتبطة بالسرطان (CAMLs) (الشكل 3)، والتي لم يتم الإبلاغ عنها على نطاق واسع في الدراساتالسابقة 15,16,17.

بعد الهضم، أظهرت تحليلات scRNA-seq أن هذا الإجراء يعزل بنجاح أنواع خلايا متنوعة. يجب تحضير المحاليل الإنزيمية حديثا في يوم التجربة. جميع معايير الهضم محسنة لرئة فأر واحدة كاملة. عند استخدام فص واحد فقط أو عدة رئتين، يجب ضبط وقت الهضم لضمان بقاء الخلايا العالية وتفكك كامل للأنسجة. التلوث الريبي المحيط وتكوين الأجزاء المتعددة هما عاملان رئيسيان يؤثران على جودة scRNA-seq29. على الرغم من أن مجموعات إزالة الخلايا الميتة غالبا ما تستخدم لتعزيز الصلاحية، إلا أن هذا البروتوكول ينتج باستمرار أكثر من 80٪ من الخلايا الحية بعد الهضم، مما يجعل هذه الخطوة اختيارية. أكد مخطط تصنيف الباركود وجود تلوث طفيف في الحمض النووي الريبي المحيط حتى بدون إزالة الخلايا الميتة.

تؤكد الدراسة الحالية صحة هذه المنهجية في سياق الرئة الفأرية الحاملة للأورم بالكامل. يوفر هذا الهضم الإنزيمي المحسن نموذجا لدراسة الأنسجة الحاملة للأورام الأخرى التي تتميز ببيئات دقيقة مشابهة. علاوة على ذلك، فإن القدرة العالية على البقاء والحفاظ على جميع أنواع الخلايا التي حققها هذا البروتوكول تجعله مناسبا لتقنيات التسلسل المتقدمة، مثل CITE-seq لرسم خرائط البروتينات السطحية وATAC-seq للتنميط فوق الجيني (اللاجينية).

على الرغم من أن هذا البروتوكول ينتج معلقات خلية واحدة عالية الجودة بتكلفة منخفضة، إلا أن الإجهاد الخلوي الناتج عن العملية قد يحدث أثناء الهضم الإنزيمي. لتقليل تشوهات التعبير الجيني المرتبطة بالإجهاد، يجب أن يعالج عامل واحد ما لا يزيد عن أربع عينات في نفس الوقت.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنهم لا يملكون مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للصحة، والمعهد الوطني للعيون (NEI)، الولايات المتحدة الأمريكية، المنح 5R01EY026202، R01EY035333؛ منح المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والوجه (NIDCR) R01DE031044، 2R01DE014756، ومنح المعهد الوطني للسرطان (NCI) R01CA271500 و2R01CA211187.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM/F12ثيرمو فيشر11320033زراعة الخلايا
الكولاجيناز من النوع الرابعسيغما ألديتشC5138الإنزيمات الهاضمة
ديسباسي IIسيغما ألديتشD4693الإنزيمات الهاضمة
DNase Iروش11284931001إزالة الحمض النووي
مصفاة خلية فالكون 70فالكون352350إزالة الأنسجة غير المهضومة
مقص معقمFST14088-10الأنسجة المقطوعة
مخزن تحلل خلايا الدم الحمراءسيغما ألديتشR7757إزالة خلايا الدم
FBS غير نشط بالحرارةفينيكس ساينتيفكPS100حماية الخلايا
PBS خالية من Ca+/Mg+ثيرمو فيشر10010023إنزيمات الديسيد/خلايا الغسيل
إبرة 21G متعددة الأمان  سارستيدت3051524تروية الجسم بالكامل
50 مل حقنة  BD300866تروية الجسم بالكامل
طبق 6 سمكورنينغ430116هضم الأنسجة
طبق 10 سمكورنينغ430167هضم الأنسجة
الأجسام المضادة للكتلة FCBD553141; RRID:AB_394655قياس التدفق الخلوي
DAPIBD564907; RRID:AB_2869624قياس التدفق الخلوي
CD326BD563478; RRID:AB_2738234قياس التدفق الخلوي
HIVmPGKCre VSVGنواة فيروسية UI VectoreVVC-U في آيوا-7556لينتيفاروس
مقياس تدفق ZE5 (يتي)بيو-رادتحليل قياس تدفق الخلايا
فأرة KrasLSL-G12D/+مختبر جاكسون008179; RRID:IMSR_JAX:008179
فأر مراسل TdTomatoمختبر جاكسون007909; RRID:IMSR_JAX:007909 

المراجع

  1. Leiter, A., Veluswamy, R. R., Wisnivesky, J. P. The global burden of lung cancer: current status and future trends. Nat Rev Clin Oncol. 20 (9), 624-639 (2023).
  2. Schabath, M. B., Cote, M. L. Cancer progress and priorities: Lung cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 28 (10), 1563-1579 (2019).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Yu, H. A., et al. Poor response to erlotinib in patients with tumors containing baseline EGFR T790M mutations. Ann Oncol. 25 (2), 423-428 (2014).
  5. Cappuzzo, F., et al. MET increased gene copy number and primary resistance to gefitinib therapy in non-small-cell lung cancer. Ann Oncol. 20 (2), 298-304 (2009).
  6. Maman, S., Witz, I. P. A history of exploring cancer in context. Nat Rev Cancer. 18 (6), 359-376 (2018).
  7. Croci, D. O., et al. Dynamic cross-talk between tumor and immune cells in orchestrating the immunosuppressive network. Cancer Immunol Immunother. 56 (11), 1687-1700 (2007).
  8. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity. 21 (2), 137-148 (2004).
  9. Mittal, D., Gubin, M. M., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. New insights into cancer immunoediting: Elimination, equilibrium and escape. Curr Opin Immunol. 27, 16-25 (2014).
  10. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nat Rev Immunol. 18 (1), 35-45 (2018).
  11. Han, G., et al. An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma. Nature. 627 (8004), 656-663 (2024).
  12. van den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  13. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  14. Zhao, W., et al. A cellular and spatial atlas of TP53-associated tissue remodeling defines a multicellular tumor ecosystem in lung adenocarcinoma. Nat Cancer. 6 (11), 1857-1879 (2025).
  15. Marjanovic, N. D., et al. Emergence of a high-plasticity cell state during lung cancer evolution. Cancer Cell. 38 (2), 229-246.e13 (2020).
  16. Xie, L., et al. PLVAP mediates regulation of the tumour microenvironment in early-stage lung adenocarcinoma. Clin Transl Med. 15 (12), e70532(2025).
  17. Fernandes, L. M., et al. A single-cell atlas of normal and KRASG12D-malformed lymphatic vessels. JCI Insight. 10 (5), e185181(2025).
  18. Pirrello, A., Killingsworth, M., Spring, K., Rasko, J. E. J., Yeo, D. Cancer-associated macrophage-like cells as a prognostic biomarker in solid tumors. J Liquid Biopsy. 6, 100275(2024).
  19. Rudnick, J. A., Debnath, J. Autophagy in host stromal fibroblasts supports tumor desmoplasia. Autophagy. 17 (12), 4497-4498 (2021).
  20. Nissen, N. I., Karsdal, M., Willumsen, N. Collagens and cancer-associated fibroblasts in reactive stroma. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 115(2019).
  21. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  22. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).
  23. Pariollaud, M., et al. Circadian disruption enhances HSF1 signaling and tumorigenesis in KRAS-driven lung cancer. Sci Adv. 8 (39), eabo1123(2022).
  24. Wu, F., et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and microenvironment in advanced NSCLC. Nat Commun. 12 (1), 2540(2021).
  25. McKeehan, W. L., Ham, R. G. Calcium and magnesium ions regulate multiplication in normal and transformed cells. Nature. 275 (5682), 756-758 (1978).
  26. Seltzer, J. L., Welgus, H. G., Jeffrey, J. J., Eisen, A. Z. Role of Ca2⁺ in mammalian collagenase activity. Arch Biochem Biophys. 173 (1), 355-361 (1976).
  27. Shao, S., et al. Pharmacological expansion of type II alveolar epithelial cells promotes airway repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (16), e2400077121(2024).
  28. Chen, Q., Liu, Y. Isolation and culture of mouse alveolar type II cells. STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).
  29. Arceneaux, D., et al. A contamination-focused approach for optimizing single-cell RNA-seq experiments. iScience. 26 (7), 107242(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

tdTomato
التحضير الأمثل للأنسجة الرئوية الحاملة للورم في الفأر الكامل لقياس تدفق الخلايا وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.