هنا، نقدم طريقة معيارية لعزل الخلايا الجذعية والخلايا الدهنية المشتقة من الدهون بكفاءة، تتميز بانخفاض >90٪ في وقت المعالجة، وحيوية عالية للخلايا، وتوافق واسع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزل الفعال للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون والخلايا الدهنية من نسيج الدهون الخنازيري
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
برزت الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs) كخلايا بذور مثالية في الطب التجديدي بسبب مصادرها الوفيرة، والحصاد طفيف التوغل، وإمكانات التمايز متعددة الأنساس، وخصائصها المعدلة للمناعة. تشمل تطبيقاتها إصلاح الأنسجة، ونمذجة الأمراض، والعلاج الخلوي؛ ومع ذلك، يظل العزل الفعال لمراكز التغذية المغذية عالية القدرة على البقاء أمرا حيويا لتقدم البحث والترجمة السريرية. طرق العزل التقليدية، مثل الهضم الإنزيمي مع التفكك الميكانيكي عبر التوصيل بالماصات، محدودة بأوقات معالجة طويلة (1–3 ساعات)، وضعف بقاء الخلايا (غالبا <70٪)، والتفاوت الكبير بين الدفعات، مما يؤثر على التجارب اللاحقة.
هنا، نقدم نظام SoniConvert (نظام فصل الخلايا الميكانيكي القائم على الموجة)، الذي يجمع بين الموجة الميكانيكية والهضم الإنزيمي لمعالجة هذه التحديات. يدمج النظام وحدة تحكم تعتمد على المعالج الدقيق تنظم التفكك الميكانيكي الموجي عبر التغذية الراجعة الرقمية، إلى جانب كاشف فخم خاص بالأنسجة محسن للأنسجة الدهنية (حضانة من 5 إلى 15 دقيقة). يتيح هذا النهج التحويل السريع للأنسجة إلى تعليق خلية واحدة، مع إتمام التفكك الميكانيكي خلال 3–9 ثوان.
يقدم النظام ثلاث مزايا: (1) معالجة فائقة السرعة، مع عملية عزل النواة — من الهضم الإنزيمي إلى فصل أجزاء الخلايا الأولي — التي تكتمل في حوالي 30 دقيقة (>90٪ تقليل مقارنة بالطرق التقليدية); (2) الحفاظ على قابلية حياة، مع تلوين تريبان الأزرق الذي يؤكد صلاحية الخلية بنسبة 80–95٪، متجاوزا البروتوكولات التقليدية؛ و(3) التوافق الواسع، حيث تلبي المعلقات أحادية الخلية الناتجة متطلبات الزراعة الخلوية الأولية، وقياس تدفق الخلية، واختبارات السمية الخلوية، وبناء العضوية الدهنية. من خلال تقليل وقت المعالجة، وتعزيز سلامة الخلايا، والحد من التباين، يوفر هذا النظام منصة عملية للأبحاث المتعلقة بالدهون.
المقدمة
الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs)، وهي مجموعة أساسية من الخلايا الجذعية الميزنشيمية المعزولة من الأنسجة الدهنية، تظهر إمكانات علاجية كبيرة بسبب سهولة وصولها، والحصاد طفيف التوغل، وقدرتها القوية على التكاثر، وإمكانات التمايز متعددة السلالات، وخصائصها القوية في الباراكرين والتعديل المناعي 1,2,3,4 . وقد وضعت هذه الصفات مراكز ADSCs كمرشحين واعدين للطب التجديدي، وهندسة الأنسجة، والعلاج المناعي. ومع ذلك، تعتمد فائدة الترجمة لأنظمة ADSC على القدرة على عزل مجموعات سكانية عالية النقاء سليمة وظيفيا — وهي عملية لا تزال تحديا تقنيا. يقدم علم الأحياء الفريد للأنسجة الدهنية عقبتين رئيسيتين: (1) المحتوى العالي من الدهون في الخلايا الدهنية يجعلها عرضة للتمزق أثناء المعالجة الميكانيكية، مما يطلق دهونات حرة تلوث الجزء الوعائي البتكمي (SVF) وتؤثر على قدرة الخلايا على الاستمرار وتعطيل 5,6؛ و(2) تعقيد النسيج الهيكلي، الذي يشمل اللفافة، خلايا البطانة، الخلايا المناعية، ومكونات الدم7، يعقد فصل الخلايا المشتقة من الدهون. تؤكد هذه القيود الحاجة الملحة لطريقة فعالة وسريعة ومحافظة على الجدوى لعزل الخلايا الدهنية والخلايا الدهنية عالية الجودة، والتي تعتبر ضرورية بنفس القدر للتطبيقات اللاحقة مثل نمذجة الأمراض الأيضية والعلاجات المعتمدة على الخلايا.
تتوفر حاليا عدة طرق معروفة لعزل الخلايا المشتقة من الدهون، بما في ذلك الهضم الإنزيمي، وزراعة الزراعة الخارجية، والفصل الميكانيكي 8,9,10. الهضم الإنزيمي، وهو النهج الأكثر تبنيا، يستخدم الكولاجناز لتحليل مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، مما يطلق خلايا جذعية مغلفة. عادة ما تتضمن هذه الطريقة تقطيع الأنسجة، وهضم الكولاجناز (37 درجة مئوية، 1–2 ساعة)، وعزل SVF عبر الطرد المركزي، وتنقية الزراعة اللاصقة. على الرغم من فعاليته في تفكيك ECM، يعاني الهضم الإنزيمي من عيوب ملحوظة: وقت معالجة طويل (3–4 ساعات إجمالا)، الاعتماد على أحجام عينات كبيرة، ومخاطر السمية الخلوية الإنزيمية أو التغير من دفعة إلى دفعة من كولاجنازات الحيوانية—وكلها تعيق الترجمة السريرية. تنتج زراعة إكسبلاينت، التي تستفيد من هجرة الخلايا الجذعية من شظايا الأنسجة، خلايا ذات قابلية حفظ للحياة لكنها تعاني من انخفاض إنتاجية وتأخر في تعافي الخلايا (7–10 أيام). التفكك الميكانيكي، الذي يعتمد على الاضطراب الفيزيائي (مثل التذبذب، القص)، يقلل من وقت المعالجة لكنه غالبا ما يضر بسلامة الخلية، مما يؤدي إلى تقليل قابلية البقاء وعدم نقية التجمعات. معا، تفشل هذه الطرق في التوفيق بين الكفاءة والنقاء والقابلية للاستمرارية—وهي معايير حاسمة لعزل الخلايا من الدرجة السريرية. لذا، نقترح طريقة جديدة لعزل الخلايا المشتقة من الدهون (الخلايا الدهنية والخلايا المدمجة ADSCs) تجمع بين الهضم الإنزيمي والتفكك الميكانيكي الموجي11. يحقق هذا النهج تقدمين رئيسيين: (1) كفاءة الوقت: من خلال دمج كوكتيلات إنزيمات خالية من الحيوانات محسنة مسبقا مع موجات ميكانيكية منخفضة التردد، يتم تقليل وقت المعالجة الكلي من 3–4 ساعات إلى ~30 دقيقة (الشكل 1)؛ (2) الحفاظ على البقاء: يقلل التشتت الميكانيكي اللطيف من تمزق الخلايا الدهنية وإطلاق الدهون. ومن المهم أن الإطار الزمني البالغ 30 دقيقة يشير إلى سير عمل عزل النواة (الهضم، التفكك الميكانيكي، الترشيح، والطرد المركزي الأولي) للحصول على كسور خام للخلايا الدهنية وكسور SVF؛ تتطلب خطوات التنقية الاختيارية في مرحلة التصفية، مثل تحليل خلايا الدم الحمراء (RBC)، وقت معالجة إضافي.
تظهر طريقتنا المحسنة لعزل خلايا الدهون إمكانات كبيرة للتطبيق عبر مجالات بحثية وسريرية متعددة. في الأبحاث الأساسية، تظهر الخلايا عالية القدرة على الحياة المكتسبة أداء استثنائيا في دراسات التمايز الناتج عن الأديبوجينات والعظيمية، مما يوفر مصدرا موثوقا للخلية لتطبيقات هندسة الأنسجة. في الطب الانتقالي، أظهرت الدراسات السريرية الإمكانات العلاجية لمراكز الالتهاب الدهنسي في علاج حالات مثل التهاب المفاصلالعظمي 12، وأمراض القلب والأوعية الدموية13، والتصلب المتعدد14، ومرض التهاب الأمعاء (IBD)/مرض كرون15. تعد هذه الخلايا المعزولة بسرعة كبنات مثالية لبناء عضويات الأنسجة الدهنية وتنفيذ تطبيقات العلاج الخلوي، مما يدفع بشكل كبير في أبحاث فحص الأدوية ونمذجة الأمراض. علاوة على ذلك، فإن التعليق عالي الجودة أحادي الخلية مناسب لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. في الختام، يؤسس هذا النهج المتكامل منصة تكنولوجية قوية للأنسجة الدهنية، تدعم كل من البحث الأساسي والترجمة السريرية في الطب التجديدي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع أبحاث الحيوانات وفقا للوائح إدارة شؤون الحيوانات التجريبية (وزارة العلوم والتكنولوجيا، الصين، تم تعديلها في مارس 2017)، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات ورفاهية الحيوان في جامعة سيتشوان الزراعية (رقم الإذن: 20230089). يتطلب هذا البروتوكول استخدام نظام SoniConvert، وهو جهاز متوفر تجاريا لتفكك الأنسجة بمساعدة الموجة الميكانيكية (ويشار إليه لاحقا بنظام التفكك الميكانيكي). البروتوكول محسن لتناسب نسيج الدهن الخنزيري، واعتماده على هذه المعدات المتخصصة هو قيد رئيسي.
1. جمع وتحضير الأنسجة الدهنية
- التعقيم قبل العملية وإزالة الشعر
- قتل الخنزير عن طريق جرعة زائدة عن الصوديوم البنتوباربيتال عن طريق الوريد (100 ملغ/كجم من وزن الجسم). تأكيد الوفاة قبل جمع الأنسجة.
- ضع شاشا معقما منقوعا في 2٪ يود لتعقيم لولبي لظهر الخنزير، ويمتد لمسافة 15 سم من خط المنتصف. اترك ليجف لمدة 30 ثانية.
- استخدم شفرة حلاقة معقمة لحلق الشعر من منطقة بحجم 16 سم × 8 سم. تأكد من إزالة كل الشعر من منطقة العمليات.
- امسح الخلف مرتين بنسبة 75٪ إيثانول باستخدام شاش معقم.
- جمع الأنسجة الدهنية
- قم بعمل شق عرضي بطول 20 سم على طول الخط الأوسط الظهري باستخدام مشرط معقم.
- ارفع حافة الشق باستخدام ملقط معقم. قم بتقشير على المستوى الطبيعي بين النسيج الدهني والأدمة للحصول على طبقة علوية كاملة من طبقة النسيج الدهني تحت الجلد الخلفي (ULB) بسماكة تقارب 2–3 ملم.
- اشطف ال ULB مرة واحدة في محلول ملحي معقم بارد جدا وضعه في طبق زراعة معقم (الشكل 2).
الشكل 2: جمع ULB للخنازير لعزل الخلايا. (أ) توضيح لبنية نسيج ظهر الخنزير الدهني؛ (ب) موقع قطع خنازير صغيرة في باما؛ (ج) ظهور نسيج دهني خلفي، يحتوي الدهن تحت الجلد في ظهر الخنزير على طبقتين، الطبقة العليا (ULB) والطبقة الداخلية (ILB); (د) ULB المجمع. الاختصار: ULB = الطبقة العليا من الظهر؛ ILB = الطبقة الداخلية للظهر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
نقطة التوقف: يمكن حفظ النسيج الدهني المجمع في محلول ملحي معقم مثلج أو محلول D-Hanks عند 4 درجات مئوية لفترة قصيرة قبل التشريح الإضافي.
ملاحظة: الهدف هو جمع ULB. تجنب إدخال الطبقة السفلية من نسيج الدهون الخلفية تحت الجلد (ILB) أثناء التشريح.
- تشريح وتنظيف الأنسجة الدهنية
- أضف 10 مل من محلول D-Hanks البارد المثلج لكل 1.8 جرام من النسيج إلى الطبق وتأكد من أن النسيج مغمور بالكامل.
- تحديد وإزالة جميع الأوعية الدموية المرئية من الأنسجة باستخدام مقص جراحي معقم. قم بإزالة أي نسيج ضام ومكونات ليفية. تخلص من المواد المستخرجة في حاويات مخصصة للخطر البيولوجي.
ملاحظة: استخدم الحذر الشديد عند التعامل مع الآلات الحادة؛ دائما اقطع بعيدا عن الجسم وتخلص من الشفرات والمقصات المستخدمة في حاويات حادة فور الاستخدام. - اشطف الأنسجة داخل مخزن D-Hanks لإزالة الدم المتبقي والحطام.
ملاحظة: للعينات التي تحتوي على ورم دموي زائد، استبدل المخزن 1–3 مرات حسب الحاجة لتحقيق وضوح بصري. حافظ على جميع خطوات التشريح على الثلج للحفاظ على صحة الأنسجة.
- التفكك الميكانيكي للأنسجة الدهنية
- انقل 1.8 جرام من شظايا الأنسجة المغسولة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 مل. أضف 800 ميكرولتر من محلول تفكك الأنسجة من النوع A (A-buffer) إلى الأنبوب.
- باستخدام مقص عيون معقم، قم بتقطيع الأنسجة في الأنبوب إلى قطع صغيرة بحجم يقارب 1–2 مم3 بوصة.
ملاحظة: إذا لوحظ تسرب كبير للدهون أثناء أو بعد التقطيع، اغسل الأنسجة مرة أخرى بمحلول D-Hanks المبرد مسبقا بمقدار 1 مل قبل الانتقال إلى الهضم الإنزيمي لإزالة الدهون من الخلايا الدهنية المكسورة. تحافظ هذه الخطوة على سلامة الخلايا الدهنية للتحليل اللاحق.
2. عزل الخلايا وتجانسها
- المعالجة الإنزيمية
- أضف 200 ميكرولتر من عامل تفكك الأنسجة من النوع A (محلول النوع A) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. قم بتدوير الأنبوب وهزه بلطف باليد 3 مرات لخلط المحتويات والتأكد من أن شظايا الدهون مغمورة بالكامل في محلول التفكيك.
- تأكد من أن غطاء الأنبوب مغلق بإحكام. ضع الأنبوب في حوض معدني بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وحضن لمدة 5–10 دقائق.
ملاحظة: راقب المحلول حتى يصبح عكاريا وتبدو شظايا الأنسجة مهضومة جزئيا. يحتوي محلول النوع A على الكولاجناز والبروتيز المحايد. ارتد قفازات النتريل، ومعطف مختبر، ونظارات أمان عند التعامل معه. تجنب ملامسة الجلد؛ إذا حدث تعرض، اشطفها فورا بماء كثيف لمدة 15 دقيقة. لن يتم التخلص من A-Buffer بعد إضافة حل النوع A.
- التفكك الميكانيكي بمساعدة الموجات فوق الصوتية
- انقل شظايا الأنسجة الدهنية المهضومة جزئيا مع المخزن المحيط من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 مل مخصص لنظام التفكك الميكانيكي.
- شغل البرنامج المسبق لنسيج دهني في نظام التفكك الميكانيكي لإجراء التفكك الميكانيكي باستخدام موجة جيبية بسرعة 200 هرتز.
3. الترشيح للحصول على تعليق خلية واحدة
- الترشيح والطرد المركزي
- اجمع تعليق الخلية ومرره عبر مصفاة خلية بحجم 200 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 50 مل لإزالة الحطام الكبير وكتل الأنسجة غير المهضومة.
- أضف 5 مل من محلول D-Hanks المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) إلى المصفاة. شطف المصفاة بمحلول D-Hanks مرتين لتعظيم إنتاج الخلية.
- قم بالطرد المركزي بتعليق الخلية المفلتر عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
نقطة التوقف: بعد الطرد المركزي، يمكن معالجة تعليق الخلية فورا أو إبقاؤه على الثلج لفترة قصيرة قبل فصل الطبقات. - جمع الخلايا الدهنية: لجمع الخلايا الدهنية، يتم استنشاق وتخلص من طبقة الدهون الفوقية باستخدام ماصنة معقمة معقمة، مع ترك 1 مل من العزل لحماية طبقة الخلايا الدهنية. اجمع الطبقة الثانية لتحليل الخلايا الدهنية في الأسفل في النهاية. تجنب إزعاج الطبقتين الثالثة والرابعة.
- تجمع الجزء الوعائي البكتمي (SVF): بعد إزالة الطبقات العلوية، أعد تعليق الحبيبة السفلية التي تحتوي على الجزء الوعائي النسمي (SVF) بلطف في 1 مل من D-Hanks/PBS. أعد تعليق حبيبة الخلية بلطف في 1 مل من D-Hanks/PBS لتحقيق تركيز خلوي يتراوح بين 2–5 × 106 خلايا/مل.
ملاحظة: من الناحية المثالية، يمكن ملاحظة أربع طبقات بعد الطرد المركزي: طبقة الدهون في الأعلى؛ الطبقة الثانية التي تحتوي على الخلايا الدهنية؛ الثالث هو طبقة العزل المحبة للماء؛ والطبقة السفلية هي SVF، التي تحتوي على الخلايا الجذعية (الشكل 1).
- تحليل الخلل الأحمر الأحمر
- ملاحظة: إذا أظهرت الحبيبات الحمراء لونا أحمر كبيرا، مما يدل على تلوث خلايا الدم الحمراء، قم بإجراء تحليل الرياح.
أعد تعليق الحبيبات الخلوية في 1–3 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) باستخدام ماصة P1000 ذات أطراف واسعة التجويف. حضن على الثلج لمدة 15 دقيقة مع خلط أحيانا. - قم بتبريد جميع المحاليل ودوارات الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية لتقليل النشاط الأيضي أثناء المعالجة.
- الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق الفائق بالكامل.
- اغسل الخلايا مرة أخرى عن طريق إعادة تعليق الحبيبات في محلول D-Hanks المبرد مسبقا وجهاز الطرد المركزي بمقدار 5 مل بدرجة حرارة 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
- ملاحظة: إذا أظهرت الحبيبات الحمراء لونا أحمر كبيرا، مما يدل على تلوث خلايا الدم الحمراء، قم بإجراء تحليل الرياح.
- إعادة التعليق النهائية
- أعد تعليق الحبيبة النهائية في D-Hanks/PBS للتطبيقات اللاحقة.
4. التطبيقات والتحليل في مرحلة ما بعد التدفق.
- تقييم بقاء خلايا SVF وتقييم إنتاجية الخلايا
- جهز تعليق خلايا SVF الذي تم الحصول عليه في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل. حافظ على التعليق على التجميد حتى الاستخدام.
- اخلط 10 ميكرولتر من تعليق خلية SVF مع 10 ميكرولتر من محلول Trypan Blue بنسبة 0.4٪ في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 0.5 مل. استخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل 3 مرات لضمان خلط متساو.
ملاحظة: التركيز النهائي لتريبان بلو في الخليط هو 0.2٪. تجنب إدخال فقاعات الهواء أثناء الخلط، لأنها قد تتداخل مع العد الآلي للخلايا.
نقل 10 ميكرولتر من خليط الخلايا المصبوغ إلى شريحة عد مناسبة لعداد الخلايا الآلي. تأكد من أن العينة تملأ الحجرة بالكامل دون فائض. - أدخل شريحة العد في عداد الزنزانة. اختر نوع اختبار Trypan Blue وضبط نطاق تركيز الخلية إذا لزم الأمر.
- اضغط زر العد لبدء العد الآلي للهواتف. سيلتقط الجهاز صورا لغرفة العد ويميز الخلايا الحية عن الخلايا الميتة تلقائيا.
- سجل نسبة صلاحية الخلايا ويعد إجمالي عدد الخلايا الصالحة للحياة المعروضة على شاشة الجهاز. قم بإجراء ثلاث قياسات مستقلة لكل عينة وحساب متوسط القدرة على البقاء وإنتاج الخلايا لكل جرام من نسيج دهني.
ملاحظة: نظف شريحة العد ومنفذ تحميل الجهاز بنسبة 70٪ من الإيثانول بعد كل استخدام لمنع التلوث المتبادل بين العينات.
- ملاحظة شكل الخلايا الدهنية
- صبغ الخلايا الدهنية المعزولة ب 5 ميكروغرام/مل هوشست للنوى و1 ميكرومولار بوديبي للدهون في D-Hanks/PBS لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
نقطة التوقف: بعد التلوين، يجب تصوير العينات بسرعة؛ إذا لزم الأمر، يمكن حمايتها من الضوء عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لفترة قصيرة قبل المجهر. - استخدم نظام زجاجي مغطى بشريحة صديق لخلايا الدهون مصنوع يدويا لتحضير الشرائح لتجنب ضغط الخلايا.
- راقب النوى (الملونة ب Hoechst) وقطرات الدهون (المصبوغة ب BODIPY) تحت مجهر فلوري.
ملاحظة: بسبب الحجم الكبير (20–300 ميكرومتر) ومحتواها العالي من الدهون، فإن الخلايا الدهنية هشة، تميل إلى الطفو، وتتكدس في طبقات متعددة، مما يجعل طرق التثبيت التقليدية غير مناسبة للرصد المجهري الواضح (الشكل 3A). لمعالجة ذلك، تم تطوير نظام تثبيت منزلي الصنع صديق للخلية الدهونية باستخدام شرائح وغطاء قياسي (الشكل 3B).
- صبغ الخلايا الدهنية المعزولة ب 5 ميكروغرام/مل هوشست للنوى و1 ميكرومولار بوديبي للدهون في D-Hanks/PBS لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تنقية مكونات الأوعية الدموية البثوية والملاحظة الشكلية لأحلام ADSCs
- تم زرع SVF المعزولة حديثا في قارورة زراعة خلايا T25 تحتوي على 5 مل من DMEM مع 10٪ FBS و1٪ بنسلين-ستربتومايسين. حضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
- بعد 48 ساعة، اغسل القارورة بلطف مرتين باستخدام PBS المسخن مسبقا لإزالة الخلايا غير الالتصقة. أضف وسط زراعة طازج واستمر في الحضانة.
- استبدل وسيط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة أيام. راقب شكل الخلايا والتقاطعها تحت مجهر مقلوب.
- عندما تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 80–90٪ (عادة بعد 7–10 أيام)، افصل الخلايا باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA لمدة 3–5 دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بالتحييد باستخدام وسط الزراعة واجمع تعليق الخلية.
- قم بإجراء تلوين Trypan Blue لاكتشاف صلاحية الخلية قبل اكتشاف وفرز FACS.
- راقب شكل الميكروسكوب المزروعة المنقاة تحت المجهر البصري.
- قم بترشيح تعليق الخلية المجمع عبر منخل خلوي بقطر 70 ميكرومتر لإزالة أي تجمعات متبقية. أعد تعليق الخلايا في PBS التي تحتوي على 2٪ FBS لتحليل FACS.
- صبغ الخلايا بأجسام مضادة متقاربة بالفلوروكروم ضد CD73 وCD90 وCD11b وCD45 لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
- اغسل الخلايا مرتين باستخدام محلول التلوين وأعد تعليقها في PBS يحتوي على 2٪ FBS.
- إجراء تحليل تدفق الخلايا باستخدام فوهة 70 ميكرومتر عند 20 psi ومعدل تدفق أقل من 3.0.
- استبعد حطام الخلايا عن طريق تحديد البوابة على المجموعة الرئيسية باستخدام معلمات منطقة التشتت الأمامي (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبي (SSC-A).
- إزالة الدوبلتات بواسطة FSC-A مقابل FSC-H واختر مجموعة الطبقات المفردة القابلة للتحليل لاحقا.
- تحليل الخلايا المحصورة بناء على تعبير العلامة السطحية. استخدم CD73 وCD90 كمؤشرات إيجابية وCD11b وCD45 كعلامات سلبية للتحقق من النمط الظاهري ل ADSC.
- راقب شكل الميكروسكوات المثرية والمزرعة تحت المجهر البصري. تشير الشكل المميز على شكل المغزل الشبيه بالأرومات الليفية إلى نجاح في تخصيب ADSC.
- التمايز الديني الناتج عن ADSC
- زرع الجيل الثالث من الخلايا المدمجة بكثافة 1 × 104 خلايا/سممربع. عندما يصل التقاء الخلايا إلى حوالي 90٪، ابدأ التحفيز الدهني المنشأ.
- تحضير وسط التحفيز الأديبوجيني باستخدام وسط إيجل المعدل (DMEM) من دولبيكو عالي الجلوكوز والذي يحتوي على 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS)، و0.5 ملليمولار 3-إيزوبيوتيل-1-ميثيلزانثين (IBMX)، و1 ميكرومولار ديكساميثازون، و10 ميكروغرام/مل إنسولين، و1 ميكرومولار روزيغليتازون.
- بعد 3 أيام من الحث، استبدل الوسط بوسط صيانة وغير المحلول كل يومين.
- بعد 14 يوما من التحفيز، قم بصبغ الخلايا بزيت أحمر O ورصد قطرات الدهون تحت مجهر مقلوب.
- التمايز العظامي ADSC
- عندما يصل التقاء الخلايا إلى 80–90٪، يبدأ التحفيز العظامي. صيغ وسط الحث العظمي مع DMEM عالي الجلوكوز يحتوي على 10٪ FBS، 10 ملليمولار β جليسروفوسفات، 50 ميكروغرام/ملتر حمض الأسكوربيك، 10 ميكرومولار كالسيتريول، و1 ميكرومولار ديكساميثازون.
- غير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام واستمر في عملية الحث لمدة تقارب 14 يوما.
- قم بصبغ الخلايا ب 2٪ من أليزارين ريد S (رقم الحموضة 5.2) وراقبها تحت مجهر مقلوب.
- بناء وتحديد الأورجينويد
- جهز معلقا أحادي الخلية من ADSCs في وسط زراعة كامل وضبط تركيز الخلية إلى 2 ×10 4 خلايا/20 ميكرولتر.
- اقلب غطاء طبق الزراعة بحجم 100 مم وانثر قطرات بحجم 20 ميكرولتر من تعليق الخلية على السطح الداخلي للغطاء.
- أضف زبدة الفول السوداني المعقمة إلى قاع الطبق للحفاظ على الرطوبة، غط الغطاء بعناية، وحضن قطرات التعليق تحت ظروف الزراعة القياسية.
- راقب القطرات يوميا ودع الخلايا تتجمع وتتكون كرويا لمدة 6 أيام.
- اجمع الكرويدات بلطف باستخدام ماصة وانقلها إلى ماتريغيل المبرد مسبقا على الثلج.
- قم بإدخال الكرويدات في Matrigel ووضع الخليط في أطباق الزراعة قبل حضنه في ظروف الزراعة القياسية.
- استبدل الوسط بانتظام وراقب نمو العضويات حتى الأيام 18–28، عندما تصبح الهياكل مضغوطة وناضجة.
- تثبيت الأعضاء ب 4٪ بارافورمالديهايد، ونفيريتها بنسبة 0.1٪ ترايتون X-100، وامنع الارتباط غير النوعي بنسبة 5٪ BSA.
- حضن العينات بالأجسام المضادة الأولية ضد CD73 وCD90 وCD11b وCD45، ثم حضنها بالأجسام المضادة الثانوية الفلورية المقابلة.
- صبغ الأعضاء ب Hoechst و BODIPY لرؤية النوى وقطرات الدهون على التوالي، ومراقبة العينات الملونة تحت مجهر فلوري.
ملاحظة: قم بفرز الخلايا وجميع عمليات التلاعب التي تشمل الزراعة المفتوحة، بما في ذلك التلقير، والتغذية، وتحضير التلوين، تحت ظروف معقمة صارمة في خزانة أمان حيوي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 1: رسم تخطيطي لعملية عزل الخلايا المشتقة من الدهون. يصور المخطط الطريقة التقليدية والطريقة الحالية كسير عمل توضيحي. هناك ثلاث خطوات رئيسية في عزل الخلايا المشتقة من الدهون: الأولى هي المعالجة المسبقة؛ الثاني هو تفكك الأنسجة الدهنية لتحرير الخلايا؛ والأخير هو فصل الخلايا عن طريق الترشيح والطرد المركزي. <...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم هذه الدراسة نهجا متكاملا جديدا لعزل الخلايا المشتقة من الدهون (خاصة الخلايا الدهنية والخلايا المدمجة للدهون) يعالج القيود الحرجة للطرق التقليدية. من خلال الجمع بين الارتخاء الإنزيمي الخاص بالنسيج مع تفكك الموجات الميكانيكي الدقيق، يحقق هذا النظام عزلا سريعا (إجمالي وقت معالجة ~30 دقيقة)، وقابلية للبقاء (80–95٪)، وعزل خلوي قابل للتكرار.
الهضم الإنزيمي التقليدي، رغم استخدامه الواسع، يعتمد على حضانة الكولاجيناز لفترة طويلة (1–3 ساعات) واستخدام الماصات الميكا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلف زيي تشاو وجيايينغ يو مرتبطان بشركة تشنغدو دوس سينس للتكنولوجيا الحيوية، المحدودة، التي تصنع نظام سونيكونفر (SC-L1W) ومجموعة تفكك الأنسجة الدهنية (TM008) المستخدمة في هذا البروتوكول. المؤلفون الآخرون يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (Li M: 32421005 and 32225046، لو L: 32472857); مشاريع العلوم والتكنولوجيا في منطقة شيزانغ ذاتية الحكم في الصين (XZ202501ZY0147 إلى م.ل.); مؤسسة الصين للعلوم ما بعد الدكتوراه (لو إل: 2024M763881)؛ التمويل الخاص لما بعد الدكتوراه في تشونغتشينغ (لو إل: 2023CQBSHTB3098)؛ برنامج التدريب الوطني والإقليمي للمرحلة الجامعية في الابتكار وريادة الأعمال (لو إل: 202510626001)؛ ومشروع العلوم والتكنولوجيا الزراعية الرئيسي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجموعة تفكك الأنسجة من النوع A | دوكسينس | TM001 | يحتوي على عامل تفكك الأنسجة من النوع A (محلول من النوع A) ونوع A من محلول تفكك الأنسجة (A-buffer). |
| مجموعة متوسط التمايز المفرط | أوريسيل | GUXMD-90031 | يستخدم للتمايز الناتج عن الأديبوجينات، بما في ذلك وسط إيجل المعدل (غير المعدل) والوسيط الصيانة من Dulbecco عالي الجلوكوز |
| أليزارين ريد إس | أوريسيل | A5533ALIR-10001 | التلوين المعدني للتمايز العظامي (pH 5.2) |
| حمض الأسكوربيك | سيغما-ألدرتش | A4544 | حمض L-أسكوربك، اختبار زراعة الخلايا، لتحفيز العظام |
| خنازير باما الصغيرة | شركة تشنغدو دوسي للحيوانات التجريبية المحدودة | حيوانات ذكور تبلغ من العمر سنة واحدة، بدرجة حماية من الشمس (SPF) ويتم الحفاظ عليها تحت إجراءات التطعيم الموحدة، وإزالة الديدان، والتنظيف. https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html | |
| عداد الخلايا الآلي Bio-Rad TC20 | مختبرات بيو-راد | 1450011 | عداد الخلايا الآلي لتقييم الجدوى والإنتاجية |
| بوديبي | ثيرمو فيشر العلمي | D3922 | صبغة دهنية محايدة |
| BSA (5٪) | سيغما-ألدرتش | A9418 | ألبومين مصل البقر، مسحوق متحطم بالليوفيل، للحجب |
| الكالسيتريول | سيغما-ألدرتش | C9756 | 1α,25-ثنائي هيدروكسي فيتامين D3، للتحفيز العظامي |
| مصفاة الخلايا (70 ومو؛ m) | كورنينغ | 352350 | فالكون 70 μ مصفاة خلية m، معقمة، لتحضير عينات FACS |
| مصفاة الخلايا (200 & mu; m) | pluriSelect | 43-50200-03 | pluriStrainer، شبكة PET، تتسع لأنابيب 50 مل، معقمة وغير دقيقة؛ |
| أنبوب الطرد المركزي (50 مل) | كورنينغ | 352098 | أنبوب مخروطي عالي الوضوح بسعة فالكون 50 مل، معقم، بولي بروبيلين |
| شريحة العد (ل Bio-Rad TC20) | مختبرات بيو-راد | 1450011 | شريحة عد ثنائية الحجرة لعداد الخلايا الآلي TC20 |
| طبق الزراعة (100 مم) | كورنينغ | 430167 | طبق بوليسترين معقم، لتكوين القطرات المعلقة |
| ديكساميثازون | سيغما-ألدرتش | D4902 | ≥ 98٪، للتحفيز الناتج عن الدهون والاستئصال العظمي |
| محلول الملح المتوازن دي-هانكس أو PBS | جيبكو | 10010015 | مبرد مسبقا إلى 4 ف... C، pH 7.4. |
| DMEM | جيبكو | 11965084 | يستخدم هذا في زراعة SVF المعزولة الطازجة |
| DNase I | بيوتايم | D7073 | اختياري، ويوصى به إذا لاحظ التكتل. |
| الإيثانول | سيغما-ألدرتش | 459836 | 75٪ لتعقيم الأسطح. |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | جيبكو | A4736201 | نظام Tet معتمد، أصل أمريكي، معقم وغير متوقع؛ |
| مقياس التدفق الخلوي | بكالوريوس العلوم الحيوية | BD FACSCanto II | 3 ليزرات (405 نانومتر، 488 نانومتر، 633 نانومتر)، 8 قنوات فلورية، لتحليل علامات السطح (CD73، CD90، CD11b، CD45)، تلبي 70  متر متطلبات الفوهة عند 20 رطل لكل بوصة مربعة |
| مجهر الفلورة | أوليمبوس | نموذج مقلوب أو قائم قادر على مجموعات مرشحات FITC وDAPI. | |
| الأجسام المضادة الثانوية الفلورية | ثيرمو فيشر العلمي | A-11001 (مضاد للفأر)، A-11008 (مضاد للأرانب) | أليكسا فلور مترفق، للتألق المناعي |
| الأجسام المضادة المتقاربة بالفلوروكروم (CD73، CD90، CD11b، CD45) | بكالوريوس العلوم الحيوية | 561254 (CD73)، 561970 (CD90)، 557321 (CD11b)، 555485 (CD45) | لتحليل التدفق الخلوي لنمط ADSC |
| هوشتت | ثيرمو فيشر العلمي | H3570 | صبغة نووية لتقييم الخلايا الحية/الميتة. |
| آي بي إم إكس | سيغما-ألدرتش | I5879 | ≥ 99٪ (HPLC)، لوسط التحفيز المنشأ |
| محلول ملحي معقم بارد كالثلج | باكستر | 2F7124 | حقن كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪، ميزة خاصة، لشطف الأنسجة |
| الأنسولين | سيغما-ألدرتش | I9278 | المؤتلف، المعبر عنه في الخميرة، للتحفيز الأدديبوجيني |
| يودوفور | سيغما-ألدرتش | 25104 | محلول مطهر بنسبة 2٪. |
| ماتريجيل | كورنينغ | 354230 | عامل النمو منخفض، خال من الفينول الأحمر، لزرع الكرويدات وذلك الكرويد؛ |
| ميتال باث | سيرفيسبيو | SMB-H | يستخدم للحضانة عند درجة حرارة 37 &C. |
| أويل ريد أو | أوريسيل | OILR-10001 | صبغة الدهون لتمايز الخلايا الدهنية |
| المجهر البصري | أوليمبوس | مجهر سbrightfield قياسي مع 10x & ndash; أهداف 40x. | |
| طقم وسط التمايز العظمي | أوريسيل | GUXMD-90021 | يستخدم في التمايز العظامي، بما في ذلك وسط إيجل المعدل (غير المعدل) والوسيط الصيانة من دولبيكو عالي الجلوكوز |
| ماصة P1000 ذات أطراف واسعة القطر | بيكمان كولتر | B01113 | أطراف بقطر واسع من Biomek P1000 Span-8، معقم |
| بارافورمالديهايد (4٪) | ثيرمو فيشر العلمي | J61899 | محلول مائي، لتثبيت الأعضاء العضوية |
| ماصة pasteur | كورنينغ | 7095S-5C | معقم، قابل للتخلص منه. |
| البنسلين-ستريبتوميسين | جيبكو | 15070063 | 10,000 وحدة U/mL بنسلين، 10,000 & mu; g/mL ستريبتومايسين، عقيم |
| الصوديوم البنتوباربيتال | شركة هيكما للأدوية الأمريكية | 24201-010-20 | قابلة للحقن، للقتل الرحيم (100 ملغ/كجم من وزن الجسم، عن طريق الوريد). أندا 203619 |
| الأجسام المضادة الأولية (CD73، CD90، CD11b، CD45) | بكالوريوس العلوم الحيوية | 561254 (CD73)، 561970 (CD90)، 557321 (CD11b)، 555485 (CD45) | لصبغ المناعة العضوية |
| خلية الدم الحمراء (RBC) لتحليل الخلايا الحمراء | سولاربيولوجيا | R1010 | إذا كان ذلك مطلوبا للتطبيقات اللاحقة. |
| الطرد المركزي المبرد | إبندورف | 5702R | يستخدم لخطوات الطرد المركزي عند 4 درجات &C. |
| روزيغليتازون | شركة كايمان للكيماويات | 71740 | ≥ 98٪، PPAR وغاما؛ منشط لتحريض الأديبوجينات |
| حاوية شاربس | بيكتون ديكنسون | 305270 | حاوية مقاومة للثقب للشفرات والمقصات المستخدمة |
| نظام تحضير التعليق أحادي الخلية سوني كونفرت | دوكسينس | SC-L1W | يستخدم للتفكك الميكانيكي للأنسجة. |
| مخزن التلوين (مخزن تلوين التدفق الخلوي) | العلوم الإلكترونية الحيوية (ثيرمو فيشر ساينتيفيك) | 00-4222-57 | 200 مل، جاهز للاستخدام، يحتوي على FBS و0.09٪ صوديوم أزيد كمادة حافظة، لتخفيف الأجسام المضادة والخلايا، وخطوات التلوين السطحي والغسل في قياس خلوي التدفق&nb; |
| أنبوب إيبندورف معقم بسعة 1.5 مل | إبندورف | 30121.517 | أنبوب الطرد المركزي الدقيق بقفل آمن، معقم، لتقطيع الأنسجة |
| طبق الثقافة المعقمة | كورنينغ | 430167 | طبق زراعة معقم بمقاس 100 مم × 20 مم، لجمع الأنسجة |
| الملقط المعقم | سكلار | 96-1719 | ملقط إبهام معقم مسنن، مخصص لمعالجة الأنسجة |
| الشاش المعقم | شركة دوكال | 7060033 | وسادات شاش معقمة للتعقيم والمسح |
| مقص العيون المعقم | سكلار | 10023-580 | مقص زنبركي من نوع فاناس، لتقطيع الأنسجة إلى 1-2 مم وفوق؛ قطع |
| ماكينة حلاقة معقمة | 3M | 9681 | شفرة حلاقة تحضيرية جراحية، لإزالة الشعر من منطقة العمليات |
| مشرط معقم | إنتيجرا ميلتكس | 4-415 | مشرط معقم يستخدم لمرة واحدة، لعمل شق |
| المقص الجراحي المعقم | سكلار | 10022-580 | مقص قزحية العقم من الدرجة المستحقة، لتشريح الأوعية الدموية والأنسجة الضامة |
| قارورة زراعة الخلايا T25 | كورنينغ | 430639 | قارورة زراعة خلايا فالكون T25، غطاء مهوى، معقم |
| ترايتون X-100 (0.1٪) | سيغما-ألدرتش | T8787 | درجة مختبرية، للنفاذ&nb; |
| تريبان بلو | جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك | 15250061 | حل 0.4٪ لعد بقاء الخلايا. |
| تريبسين-إيدتا (0.25٪) | جيبكو | 25200056 | 0.25٪ تريبسين، 1 ملي مولار EDTA، لفصل ADSCs |
| β-جليسروفوسفات | سيغما-ألدرتش | G9422 | بنتاهيدرات ملح ثنائي الصوديوم، للتحفيز العظامي |
المراجع
- Qin, Y., et al. An update on adipose-derived stem cells for regenerative medicine: where challenge meets opportunity. Adv Sci. 10 (20), 1-27 (2023).
- Wang, L., et al. A review of adipose-derived mesenchymal stem cells’ impacts and challenges: metabolic regulation, tumor modulation, immunomodulation, regenerative medicine and genetic engineering therapies. Front Endocrinol. 16, 1606847(2025).
- Suchanecka, M., et al. Adipose derived stem cells – sources, differentiation capacity and a new target for reconstructive and regenerative medicine. Biomed Pharmacother. 186, 118036(2025).
- Su, H., et al. Bridging the gap: clinical translation of adipose-derived stem cells - a scoping review of clinical trials. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 288(2025).
- Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC). J Vis Exp. (156), e60485(2020).
- Attané, C., Estève, D., Moutahir, M., Reina, N., Muller, C. A protocol for human bone marrow adipocyte isolation and purification. STAR Protoc. 2 (3), 100629(2021).
- Emont, M. P., Rosen, E. D. Exploring the heterogeneity of white adipose tissue in mouse and man. Curr Opin Genet Dev. 80, 102045(2023).
- Uguten, M., et al. Comparing mechanical and enzymatic isolation procedures to isolate adipose-derived stromal vascular fraction: a systematic review. Wound Repair Regen. 32 (6), 1008-1021 (2024).
- Villanueva-Carmona, T., Cedó, L., Núñez-Roa, C., Maymó-Masip, E., Vendrell, J., et al. Protocol for the in vitro isolation and culture of mature adipocytes and white adipose tissue explants from humans and mice. STAR Protoc. 4 (4), 102693(2023).
- Cohen, M., et al. Adipose tissue explant culture using PDMS flow chambers: an alternative to static explant culture. Adipocyte. 14 (1), (2025).
- Liu, Y., Zhao, H., Yu, J., et al. A novel laboratory-based strategy for single adipocyte and adipose-derived stem cells extraction for transplantation: an experimental research. Aesthet Plast Surg. 49, 367-379 (2025).
- Tangkanjanavelukul, P., et al. Cartilage regeneration potential in early osteoarthritis of the knee: a prospective, randomized, open, and blinded endpoint study comparing adipose-derived mesenchymal stem cell (ADSC) therapy versus hyaluronic acid. Int J Mol Sci. 26 (17), 8476(2025).
- Qayyum, A. A., et al. Effect of allogeneic adipose tissue-derived mesenchymal stromal cell treatment in chronic ischaemic heart failure with reduced ejection fraction – the SCIENCE trial. Eur J Heart Fail. 25 (4), 576-587 (2023).
- Arab, F. L., et al. Safety and feasibility of intravenous fresh adipose-derived mesenchymal stem cells in secondary progressive multiple sclerosis: phase I/IIa clinical results. Stem Cell Res Ther. 17, 120(2026).
- Sheykhhasan, M., et al. Therapeutic potential and mechanistic insights into adipose-derived stem cells and mesenchymal stem cell-derived exosomes in patients with Crohn’s disease-associated fistulas: challenges and future perspectives. Stem Cell Res Ther. 16, 664(2025).
- Dufau, J., et al. In vitro and ex vivo models of adipocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C822-C841 (2021).
- Ghazal, S. K., et al. Adipose tissue-derived stem cells: a comparative review on isolation, culture, and differentiation methods. Cell Tissue Bank. , 1-16 (2021).
- Zhu, R., et al. Isolation methods, proliferation, and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells from different fat depots in bovines. Mol Cell Biochem. , (2023).
- Benitez, G. J., Shinoda, K. Isolation of adipose tissue nuclei for single-cell genomic applications. J Vis Exp. (160), e61230(2020).
- Basatvat, S., Bach, F. C., Barcellona, M. N., et al. Harmonization and standardization of nucleus pulposus cell extraction and culture methods. JOR Spine. 6 (1), e1238(2023).
- Escudero, M., et al. Scalable generation of pre-vascularized and functional human beige adipose organoids. Adv Sci. 2301499, 1-20 (2023).
- Mandl, M., et al. An organoid model derived from human adipose stem/progenitor cells to study adipose tissue physiology. Adipocyte. 11 (1), 164-174 (2022).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
