يقوم هذا البروتوكول بتقييم تصريف اللمفاوم بعد الكسر من خلال دمج التصوير القريب من الأشعة تحت الحمراء بالإندوسيانين الأخضر (ICG) مع الموجات فوق الصوتية لقياس تطهير العقد اللمفاوية الأخمصية وتضخم العقد اللمفاوية الموضعية في الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
* These authors contributed equally
يقوم هذا البروتوكول بتقييم تصريف اللمفاوم بعد الكسر من خلال دمج التصوير القريب من الأشعة تحت الحمراء بالإندوسيانين الأخضر (ICG) مع الموجات فوق الصوتية لقياس تطهير العقد اللمفاوية الأخمصية وتضخم العقد اللمفاوية الموضعية في الفئران.
غالبا ما ترافق الكسور الرضحية ضعف في وظيفة تصريف الجهاز اللمفاوي. يشير انخفاض تصريف الجهاز اللمفاوي وتضخم العقد اللمفاوية بعد الكسر إلى عمليات ديناميكية مستمرة للاستجابة الالتهابية الحادة وتجنيد الخلايا المناعية. تصف هذه المقالة طريقة تم فيها حقن 6 ميكرولتر من الإندوسيانين الأخضر بجرعة 0.2 ملغ/مل في المنطقة الأخمصية للفئران التي تخضع لجراحة كسر الظنبوب أو الوهمية. قام تصوير الفلورة تحت الحمراء القريبة بقياس إشارة ICG الأخمصية عند 0 ساعة و24 ساعة لحساب معدل التخلي البالغ 24 ساعة كقراءة لتصريف اللمفاوات في الفئران. تم استخدام الموجات فوق الصوتية في الوقت نفسه لإعادة بناء العقد اللمفاوية الماصمية ثلاثية الأبعاد، ومقارنة أحجامها، وتقييم التضخم الناتج عن الكسر. أظهرت النتائج أنه بعد الكسر، انخفض معدل إزالة الجهاز اللمفاوي بشكل ملحوظ، وكانت شدة الفلورة في ICG في المنطقة الأخمصية أعلى بشكل ملحوظ، كما أن حجم الخلايا اللولية المضوية المضغوطة تضخم بشكل ملحوظ. مقارنة بالطرق السابقة لقياس الجهاز اللمفاوي، مثل المقاطع النسيجة المرضية أو التصوير اللمفاوي، والتي غالبا ما تفشل في تحقيق الملاحظة الحية، والديناميكية، والملاحظة المستمرة، تظهر هذه الطريقة استقرارا عاليا وقابلية للتكرار. ومن الجدير بالذكر أنه يتيح المراقبة الديناميكية داخل الجسم الحي. لوظيفة تصريف الجهاز اللمفاوي، مما يوفر دعما فنيا قويا للتحقيق في التغيرات في ارتجاع اللمفاوات في نماذج الكسور.
غالبا ما تسبب الكسور الرضحية ضررا كبيرا في الأنسجة وتورما، مما يزيد من خطر المضاعفات مثل العدوى، والنخر، وعدم التماسك في العظم 1,2. أظهر غريجورز شتشيسني وآخرون أن خلل التصريف اللمفاوي، الذي يؤدي إلى وذمة الأنسجة، مرتبط بتأخر الشفاء3. تشير الدراسات إلى أنه خلال عملية شفاء الكسر، بالإضافة إلى إصلاح أنسجة العظام، يلعب الجهاز اللمفاوي في موقع الكسر دورا مهما أيضا. الأوعية اللمفاوية مسؤولة ليس فقط عن تصريف السائل الخلالي ومنع التورم4، بل أيضا عن تنظيم هجرة الخلايا المناعية وإزالة الفضلات الأيضية. ومع ذلك، في المراحل المبكرة من الكسر، يمكن للعوامل الالتهابية مثل TNF-α، IL-1، IL-6، وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (MCSF) أن تتلف خلايا البطانة اللمفاوية5، مما يؤدي إلى تغيرات مرضية مثل التنكس، والوذمة، والتليف6. أظهرت الدراسات ذات الصلة وجود خلايا بطانية لمفاوية في العظم والشواهقة، بالإضافة إلى الأنسجة الدهنية والعضلية المحيطة. علاوة على ذلك، يشارك التصريف اللمفاوي أيضا في تنظيم البيئة الدقيقة للورم الدموي بعد الكسر؛ يساعد التصريف الفعال من الخلايا اللمفاوية على بقاء الخلايا العظمية العظمية وتكاثر الخلايا الجذعية الميزنشيمية لنخاع العظم (BMSCs). أثناء الكسر، تعد عوامل الالتهاب المضادة للالتهاب (TNF-α، IL-1، وIL-6) وعوامل النمو (TGFβ1 وPDGF) التي تنتجها الخلايا المناعية في الموقع التالف عوامل تنظيمية مهمة لموت الخلايا المبرمجة في الخلايا العظمية وتكاثر BMSC8. أكد حسين أرسلان وعلماء آخرون التأثير السلبي للوذمة اللمفاوية على الخلايا العظمية. تسلط هذه النتائج البحثية الضوء على الدور المهم لتصريف الجهاز اللمفاوي في شفاء الكسور. لقد سهلت التطورات الحديثة في تصوير الفلورة بالأشعة تحت الحمراء القريبة من ICG المراقبة غير الجراحية في الوقت الحقيقي لديناميكيات تدفق اللمفاوات في كل من النماذج الحيوانيةوالبشر 9,10,11. تسمح هذه التقنية بتقييم كمي لانقباض الأوعية اللمفاوية، وسرعة التصريف، وسلامة المسار10،11. أظهرت دراسة باستخدام نماذج الفأر لالتهاب المفاصل والالتهاب أن تصوير ICG-NIR يمكنه التمييز بين الاستجابات اللمفاوية الحادة والمزمنة، مما يبرز أنماط تصريف مميزة أثناء إصابة الأنسجة والتعافي. علاوة على ذلك، ثبت أن التصوير اللمفاوي التابع للأشعة الليفية فعال في مراقبة التعافي الوظيفي بعد التصريف اللمفاوي اليدوي وفي تقييم فعالية العلاجات الموجهة لللمفاويات. يوفر التصوير بالموجات فوق الصوتية طريقة كمية تكميلية لتقييم شكل وحجم العقد اللمفاوية المتصيفة، بالإضافة إلى وذمة الأنسجة المرتبطة بضعف التصريف اللمفاوي. يتيح دمج تصوير التألق الشعاعي النووي مع الموجات فوق الصوتية تقييم وظيفة الجهاز اللمفاوي والتغيرات التشريحية في الوقت نفسه، مما يوفر نهجا متعدد الوسائط للتحقيق في ديناميكيات اللمفاوية في الجسم الحي. على الرغم من الاعتراف المتزايد بالدور الحاسم لخلل الوظائف اللمفاوية في الشفاء بعد الصدمة، لا تزال الطرق الموحدة والقابلة للتكرار لتقييم تصريف الجهاز اللمفاوي بعد الكسور غير موجودة. العديد من طرق التصوير الحالية تدخلية، تفتقر إلى الدقة المكانية الكافية، أو تفشل في مراقبة تدفق اللمفاوف ديناميكيا. لذلك، من المتوقع أن يعالج تطوير بروتوكول يجمع بين ICG-NIR والتصوير بالموجات فوق الصوتية هذا النقص المنهجي ويوفر أداة فعالة لتقييم التعافي اللمفاوي ومساهمته في إصلاح العظام.
تقدم هذه الدراسة إطارا مبتكرا يجمع بين تصوير التألق ICG-NIR والموجات فوق الصوتية عالية الدقة لتقييم تصريف الجهاز اللمفاوي بعد كسور الظنبوب في الفئران. يتيح هذا النهج التحليل شبه الكمي لكفاءة التصريف ويقيس حجم العقد اللمفاوية أثناء عملية شفاء الكسر. له أيضا بعض القيود. أولا، يستخدم ICG-NIR بشكل أساسي لتقييم الأوعية اللمفاوية السطحية، وقدرته على التصوير للهياكل العميقة محدودة. ثانيا، رغم أن التغيرات في حجم العقد اللمفاوية توفر بعض المعلومات، إلا أنها تفتقر إلى التحديد ولا يمكنها استبدال القياسات الوظيفية المباشرة بالكامل. تتمتع هذه المنهجية بإمكانيات ترجمية كبيرة وتحسن فهمنا لوظيفة الجهاز اللمفاوي في تجديد العظام.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت الموافقة على تجارب الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مركز شنغهاي للكائنات النموذجية (رقم الموافقة: NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). تم استخدام فئران ذكور C57 مع نموذج كسر (عمر 6–8 أسابيع) في هذه الدراسة. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. الرعاية قبل العملية
2. الإجراءات التجريبية
ملاحظة: توحيد إعدادات التخدير، وجرعة وحجم ICG، وموقع وعمق الحقن، ووقت التعرض، وتعريف العائد على العائد، ومعايير فحص الموجات فوق الصوتية عبر جميع الجلسات لتقليل التفاوت بين الحيوانات.
3. الرعاية بعد العملية
4. التقييم
ملاحظة: اجعل محققا أعمى عن تخصيص المجموعة ليقوم بجمع الصور والتحليلات الكمية، والاحتفاظ بجميع مجموعات البيانات مشفرة حتى الانتهاء من التحليلات الإحصائية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
في الأيام 1 و7 و14 بعد تأسيس نموذج الكسر، كانت شدة فلورية ICG الأخمصية على مدى 24 ساعة (FI24h) في مجموعة الكسر أعلى باستمرار من تلك الموجودة في مجموعة الجراحة الوهمية (الشكل 3). أظهر التحليل الكمي النسبي لشدة فلورة ICG من الصور الأخمصية المجمعة أن معدل إزالة الفلورة اللمفاوية في مجموعة الكسر كان أقل بشكل ملحوظ من معدل الجراحة الزائفة (p < 0.05) (الشكل 4). وفي الوقت نفسه، كشف التصوير بالموجات فوق الصوتية ثلاثي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يتضمن البروتوكول عدة تفاصيل يسهل تجاهلها. على سبيل المثال، زمن التعريض غير ثابت ويجب تحديده بناء على شدة الفلورة النوعية. ومع ذلك، يجب أن يبقى وقت التعرض لنفس مجموعة الفئران عند 0 ساعة و24 ساعة ثابتا؛ وإلا، فقد تكون النتائج غير موثوقة. عند استخدام الموجات فوق الصوتية للمراقبة، من الضروري تغطية أطراف الفأر السفلية بالكامل بعامل الاقتران، لأن أي مناطق مكشوفة ستسبب تشوها في الصور الناتجة عند مسح المجس لتلك المناطق. أثناء الفحص، يجب أن تبقى أطراف الفأر السفلية ثابتة. يمكن للمشغل تثبيت الفأر ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.
تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية (82174407 إلى YJZ)، وبرنامج تدريب قادة التخصصات التابع للجنة الصحة الجديدة في بودونغ في شنغهاي (PWRd2020-05)، ومشروع قادة الانضباط للجنة الصحة الجديدة في بودونغ (PWRq2020-56)، ومشروع سانمينغ الطبي في شنتشن (رقم SZZYSM202311006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 Microliter Microsyringe | Hamilton Company | 80330/00 | إن Hamilton 80330/00 microsyringe هو أداة قياس دقيقة بسعة 10 L، تتميز بإبرة مقاس 26s، بطول 51mm، ونوع 2 للنقطة. وهو مصمم لتوصيل دقيق للكميات الصغيرة في تطبيقات الكروماتوغرافيا، حقن العينات، والكيمياء التحليلية. |
| 3D Ultrasound Vevo 3100 Imaging System | Vevo 2100 | Vevo 2100 هو نظام تصوير بالموجات فوق الصوتية عالي التردد للبحث قبل السريري، يوفر تصورًا ثلاثي الأبعاد في الوقت الفعلي للحيوانات الصغيرة. يوفر دقة فائقة لدراسات القلب والأوعية الدموية، والأورام، وعلم الأحياء التطوري، ويندمج مع برنامج Vevo LAB لتحليل البيانات. | |
| 75% Ethanol | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | G73537O | الإيثانول بنسبة 75% هو محلول مطهر يستخدم على نطاق واسع في المختبرات لتعقيم الأسطح، وتنظيف المعدات، ومكافحة التعقيم. يقتل بشكل فعال البكتيريا، والفيروسات، والفطريات من خلال تنكس البروتينات، ويستخدم بشكل شائع في البيئات البيولوجية والسريرية. |
| Cotton Swab | Hebei Kangji Medical Equipment Co., Ltd. | 20250303 | مسحات القطن هي أدوات تطبيق معقمة وامتصاصية تستخدم لجمع العينات بدقة، أو لتطبيق المحاليل، أو للتنظيف في الإجراءات الطبية، والتشخيصية، والمخبرية. تتضمن أعوادًا خشبية أو بلاستيكية مع أطراف قطنية للمناولة الصحية. |
| Coupling Agent | Tianjin Jinya Technology Development Co., Ltd. | 20241029 | عامل الاقتران، المعروف باسم جل الموجات فوق الصوتية، هو وسط مائي يستخدم لتعزيز الانتقال الصوتي بين محول الموجات فوق الصوتية والجلد. يزيل جيوب الهواء لتحسين التصوير، وغير مسبب للتهيج، ويتم توفيره في حاوية 250mL للاستخدام الطبي والتشخيصي. |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | Prism 10 | برنامج علمي للرسوم البيانية والتحليل الإحصائي يستخدم لتحليل البيانات، والتصور، والعرض. |
| Image J | National Institutes of Health | ImageJ 1.54d | برنامج معالجة وتحليل الصور مبني على جافا، ومتاح للجمهور، ويستخدم على نطاق واسع لتحليل الصور البيولوجية والطبية. |
| indocyanine green | Dandong Yichuang Pharmaceutical Co., Ltd. | 8305128 | الأخضر الإنديوسياني هو صبغة أنيونية قابلة للذوبان في الماء تستخدم في التشخيص الطبي لتحديد الناتج القلبي، ووظيفة الكبد، وتدفق الدم في الكبد، وتصوير الشبكية. يتم توفيره في قوارير 25mg للإعطاء الوريدي، ويظهر توهجه في نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة لأغراض التصوير. |
| isoflurance | RWD | R650-IE | الأيزوفلوران هو مخدر عام مستنشق. له معامل تقسيم دم/غاز صغير. عند استخدامه لتخدير الحيوانات، يمكنه تحريض التخدير بسلاسة، وبسرعة، وبشكل مريح، مع التعافي السريع، والاسترخاء الجيد للعضلات، وعدم وجود تأثير محفز على الجهاز العصبي السمبتاوي. معدل استقلاب الأيزوفلوران في الكبد منخفض، وبالتالي فإن له سمية منخفضة على الكبد، ولا توجد آثار جانبية واضحة حتى مع الاستخدام المتكرر. لتجنب الآثار الضارة لغازات التخدير النفايات على البيئة وموظفي المختبر، يوصى باستخدامه مع نظام استعادة الغاز. |
| Microbalance | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd. | FA1004B | الميزان الدقيق FA1004B هو أداة تحليل عالية الدقة مصممة لوزن دقيق للعينات الصغيرة، ويوفر دقة تصل إلى 0.0001g، ومناسب للتطبيقات المختبرية التي تتطلب قياسات دقيقة في البحث ومراقبة الجودة. |
| Near-Infrared Imaging System | Olympus | MVX10 | Olympus MVX10 هو نظام مجهر فلوري زووم كبير محسّن للتصوير قريب من الأشعة تحت الحمراء. يوفر تصورًا عالي الدقة لعينات كبيرة مع نطاق زووم واسع، وبصريات متقدمة لاختراق الأنسجة العميقة، وتوافق مع تقنيات الفلوريسنس في البحوث البيولوجية والمواد. |
| Vevo lab | \ | Vevo LAB | حزمة برامج تحليل التصوير المستخدمة لتحليل بيانات التصوير Vevo، بما في ذلك القياس، والحساب، وإنشاء التقارير. |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.